Made available in DSpace on 2014-11-08T01:01:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462497-Texto+Completo-0.pdf: 10847685 bytes, checksum: 165076ea77d05917e2cde7a738dd5a4f (MD5) Previous issue date: 2014 / Centrolenidae and Allophrynidae constitute a a large clade of neotropical treefrogs of approximately 148 species. Althought some studies have been addressed phylogenetically this group, a comprehensive phylogenetic analysis including a total evidence aproach has never been presented. The objetives of this study was: 1) test previosly phylogentic hypothesis in Centrolenidae and Allophrynidae; ii) test the monophyly of both families; iii) perform a new phylogenetic analysis using both DNA and phenotipic evidence and iv) analize the evolution of some morphological and behavior characters consistent with the hypothesized relationships proposed. This phylogentic analysis was based in 378 terminals (268 of ingroup) representing 145 spepcies, 189 phenotipic characters and approximately 8500pb of 13 genes. The phylogenetic analysis resulted in 34 most parsimonious trees of 67. 821 steps, which are summarized in a strict consensus cladogram. Concurring with previous studies, the Total Evidence phylogenetic analysis here performed corroborated the closely relationship between Allophrynidae and Centrolenidae families, it also corroborated the monophyly of subfamilies Hyalinobatrachiinae and Centroleninae.A new subfamily “Allobatrachinae and new genus “Allobatrachium” are erected to allocate “Allobatrachium” sp, which form the sister taxon of all others centrolenids. Within Hyalinobatrachiinae, the genera Hyalinobatrachium and Celsiella are corroborated as monophyletic. Other results support a sister-group relationship between Ikakogi, Celsiella + Hyalinobatrachium. Whitin Centroleninae, two main clades were recovered: the first includes the tribe Cochranellini and the second another clade no named but composed of two mayors groups Nymphargus + Centrolene. Whitin Cochranellini, the analyses also corroborated the monophyly of Cochranella, Espadarana, Rulyrana, Sachatamia, Chimerella and Vitreorana but, Teratohyla is demonstrably nonmonophyletic: ((Chimerella (Teratohyla + Vitreorana)) (Teratohyla ((Cochranella + Espadarana) (Rulyrana + Sachatamia)))). To reconcile this situation, the genus Chimerella (one species) and two species of Teratohyla (T. amelie and T. pulverata) are placed in the synonymy of Vitreorana. Rulyrana is redefined and now includes 12 species by adding three species previously placed in Sachatamia genus. / A família Centrolenidae é atualmente composto por 148 espécies; Allophrynidae, por sua parte, está constituída por apenas três espécies. Apesar de alguns estudos terem avaliado as relações destas duas famílias, uma hipótese compreensiva para estas famílias incorporando a evidência fenotípica e a molecular nunca foi proposta. Os objetivos deste trabalho foram: i) testar a hipótese de relações filogenéticas previas de Centrolenidae e Allophrynidae; ii) testar a monofilia destas duas famílias; iii) propor uma hipótese de relacionamento filogenético e iv) analisar a evolução de alguns caracteres morfológicos e comportamentais no contexto da nova hipótese de relações a ser proposta. Para isto, foi realizada uma análise filogenética baseada em 378 terminais (268 do grupo interno, representando 145 espécies), 189 caracteres fenotípicos e sequencias de 13 genes (ca de 8500 pb). A análise cladística de parcimônia deste estudo teve como resultado final 34 árvores igualmente parcimoniosas de 67. 821 passos. As árvores mais parcimoniosas apresentaram conflito em quatro pontos no relacionamento interno apresentado pelas espécies de Hyalinobatrachium: H. fleischmanni e H. tatayoi; Espadarana: E. prosoblepon e E. callistoma; Rulyrana: R. adiazeta e R. susatamai e Centrolene: Centrolene sp4, Centrolene sp5 e C. condor. Assim como em trabalhos prévios, este estudo corroborou a estreita relação entre as famílias Allophrynidae e Centrolenidae. A família Centrolenidae e as subfamílias Hyalinobatrachiinae e Centroleninae foram corroboradas como monofiléticas.A nova subfamília “Allobatrachinae” e novo gênero “Allobatrachium” são erigidos para alocar a espécie “Allobatrachium” sp, o táxon irmão de todos os centrolenídeos. Dentro de Hyalinobatrachiinae, os gêneros Hyalinobatrachium e Celsiella foram corroborados como monofiléticos. Ikakogi foi recuperado como grupo irmão Celsiella + Hyalinobatrachium. Dentro de Centroleninae, dois grandes clados foram recuperados: o primeiro deles apresenta a categoria taxonômica de tribo Cochranellini, e o segundo não se encontra nomeado e está conformado por Nymphargus + Centrolene. O monofiletismo destes dois últimos grupos foi corroborado. Dentro de Cochranellini, o monofiletismo de Cochranella, Espadarana, Rulyrana, Sachatamia, Chimerella e Vitreorana também foi corroborado, mas, contrariamente, Teratohyla não foi corroborado como monofilético. As relações entre esses gêneros é descrita como a seguir: ((Chimerella (Teratohyla + Vitreorana)) (Teratohyla ((Cochranella + Espadarana) (Rulyrana + Sachatamia)))). Para reconciliar esta situação, o gênero Chimerella (uma espécie) e duas espécies do gênero Teratohyla (T. amelie e T. pulverata) são alocadas na sinonímia do gênero Vitreorana. O gênero Rulyrana é expandido a 12 espécies ao incluir em sinonímia as três espécies atualmente reconhecidas do gênero Sachatamia.

