Les procédés de bioraffinerie, et notamment les agrocarburants, sont aujourd'hui reconnus comme essentiels pour sortir de l'économie actuelle basée sur le pétrole. Dans le cas du bioéthanol produit à partir de biomasse lignocellulosique, l'hydrolyse enzymatique par les enzymes de Trichoderma reesei est le principal point faible du procédé et doit être améliorée. Ces travaux de thèse s'intègrent dans le cadre du projet Futurol, et ont pour objectif d'identifier de nouvelles enzymes capables d'améliorer l'activité de T. reesei sur la lignocellulose. Une analyse post-génomique réalisée sur les secrétomes de vingt souches fongiques s'est révélée particulièrement prometteuse pour l'identification d'enzymes lignocellulolytiques d'intérêt. Une approche de génomique comparative a également abouti à la sélection de deux endo-mannanases de famille GH5 et GH26 chez le champignon Podospora anserina. Ces hémicellulases ont permis d'améliorer significativement la libération de glucose par T. reesei à partir d'épicéa. Une étude fondamentale approfondie a permis de résoudre les structures cristallographiques et de mettre en évidence les relations entre les spécificités enzymatiques de chaque enzyme et leurs caractéristiques structurales. La structure tridimensionnelle de la mannanase GH26 couplée à son CBM35 présente un linker court et rigide et une organisation du site actif atypique. Les deux mannanases ont également fait l'objet d'un travail d'ingénierie aléatoire qui a abouti à des variants des deux enzymes présentant une amélioration de l'efficacité catalytique et/ou une modification de spécificité. / Biorefineries such as biofuels are nowadays considered as essential to reduce our dependence on oil products. In the production process of bioethanol from lignocellulosic biomass, enzymatic hydrolysis performed by Trichoderma reesei enzymes is the main bottleneck of the process and requires improvements.The present work is part of the Futurol project, and aims at identifying new enzymes to improve the activity of T. reesei toward lignocellulose. Post-genomic analyses on twenty fungal strains have revealed the potential of this approach to identify lignocellulolytic enzymes of interest. Comparative genomics also led to the selection of two endo-mannanases from families GH5 and GH26 from the fungus Podospora anserina. These hemicellulases significantly improved glucose release upon T. reesei hydrolysis of spruce. An in-depth fondamental study allowed the solving of cristallographic structures and revealed the relationships between enzymatic specificities and structural characteristics. The structure of GH26 catalytic module appended to CBM35 highlighted a short and rigid linker and an atypical active site organization. The two mannanases were subjected to molecular engineering. Variants displaying improved catalytic efficiency and/or modified specificity were identified for both enzymes.

Les contaminations par les moisissures représentent un problème majeur au sein de l'industrie agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique, et dans le secteur médical. Actuellement, l'identification des champignons filamenteux est basée sur l'analyse des caractéristiques phénotypiques, nécessitant une expertise et pouvant manquer de précision, ou sur les méthodes moléculaires, coûteuses et fastidieuses. Dans ce contexte, l'objectif de cette étude a consisté à développer un protocole simple et standardisé à l'aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) combinée à une méthode d'analyse chimiométrique, proposant une méthode alternative pour l'identification rapide des moisissures. Au total, 498 souches de champignons filamenteux (45 genres et 140 espèces) ont été analysées à l'aide d'un spectromètre IRTF à haut débit. L'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS -DA), méthode chimiométrique supervisée, a été appliquée à chaque spectre dans les gammes spectrales 3200-2800 et 1800-800 cm-1. Différents modèles de calibration ont été construits à partir de 288 souches, ceci en cascade de la sous-division jusqu'à l'espèce en se basant sur la taxonomie actuelle. La prédiction des spectres en aveugle, obtenus à partir de 105 souches, au niveau du genre et de l'espèce est respectivement de 99,17 % et 92,3 %. La mise en place d'un score de prédiction et d'un seuil a permis de valider 80,22 % des résultats. L'implémentation d'une fonction de standardisation (SF) a permis d'augmenter le pourcentage de spectres bien prédits, acquis sur un autre instrument, de 72,15 % (sans fonction) à 89,13 %, validant la transférabilité de la méthode. Puisqu'une biomasse mycélienne suffisante peut être obtenue après 48h de culture et que la préparation des échantillons implique l'utilisation d'un protocole simple, la spectroscopie IRTF combinée à la PLS-DA