Approximately 15% of human cancers utilize a recombination-based mechanism termed Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) to maintain the lengths of their telomeres. The Fanconi anaemia protein FANCJ localizes to telomeric foci in human ALT cells, but not in telomerase-positive or primary cells. Telomere-associated FANCJ frequently localizes with FANCD2 and BRCA1, and primarily localizes to ALT-associated PML nuclear bodies. Depletion of FANCJ in human ALT cells causes the loss of BRCA1 at telomeric foci and a decrease in telomeric repeat DNA content primarily as a result of the loss of the brightest telomeric repeat DNA foci. In contrast, depletion of the FANCD2 results in increased telomeric repeat DNA synthesis and this is suppressed upon the codepletion of FANCJ. Together, data from this study suggest that FANCJ is required for telomeric repeat DNA synthesis in human ALT cells, which may or may not be dependent on BRCA1, and FANCD2 restrains this synthesis.

Approximately 15% of human cancers utilize a recombination-based mechanism termed Alternative Lengthening of Telomeres (ALT) to maintain the lengths of their telomeres. The Fanconi anaemia protein FANCJ localizes to telomeric foci in human ALT cells, but not in telomerase-positive or primary cells. Telomere-associated FANCJ frequently localizes with FANCD2 and BRCA1, and primarily localizes to ALT-associated PML nuclear bodies. Depletion of FANCJ in human ALT cells causes the loss of BRCA1 at telomeric foci and a decrease in telomeric repeat DNA content primarily as a result of the loss of the brightest telomeric repeat DNA foci. In contrast, depletion of the FANCD2 results in increased telomeric repeat DNA synthesis and this is suppressed upon the codepletion of FANCJ. Together, data from this study suggest that FANCJ is required for telomeric repeat DNA synthesis in human ALT cells, which may or may not be dependent on BRCA1, and FANCD2 restrains this synthesis.

La anemia de Fanconi (FA) es un desorden genético de naturaleza autosómica recesiva y caracterizado por una serie de malformaciones congénitas, fallo de médula ósea y una elevada predisposición a adquirir tumores sólidos y leucemia mieloide aguda. Las células FA, poseen una elevada inestabilidad cromosómica tanto espontánea como inducida por agents inductors de enlaces cruzados. Otros rasgos celulares son la sensibilidad frente al daño oxidativo, fallos en el ciclo cellular, niveles elevados de apoptosis regulación deficiente de la transcripción y disfunción telomérica. Hasta el momento, se ha descrito que existen 12 genes diferentes que pueden causar esta enfermedad, aunque no todos ellos han sido clonados y caracterizados. De entre ellos, FANCA es el que más frecuentemente se halla mutado entre la población y presenta un amplio espectro de mutaciones, siendo las grandes deleciones una de las principales.Un conocimiento más profundo de la biología de esta enfermedad nos va a permitir adquirir una visión más global de la reparación del daño en el DNA en respuesta a determinados agentes así como un mejor entendimiento de las interacciones moleculares que se establecen entre distintos síndromes genéticos y que tienen un indiscutible valor diagnóstico y terapéutico.En este trabajo de tesis se han planteado cuatro objetivos principales y generales, que son:- Establecer potenciales relaciones entre las características hematológicas de la enfermedad y algunas características celulares tales como el acortamiento telomérico y las anomalías cromosómicas numéricas o estructurales.- Caracterizar genéticamente a la población afectada por la anemia de Fanconi española.- Explorar el papel de la ruta FA en la biología y el mantenimiento telomérico.- Estudiar la biología molecular de la ruta FA en respuesta al daño genómico.Con los estudios llevados a cabo, se ha observado un acortamiento telomérico acelerado en los pacientes Fanconi acompañado de un incremento en el número de fragmentos extrateloméricos y fusiones, aunque este exceso de fusiones terminales ocurre de manera independiente a la presencia de TRF2 en el telómero. Además, este acortamiento no está directamente relacionado con la severidad de la enfermedad a nivel hematológico. Si que se relaciona, sin embargo con la enfermedad hematológica la frecuencia espontánea de roturas cromosómicas.Por otra parte, se ha estudiado y caracterizado exhaustivamente la población Fanconi española, haciendo especial énfasis en los portadores de mutaciones en el gen FANCA y en la población de etnia gitana, poseedores de la mayor frecuencia de portadores de mutaciones en FANCA a nivel mundial.Un dato importante extraído de estos estudios es la participación de la histona H2AX dentro de la ruta Fanconi en respuesta a la irradiación con UV-C. / Fanconi anemia (FA) is an