Regulatory T cells (Treg) represent a crucial CD4 T cells subset involved in maintenance of immune-tolerance. Since their first description important efforts have been undertaken to better understand their biology, their development and their mechanisms of action. However, little is known about factors controlling Treg peripheral homeostasis. The aim of this thesis work was to better define mechanisms involved in governing Treg homeostasis and to investigate the eventual contribution of perturbation of Treg homeostasis in human disease. In the first part of this thesis work we tried to define in the murine system the role played by IL-7 in governing Treg homeostasis. We showed that Treg surface expression of CD127, the IL-7 receptor alpha chain, is finely regulated as it depends on their activation as well as on their tissue localization. More importantly, we demonstrated that Treg do express functional levels of CD127, identifying these cells as potential target of IL-7. Using both genetically modified murine models of altered IL-7 signaling and adoptive transfer models, we obtained definitive evidence for a direct role of IL-7 in governing Treg cell numbers. Finally, we demonstrated that IL-7 signaling in Treg optimizes their capacity to react to IL-2 an important cytokine regulating Treg homeostasis. In the second part of this work we investigated Treg homeostasis in the context of HIV infection. Employing for the first time in HIV infection a novel consensus Treg identification strategy and applying it to different groups of HIV infected patients, including primary infected patients and HIV controllers, we showed that HIV infection is characterized by an early and long lasting alteration of Treg homeostasis. In particular we demonstrated that effector rather than naive Treg are affected by HIV infection. Moreover, we showed that effector Treg numbers inversely correlated with HIV specific CD8 T cells responses, providing ex vivo evidence of Treg involvement in HIV immunity.

Mon travail de thèse a consisté à caractériser une sous-population de lymphocytes T régulateurs naturels de phénotype CD8+CD25+.<p>Nous avons purifié les CD8+CD25+ nTregs et vérifié par cytométrie de flux leur expression en FOXP3 et CTLA-4. Puis nous avons pu montrer que ces cellules possèdent des propriétés suppressives dans un test d’inhibition de la prolifération de lymphocytes T activés allogéniquement. Les lymphocytes CD8+CD25+ nTregs expriment les gènes FOXP3, CTLA-4, GARP et CCL-4 et les cytokines IL-10 et TGF-β. Par contre, les gènes CD28, ICOS, FOXO1 et Helios sont sous-exprimés dans les nTregs CD8+CD25+ par rapport aux lymphocytes T CD8+CD25-. <p>Nous avons établi une signature micro-ARN qui comprend 10 micro-ARNs différentiellement exprimés :7 micro-ARNs sous-exprimés "miR-9, -24, -31, -155, -210, -335 et -449 " et 3 micro-ARNs surexprimés " miR-214, -205 et -509". De plus, nous avons pu explorer la relevance biologique de cette signature micro-ARN en montrant dans un premier temps que les miRs "-31, -24, -210, -335" ciblent spécifiquement la région 3'UTR de FOXP3, de même les miR-9 et miR-155 ciblent la région 3'UTR de CTLA-4, et les miR-24, et -335 ciblent la région 3'UTR de GARP. Ceci a été fait par des expériences de co-transfections suivies d'une mesure de l'activité rapportrice luciférase. De plus, nous avons pu démontrer par des expériences de transduction lentivirale ex vivo, de cellules T primaires, que des micro-ARNs de la signature régulent l’expression de FOXP3, CTLA-4 et GARP dans les Tregs naturels CD8+CD25+ humains. <p>Cette étude montre l'importance des micro-ARNs dans la régulation post-transcriptionnelle des gènes impliqués dans la fonction régulatrice des lymphocytes T régulateurs.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Regulatory T cells (Tregs) are a subpopulation of T cells with immuno-suppressive properties. Tregs play a key role in immune response regulation and tolerance to antigens, thereby preventing autoimmunity, and may be partly responsible for the lack of an appropriate immune response against tumor cells. However, a human microRNA (miR) Treg signature has not been described yet. We investigated human natural Tregs and identified a signature composed of five microRNAs (-21, -31, -125a, -181c and -374). Among those, two were considerably under-expressed (miR-31 and miR-125a). We identified a functional target sequence for miR-31 in the 3’ untranslated region (3’ UTR) of FOXP3 mRNA. Using lentiviral transduction of fresh cord blood T cells, we demonstrated that miR-31 and miR-21 had opposite effects on FOXP3 expression. We showed that miR-31 negatively regulates FOXP3 expression by binding directly to its potential target site in the 3’ UTR of FOXP3 mRNA. We next demonstrated that miR-21 acted as a positive, though indirect, regulator of FOXP3 expression.