apparaît comme une méthode rapide et peu coûteuse, ce qui la rend particulièrement attractive pour l'identification des champignons filamenteux au niveau industriel. Les résultats obtenus placent la spectroscopie IRTF parmi les méthodes analytiques prometteuses et avant-gardistes, possédant un haut pouvoir discriminant et une forte capacité d'identification, en comparaison avec les techniques conventionnelles. / Mold contaminants represent a major problem in various areas such as food and agriculture, pharmaceutics, cosmetics and health. Currently, molds identification is based either on phenotypic characteristics, requiring an expertise and can lack accuracy, or on molecular methods, which are quite expensive and fastidious. In this context, the objective was to develop a simple and standardized protocol using Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy combined with a chemometric analysis, allowing to implement an alternative method for rapid identification of molds. In total, 498 fungal strains (45 genera and 140 species) were analyzed using a high-throughput FTIR spectrometer. Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA), a supervised chemometrics method, was applied to each spectrum in the spectral ranges 3200-2800 and 1800-800 cm-1 for the identification process. Using 288 strains, different calibration models were constructed in cascade and following the current taxonomy, from the subphylum to the species level. Blind prediction of spectra from 105 strains at the genus and species levels was achieved at 99.17 % and 92.3% respectively. The establishment of a prediction score and a threshold permitted to validate 80.22% of the obtained results. The implementation of a standardization function (SF) permitted to increase the percentage of well predicted spectra from strains analyzed using another instrument from 72.15% (without SF) to 89.13% and permitted to verify the transferability of the method. Since sufficient mycelial biomass can be obtained at 48h culture and sample preparation involved a simple protocol, FTIR spectroscopy combined with PLS-DA is a very rapid and cost effective method, which could be particularly attractive for the identification of moulds at the industrial level. The results obtained places FTIR spectroscopy among the avant-garde promising analytical approaches, with high discriminant power and identification capacity, compared to conventional techniques.

Apple pomace is a solid by-product acquired from pressing and crushing millions of tons of apple in juice-industries. It represents 25-30 % of the original fruit and consists of peels, seeds and pulp. This raw material has multiple applications due to its high carbohydrate and moisture content. This bachelor thesis evaluated the use apple pomace acquired from Herrljunga cider for the cultivation of a filamentous fungus to produce biomass and ethanol. Different pretreatment strategies were applied to the apple pomace to extract as much sugars as possible. Several batches were made by mixing pomace and distilled water at different ratios (g pomace per g water) and different water temperatures. Apple juice was produced by filtering soaked pomace using a fine fabric. Apple pomace suspensions were made by adding pomace and water without mixing it (non-homogenised) and homogenised suspensions by mixing with a kitchen blender. Some apple juice batches were pH adjusted to 5.5 to investigate the effect on the fungal growth. The batches were put in Erlenmeyer flasks, sterilised and inoculated with the fungal strain Rhizomucor that has been isolated from Indonesian leaves used for tempe preparation. The Erlenmeyer flasks were incubated in a water shake for 72 h. Samples were taken every 24 h to follow sugar and ethanol concentrations. The samples were analysed by HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). The results showed that apple pomace suspension did not perform well compared to the apple juice since the suspension was too viscous and lacked oxygen for the fungus to grow properly in the solution. The apple juice did show a significant improvement compared to the suspension, however pH adjustment to 5.5 had a negative impact on the fungal growth. Cold pre-treatment with an apple pomace to water ratio of 1 g pomace /g water produced the most biomass, with a yield of 9.7 g biomass per kg dry apple pomace. For ethanol production, an apple pomace to water ratio of 1 g pomace /g water using hot water had the highest yield of 11.2 g ethanol per kg dry apple pomace. / Äppelpressmassa är en solid biprodukt, producerad genom att pressa och trycka milliontals ton äpple i bland annat juiceindustrier. Den kvarstående massan motsvarar 25-30 % av äpplet och består utav skal, frön och fruktkött. Denna råvara har många tillämpningar då den