autosomic recessive genetic disorder characterized by a subset of congenital malformations, bone marrow failure and a high predisposition to solid tumours and acute myeloid leukaemia acquisition. FA cells harbour a high spontaneous and induced by interstrand crosslinking agents chromosomic instability. Some other cellular features are the sensibility in front of oxidative damage, cell cycle failure, increased levels of apoptosis, impaired transcription regulation and telomeric dysfunction.Up to date, there have been described 12 genes that cause this disease though not all of them have been cloned and characterized so far. Among them, FANCA is the most prevalent gene in the affected population and it can be affected by a wide spectrum of mutations, being large deletions one of the most common. Acquire a sight about the biology of this illness will allow us having a wider view about/on DNA damage repair in response to some agents. At the same time, we can have a better knowledge about the molecular interactions established among different genetic syndromes with an indisputable diagnostic and therapeutic value. Within the present thesis four main objectives have been raised:- Establishment of potential relationship between the haematological disease and telomere shortening, and numerical or structural chromosomal abnormalities - Genetic characterization of Fanconi anemia Spanish population- Explore the role of the FA pathway on telomeric biology and maintenance- Study the molecular biology of the FA pathway in response to genomic damage As a conclusion of these studies, an accelerated telomeric shortening together with and increased number of extratelomeric fragments and end-to-end fusions has been observed in the FA patients compared to age-matched controls. The excess of terminal fusions is not related with an impaired role of TRF2. This telomeric shortening is not related with the hematologic disease observed in these patients.However, the spontaneous frequency of chromosomal breaks seems to correlate with the haematological severity.Spanish FA population has been extensively studied and characterized, especially those belonging to FA-A complementation group and the gypsy population, which has come out to be the group with the highest frequency of FANCA mutated carriers worldwide.An important point unraveled from our studies is the role of histone H2AX in the FA pathway in response to UV-C irradiation.

Würzburg, Univ., Diss., 2002.

The inherited bone marrow failure syndrome Fanconi Anaemia (FA) is caused by mutations in any one of the multiple FANC genes, which encode proteins that collaborate in the FA/BRCA DNA damage response pathway. FA is characterised by extreme predisposition to acute myeloid leukaemia (AML). AML in FA is associated with typical chromosomal aberrations involving gains of the long arm of chromosome 3 (3q gains). These are linked to overexpression of the oncogene ecotropic viral integration site 1 (EVI1). Based on this clinical observation, the hypothesis that EVI1 confers leukaemic transformation, in particular in the context of FA, was tested. Mouse embryonic stem cells with either functional or disrupted FA/BRCA-pathway were used to model normal and FA-associated embryonic haematopoiesis, and the effect of EVI1 overexpression was assessed in this model. EVI1 functions were also investigated with respect to protein interactions, focusing on the interaction with the co-repressor C-terminal binding protein 1 (CtBP1), in the context of genotoxic stress. To study this, in vitro haematopoietic differentiation assays, flow cytometry, mass spectrometry, immunoprecipitations and immunofluorescence were employed. In vitro haematopoietic differentiation using mouse embryonic stem cells with defective Fanca was successfully developed and applied. The analysis revealed that EVI1 overexpression in haemangioblast-like cells prevented the generation of haematopoietic precursors through endothelial to haematopoietic transition. Studies into EVI1 protein interaction dynamics showed that DNA damage-induced phosphorylation of EVI1 modifies interaction with the co-repressor CtBP1. This interaction was demonstrated to be partially required for the EVI1-induced block of the development of haematopoietic precursors using the mESC-based model. An EVI1-mediated modulation of the FA phenotype characteristic G2-arrest and of the FA-associated embryonic haematopoiesis was not demonstrated. This study contributes to the understanding of the function of the EVI1 oncogene in normal and FA-associated haematopoiesis and the DNA damage response. FA-associated haematopoiesis and leukaemogenesis can be further studied using the embryonic haematopoiesis model developed here, and further studies can build on the data generated with respect to EVI1.