<p>Recent reports have shown that histone deacetylase inhibitors increased FOXP3 expression in T cells. We therefore decided to investigate in non-Treg CD4-positive cells, the mechanisms by which an aspecific opening of the chromatin could lead to an increased FOXP3 expression. We focused on the binding of potentially activating transcription factors to the promoter region of FOXP3 and on modifications in the five miRs constituting the Treg signature. Valproate treatment induced binding of Ets-1 and Ets-2 transcription factors to the FOXP3 promoter and acted positively on its expression, by increasing the acetylation of histone H4 lysines. Valproate treatment also induced the acquisition of the miRs of Treg signature. To elucidate whether the changes in the miRs expression could be due to the increased FOXP3<p>expression, we transduced these non-Tregs with a FOXP3 lentiviral expression vector, and found no changes in miRs expression. Therefore, the modification in their miR expression profile is not due to an increased expression of FOXP3 but directly results from histone deacetylase inhibition. Rather, the increased FOXP3 expression results from the additive effects of Ets factors binding and the change in the expression level of miR-21 and miR-31. These data, by allowing a better understanding of the molecular phenomena underlying the number and function of Tregs, could open the door to novel therapeutic approaches in cancer immunotherapy and treatment of autoimmune disorders. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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La vaccination muqueuse est un moyen efficace de lutter contre les pathogènes qui utilisent les muqueuses comme porte d’entrée. Cependant, la vaccination muqueuse avec des antigènes non réplicatifs nécessite l’utilisation d’adjuvants. Les molécules de la famille de la toxine du choléra, l’entérotoxine thermolabile d’E.coli (LT), la toxine du choléra (CT) ainsi que le mutant LT-R192G et les sous-unités B non toxiques de ces toxines (LTB et CTB) ont été montrées augmenter les réponses immunitaires contre des antigènes coadministrés par voie muqueuse. Cependant leur mécanisme d’action est complexe et reste encore mal connu et des différences entre molécules entières et sous-unités B ont été rapportées ainsi que, pour une même molécule, des différences selon le modèle utilisé. Dans ce travail, nous avons étudié les effets de ces cinq molécules sur les réponses anticorps ainsi que sur les lymphocytes T CD4 dans un modèle murin d’immunisation intrarectale avec des pseudoparticules virales de rotavirus (VLP-2/6). Chez les souris non immunisées, nous avons montré que ces molécules, à l’exception de la CTB, diminuent in vitro les lymphocytes T régulateurs naturels CD4+CD25+Foxp3+, probablement par un mécanisme d’apoptose. Chez les souris immunisées, toutes les molécules étudiées induisent une même réponse anticorps sérique et fécale spécifique des VLP-2/6, qu’il s’agisse des molécules entières connues pour leur fort pouvoir adjuvant ou des sous-unités B qui, elles, ont été rapportées avoir un plus faible effet adjuvant voire un effet tolérogène dans certaines études. Concernant la réponse T CD4, les réponses spécifiques de l’antigène et de l’adjuvant ont été analysées. Des différences importantes ont été mises en évidence entre ces molécules. Notamment, seules les molécules entières (LT, LT-R192G et CT) induisent la production d’IL-2 et l’activation de lymphocytes T CD4+CD25+Foxp3- mémoires spécifiques de l’antigène tout en permettant la mise en place d’une régulation médiée par des lymphocytes T régulateurs CD4+CD25+Foxp3+ (boucle d’autorégulation), qui pourraient jouer un rôle majeur lors d’une réponse secondaire, afin d’éviter les réactions inflammatoires délétères. Malgré ces différences, toutes les molécules étudiées induisent la production d’IL-17, suggérant le rôle majeur de cette cytokine dans l’effet adjuvant.L’influence de la