Resumo não disponíveis

As ribonucleases catalisam a clivagem do RNA e são componentes ubíquos das células, desde procariotos até eucariotos. A família T2 é a classe de RNases mais amplamente distribuída entre os organismos vivos. A ampla distribuição desta família sugere que ela deve ter um papel funcional muito importante na biologia celular destes organismos. Em Solanaceae, há basicamente dois grupos destas proteínas, um representado pelas S-RNases, as quais estão envolvidas com a rejeição do pólen na autoincompatibilidade gametofítica e um outro grupo mais diverso que é denominado de S-like RNases, com funções muito diversificadas. As S-RNases se apresentam na forma de um gene multialélico, altamente polimórfico, que está contido no lócus S. O lócus S é composto por uma combinação de proteínas SLF (S-locus F-box), responsáveis pela determinação do fator polínico, e uma S-RNase produzida apenas no pistilo, de forma que estes genes estão fortemente ligados formando o haplótipo S. Esses produtos gênicos interagem possibilitando a rejeição do auto-pólen num fenômeno denominado distinção colaborativa do pólen não próprio. No Capítulo II, foram utilizados métodos filogenéticos para determinar os principais agrupamentos de alelos na genealogia de S-RNases do gênero Solanum. A topologia da árvore não mostrou sinal filogenético para espécies, contudo, isso era esperado uma vez que a diversificação destes alelos ocorreu anteriormente à diversificação das espécies, gerando um fenômeno denominado de polimorfismos trans-específicos. Além disso, foram realizadas análises de seleção positiva, as quais encontraram um alto número de resíduos com altas probabilidades, indicando que estão sob pressão de seleção positiva darwiniana. Com o intuito de compreender a diversidade estrutural destes alelos, foram construídos modelos teóricos com base em modelagem por homologia dos principais clados da filogenia, já que estas sequências apresentam um elevado grau de polimorfismo. Os resultados mostraram grande variação estrutural na região hipervariável destas sequências, enquanto que regiões conservadas não apresentaram grandes mudanças estruturais e com estruturas secundárias características. No Capítulo III, foram realizadas diversas análises com o objetivo de compreender a diversificação estrutural e funcional de RNases T2 na família Solanaceae. As análises filogenéticas mostraram a formação de três principais grupos, sendo um de S-RNases, e os outros dois de S-like RNases. Com relação ao Clado 2, podemos inferir que houveram ao menos dois eventos de duplicação gênica. Além disso, também foram utilizados os métodos de NSsites e branch-site para inferência de seleção positiva como uma forma de identificar possíveis sinais de diversificação molecular. Muitos resíduos parecem estar sob seleção em ambos os métodos, embora um número maior fosse encontrado no NSsites (41), com estes resíduos localizando-se em regiões mais flexíveis da proteína, enquanto que os aqueles selecionados de acordo com o brach-site (8) estavam situados em posições mais rígidas da estrutura. Em súmula, os resultados encontrados nos capítulos que compreendem esta tese demonstram que análises teóricas podem contribuir efetivamente de inúmeras maneiras com o intuito de desenvolver uma melhor compreensão dos fenômenos biológicos relacionados com a evolução molecular de famílias multigênicas, além de também contribuir no entendimento dos processos de diversificação de genes multialélicos, utilizando como modelo de estudo a família gênica RNase T2. / The ribonucleases catalyze the cleavage of RNA and are ubiquitous components of cells, from prokaryotes to eukaryotes. The T2 family is the most widely category of RNases distributed among living organisms. The wide distribution of this family suggests that it should play an important functional role in cell biology of these organisms. Basically, there are two groups of these proteins in Solanaceae, one represented by SRNases, which are involved in the rejection of pollen in gametophytic self-incompatibility and a more diverse group, which is termed S-like RNases with very diverse functions. SRNases are a highly polymorphic and multiallelic gene contained in the S locus. The S locus consists of a combination of SLF proteins (F-box S-locus), responsible for the pollen factor, and one S-RNase expressed only in the pistil, and those genes are tightly linked as an S-haplotype. Products of these genes interact enabling the rejection of self-pollen in a phenomenon called collaborative non-self recognition. In Chapter II, we used phylogenetic methods to determine the main clusters of alleles in the genealogy of SRNase in the Solanum genus. The topology of the tree showed no phylogenetic sign to species delimitation, but it was expected since the diversification of these alleles occurred previously the diversification of the species, generating a phenomenon called trans-specific polymorphism. In addition, analyzes of positive selection were carried out, and it resulted in a significant number of residues with high probability, indicating they are under Darwinian positive selection. In order to understand the structural diversity of alleles, theoretical models were constructed based on homology modeling of the major clades found in the phylogeny, since it has a high degree of polymorphism in these sequences. The results showed that major structural variations are located in the hypervariable regions of these sequences, while conserved regions performed without major structural changes and showed stable secondary structures. In Chapter III, we used several analyzes to understand the structural and functional diversification of RNase T2 in the Solanaceae family. Phylogenetic analyses showed the clustering of three main groups, one with just SRNases and the two others composed by S-like RNases. Regarding to Clade 2, we could infer that at least two gene duplication events have occurred. In addition, we used two methods for inference of positive selection, NSsites and branch-site, as a mean to identify possible signals of molecular diversification. Many residues seem to be under selection in both methods, although a higher number was found in NSsites (41), and these residues were located in more flexible regions of the protein, while those selected according to the brach-site (8) were located at more rigid positions of the structure. In summary, the results found in the chapters of this thesis show that theoretical analyses could effectively contribute in many ways in order to develop a better understanding of biological phenomena related to the molecular evolution of gene families. Also, it contributes to the understanding of the processes related to multiallelic genes diversification, using gene family RNase T2 as a model.