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AguilarRodriguez_DavidEnrique_D.pdf: 4668835 bytes, checksum: 3c1abf6e2f254877f29ff8772ac563fc (MD5) Previous issue date: 2003 / Doutorado

Fanconi-Anämie (FA) ist, mit Ausnahme von Mutationen in FANCR/RAD51, eine autosomal-rezessive oder X-chromosomal vererbte Krankheit, die sich durch eine ausgesprochene klinische als auch genetische Heterogenität auszeichnet. Neben einem fortschreitenden Knochenmarksversagen zählen zu den typischen Merkmalen eine Vielzahl an angeborenen Fehlbildungen, wie beispielsweise Radialstrahlanomalien, Minderwuchs oder Pigmentierungsstörungen. Zudem besteht für FA-Patienten ein überdurchschnittlich hohes Risiko bereits in jungen Jahren an akuter myeloischer Leukämie oder soliden Tumoren zu erkranken. Bislang konnten in 21 FA-Genen (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U oder -V) krankheitsverursachende Mutationen identifiziert werden, deren Proteinprodukte maßgeblich an der Aufrechterhaltung der Genomstabilität beteiligt sind und Komponenten des FA/BRCA-DNA-Reparaturweges darstellen. In der klassischen FA-Mutationsanalyse kommen meist Sanger-Sequenzierungen sowie MLPA- und Immunblot-Analysen zum Einsatz. Da im Wesentlichen keine Genotyp-Phänotyp-Korrelation besteht, gestaltet sich, gerade bei seltenen FA-Komplementationsgruppen, der Nachweis von krankheitsverursachenden Mutationen oftmals sehr zeit- und kostenintensiv. Während der letzten Jahre wurden verschiedene Strategien zur Anreicherung und Sequenzierung entwickelt, welche die parallele Sequenzanalyse einzelner ausgewählter Gene, ganzer Exome oder sogar des gesamten Genoms und somit eine kosten- und zeiteffiziente Mutationsanalyse ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Anreicherungsmethoden mit anschließender Hochdurchsatzsequenzierung auf ihre Anwendbarkeit in der molekulargenetischen FA-Diagnostik getestet, um klassische Mutationsanalyse-Methoden zu ergänzen oder möglicherweise sogar ganz ersetzen zu können. Der erste Teil der Arbeit befasste sich mit der Etablierung eines FA-spezifischen Genpanels zur Genotypisierung von FA-Patienten. Nachdem die Methode zunächst anhand von FA-Patienten mit bekannten Mutationen optimiert werden musste, erwies sie sich als effizienter Ansatz zum Nachweis krankheitsverursachender Mutationen bei FA-Patienten unbekannter Komplementationsgruppe. Durch die FA-Panelanalyse konnten 37 von 47 unklassifizierten Patienten einer FA-Komplementationsgruppe zugeordnet werden, indem deren kausalen Mutationen bestimmt wurden. In einem weiteren Ansatz sollte die Anwendbarkeit eines kommerziellen Anreicherungspanels zur FA-Diagnostik untersucht werden. Auch hier konnte ein Großteil der krankheitsverursachenden Mutationen von fünf bekannten wie auch 13 nicht zugeordneten FA-Patienten detektiert und somit eine molekulargenetische Diagnose bei neun weiteren, zuvor unklassifizierten FA-Patienten, gestellt werden. Ferner wurden sechs ausgewählte Patienten, zusätzlich zur Panelanreicherung, per Exomanalyse untersucht. Zum einen konnten Mutationen in bekannten FA-Genen bestätigt oder neu identifiziert werden. Zum anderen wurden auch potentiell pathogene Mutationen in DNA-Reparaturgenen außerhalb des FA/BRCA-Signalweges bei zwei Patienten mit unbestätigter Verdachtsdiagnose FA verifiziert. So wurde bei mehreren Mitgliedern einer Familie mit unterschiedlichen Tumorerkrankungen eine zuvor unbeschriebene homozygote Nonsense-Mutation in der BER-Glykosylase NTHL1 nachgewiesen, für welche bislang erst zwei pathogene Mutationen als Auslöser eines neuen Krebssyndroms bekannt sind. Bei einem weiteren Patienten wurden compound-heterozygote Mutationen in RPA1 detektiert, ein Gen für das bislang noch kein Krankheitsbild bekannt ist. Mit Hilfe der drei verschiedenen Anreicherungsstrategien konnten insgesamt 47 von 60 unklassifizierten FA-Patienten 13 verschiedenen Komplementationsgruppen eindeutig zugeordnet werden. Es zeigte sich dabei ein breites Spektrum