har ett högt kolhydrat- och vätskeinnehåll. Detta examensarbete utvärderade användningen av äppelpressmassa från Herrljunga cider för att odla en filamentös svamp i syfte att producera biomassa och etanol. Massan blev utsatt för olika förbehandlingar för att extrahera så mycket socker som möjligt. Olika satser gjordes genom att blanda äppelpressmassa med vatten i olika förhållanden (g äppelpressmassa per g vatten) och olika vattentemperaturer. Äppeljuice producerades genom att filtrera blöt massa med ett fint tyg. Suspensioner gjordes genom att tillsätta vatten till massan och inte blanda det (icke-homogent). En annan variant gjordes genom att blanda äppelpressmassa och vatten med en mixer (homogent). Några utav äppeljuicesatserna pH justerades till 5.5 för att se hur det påverkade svamptillväxten. Satserna flyttades till Erlenmeyer flaskor, steriliserades och ympades med den filamentösa svampen Rhizomucor. Erlenmeyer flaskorna flyttades till ett skakvattenbad för att jäsa i 72 timmar. Prover togs var 24:e timma för att se socker- och etanolkoncentrationerna ändras. Detta analyserades med hjälp utav en HPLC. Resultaten visade att suspensionssatserna inte presterade bra jämfört med äppeljuicesatserna. Detta misstänks bero på att innehållet var väldigt visköst och hade lågt syreinnehåll för svampen att kunna växa. Att justera pH till 5.5 för äppeljuicesatserna visade sig inte vara bra, de presterade sämre jämfört med justerade satser. Förbehandlingen med en äppelpressmassa till vatten förhållandet på 1 g äppelpressmassa/1 g kallt vatten producerade mest biomassa med ett utbyte av 9.7 g torr biomassa per kg torr äppelpressmassa. För etanolproduktion hade förbehandlingsmetoden med en äppelpressmassa till vatten förhållandet på 1 g äppelpressmassa/1 g varmt vatten högst utbyte med 11.2 g etanol per kg torr äppelpressmassa.

Os fungos filamentosos são utilizados em larga escala na produção de produtos biotecnológicos na indústria devido a sua versatilidade e um dos exemplos são as peptidases que representam uma das principais classes de enzimas hidrolíticas. As peptidases são hidrolases que catalisam a quebra das ligações peptídicas das proteínas e que nos microrganismos são responsáveis por funções fisiológicas e patológicas, além de ter muitas aplicações em diversos campos industriais. Neste estudo foram analisados diferentes bioprocessos fermentativos para produção de peptidases pelo fungo Aspergillus terreus. Este microrganismo foi capaz de produzir peptidases em ambos os bioprocessos, sólido ou submerso, obtendo melhor performance e o pico de produção no bioprocesso fermentativo sólido de valor 677U/mL, nas condições 5g de farelo de trigo, 72 horas, 30°C e 75% de umidade. Utilizando o bioprocesso fermentativo submerso também obtivemos resultados satisfatórios com pico de atividade de 360U/mL, nas condições de meio padrão suplementado com Caseína 0,5%, 72 horas e 35°C. A caracterização bioquímica parcial dos extratos dos dois bioprocessos mostrou semelhanças entre algumas características das enzimas produzidas como a faixa extensa de pH ótimo abrangendo regiões ácidas, neutra e alcalinas, temperatura ótima pontual de 55°C e perfil de inibição pelo PMSF e EDTA. Contudo, os perfis de estabilidade (pH e temperatura) e comportamento frente a adição de íons apresentaram respostas diferentes entre si, o que sugere a produção de enzimas diferentes produzidas pelo mesmo fungo em meios distintos. A microencapsulação por Spray Drying como processo de estabilização foi satisfatória obtendo rendimentos de 37,5-58,2% e com níveis acima de 50% de atividade enzimática. Em contrapartida, a imobilização enzimática demonstrou ser eficaz na etapa de ligação ao suporte, mas não foi capaz de estabilizar a enzima presente no extrato, o que ficou caracterizado pela perda de atividade proteolítica. / Filamentous fungi are extensively used in the production of biotechnological products in industry because of their versatility and one of the examples are peptidases which constitute a major class of hydrolytic enzymes. The peptidases are hydrolases which catalyze the cleavage of peptide bonds of proteins and microorganisms that are responsible for the physiological and pathological roles, in addition to having many applications in various industrial fields. This study evaluated various bioprocesses for fermentative production of peptidases by the fungus Aspergillus terreus. This microorganism was able to produce peptidase in both bioprocess, solid or submerged, achieving better performance in the solid bioprocess with peak of production of 677U/mL under the conditions 5g wheat bran, 72 hours, 30°C and 75% humidity . Using submerged fermentation bioprocess we also obtained satisfactory results with peak of activity of 360U/mL with conditions of standard medium