Os gêneros Athenaea e Aureliana (Solanaceae) são compostos por sete e oito espécies, respectivamente, e os mesmo são distintos pela presença do cálice acrescente, que envolve o fruto, nas espécies de Athenaea. Suas plantas são arbustos com flores brancas com máculas esverdeadas ou roxas. A espécie mais abundante do grupo é Aureliana fasciculata, que ocorre ao longo de toda a Mata Atlântica. As demais espécies são raras. Athenaea e Aureliana são considerados gêneros irmãos, de acordo com a mais recente análise filogenética da família Solanaceae, e pertencem à subtribo Withaninae. Esta subtribo apresenta uma distribuição intrigante, pois é composta por apenas sete gêneros que ocorrem na América do Sul, Eurásia, norte da África e Ásia, além do arquipélago do Havaí, da Ilha de Santa Helena e das Ilhas Canárias. O objetivo geral deste trabalho foi contribuir para o conhecimento das relações evolutivas entre as espécies dos gêneros Aureliana e Athenaea. Para isso, foram realizadas a análise filogenética e a datação a partir de dados moleculares dos gêneros Athenaea e Aureliana, incluindo os demais gêneros da subtribo Withaninae, além da análise filogeográfica de Aureliana fasciculata. Para as análises filogenéticas foram sequenciadas cinco regiões do genoma plastidial (gene ndhF, intron trnL e os espaçadores plastidiais trnL-trnF, psaI-accD e trnC-ycf6). Os resultados obtidos indicam que a diversificação das espécies dos gêneros Athenaea e Aureliana a partir de um ancestral comum ocorreu cerca de 3,9 milhões de anos atrás. Não foram detectados clados correspondentes a cada um dos gêneros. Para a análise filogeográfica de Aureliana fasciculata foram sequenciados os espaçadores plastidiais trnH-psbA e trnS-trnG. Foram detectados quatorze haplótipos em 112 indivíduos da espécie, que também apresentou sinais de estruturação geográfica, com moderado isolamento por distância. Uma putativa barreira Norte/Sul entre os haplótipos, localizada ao sul do rio Doce (Espírito Santo, Brasil) também foi inferida. Uma expansão populacional há cerca de 50–60 mil anos atrás foi detectada, o que coincide com registros palinológicos de expansão da área florestal na Mata Atlântica. Os eventos históricos que moldaram a distribuição e demografia atual de Aureliana fasiculata são anteriores ao último máximo glacial e parecem estar relacionados a eventos climáticos do Pleistoceno. Por último, foi construída e validada uma biblioteca enriquecida em microssatélites de Aureliana fasciculata. Foram descritos sete pares de ―primers‖ polimórficos, com três alelos por locus, em média, e 6 heterozigosidade observada entre 0,05 e 1,00. A ampliação da amostragem e a utilização de marcadores moleculares de evolução mais rápida poderão trazer informações ainda mais completas sobre a taxonomia e história evolutiva dos gêneros Athenaea e Aureliana. / Athenaea and Aureliana (Solanaceae) genera are composed by seven and eight species, respectively. The character that distinguishes both genera is the presence of acrescent calyx, which involves the fruit, in Athenaea species. The plants are shrubs with white flowers and green or purple stains. The most abundant species of the group is Aureliana fasciculata, which occurs along the Atlantic Rainforest. All remaining species are rare. Both genera are considered as sister groups, according to the most recent phylogenetic analysis of Solanaceae family, and they both belong to subtribe . This group presents a puzzling distribution. It is composed by seven genera that occur in South America, Eurasia, North of Africa and Asia, plus Hawaiian Archipelago and St. Helena and Canary Islands. The main goal of the present study is to contribute to the knowledge of the evolutive relationship among the species of Athenaea and Aureliana. In order to do this, a phylogenetic analysis and molecular dating based on molecular data was performed, including Athenaea and Aureliana species, plus subtribe Withaninae representatives. The phylogeography of Aureliana fasiculata was also investigated. Five plastidial genomic regions (ndhF gene, trnL intron, and trnL-trnF, psaI-accD and trnC-ycf6 intergenic spacers) were employed to the phylogenetic analysis. The obtained result indicates that the diversification of Athenaea and Aureliana species from their common ancestor occurred circa 3.9 million years ago. Clades corresponding to each genus were not detected. The trnH-psbA and trnS-trnG plastidial spacers were employed to perform phylogeographic analysis of Aureliana fasciculata. Fourteen haplotypes were detected among 112 individuals. The species displayed signs of geographic structure and moderate isolation by distance. A putative barrier among North/South haplotypes, located south of the Doce River (Espírito Santo, Brazil), was also inferred. A populational expansion circa 50 – 60 thousand years ago was detected, which agrees with palinological information regarding forest area expansion at the same period at the Atlantic Rainforest. The historical events that shaped the present geographic pattern and domography are older than the Last Glacial Maximum, and they seem to be related to Pleistocene climatic events. At last, a microsatellite-enriched library was constructed and validated to Aureliana fasciculata. Seven pairs of polymorphic microsatellite primers were described, which displayed three alleles per locus, on average, and observed heterozygosity that ranged from 0.05 to 1.00. A broader sampling and the use of rapdly evolving molecular markers may provide more 8 complete information about the taxonomy and evolutive history of Athenaea and Aureliana genera.