voie d’administration sur ces effets est en cours d’étude grâce à la comparaison avec la voie intranasale / Mucosal immunization is an important goal of vaccine development to protect against pathogens that use mucosa as portals of entry. However, the use of non-replicating antigens requires the addition of adjuvants.Cholera-like enterotoxins, cholera toxin (CT) from Vibrio cholerae and the heat-labile enterotoxin (LT) from toxinogenic strains of E. coli, as well as the mutant LR-192G and their B subunits (CTB and LTB) have been shown to increase immune responses against unrelated co-administered antigens by mucosal routes. However, their mechanism of action is very complex and not completely understood and differences exist between holotoxins and B subunits and within molecules, differences exist between the models used.In this work, we have studied the effects of these five molecules on antibody responses and on CD4+ T cell responses in a murine model of intrarectal immunization using rotavirus-like particles (2/6-VLP). In non-immunized mice, we have shown that all molecules, except CTB, decreased CD4+CD25+Foxp3+ natural regulatory T cells, probably by induction of apoptosis.In immunized mice, all molecules induced similar VLP-2/6 specific systemic and fecal antibody responses, teither he holotoxins, which are well known for their strong adjuvanticity or their B subunits with a less strong adjuvanticity but with also a tolerogenic effect in some studies.Regarding the CD4+ T cell response, antigen- and adjuvant- specific responses have been analysed. Important differences have been highlighted between the molecules. Among others things, only whole toxins (LT, LT-R192G and CT) trigger IL-2 production and activation of antigen specific memory CD4+CD25+Foxp3- T cells and at the same time antigen specific CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells are activated which may control the effector response (Feedback loop regulation) and avoid deleterious inflammation. In spite of these differences, all studied molecules triggered IL-17 production, suggesting the major role of this cytokine in adjuvanticity. We are currently comparing the intrarectal and intranasl routes in order to evaluate the role played by the route of immunisation in different effects of these molecules

A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) e a Deficiência Seletiva de Imunoglobulina A (DIgA) são as imunodeficiências primárias humorais de maior freqüência na população mundial. Ambas as doenças são caracterizadas pela ausência ou redução significativa de imunoglobulinas no soro. Embora diversas anormalidades imunológicas tenham sido associadas a estas doenças, nenhuma hipótese unificadora a respeito das bases moleculares das mesmas foi proposta até o presente momento, sendo que o único defeito comum a todos os pacientes é a falha na diferenciação de células B em plasmócitos e conseqüente secreção de anticorpos. Devido à alta incidência de auto-imunidade e alergia em pacientes com ICV e DIgA, no presente trabalho, visamos analisar por citometria de fluxo a população de linfócitos CD4+ com potencial regulador nesses pacientes, para avaliar se possíveis defeitos quantitativos ou funcionais nesta população reguladora poderiam explicar a alta incidência de doenças auto-imunes ou alérgicas associadas a estas imunodeficiências. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) and Selective Immunoglobulin A deficiency (IgAD) are the humoral primary immunodeficiencies with the highest incidence in the population. Both diseases are characterized by the absence or significant reduction of serum immunoglobulins. Although several immunological abnormalities have been associated with these diseases, no unifying hypothesis regarding the molecular basis of CVID and IgAD have been proposed to date, and the only defect common to all patients is the failure in differentiation of B cells into plasma cells and consequent secretion of antibodies. Due to the high incidence of autoimmunity and allergy in patients with CVID and IgAD, in the present work we analyzed by flow cytometry the population of CD4+ lymphocytes with regulatory potential in these patients to assess whether possible quantitative or functional defects in this regulatory population could explain the high incidence of autoimmune diseases or allergic reactions associated with these immunodeficiencies.