supplemented with 0.5% casein, 72 hours and 35°C. Biochemical characterization of the two partial purified extracts showed similarities between some characteristics of the enzymes produced, as large optimum pH range spanning regions acidic, neutral and alkaline point temperature optimum of 55 ° C and the inhibition profile of PMSF and EDTA. However, the stability profiles (pH and temperature) and behavior in addition ions showed different responses to each extract, which suggests the production of different enzymes in different ways. Microencapsulation by Spray Drying and stabilization process was obtaining satisfactory yields of 37.5 to 58.2%, with levels above 50% of enzyme activity. In contrast, the enzyme immobilization step was effective in bonding the support, but was not able to stabilize the enzyme present in the extract, which was characterized by the loss of proteolytic activity

INTRODUÇÃO: Infecções fúngicas superficiais podem ser causadas por dermatófitos, leveduras ou fungos filamentosos não dermatófitos. O tipo de lesão desenvolvida eventualmente se correlaciona ao agente etiológico, à capacidade de resposta imunológica do hospedeiro, ao sítio anatômico da lesão e tecido afetado. A proposta desse trabalho é isolar e identificar agentes de onicomicose em pessoas idosas (acima de 60 anos de idade), que frequentemente apresentam alteração da resposta imune. CASUISTICA E MÉTODOS: A técnica de identificação de fungos foi a análise do resultado conjunto do exame micológico direto, isolamento e microcultura do raspado ungueal. Escamas subungueais e escamas interdigitais foram coletadas de 35 pessoas idosas, com suspeita clínica de onicomicose, institucionalizados em duas casas assistenciais no município de São Bernardo do Campo, SP, Brasil. RESULTADOS: Os materiais coletados foram analisados e, no raspado ungueal, observou-se 18 (51,40%) resultados positivos no exame direto e 15 (44,40%) no isolamento. Os dermatófitos foram evidenciados em 8 (44,40%) dos isolados, identificando-se 5 (27,80%) como Trichophyton rubrum e 1 (5,60%) de cada um como Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes e Microsporum gypseum. O segundo grupo mais isolado foram 7 (38,90%) leveduras, identificadas como: 3 (16,70%) Candida guilliermondii, 2 (11,10%) Candida parapsilosis e 1 (5,60%) Candida glabrata, 1 (5,60%) Trichosporon asahii. O último grupo foi representado por 3 (16,70%) isolados de fungos filamentosos não dermatófitos, identificados como: Fusarium sp, Aspergillus sp e Neoscytalidium sp, 1 (5,60%) de cada um. Trinta (85,70%) dos raspados interdigitais foram negativos e em 5 (14,30%), a identificação dos agentes coincidiu com o fungo causador da onicomicose (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii e 1 Fusarium sp). No grupo controle (9 pessoas idosas clinicamente sem lesão ungueal) realizou-se coleta interdigital, isolando-se Candida guilliermondii em apenas 1 (11,0%). CONCLUSÕES: Pelo método de identificação empregado, observou-se que os fungos causadores de onicomicoses encontrados neste trabalho estão de acordo com relatos da literatura recente; a apresentação clínica da unha com onicomicose por fungos filamentosos não dermatófitos foi indistinguível daquela por dermatófitos ou candidoses e, do ponto de vista etiológico, não se observou diferença entre a onicomicose de pessoas idosas institucionalizadas com os dados da ocorrência de onicomicose na população geral divulgados pela literatura / INTRODUCTION: Superficial fungal infections can be caused by dermatophytes, yeasts or filamentous non-dermatophyte fungi. The type of injury eventually correlates to the the etiologic agent, the ability of the host immune response, the anatomical site of the lesion and the kind of the affected tissue. The purpose of this study is to isolate and identify agents of onychomycosis in the elderly (people over 60 years old), who often have alterations in the immune response. MATERIAL AND METHODS: The technique for the identification of fungi was the analysis of the combined result of mycological examination, isolation and microcultures of nail scrapings. Subungual and interdigital scales were collected from 35 elderly with a clinical suspicion of onychomycosis, institutionalized in two care houses in the city of Sao Bernardo do Campo, SP, Brazil. RESULTS: The collected materials were analyzed and the nail scrapings displayed 18 (51.40%) positive results on direct examination and 15 (44.40%) in isolation. Dermatophytes were found in 8 (44.40%) isolates, 5 (27.80%) beeing identified as Trichophyton rubrum and 1 (5.60%) of each others as Trichophyton tonsurans, Trichophyton mentagrophytes and Microsporum gypseum. The second more isolated group were composed by 7 (38.90%) yeasts, identified as: 3 (16.70%) Candida guilliermondii, 2 (11.10%) Candida parapsilosis, 1 (5.60%) Candida glabrata, and 1 ( 5.60%) Trichosporon asahii. The last group was represented by 3 (16.70%) isolated of non-dermatophyte filamentous fungi, identified as Fusarium sp, Aspergillus sp and Neoscytalidium sp 1 (5.60%) of each. Thirty (85.70%) of the interdigital scrapings were negative and 5 (14.30%) positive, being the agents coincident with the onychomycosis causing fungi (2 Trichophyton rubrum, 1 Trichophyton mentagrophytes, 1 Candida guilliermondii and 1 Fusarium sp) . In the control group (9 elderly with clinically uninjured nail) interdigital collecting was held, isolating Candida guilliermondii in only one (11.0%). CONCLUSIONS: Using this identification method, it was observed that the fungi that cause onychomycosis found in this study are consistent with the reports in the recent medical literature, the clinical presentation of toenail onychomycosis caused by non-dermatophyte molds was indistinguishable from that due to candidosis or dermatophyte and, in terms of etiology, no difference was observed between the onychomycosis of the institutionalized elderly from the occurrence of onychomycosis in the general population disclosed in the literature

O presente trabalho foi delineado considerando-se a importância de fungos filamentosos e leveduras, os quais estão associados a diversas patologias no homem e animais. Deve-se considerar ainda que o leite e seus derivados lácteos contaminados com estes microrganismos podem constituir potenciais vias de transmissão de zoonoses a eles relacionados. Foram analisadas amostras de leite cru dos tipos A, B e C colhidas nas próprias propriedades leiteiras, bem como amostras de leite comercializado diretamente ao consumidor, visando-se a comparação da qualidade destes produtos quanto à presença e quantidade de fungos. Procedeu-se ainda à avaliação da susceptibilidade dos fungos isolados das amostras de leite às relações temperatura/tempo empregados nos processos de pasteurização e avaliação da sensibilidade destes isolados à fervura do leite. Foram analisadas 70 amostras de leite, sendo 50 de tanques de refrigeração de propriedades leiteiras, 10 de latões de propriedades de exploração leiteira e 10 de latões de transportadores e distribuidores que armazenam e comercializam leite clandestino, sendo que não houve diferença estatisticamente significante entre as medianas das quantidades de unidades formadoras de colônias de fungos/mL de Leite das diferentes procedências, indicando que o nível de contaminação por fungos nas amostras destas três origens foi similar. Foram isolados, em diferentes percentagens, fungos filamentosos e leveduras de todas as amostras de leite das diferentes procedências: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, dentre outras), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. Todos os gêneros e espécies isoladas foram submetidos aos testes de pasteurização rápida e lenta, bem como a fervura. O processo de pasteurização rápida foi o procedimento no qual houve maior resistência (72,18%) por parte dos isolados de leveduras e fungos filamentosos submetidos ao teste na metodologia aplicada, seguido pelo processo de fervura (15,89%) e o de pasteurização lenta (0,99%). / The present study was outlined considering the importance of filamentous fungi and yeasts, associated to various pathologies in man and animals. It must be considered that milk and dairy products when contaminated with these microorganisms can represent a potential means of zoonosis transmission related to them. Samples of raw milk types A, B and C, collected in dairy farms, as well as milk sold directly to the consumer, were analysed, aiming the comparison of the quality of these products as to the presence and quantity of fungi. The susceptibility of the isolates to the temperature/time rates employed in pasteurization and boiling was also evaluated. Seventy samples of raw milk were analysed, 50 from bulk tanks, 10 from small tanks of milk from dairy farms, and 10 from transportation tanks and distributors that store and sell clandestine milk. No statistically significant difference was observed between medians of the quantity of colonies forming units of fungi/mL of milk from the different sources, indicating that the level of contamination by fungi was similar when the three sources were compared. Filamentous fungi and yeasts were isolated in different percentages from all the samples from the different sources: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, etc.), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. All isolates were submitted to pasteurization and boiling. Quick pasteurization was the procedure in which the highest resistance (72.18%) of the isolates was verified, followed by boiling (15.89%) and slow pasteurization (0.99%).

