Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare se manifestant par des troubles développementaux, sanguins, et une prédisposition à certains cancers. Les cellules de patients montrent une sensibilité élevée aux agents causant des ponts interbrins dans l'ADN, dont la réparation implique l'activation de la recombinaison homologue. La présence de PALB2, mutée dans l'anémie de Fanconi, est nécessaire pour la localisation chromatinienne de BRCA2 et RAD51, en réponse aux dommages à l'ADN. Comme BRCA2, PALB2 est un gène de prédisposition au cancer du sein. Il devient important de mieux comprendre le rôle de PALB2/FANCN dans la recombinaison homologue. Nous avons entrepris la caractérisation de l'activité biochimique de PALB2 en la purifiant, de même qu'un mutant associé au cancer du sein, PALB2Q775X, afin de clarifier son rôle dans la réparation de l'ADN. Les données obtenues suggèrent que PALB2 possède les caractéristiques d'un médiateur de la recombinaison homologue, ce qui en fait une cible privilégiée dans le développement de thérapies anticancéreuses dans le futur.

L'anémie de Fanconi (FA) est caractérisée par une aplasie médullaire, un risque accru de développer des cancers, ainsi que plusieurs types de malformations congénitales. La voie de NOTCH1 est impliquée dans l'embryogenèse et le maintien des cellules souches hématopoïétiques (HSC), qui sont déréglés chez les patients FA. Puisque les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1 jouent un rôle essentiel dans l'hématopoïèse et le développement, nous avons étudié les liens qui existent entre les protéines FA et Hairy Enhancer of Split 1 (HES1), un effecteur de la voie de NOTCH1. Nous avons montré une interaction entre l'effecteur HES1 et le complexe FA, nécessaire à l'intégrité de la voie de l'anémie de Fanconi. Nos résultats indiquent également que la protéine HES1, en plus d'être un partenaire du complexe FA, est une cible de son activité E3 ubiquitine ligase. De plus, nous avons montré que le complexe FA est un co-régulateur de l'expression génique des cibles de l'effecteur HES1, en bloquant la formation du complexe de répression transcriptionnelle HESl-TLE/Gro. Finalement, l'étude fonctionnelle de l'interaction du complexe FA avec HES1 nous a permis de comprendre l'inter-relation qui existe entre les voies signalétiques de l'anémie de Fanconi et de NOTCH1, par le biais de l'effecteur HES1.

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie multigénique récessive rare qui atteint les enfants en bas âge. Plusieurs protéines FA forment un complexe nucléaire essentiel à l'activité de la voie de l'anémie de Fanconi au cours des mécanismes de réparation de l'ADN et d'apoptose ainsi qu'au cours du cycle cellulaire et du développement. Les patients FA présentent tous une pancytopénie qui résulte du non renouvellement des cellules souches de la moelle osseuse et sont souvent atteints de malformations congénitales. Malgré les récentes avancées sur la compréhension de la dynamique et de la régulation de la voie Fanconi, la fonction de la plupart des protéines FA demeure toujours inconnue. L'objectif principal du projet de recherche était donc d'identifier d'éventuels partenaires biochimiques de la protéine FANCC par un criblage de banque d'ADNc afin de mieux comprendre la fonction des protéines FA dans les divers mécanismes cellulaires. Deux interacteurs potentiels retenus, soit CtBPl et UNC5A, ont été analysés pour leur capacité à interagir ou colocaliser avec d'autres protéines Fanconi par double hybride dans la levure, par coimmunoprécipitation et par immunofluorescence. Il a été montré que CtBPl interagit avec le complexe Fanconi et que UNC5A interagit avec la protéine FANCC. Aussi, l'activation de la voie Wnt induit une translocation nucléaire et une colocalisation des protéines F ANC A, FANCC et CtBPl. L'interaction directe entre le corépresseur CtBPl et le complexe FA suggère un rôle de la voie Fanconi dans les mécanismes de développement par le biais de la voie de développement Wnt. D'autres analyses sont nécessaires pour postuler sur l'implication de la protéine UNC5A dans l'anémie de Fanconi.