an neuen, bislang unbeschriebenen FA-Mutationen. Den größten Anteil an der Gesamtzahl der nachgewiesenen Mutationen hatten Spleißmutationen, die auf eine Auswirkung auf das kanonische Spleißmuster untersucht wurden, um einen pathogenen Effekt nachweisen zu können. Weiterhin schloss die Arbeit die Charakterisierung einzelner FA-Patienten bzw. Komplementationsgruppen mit ein. Dazu zählen die seltenen Untergruppen FA-T und FA-Q, für die jeweils ein neuer Patient identifiziert werden konnte. Durch die funktionelle Charakterisierung der dritten jemals beschriebenen FA-Q-Patientin konnten Einblicke in das Zusammenspiel der Reparatur von DNA-Quervernetzungen und der Nukleotidexzisionsreparatur gewonnen und die phänotypische Variabilität von FA durch die subjektive als auch zelluläre UV-Sensitivität der Patientin ergänzt werden. Darüber hinaus konnte das Mutationsspektrum in FA-I sowie FA-D2 erweitert werden. Eine genauere Untersuchung der Pseudogenregionen von FANCD2 ermöglichte dabei die gezielte Mutationsanalyse des Gens. Insgesamt konnten die Ergebnisse dieser Arbeit dazu beitragen, das Mutationsspektrum in FA zu erweitern und durch die Identifizierung und Charakterisierung einzelner Patienten neue Einblicke in verschiedene Komponenten des FA/BRCA-Signalweges zu erhalten. Es zeigte sich, dass neue DNA-Sequenzierungsstrategien in der FA-Diagnostik eingesetzt werden können, um eine effiziente Mutationsanalyse zu gewährleisten und klassische Methoden in Teilbereichen zu ersetzen. / Fanconi anemia (FA) is, with the exception of mutations in FANCR/RAD51, an autosomal recessive or X-linked inherited disease that is characterized by a remarkable clinical and genetic heterogeneity. In addition to progressive bone marrow failure, typical features include a multitude of developmental malformations, such as radial ray anomalies, growth retardation or cutaneous pigment displacement. Additionally, FA patients have a higher risk for developing acute myelogenous leukemia or solid tumors early in life. To date, pathogenic mutations have been identified in 21 FA genes (FANCA, -B, -C, - D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U or -V) whose protein products are responsible for maintaining genomic integrity and constitute components of the FA/BRCA DNA repair pathway. Typical methods for FA mutation analysis comprise Sanger sequencing as well as MLPA and immunoblot analyses. As no definite genotype-phenotype correlation exists, pathogenic mutation detection in rare subgroups is often quite time-consuming and cost-intensive. Within the last few years, distinct strategies for both enrichment and sequencing of a subset of genes, whole exomes or even the whole genome have been developed that facilitate a cost-effective and time-saving mutation analysis. In the present work different target-enrichment strategies followed by high-throughput sequencing were tested for their applicability in molecular genetic diagnostics of FA in order to complement or even replace classic strategies for mutation analysis. The first part of this work addressed the establishment of an FA-specific gene panel for genotyping FA patients. After optimizing this method by means of FA patients with known mutations, this proved to be an efficient approach for detecting pathogenic mutations in FA patients of unknown complementation groups. Due to FA gene panel analysis, 37 of 47 unclassified FA patients were assigned to a complementation group based on the identification of their causative mutations. In another approach, a commercial enrichment panel was tested for its application in FA diagnostics. Again, most pathogenic mutations of five classified and 13 unclassified FA patients were detected, enabling a molecular diagnosis for nine previously unclassified FA patients. Moreover, six selected patients were studied by exome analysis in addition to panel enrichment. This allowed for mutations in known FA complementation groups to be confirmed or newly