As proteínas glicolíticas em plantas são codificadas por pequenas famílias multigênicas, que fornecem um interessante contraste às famílias multigênicas com um grande número de cópias estudadas até o momento. Os genes Adh codificam enzimas glicolíticas, conhecidas como álcool desidrogenase, as quais têm sido caracterizadas em várias famílias de plantas. Embora as seqüências de aminoácios das cadeias longas de ADH, que contêm zinco como cofator, sejam altamente conservadas, a função metabólica dessa enzima é variável. Além disso, elas têm diferentes padrões de expressão e estão submetidas a diferentes taxas não-sinônimas entre as diferentes cópias gênicas. É possível que as cópias de Adh tenham sido mantidas como conseqüência da substituição adaptativa de aminoácidos que conferiu uma mudança em sua função. Neste estudo, estendemos análises prévias dessa família gênica, utilizando técnicas de filogenia e modelagem molecular, com o objetivo de entender o processo de diversificação envolvido na evolução dessa família multigênica. As análises filogenéticas indicaram que têm havido eventos separados de duplicação dentro de angiospermas, ou seja, genes identificados como Adh1, Adh2 e Adh3 em diferentes grupos podem não ser homólogos. Nenhuma indicação de seleção positiva foi encontrada para a família gênica Adh em plantas. Entretanto, os coeficientes de divergência funcional ( ) estimados entre os grupos de genes Adh1 e Adh2 indicaram mudanças sítio-específicas, estatisticamente significativas, na taxa evolutiva entre os mesmos, bem como entre aqueles genes Adh de diferentes famílias botânicas, sugerindo que alterações nas restrições funcionais podem ter ocorrido em alguns resíduos de aminoácidos depois da especiação. Modelos teóricos da estrutura tridimensional da enzima álcool desidrogenase de 17 espécies de plantas foram construídos e validados estereoquimicamente. Os resíduos de aminoácidos importantes para a divergência funcional dessa enzima foram identificados na estrutura tridimensional da mesma. / The glycolytic proteins in plants are coded by small multigene families, which provide an interesting contrast to the high copy number gene families studied to date. The alcohol dehydrogenase (Adh) genes encode glycolytic enzymes that have been characterized in some plant families. Although the amino acid sequences of zinccontaining long-chain (LC) ADHs are highly conserved, the metabolic function of this enzyme is variable. Besides this, they have different patterns of expression and are submitted to differences in nonsynonymous substitution rates between gene copies. It is possible that the Adh copies have been retained as a consequence of adaptative amino acid replacement which has conferred a subtle change in function. We extend previous studies of this gene family, with the goal of using phylogenetic approach and molecular modeling tools to understand the process of diversification involved in the evolutionary process of this multigene family. The phylogenetic analysis indicate that there have been a number of separate duplication events within angiosperms, that is to say genes labeled Adh1, Adh2 and Adh3 in different groups may not be homologous. No indication of positive selection was encountered for the plant Adh gene family. However, the coefficients of functional divergence ( ) estimated between the Adh1 and Adh2 gene groups indicate statistically significant site-specific shift of evolutionary rate between them, as well as between those of different botanical families, suggesting that altered functional constraints may take place at some amino acid residues after speciation. Theoretical tridimensional models of seventeen plant alcohol dehydrogenase were constructed and verified to be stereochemically valid. The amino acids residues important for the functional divergence of this enzyme were identified in the ADH tridimensional structure.