O estudo teve por finalidade avaliar a contaminação por aflatoxinas (AF) em três espécies de peixes no Estado de São Paulo, avaliando também a micobiota e a ocorrência das toxinas nas rações. Foram coletadas amostras de ração, em uso e em estoque, e amostras dos peixes lambari (Astyanax altiparanae), matrinxã (Brycon cephalus) e pacu (Piaractus mesopotamicus) em cinco pisciculturas localizadas no Estado de São Paulo. As amostras de ração foram avaliadas quanto à contaminação fúngica, classificando os Aspergillus quanto à espécie e ao potencial toxigênico. A contagem de bolores variou de 1,0 x 102 UFC/g até 4,0 x 104 UFC/g, sendo o maior valor encontrado em rações em uso. A atividade de água variou de 0,45 a 0,72. Na análise da micobiota da ração, o gênero Aspergillus foi encontrado em 100% das amostras avaliadas, além dos gêneros Penicillium, Fusarium e Cladosporium. Dentre os isolados de Aspergillus seção Flavi, 84,2% produziram aflatoxinas. Foram identificadas diferentes espécies de Aspergillus, sendo 42,1% classificados como Aspergillus flavus. A detecção e quantificação de aflatoxinas foram efetuadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) em amostras de ração, tecido muscular e fígado dos peixes. AFB1 e AFG2 foram detectadas em 8,34% e 16,67% das amostras de ração, respectivamente. No tecido muscular, apenas uma amostra apresentou 5,4 µg AFM1/kg. Nas amostras de fígado, 50% apresentaram AFM1, variando de 2,3 a 17,1 µg/kg, e 16,67% apresentaram AFB1 em níveis de 8,9 a 12,7 µg/kg. Embora tenham sido encontrados níveis baixos de aflatoxinas na ração das propriedades investigadas, a detecção nos tecidos dos peixes sugere que os animais ingeriram a toxina em algum momento. Assim, pode-se concluir que o risco de contaminação por aflatoxinas em pisciculturas no estado de São Paulo existe e deve ser controlado. / The study aimed to evaluate the contamination by aflatoxins (AF) in three species of fish in the state of Sao Paulo, evaluating also the mycobiota and the occurrence of toxins in feed. It were collected feed samples, in use and stored, and fish samples: lambari (Astyanax altiparanae), matrinxã (Brycon cephalus) and pacu (Piaractus mesopotamicus) in five fish farming from state of Sao Paulo. Feed samples were evaluated for fungal contamination, classifying Aspergillus at species and their toxigenic potential. The mold count ranged from 1.0 x 102 CFU/g to 4.0 x 104 CFU/g, and the highest value was found in feed in use. The water activity ranged from 0.45 to 0.72. Regarding mycobiota analysis, the genus Aspergillus was found in 100% of the samples, as well Penicillium, Fusarium and Cladosporium genus were noted. Among the isolates of Aspergillus section Flavi, 84.2% produced aflatoxins. Different Aspergillus species were identified, with 42.1% classified as Aspergillus flavus. The detection and quantitation of aflatoxins in feed samples, fish muscle and fish liver were performed by high performance liquid chromatography (HPLC). AFB1 and AFG2 were detected in 8.34% and 16.67% of feed samples, respectively. In fish muscle, only one sample showed 5.4 µg AFM1/kg. In the liver samples, 50% presented AFM1, ranging from 2.3 to 17.1 µg/kg, and 16.67% had AFB1 at levels from 8.9 to 12.7 µg/kg. Despite the low levels of aflatoxin in the fish feed from the investigated properties, the detection in fish tissues suggests that animals could have ingested the toxin anytime. Thus, it can be concluded that the risk of aflatoxin contamination in fish farming in the state of Sao Paulo exists and it must be controlled.