identified. Additionally, potentially pathogenic variants in DNA-repair genes outside the FA/BRCA pathway were verified in two patients with an unconfirmed suspected diagnosis of FA. One previously undescribed homozygous nonsense mutation in the BER glycosylase NTHL1 was detected in several members of one family with various tumors. For this gene, only two distinct pathogenic mutations were previously described to cause a novel cancer syndrome. In another patient, compound heterozygous mutations in RPA1 were detected, a gene for which no disease pattern is yet known. By means of the three different enrichment strategies a total of 47 of 60 unclassified FA patients were definitely assigned to 13 diverse complementation groups. In this context, a broad spectrum of previously undescribed mutations was identified. The majority of all verified mutations were splice mutations that were examined for an effect on the canonical splicing pattern in order to verify a pathogenic effect. Additionally, this work also included the characterization of individual FA patients and complementation groups, respectively. These include the rare subgroups FA-T and FA-Q, for each of which one new patient was identified. Functional characterization of the third ever described FA-Q patient allowed new insights into the interplay of DNA interstrand-crosslink and nucleotide excision repair and broadened the spectrum of phenotypic variability of FA by the subjective and cellular UV sensitivity of this patient. Furthermore, the mutation spectrum in both FA-I and FA-D2 was expanded. Here, a closer investigation of the pseudogene regions of FANCD2 facilitated a precise mutation screening of the gene. Overall, the results of this work broadened the mutation spectrum of FA and allowed new insights into diverse components of the FA/BRCA pathway by identifying and characterizing individual patients. It became apparent that novel strategies for DNA sequencing can be applied in FA diagnostics to ensure an efficient mutation analysis, as well as to replace some parts of classical approaches.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / The Fanconi anemia (FA) pathway consists of 21 genes that maintain genomic stability and prevent cancer. Biallelic mutations within this network cause Fanconi anemia, an inherited bone marrow failure and cancer predisposition syndrome. Heterozygous inborn mutations in FA genes increase risk of breast/ovarian cancers, and somatic mutations occur in malignancies in non-Fanconi patients. Understanding the tumor suppressive functions of FA signaling is important for the study of Fanconi anemia, inherited cancers, and sporadic cancers. The FA network functions as a genome guardian throughout the cell cycle. In addition to the well-established roles of FA proteins in interphase DNA replication/repair, the FA pathway controls mitosis by regulating the spindle assembly checkpoint (SAC) to ensure proper chromosome segregation. The SAC consists of several tumor suppressors, including Mad2, and SAC impairment predisposes to aneuploidy and cancer. However, the in vivo contribution of SAC dysfunction to malignant transformation of FA-deficient cells remains unknown. Furthermore, the mechanisms by which FA proteins regulate the SAC are unclear. To test whether SAC dysfunction drives genomic instability and tumorigenesis in FA, we generated a novel FA-SAC model by intercrossing Fancc-/- and Mad2+/- mice. The intercrossed mice displayed heightened aneuploidy secondary to exacerbated SAC dysfunction. Importantly, these mice were prone to developing hematologic malignancies, particularly leukemia, faithfully recapitulating the clinical phenotype of Fanconi anemia. Upon establishing SAC dysfunction as a driver of tumorigenesis in FA, we next explored the mechanism by which FANCC regulates the SAC. We demonstrated that the mitotic kinase CDK1 phosphorylates FANCC to regulate subcellular localization and SAC function of FANCC during mitosis. Our study highlights the essential role of compromised chromosome segregation in the development of leukemia due to impaired FA signaling. This work furthers our knowledge of FANCC signaling at the SAC, and has implications for future use of mitotic-centered therapies for FA-associated tumors. / 2 years