As ribonucleases catalisam a clivagem do RNA e são componentes ubíquos das células, desde procariotos até eucariotos. A família T2 é a classe de RNases mais amplamente distribuída entre os organismos vivos. A ampla distribuição desta família sugere que ela deve ter um papel funcional muito importante na biologia celular destes organismos. Em Solanaceae, há basicamente dois grupos destas proteínas, um representado pelas S-RNases, as quais estão envolvidas com a rejeição do pólen na autoincompatibilidade gametofítica e um outro grupo mais diverso que é denominado de S-like RNases, com funções muito diversificadas. As S-RNases se apresentam na forma de um gene multialélico, altamente polimórfico, que está contido no lócus S. O lócus S é composto por uma combinação de proteínas SLF (S-locus F-box), responsáveis pela determinação do fator polínico, e uma S-RNase produzida apenas no pistilo, de forma que estes genes estão fortemente ligados formando o haplótipo S. Esses produtos gênicos interagem possibilitando a rejeição do auto-pólen num fenômeno denominado distinção colaborativa do pólen não próprio. No Capítulo II, foram utilizados métodos filogenéticos para determinar os principais agrupamentos de alelos na genealogia de S-RNases do gênero Solanum. A topologia da árvore não mostrou sinal filogenético para espécies, contudo, isso era esperado uma vez que a diversificação destes alelos ocorreu anteriormente à diversificação das espécies, gerando um fenômeno denominado de polimorfismos trans-específicos. Além disso, foram realizadas análises de seleção positiva, as quais encontraram um alto número de resíduos com altas probabilidades, indicando que estão sob pressão de seleção positiva darwiniana. Com o intuito de compreender a diversidade estrutural destes alelos, foram construídos modelos teóricos com base em modelagem por homologia dos principais clados da filogenia, já que estas sequências apresentam um elevado grau de polimorfismo. Os resultados mostraram grande variação estrutural na região hipervariável destas sequências, enquanto que regiões conservadas não apresentaram grandes mudanças estruturais e com estruturas secundárias características. No Capítulo III, foram realizadas diversas análises com o objetivo de compreender a diversificação estrutural e funcional de RNases T2 na família Solanaceae. As análises filogenéticas mostraram a formação de três principais grupos, sendo um de S-RNases, e os outros dois de S-like RNases. Com relação ao Clado 2, podemos inferir que houveram ao menos dois eventos de duplicação gênica. Além disso, também foram utilizados os métodos de NSsites e branch-site para inferência de seleção positiva como uma forma de identificar possíveis sinais de diversificação molecular. Muitos resíduos parecem estar sob seleção em ambos os métodos, embora um número maior fosse encontrado no NSsites (41), com estes resíduos localizando-se em regiões mais flexíveis da proteína, enquanto que os aqueles selecionados de acordo com o brach-site (8) estavam situados em posições mais rígidas da estrutura. Em súmula, os resultados encontrados nos capítulos que compreendem esta tese demonstram que análises teóricas podem contribuir efetivamente de inúmeras maneiras com o intuito de desenvolver uma melhor compreensão dos fenômenos biológicos relacionados com a evolução molecular de famílias multigênicas, além de também contribuir no entendimento dos processos de diversificação de genes multialélicos, utilizando como modelo de estudo a família gênica RNase T2. / The ribonucleases catalyze the cleavage of RNA and are ubiquitous components of cells, from prokaryotes to eukaryotes. The T2 family is the most widely category of RNases distributed among living organisms. The wide distribution of this family suggests that it should play an important functional role in cell biology of these organisms. Basically, there are two groups of these proteins in Solanaceae, one represented by SRNases, which are involved in the rejection of pollen in gametophytic self-incompatibility and a more diverse group, which is termed S-like RNases with very diverse functions. SRNases are a highly polymorphic and multiallelic gene contained in the S locus. The S locus consists of a combination of SLF proteins (F-box S-locus), responsible for the pollen factor, and one S-RNase expressed only in the pistil, and those genes are tightly linked as an S-haplotype. Products of these genes interact enabling the rejection of self-pollen in a phenomenon called collaborative non-self recognition. In Chapter II, we used phylogenetic methods to determine the main clusters of alleles in the genealogy of SRNase in the Solanum genus. The topology of the tree showed no phylogenetic sign to species delimitation, but it was expected since the diversification of these alleles occurred previously the diversification of the species, generating a phenomenon called trans-specific polymorphism. In addition, analyzes of positive selection were carried out, and it resulted in a significant number of residues with high probability, indicating they are under Darwinian positive selection. In order to understand the structural diversity of alleles, theoretical models were constructed based on homology modeling of the major clades found in the phylogeny, since it has a high degree of polymorphism in these sequences. The results showed that major structural variations are located in the hypervariable regions of these sequences, while conserved regions performed without major structural changes and showed stable secondary structures. In Chapter III, we used several analyzes to understand the structural and functional diversification of RNase T2 in the Solanaceae family. Phylogenetic analyses showed the clustering of three main groups, one with just SRNases and the two others composed by S-like RNases. Regarding to Clade 2, we could infer that at least two gene duplication events have occurred. In addition, we used two methods for inference of positive selection, NSsites and branch-site, as a mean to identify possible signals of molecular diversification. Many residues seem to be under selection in both methods, although a higher number was found in NSsites (41), and these residues were located in more flexible regions of the protein, while those selected according to the brach-site (8) were located at more rigid positions of the structure. In summary, the results found in the chapters of this thesis show that theoretical analyses could effectively contribute in many ways in order to develop a better understanding of biological phenomena related to the molecular evolution of gene families. Also, it contributes to the understanding of the processes related to multiallelic genes diversification, using gene family RNase T2 as a model.