A Imunodeficiência Comum Variável (ICV) e a Deficiência Seletiva de Imunoglobulina A (DIgA) são as imunodeficiências primárias humorais de maior freqüência na população mundial. Ambas as doenças são caracterizadas pela ausência ou redução significativa de imunoglobulinas no soro. Embora diversas anormalidades imunológicas tenham sido associadas a estas doenças, nenhuma hipótese unificadora a respeito das bases moleculares das mesmas foi proposta até o presente momento, sendo que o único defeito comum a todos os pacientes é a falha na diferenciação de células B em plasmócitos e conseqüente secreção de anticorpos. Devido à alta incidência de auto-imunidade e alergia em pacientes com ICV e DIgA, no presente trabalho, visamos analisar por citometria de fluxo a população de linfócitos CD4+ com potencial regulador nesses pacientes, para avaliar se possíveis defeitos quantitativos ou funcionais nesta população reguladora poderiam explicar a alta incidência de doenças auto-imunes ou alérgicas associadas a estas imunodeficiências. / Common Variable Immunodeficiency (CVID) and Selective Immunoglobulin A deficiency (IgAD) are the humoral primary immunodeficiencies with the highest incidence in the population. Both diseases are characterized by the absence or significant reduction of serum immunoglobulins. Although several immunological abnormalities have been associated with these diseases, no unifying hypothesis regarding the molecular basis of CVID and IgAD have been proposed to date, and the only defect common to all patients is the failure in differentiation of B cells into plasma cells and consequent secretion of antibodies. Due to the high incidence of autoimmunity and allergy in patients with CVID and IgAD, in the present work we analyzed by flow cytometry the population of CD4+ lymphocytes with regulatory potential in these patients to assess whether possible quantitative or functional defects in this regulatory population could explain the high incidence of autoimmune diseases or allergic reactions associated with these immunodeficiencies.

L'échappement des cellules tumorales au processus d'immunosurveillance semble être une condition nécessaire au développement tumoral dans les modèles précliniques, comme chez l'homme. Les mécanismes par lesquels la tumeur parvient à médier une immunosubvertion sont multiples et font intervenir la plupart des cellules du système immunitaire, au sein desquelles, les cellules immunorégulatrices telles les cellules myéloides suppressives (MDSCs) ou les lymphocytes T régulateurs (Tregs, exprimant le facteur de transcription Foxp3), semblent jouer un rôle prépondérant. Les résultats présentés dans ce travail visent à mieux comprendre les rôles fonctionnels et pronostics des cellules myéloïdes suppressives et des Tregs dans le cancer, avec une attention plus particulière sur la façon dont ces cellules peuvent être modulées par la chimiothérapie. Concernant les MDSCs, nos travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes moléculaires présidant à leur accumulation d'une part, et d'autre part à l'acquisition de leur propriétés immunosuppressives, à travers une voie de signalisation impliquant les exosomes d'origine tumorale. Cette découverte, et la propriété d'une molécule d'usage thérapeutique courant, l'amiloride, de diminuer la production d'exosomes, y compris par les cellules tumorales, offrent une nouvelle possibilité de ciblage pharmacologique des MDSCs. Par ailleurs, l'étude des effets cytotoxiques sur les MDSCs de plusieurs molécules de chimiothérapie nous a permis de montrer que le 5-fluorouracile, probablement en raison d'un faible niveau d'expression de sa cible, la thymidilate synthase, dans les MDSCs, possédait une capacité sélective à éliminer ces cellules. Nos travaux d'immunohistochimie conduits sur des prélèvements tumoraux issus de patientes porteuses de cancers du sein localisés traitées par chimiothérapie néoadjuvante ont quand à eux permis de démontrer que la chimiothérapie néoadjuvante s'accompagne de modifications qualitatives de l'infiltration tumorale à la fois en lymphocytes T CD8+ et en lymphocytes T régulateurs Foxp3+. L'existence, après chimiothérapie néoadjuvante, d'une balance favorable de la réponse immunitaire, associant forte infiltration en CD8+ et faible infiltration en Foxp3+ s'accompagne d'une augmentation significative des marqueurs de cytotoxicité à médiation cellulaire, et est significativement corrélée à une éradication complète des cellules tumorales. Cette signature immunologique favorable se traduit également à long terme par une meilleure survie sans récidive et une meilleure survie globale, indépendamment du type de chimiothérapie reçue, de l'obtention ou non d'une réponse complète histologique, et du sous type moléculaire de cancer du sein. La combinaison de cette information immunologique avec la connaissance de la taille du résidu tumoral après traitement permet de considérablement affiner le pronostic des patientes. Enfin, nos travaux préliminaires semblent montrer que l'expression de Foxp3 dans les cellules cancéreuses de tumeurs du sein HER2+++ constitue un facteur de bon pronostic. Ces résultats illustrent donc l'importance non pas seulement des caractéristiques tumorales, mais aussi des caractéristiques de l'hôte, en particulier de la réponse immunitaire qu'il est capable de susciter, et de l'influence de la chimiothérapie sur cette dernière.

Diss. (sammanfattning) Umeå : Umeå universitet, 2010.

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