Die Fanconi-Anämie (FA) ist eine seltene, heterogene Erbkrankheit. Sie weist ein sehr variables klinisches Erscheinungsbild auf, das sich aus angeborenen Fehlbildungen, hämatologischen Funktionsstörungen, einem erhöhten Risiko für Tumorentwicklung und endokrinen Pathologien zusammensetzt. Die Erkrankung zählt zu den genomischen Instabilitätssyndromen, welche durch eine fehlerhafte DNA-Schadensreparatur gekennzeichnet sind. Bei der FA zeigt sich dies vor allem in einer charakteristischen Hypersensitivität gegenüber DNA-quervernetzenden Substanzen (z. B. Mitomycin C, Cisplatin). Der zelluläre FA-Phänotyp zeichnet sich durch eine erhöhte Chromosomenbrüchigkeit und einen Zellzyklusarrest in der G2-Phase aus. Diese Charakteristika sind bereits spontan vorhanden und werden durch Induktion mit DNA-quervernetzenden Substanzen verstärkt. Der Gendefekt ist dabei in einem der 22 bekannten FA-Gene (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) oder in noch unbekannten FA-Genen zu finden. Die FA-Gendefekte werden mit Ausnahme von FANCR (dominant-negative de novo Mutationen) und FANCB (X-chromosomal) autosomal rezessiv vererbt. Die FA-Genprodukte bilden zusammen mit weiteren Proteinen den FA/BRCA-Signalweg. Das Schlüsselereignis dieses Signalwegs stellt die Monoubiquitinierung von FANCD2 und FANCI (ID2-Komplex) dar. Ausgehend davon lässt sich zwischen upstream- und downstream-gelegenen FA-Proteinen unterscheiden. Letztere sind direkt an der DNA-Schadensreparatur beteiligt. Zu den upstream-gelegenen Proteinen zählt der FA-Kernkomplex, der sich aus bekannten FA-Proteinen und aus FA-assoziierten-Proteinen (FAAPs) zusammensetzt und für die Monoubiquitinierung des ID2-Komplexes verantwortlich ist. Für FAAPs wurden bisher keine pathogenen humanen Mutationen beschrieben. Zu diesen Proteinen gehört auch FAAP100, das mit FANCB und FANCL innerhalb des FA-Kernkomplexes den Subkomplex LBP100 bildet. Durch die vorliegende Arbeit wurde eine nähere Charakterisierung dieses Proteins erreicht. In einer Amnion-Zelllinie konnte eine homozygote Missense-Mutation identifiziert werden. Der Fetus zeigte einen typischen FA-Phänotyp und auch seine Zellen wiesen charakteristische FA-Merkmale auf. Der zelluläre Phänotyp ließ sich durch FAAP100WT komplementieren, sodass die Pathogenität der Mutation bewiesen war. Unterstützend dazu wurden mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems weitere FAAP100-defiziente Zelllinien generiert. Diese zeigten ebenfalls einen typischen FA-Phänotyp, welcher sich durch FAAP100WT komplementieren ließ. Die in vitro-Modelle dienten als Grundlage dafür, die Funktion des FA-Kernkomplexes im Allgemeinen und die des Subkomplexes LBP100 im Besonderen besser zu verstehen. Dabei kann nur durch intaktes FAAP100 das LBP100-Modul gebildet und dieses an die DNA-Schadensstelle transportiert werden. Dort leistet FAAP100 einen essentiellen Beitrag für den FANCD2-Monoubiquitinierungsprozess und somit für die Aktivierung der FA-abhängigen DNA-Schadensreparatur. Um die Funktion von FAAP100 auch in vivo zu untersuchen, wurde ein Faap100-/--Mausmodell generiert, das einen mit anderen FA-Mausmodellen vergleichbaren, relativ schweren FA-Phänotyp aufwies. Aufgrund der Ergebnisse lässt sich FAAP100 als neues FA-Gen klassifizieren. Zudem wurde die Rolle des Subkomplexes LBP100 innerhalb des FA-Kernkomplexes weiter aufgeklärt. Beides trägt zu einem besseren Verständnis des FA/BRCA-Signalweges bei. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Charakterisierung von FAAP100138, einer bisher nicht validierten Isoform von FAAP100. Durch dieses Protein konnte der zelluläre FA-Phänotyp von FAAP100-defizienten Zelllinien nicht komplementiert werden, jedoch wurden Hinweise auf einen dominant-negativen Effekt von FAAP100138 auf den FA/BRCA-Signalweg gefunden. Dies könnte zu der Erklärung beitragen, warum und wie der Signalweg, beispielsweise in bestimmtem Gewebearten, herunterreguliert wird. Zudem wäre eine Verwendung in der Krebstherapie denkbar. / Fanconi Anemia (FA) is a rare heterogeneous hereditary disease. It shows a highly variable clinical presentation including congenital malformations, bone marrow failure and increased risk for cancer and endocrine pathologies. The disease is classified as one of the genomic instability disorders that are characterized by failure of DNA damage repair processes. FA shows a typical hypersensitivity toward DNA crosslinking agents (e.g. Mitomycin C, cisplatin). There is an increased rate of chromosomal breakage and cell cycle arrest in the G2 phase. These characteristics are present spontaneously and after incubation with DNA crosslinking agents. The genetic defect can be found in one of the 22 reported FA genes (FANCA, -B, -C, -D1, -D2, -E, -F, -G, -I, -J, -L, -M, -N, -O, -P, -Q, -R, -S, -T, -U, -V, -W) or yet unknown FA genes. FA gene defects are inherited in an autosomal recessive way with the exceptions of FANCR (dominant negative de novo mutations) and FANCB (X-linked). Together with other proteins, the FA gene products establish the FA/BRCA pathway. The key event of this pathway is the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI (ID2 complex). From this point it is possible to differentiate between upstream and downstream FA proteins. The latter are directly involved in FA-dependent DNA repair processes. The upstream positioned FA proteins form the FA core complex that includes FA and FA-associated proteins (FAAPs). The FA core complex is responsible for the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI. To date no pathogenic human mutations of the FAAPs have been described. Among these proteins is FAAP100 which together with FANCB and FANCL forms the subcomplex LBP100 within the FA core complex. In the present thesis a closer characterization of this protein has been achieved. In an amniotic cell line a homozygous missense mutation could be identified. The affected fetus displayed a typical FA phenotype and the cells also showed characteristics of FA. The cellular phenotype was complemented by FAAP100WT, thus proving the pathogenicity of the mutation. Supporting this result, additional FAAP100-deficient cell lines have been generated using the CRISPR/Cas9 system. These also exhibited a typical FA cellular phenotype which could be complemented by FAAP100WT. In vitro models served as a basis for better understanding the function of the FA core complex in general and of the LBP100 subcomplex in particular. Only in the presence of an intact FAAP100 the LBP100 module can be formed and transported to sites of DNA interstrand crosslinks. There, FAAP100 significantly contributes to the FANCD2 monoubiquitination process and thus to the activation of FA-dependent DNA damage repair. In order to also examine the function of FAAP100 in vivo, an Faap100-/- mouse model has been generated which shows a relatively severe FA phenotype comparable to other FA mouse models. Because of these results FAAP100 can be categorized as a new FA gene. Moreover, the role of the LBP100 subcomplex within the FA core complex was further elucidated and a better understanding of the FA/BRCA pathway was achieved. Another part of this thesis deals with the characterization of FAAP100138, a hitherto not validated isoform of FAAP100. The cellular FA phenotype of FAAP100-deficient cell lines could not be complemented by this isoform. However, there are clues pointing to a dominant negative effect of FAAP100138 on the FA/BRCA pathway. This finding could serve as a potential explanation of how and why the FA signaling pathway is downregulated in certain tissues. A therapeutic application for cancer of FAAP100138 appears possible.