O gênero Drosophila é composto, tradicionalmente, por 15 subgêneros e mais de 1.400 espécies, perfazendo, sozinho, quase metade das espécies da família Drosophilidae. Esta diversidade, entretanto, ao mesmo tempo que fornece inúmeras oportunidades de investigação acerca de padrões evolutivos, impõe uma série de desafios taxonômicos e filogenéticos. De modo geral, pode-se dizer que a sistemática do gênero Drosophila ainda permanece, na maior parte dos casos, bastante controversa e incompleta, apesar de sua importância na elucidação da história evolutiva de inúmeros processos biológicos já evidenciados e caracterizados para o grupo. Este quadro é, ainda, agravado pela certa escassez de estudos moleculares direcionados à resolução filogenética de seus representantes Neotropicais, pertencentes, principalmente, ao subgênero Drosophila. Visando suprir algumas destas deficiências, realizou-se, neste trabalho, a análise filogenética de parte da região codificante do gene nuclear Amd (alfa metil-dopa) para um total de 49 espécies, representantes, em sua maioria, das radiações immigrans-tripunctata e virilis-repleta do subgênero Drosophila. Trata-se, portanto, da primeira abordagem molecular para muitas das espécies consideradas. Entre os resultados obtidos, destaca-se a corroboração de uma série de hipóteses de parafilia dentro da família Drosophilidae, entre as quais a do próprio gênero e do subgênero Drosophila. Novos estudos são, entretanto, necessários para o estabelecimento de um panorama mais concreto da filogenia destas espécies e, caso alguns dos resultados aqui apresentados se confirmem, uma revisão taxonômica tornar-se-á, possivelmente, indispensável. / The Drosophila genus is traditionaly composed of 15 subgenus and more than 1.400 species, performing, alone, about half of the Drosophilidae family species. However, at the same time that this diversity provides numberless opportunities of investigation, concerning patterns of evolution for example, it imposes a set of taxonomic and phylogenetic challenges. Usually, we can say that the systematics of the Drosophila genus still remain fully controverse and incomplete, despite its importance on the elucidation of the evolutive history of numberless biological processes already known and characterized for the group. This picture is still worse given the scarcity of molecular studies seeking to resolve the phylogenetic relationships of the Neotropical members of the Drosophila subgenus. Aiming to supply some of these deficiencies we accomplished, in this work, the phylogenetic analysis of 513 base pairs of the codificant region of the Amd (alpha methildopa) nuclear gene, for a whole of 49 taxa, mainly of which, are representatives of immigrans-tripunctata and virilis-repleta radiations of the Drosophila subgenus. Hence, this is the first molecular approach for a lot of the species here considered. Among the obtained results, we emphasize the corroboration of a set of hypothesis concerning merophyly inside de Drosophilidae family, among which we point out the paraphyletic status presented by the Drosophila genus and subgenus. We also corroborated many of Throckmorton (1975) radiations, as is the case for the immigrans-Hirtodrosophila, tripunctata, virilis-repleta and repleta radiations. Nevertheless, new studies are necessary to definitively establish the Drosophila subgenus phylogeny, and if some of the results here presented will come to be confirmed, a taxonomic revision of Drosophilidae will, certainly, become indispensable.

O genoma das células eucarióticas é um dos principais alvos para danos induzidos por inúmeros fatores ambientes, sejam estes de origem biótica ou abiótica. Considerando a complexidade da molécula de DNA, não é supreendente que existam diferentes tipos de lesões com os mais variados graus de severidade. Dentre todas as lesões que podem ser induzidas no DNA, as pontes intercadeias (ICLs) estão entre as mais graves. Se não forem reparadas, a presença de apenas um ICL pode ser letal para a célula. Além disso, as lesões do tipo ICLs são quimicamente heterogêneas, podendo modificar a estrutura do DNA de forma permanente ou temporária. Os mecanismos relacionados à reparação de ICLs ainda são pouco conhecidos em eucariotos. Apesar de várias proteínas terem sido descritas como essenciais ao processo, não há um modelo único que explique esta reparação. Contudo, dentre as diferentes proteínas que participam na reparação de ICLs, destacam-se as nucleases Pso2/Snm1. A forma de atuação das proteínas Pso2/Snm1 não é conhecida, mas inúmeros dados obtidos com mutantes de Saccharomyces cerevisiae e, recentemente, com células de mamífero, mostram que a ausência de Pso2p/Snm1p bloqueia a restituição do DNA de alta massa molecular. Por outro lado, tem sido mostrado que o Pso2p/Snm1p provavelmente atua na manutenção da cromatina, mas de uma forma ainda não completamente esclarecida. Uma das proteínas pertencentes à família Pso2p/Snm1p, Ártemis, possui um papel importante no desenvolvimento do sistema imunológico adaptativo de metazoários e parece ser essencial para outros processos relacionados ao metabolismo de DNA eucariótico. Desta maneira, este trabalho teve como objetivo principal o estudo da família Pso2p/Snm1p por meio da análise filogenética e de seqüências, comparando-a com proteínas homólogas já descritas em outros organismos. Além disso, esta comparação XVII permitiu estabelecer uma correlação funcional entre as proteínas em termos de reparação de DNA e manutenção da cromatina eucariótica. As análises de filogenia e de seqüências claramente demonstraram que as proteínas Pso2/Snm1 podem ser agrupadas em quatro grupos principais ao invés de três, ao contrário do que se conhecia previamente. Três destes grupos, por sua vez, são formados por subgrupos específicos, que possivelmente atuam de forma diferenciada na reparação de DNA, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica. Por outro lado, os estudos das seqüências Pso2/Snm1, baseados principalmente na técnica de análises de agrupamentos hidrofóbicos (HCA), revelaram um alto grau de similaridade de estruturas primárias e secundárias entre os diferentes grupos, um indicativo da importância estrutural para a função destas proteínas no metabolismo de DNA. A técnica de HCA permitiu mapear regiões conservadas (CRs) em todas as seqüências estudadas, compondo o chamado domínio Pso2p/Snm1p. Em alguns casos, o domínio Pso2p/Snm1p encontra-se fusionado a outros domínios catalíticos. Neste caso, destaca-se o estudo de uma nova família de DNA ligases dependentes de ATP que são exclusivas de plantas. Esta nova família, denominada de Lig6p, parece ter funções importantes no metabolismo do DNA de plantas, sendo esta a primeira DNA ligase eucariótica com função nucleásica identificada. Usando os dados obtidos neste trabalho em conjunto com os resultados de outros autores, é sugerido um possível modo de atuação das proteínas Pso2p/Snm1p na reparação de danos do tipo ICL, na manutenção da cromatina e na geração de diversidade biológica.