O Brasil apresenta cerca de 10 a 17,6% da biodiversidade mundial e apenas uma fração dela é conhecida. Os fungos filamentosos são bons produtores de enzimas e despertam um grande interesse biotecnológico. O amido é o principal carboidrato de reserva das plantas. Dentre as enzimas amilolíticas estão as glucoamilases, que catalisam a hidrólise das ligações -1,4 e -1,6 das extremidades da cadeia do amido liberando glucose. Neste trabalho foram isolados 25 fungos filamentosos de amostras de materiais em decomposição da Mata Atlântica. Dos micro-organismos com alta atividade amilolítica foram selecionados e identificados Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Foi realizada a otimização do cultivo e caracterização das amilases do extrato bruto de ambos os fungos. Após a obtenção destes dados foi selecionado A. brasiliensis, pois, sua amilase é mais termoestável e ainda não reportada na literatura. Após purificação a enzima foi identificada como glucoamilase, a qual é monomérica com 69 kDa e contém aproximadamente 21% de carboidratos. Apresenta um domínio de ligação ao amido na porção terminal e estrutura secundária rica em -hélice. Sua atividade ótima ocorre em pH 4,5 a 60°C, seu pI é de 3,21, pode ser ativada com a adição de Mn2+, e é inibida por glucose em concentrações maiores que 0,1 M. A glucoamilase apresenta excelente estabilidade ao pH e boa estabilidade a temperatura (a 50°C mantém 67% de atividade após 7 horas; a 55°C a meia vida é de 147 minutos). Com amido de batata a enzima apresentou as seguintes constantes cinéticas (km 2,21 mg/mL; Vmáx 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). A glucoamilase foi imobilizada em DEAE-PEG com ativação de 12 vezes e possibilidade de reuso de 10 vezes com perda de apenas 31% de atividade. O derivado demostrou maior facilidade para hidrolisar a amilopectina do que à amilose. Também foi realizada uma análise de neighbor joining, que agrupou a glucoamilase de A. brasiliensis próxima às glucoamilases de espécies de Aspergillus, que são consideradas as mais derivadas. / Brazil holds about 10-17.6% of the world\'s biodiversity and just a percentage of it is known. Filamentous fungi are enzyme producers that have great biotechnological application. Starch is the main reserve carbohydrate in plants. Among the amylolytic enzymes there are the glucoamylases, that catalyze the hydrolysis of -1,4 and -1,6 linkages of the end of starch chains, and releases glucose. In this research 25 filamentous fungi from Atlantic forest decaying material samples were isolated. Among microorganisms with high amylolytic activity Aspergillus brasiliensis and Rhizoupus oryzae were selected and identified. The cultivation parameters were optimized and the enzymes of crude extract were characterized. Considering the previous data Aspergillus brasiliensis was selected because its amylases are more thermostable and it has not been described in the literature yet. After purification the enzyme was identified as a glucoamylase, which is monomeric with 69 kDa and about 21% of carbohydrates in its composition. The enzyme has a starch binding domain in the terminal position and its secondary structure is rich in -helix. The optimum pH for glucoamylase activity is 4.5, the temperature is 60ºC and its pI is 3.21. The enzyme can be activated by the addition of Mn+2, and inhibited in concentrations above 0,1M glucose. The glucoamylase has an excellent pH stability and a good temperature stability (at 50ºC 67% of the activity was retained after 7 hours; at 55°C its half-life was 147 minutes). The best kinetic values were obtained with potato starch (km 2.21 mg/mL; Vmax 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). The glucoamylase was immobilized on DEAE-PEG, with an activation of 12 times and enzyme reuse 10 times with just 31% loss of its activity. The immobilized enzyme has a greater activity on amylopectin than amylose. A neighbor joining analysis with glucoamylases from filamentous fungi species was made and Aspergillus brasiliensis glucoamylase was grouped close to the glucoamylases of Aspergillus species, which are considered the most derivative.