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie infantile multigénique et complexe. Les enfants atteints d’AF souffrent d’une insuffisance médullaire progressive potentiellement mortelle. En plus du phénotype hématologique, les enfants souffrant d’AF présentent de nombreuses malformations congénitales incluant le système nerveux central et une prédisposition accrue aux cancers particulièrement de type leucémique. Plusieurs gènes associés à la maladie ont été identifiés mais leur fonction dans l’étiologie de la maladie demeure inconnue. La présence d’une mutation dans l’un des gènes Fanconi entraine une perte progressive des cellules souches hématopoïétiques (CSH) menant à un épuisement médullaire et favorisant l’apparition de leucémies. Les protéines Fanconi forment trois complexes protéiques distincts qui participent de manière séquentielle dans une voie de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN. La protéine Fanconi Anemia de groupe C, ou FANCC, est une composante du complexe majeur de cette voie Fanconi. Outre son rôle dans la voie Fanconi et dans les mécanismes de signalisation en réponse aux dommages à l’ADN, FANCC est connue pour son implication dans la mort cellulaire programmée, la détoxification des radicaux oxygénés et la réponse aux cytokines. Afin d’identifier la fonction de la protéine FANCC dans les mécanismes de développement, nous avons procédé à un criblage d’une banque d’ADNc et identifié certains partenaires biochimiques de FANCC tel le récepteur de la Netrine-1, uncoordinated-5A (UNC5A). Puisque le récepteur UNC5A a une fonction de signal de survie cellulaire et est impliqué dans les mécanismes de croissance neuronale, nous avons étudié le rôle de l’interaction FANCC-UNC5A dans les mécanismes de différenciation neuronale. Nos résultats indiquent que FANCC régule la fonction pro-apoptotique de UNC5A. Lorsque FANCC est surexprimée, les cellules retardent leur entrée en apoptose tandis qu’en absence de FANCC, UNC5A favorise l’entrée en apoptose. De plus, nos résultats indiquent que FANCC conjointement à UNC5A promeut la neurogénèse; FANCC et UNC5A colocalisent dans les neurites cellulaires. Globalement, nos résultats suggèrent que FANCC par le biais de UNC5A joue un rôle important dans la mort cellulaire et la croissance axonale. Ainsi, une dérégulation de l’interaction FANCC-UNC5A chez les patients souffrent de FA pourrait expliquer certains aspects cliniques notamment les anomalies de développement. / Fanconi anemia (FA) is a recessive syndrome characterized by diverse clinical symptoms including progressive bone marrow failure, various congenital abnormalities, chromosomal instability and predisposition to malignancies. Studies of the canonical FA pathway have focused on the mechanism of repair of DNA cross-linking damage. However, some data suggest that FA proteins may have other functions besides DNA damage signaling events, and these functions may explain some of the disease phenotypes such as defects in hematopoiesis and congenital malformations. For instance, FANCC, which is predominantly located in the cytoplasm, has multifunctional roles and is an anti-apoptotic regulator. In addition to its function as a repulsive mediator in neural development, UNC5A, the receptor for the axon guidance molecule Netrin-1, has also been proposed to be a “dependence receptor” that triggers apoptosis in the absence of its ligand. Here, we identified a novel interaction of UNC5A with FANCC and showed that FANCC positively regulates UNC5A-mediated apoptosis. Under conditions of FANCC overexpression, apoptosis is decreased, whereas the absence of a functional FANCC protein increases UNC5A-mediated apoptosis. Furthermore, FANCC and UNC5A function as a complex in neurogenesis; they co-localize at synapses formed by neurites, and FANCC is required for the promotion of neuronal outgrowth by UNC5A. Based on these findings, we propose that FANCC plays a key role in tissue morphogenesis by either delaying UNC5A-mediated apoptosis or positively impacting the expression of UNC5A. Under FANCC-deficient conditions, dysregulation of the UNC5A signal pathway can lead to developmental defects such as those seen in FA patients.