LSD (Lesion Simulating Disease) é uma família de proteínas dedo de zinco descritas como importantes na resposta hipersensitiva (HR – hipersensitive response), limitando a área da lesão e a morte celular programada (PCD – programmed cell death), regulando negativamente as espécies reativas de oxigênio (ROS – reative oxygen species) geradas em condições de estresse biótico e abiótico. Até o presente momento, a maioria dos estudos incluindo genes LSD foi realizada em Arabidopsis thaliana, havendo poucos relatos em outros organismos. Além disto, a identificação completa dos genes LSD não foi ainda descrita, o que dificulta a reconstrução da história evolutiva desta família. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar sequências de genes LSD em diferentes genomas, realizar a análise filogenética dessa família e avaliar o perfil de expressão de genes GmLSD em diferentes órgãos de soja e sob condições de estresse. Nossos resultados permitiram a identificação de 117 possíveis genes LSD exclusivamente em Viridiplantae. Os organismos basais Volvox carteri e Chamydomonas reinhardtii apresentaram uma cópia de genes LSD. Além disso, a expansão do número de cópias gênicas parece ter ocorrido no clado Embriófita. As sequências identificadas foram analisadas quanto à presença do domínio dedo de zinco característico, sendo encontradas proteínas com uma, duas e três cópias de domínios LSD. Foi observada uma ampla conservação das três sequências de domínios LSD, indicando a manutenção destas ao longo da evolução da família. A análise filogenética mostrou que a arquitetura de proteínas com três domínios LSD representa a condição mais ancestral, sendo presente desde os organismos basais. As proteínas com dois domínios LSD foram identificadas somente no clado Embriófita e proteínas que possuem um domínio LSD foram altamente representadas no clado gramíneas. Os genes de monocotiledôneas e dicotiledôneas não formaram grupos separados, indicando que a expansão da família LSD foi anterior à diversificação entre esses clados. A análise de expressão dos genes GmLSD em diferentes órgãos de soja mostrou que estes tem expressão variável dependente do órgão. Foi avaliada a expressão dos genes GmLSD em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da ferrugem asiática da soja (ASR – Asian Soybean Rust). A abordagem de RNA-seq (no qual foi analisada somente a região da lesão) permitiu a identificação de GmLSD1, GmLSD3 e GmLSD4 nos genótipos suscetível (EMBRAPA48) e resistente (PI561356), enquanto que GmLSD6 e GmLSD8 foram detectados somente no genótipo resistente PI561356. Por outro lado, o experimento de RT-qPCR (em que foram analisadas folhas de soja infectadas por P. pachyrhizi) revelou que todos os genes GmLSD foram responsivos a inoculação do fungo, embora GmLSD1, GmLSD4 e GmLSD8 tenham sido modulados exclusivamente no genótipo resistente PI561356. A análise do perfil de expressão dos genes GmLSD em raízes e folhas de plantas de soja em condições de déficit hídrico mostrou que a maioria dos genes GmLSD foi modulada em resposta ao estresse. No entanto os genes GmLSD5 (folhas), GmLSD1 e GmLSD2 (raízes) foram diferencialmente expressos somente na cultivar tolerante EMBRAPA48. Esses resultados sugerem um possível envolvimento dos genes GmLSD na PCD causada por estresses bióticos e abióticos, assim como observado em Arabidopsis thaliana. Análises futuras com os genes GmLSD são particularmente interessantes para avaliar o potencial biotecnológico destes genes, sobretudo visando o desenvolvimento de plantas de soja mais tolerantes/resistentes à diferentes condições de estresse. / LSD (Lesion Simulating Disease) is a family of zinc finger proteins described as important in the hypersensitive response (HR), limiting the area of injury and the programmed cell death (PCD), negatively regulating the Reactive oxygen species (ROS) generated under biotic and abiotic stress conditions. To date, most studies including LSD genes were performed in Arabidopsis thaliana, with few reports in other organisms. Moreover, the complete identification of LSD genes has not yet been described, which difficult the reconstruction of the evolutionary history of this family. The goals of this study were to identify LSD gene sequences in different genomes, perform a phylogenetic analysis of this family and evaluate the expression profile of GmLSD genes in different soybean organs and under stress conditions. Our results allowed the identification of 117 putative LSD genes exclusively in Viridiplantae. Volvox carteri and Chamydomonas reinhardtii basal organisms showed one copy of LSD gene. Furthermore, the expansion of the number of genes copies seems to be occurred in Embryophyte clad. The identified sequences were analyzed for the presence of the characteristic zinc finger domain, being found proteins with one, two and three copies of LSD domains. We observed