A pesquisa de linhagens com duplicação cromossômica, como a linhagem A de Aspergillus nidulans, teve oseu início no final da década de 1970. Durante este período foram isolados da linhagem A, diversos variantes deteriorados, que foram caracterizados genética e citologicamente. Neste trabalho de pesquisa, as analises genéticas demonstraram que os determinantes de deterioração ou segmentos de inserção de V5, V101, V102, V103 e V104 estão localizados nos grupos de ligação VIII, III, IV, VII e I respectivamente. As análises citogenéticas revelaram diversas alterações no ciclo celular e migração nucleares nas fases iniciais de desenvolvimento. A duplicação cromossômica da linhagem A e os variantes deteriorados foram investigados a nível molecular, por técnica de PCR. Os resultados mostraram que o segmento de inserção consiste de um provável Elemento de Transposição, denominado de MATE, o qual é característico do fungo Aspergillus nidulans. Os segmentos de inserção analisados apresentam características típicas de MATE, como o motivo "Spe" que é encontrado por toda seqüência dos Elementos MATE. / The research with chromosome duplication strains, as strain A of Aspergillus nidulans, began during the 70's, with isolation of several deteriorates variants of strain A and characterization by genetic and cytological analysis. In this work the genetic analysis has demonstrated that the deterioration determinant or insertion sequence in V5, V101, V102, V103 and V104 deteriorates variants are located in the linkages groups VIII, III, IV, VII and I, respectively. The cytological analyses have demonstrated changes in cellular cycle and nuclear migration in initial phases of development. The chromosome duplication of strain A and the deteriorated variants were investigated by PCR with designed primers to mobile elements, what have resulted in the identification of the transposable element MATE, mainly by great similarity with "Spe" motif sequence that is described as essential in activity of these elements.

O presente trabalho foi delineado considerando-se a importância de fungos filamentosos e leveduras, os quais estão associados a diversas patologias no homem e animais. Deve-se considerar ainda que o leite e seus derivados lácteos contaminados com estes microrganismos podem constituir potenciais vias de transmissão de zoonoses a eles relacionados. Foram analisadas amostras de leite cru dos tipos A, B e C colhidas nas próprias propriedades leiteiras, bem como amostras de leite comercializado diretamente ao consumidor, visando-se a comparação da qualidade destes produtos quanto à presença e quantidade de fungos. Procedeu-se ainda à avaliação da susceptibilidade dos fungos isolados das amostras de leite às relações temperatura/tempo empregados nos processos de pasteurização e avaliação da sensibilidade destes isolados à fervura do leite. Foram analisadas 70 amostras de leite, sendo 50 de tanques de refrigeração de propriedades leiteiras, 10 de latões de propriedades de exploração leiteira e 10 de latões de transportadores e distribuidores que armazenam e comercializam leite clandestino, sendo que não houve diferença estatisticamente significante entre as medianas das quantidades de unidades formadoras de colônias de fungos/mL de Leite das diferentes procedências, indicando que o nível de contaminação por fungos nas amostras destas três origens foi similar. Foram isolados, em diferentes percentagens, fungos filamentosos e leveduras de todas as amostras de leite das diferentes procedências: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, dentre outras), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. Todos os gêneros e espécies isoladas foram submetidos aos testes de pasteurização rápida e lenta, bem como a fervura. O processo de pasteurização rápida foi o procedimento no qual houve maior resistência (72,18%) por parte dos isolados de leveduras e fungos filamentosos submetidos ao teste na metodologia aplicada, seguido pelo processo de fervura (15,89%) e o de pasteurização lenta (0,99%). / The present study was outlined considering the importance of filamentous fungi and yeasts, associated to various pathologies in man and animals. It must be considered that milk and dairy products when contaminated with these microorganisms can represent a potential means of zoonosis transmission related to them. Samples of raw milk types A, B and C, collected in dairy farms, as well as milk sold directly to the consumer, were analysed, aiming the comparison of the quality of these products as to the presence and quantity of fungi. The susceptibility of the isolates to the temperature/time rates employed in pasteurization and boiling was also evaluated. Seventy samples of raw milk were analysed, 50 from bulk tanks, 10 from small tanks of milk from dairy farms, and 10 from transportation tanks and distributors that store and sell clandestine milk. No statistically significant difference was observed between medians of the quantity of colonies forming units of fungi/mL of milk from the different sources, indicating that the level of contamination by fungi was similar when the three sources were compared. Filamentous fungi and yeasts were isolated in different percentages from all the samples from the different sources: Candida spp. (C. krusei, C. guilliermondii, C. tropicalis, C. kefyr, etc.), Geotrichum spp., Rhodotorula spp., Trichosporon spp., Aureobasidium sp., Penicillium spp., Acremonium spp., Chrysosporium sp., Mucor spp., Aspergillus spp. All isolates were submitted to pasteurization and boiling. Quick pasteurization was the procedure in which the highest resistance (72.18%) of the isolates was verified, followed by boiling (15.89%) and slow pasteurization (0.99%).