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie génétique rare qui se caractérise par une insuffisance médullaire, des malformations congénitales et une prédisposition accrue au développement de cancers. Aujourd’hui, 16 protéines sont identifiées pour coopérer ensemble dans la voie métabolique de Fanconi, impliquées principalement dans la réparation de l’ADN. Pour mieux comprendre le rôle des protéines Fanconi dans d’autres mécanismes cellulaires, un criblage en double hybride a été réalisé au laboratoire afin d’identifier plusieurs nouveaux partenaires protéiques d’intérêt. La protéine associée aux microtubules, la stathmine (STMN) a ainsi été identifiée comme un nouveau partenaire potentiel de la protéine Fanconi C (FANCC). L’étude de l’interaction a confirmé un lien direct entre FANCC et STMN et révèle qu’une mutation ponctuelle, ou une délétion de l’exon 1 de FANCC, cause une perte de cette interaction. Afin d’éclaircir la fonction du complexe FANCC-STMN, nous avons étudié la localisation des protéines durant le cycle cellulaire par immunofluorescence. Les résultats ont permis de mettre en évidence une localisation commune de FANCC et STMN dans les centrosomes de cellules en mitose. Une variation de l’état de phosphorylation de STMN dans les centrosomes a été observée dans plusieurs lignées cellulaires de patients. Ainsi, les protéines FANC semblent participer à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la progression du cycle cellulaire. Pour finir, les cellules de patients FA présentent de nombreuses malformations mitotiques, tels qu’un nombre important de centrosomes surnuméraire et un fuseau mitotique de petites tailles. Notre étude a permis de montrer que la protéine FANCC participe à la régulation de l’état de phosphorylation de STMN durant la division cellulaire, via une interaction directe. Nos résultats suggèrent également que les protéines FANC semblent participer à la progression du cycle cellulaire, en régulant de manière indirecte l’activité de STMN. Puisque la dérégulation de STMN est connue pour être impliquée dans la cancérogenèse, une augmentation de l’activité de STMN dans les cellules FA semble expliquer la sensibilité des patients à développer différents types de cancer et représente une nouvelle cible prometteuse pour le traitement des cancers chez les patients FA. / The Fanconi Anemia (FA) is a genetic recessive disease characterized by a bone marrow failure, various congenital malformations, and predispose to the development of cancers. Currently, 16 proteins are identified to cooperate together in Fanconi pathway, known mainly to play a role in DNA reparation. For better understanding the involvement of Fanconi proteins in other cellular mechanisms and to identify new partners of interest, a double hybrid screen had been realized at the laboratory. The microtubule-associated protein, the stathmin (STMN), had been identified as a new potential protein partner of the Fanconi protein C (FANCC). Our study has confirmed a direct interaction between FANCC and STMN proteins, and identified that a punctually mutation or exon 1 deletion in FANCC induced a loss of this interaction. In order to clarify the function of the FANCC-STMN complex, we have study the localization of these proteins during the cell cycle by immunofluorescence experiments. These results have unveiled a co-localization of FANCC and STMN proteins in the centrosome of cells in mitosis. A decrease of STMN phosphorylation in the centrosome had been observed in fibroblast cells of FA patients. So, the FANC protein seems to be involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell cycle progression. Finally, the cells from FA patients display many mitotic spindle abnormities, such as an elevated number of supernumerary centrosomes and a decrease of mitotic spindle sizes. Our study demonstrates that the FANCC protein is involved in the regulation of STMN phosphorylation during the cell division. Our results suggest also that the FANC protein seems participate in the cell cycle progression. Knowing that the STMN deregulation is involved in the carcinogenesis, an increase of STMN activity in the FA cells seems explain the sensibility of patients to develop various cancers. The STMN protein represents a possible therapeutic target to cancer treatment of FA patients.