a wide conservation of the three sequences of LSD domains, indicating their maintenance throughout the evolution of the family. Phylogenetic analysis showed that the architecture of proteins with three LSD domains is the most ancestral condition, being present since the basal organisms. Proteins with two LSD domains have been identified only in Embryophyte clad and proteins having one LSD domain were highly represented in the Grass clad. The monocots and dicots genes not formed separate groups, indicating that the expansion of the LSD family was prior to diversification between these clades. The expression analysis of GmLSD genes in different soybean organs showed that these having an organ dependent variable expression. We evaluated the expression of GmLSD genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the Asian Soybean Rust (ASR) causal agent. The RNA-seq approach (wherein only the lesion site was analyzed) allowed the identification of GmLSD1, and GmLSD3 GmLSD4 in both susceptible (EMBRAPA48) and resistant (PI561356) genotypes, while GmLSD6 and GmLSD8 were detected only in PI561356 resistant genotype. Moreover, the RT-qPCR experiment (in which soybean leaves infected by P. pachyrhizi were analyzed) showed that all GmLSD were responsive to fungus inoculation, although GmLSD1, GmLSD4 and GmLSD8 were differentially expressed only in PI561356 resistant genotype. The analysis of GmLSD genes expression profile in roots and leaves of soybean plants under water deficit conditions showed that the majority GmLSD genes were modulated in response to stress. However, GmLSD5 (leaves), and GmLSD1 GmLSD2 (roots) genes were differentially expressed only in EMBRAPA48 tolerant cultivar. These results suggest a putative involvement of GmLSD genes in the PCD caused by biotic and abiotic stresses, as observed in Arabidopsis thaliana. Further analyzes with GmLSD genes are particularly interesting to evaluate the biotechnological potential of these genes, especially for the development of soybean plants more tolerant / resistant to various stress conditions.

O presente estudo foi realizado para investigar os padrões filogeográficos de sete espécies de canídeos sul-americanos. Um fragmento de 588pb da região controladora do DNA mitocondrial foi obtido para seis espécies do gênero Lycalopex, e usado para inferir as relações evolutivas entre estas espécies. A análise indicou L. vetulus como espécie basal, L. fulvipes como taxa monofilético, L. culpaeus e L. griseus como espécies muito próximas. Padrões intraespecificos da variação genética foram também abordados para o gênero Lycalopex e intensivamente investigados em Cerdocyon thous, neste através de um fragmento de 512pb da região controladora do DNA mitocondrial, três íntrons nucleares e dez loci de microssatélites. L. fulvipes, L. gymnocercus e Cerdocyon thous mostraram partição geográfica entre a distribuição de seus haplótipos, indicando que barreiras históricas influenciaram a variabilidade genética atual. Os processos que geraram estes padrões e causaram a especiação do gênero Lycalopex provavelmente ocorreram no Pleistoceno, determinados pelas modificações na distribuição da vegetação e pelas oscilações nos níveis do mar. Os três diferentes marcadores utilizados para a abordagem de Cerdocyon thous mostraram-se informativos e sua análise conjunta indicou que a maior parte do fluxo gênico é determinado pelos machos nesta espécie. Os marcadores nucleares inferiram alta variabilidade e ausência de isolamento entre as populações do cachorro-do-mato. / The present study was performed to investigate phylogeographic patterns of seven South American canid species. A 588bp fragment of mitochondrial DNA control region was obtained for the six species of Lycalopex genera, and used to infer evolutionary relationships between them. These analysis indicates L. vetulus as a basal species, L. fulvipes as a monophyletic taxa, and that L. culpaeus and L. griseus are closer species. Intraspecific patterns of genetic variation were also investigated for Lycalopex genera and were intensively investigated on Cerdocyon thous, in this latter by 512bp fragment of mitochondrial DNA control region, three nuclear introns and ten microsatellite loci. L. gymnocercus, L. fulvipes and Cerdocyon thous shown geographic partition between haplotype distributions, inferring that historical barriers had influenced the actual genetic variability. The processes that generate these patterns and caused the Lycalopex speciation probably took place on Pleistocene, caused by the modifications on vegetation distribution and variation on sea levels. Three different markers used for Cerdocyon thous approach were informative and their conjunct analysis indicates that gene flow can be male biased in this species. Nuclear markers inferred high variability and no geographic isolation between crab-eating fox populations.