L'anémie de Fanconi (AF) est une pathologie génétique rare (1/350 000 naissances), transmise selon le mode récessif. Son tableau clinique regroupe de nombreuses malformations congénitales, une aplasie médullaire, une pancytopénie et une prédisposition accrue aux cancers. Au plan cellulaire, une mutation sur l'un des treize gènes Fanconi suffit à induire une instabilité chromosomique et une hypersensibilité aux agents pontant l'ADN. La perte de fonction des protéines Fanconi est probablement responsable du défaut d'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et de l'état pro-apoptotique des progéniteurs médullaires. Les principaux traitements ont une très faible efficacité et induisent de dangereuses complications (toxicité, leucémies). La thérapie génique qui consiste à introduire ex vivo dans les CSH, une copie fonctionnelle du gène Fanconi altéré, apparaît ici comme le traitement alternatif le plus prometteur. Les premiers travaux effectués dans le laboratoire et confirmés pas d'autres, ont montré que la correction génique ex vivo est néfaste pour les CSH Fanconi. Une nouvelle approche thérapeutique a été mise en place, consistant à introduire la copie fonctionnelle du gène altéré directement in vivo, par injection intra-fémorale (IIF). Cette technique novatrice permet de délivrer le gène dans le milieu natif des CSH, leur évitant le stress induit par la culture. Après l'IIF de virions porteurs du gène EGFP (enhanced green fluorescent protein), des analyses sanguines mensuelles montrent une augmentation régulière de la fluorescence, confirmant l'efficacité technique du transfert génique in vivo. L'étape suivante consistait en l'injection du gène correcteur FancC, en fusion avec le marqueur EGFP (FancC-EGFP), dans des souris FancC-/-, FancA-/- et sauvages. L'expression sanguine de la protéine FANCC-EGFP confirme la transduction de cellules médullaires. L'efficacité de correction est évaluée lors de tests de survie des souris aux injections intra-péritonéales d'un agent pontant l'ADN : la mitomycine-C (MMC), sur une période de quinze semaines. Ce traitement vise à évaluer l'effet correcteur de la transduction et la fonctionnalité de la protéine transgénique, seules les cellules corrigées seront en mesure de restaurer l'intégrité de leur ADN et de proliférer. La nature des cellules corrigées a été analysée au cours de transplantations successives. Les résultats démontrent que les CSH FancC-/- recouvrent, après correction in vivo, par le transgène FancC-EGFP, une fonctionnalité semblable à celle des sauvages. Les résultats préliminaires obtenus dans le modèle murin aplasique confirment l'efficacité de la correction génique et sont particulièrement encourageants puisqu'ils permettent d'envisager l'IIF comme une nouvelle approche thérapeutique pour le traitement de l'AF.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 83-112).

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T14:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amstalden_LucilaGobby_D.pdf: 2331693 bytes, checksum: b9984b5e8cbc2821d446ee5281ae4200 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O câncer de mama (CM) é o tipo de câncer que mais comumente ocorre entre mulheres, com a estimativa de 49.240 novos casos diagnosticados em 2010 no Brasil. O CM apresenta fatores de risco conhecidos como idade, fatores sócio-econômicos, etnia, exposição excessiva a hormônios, radiação, dieta, exercícios físicos, história ginecológica e história familiar. Além dos fatores de risco, o CM apresenta fatores de prognóstico mensurados no momento do diagnóstico e que servem como preditor da sobrevida do paciente. Existem pelo menos 20 subtipos de CM distintos morfologicamente. O complexo formado pelos genes FANCD2 e FANCI tem a função chave de co-localizar o sítio nuclear de reparo para proteínas que diretamente estão relacionadas à recombinação homóloga como BRCA1, juntamente com FANCJ, RAD51, BRCA2/FANCD1 com FANCN. A descoberta de que o gene BRCA2 é, na verdade, FANCD1 atraiu pesquisadores para um novo alvo na corrida para a compreensão da história natural da doença, informação esta que permitirá avaliar a hipótese dos genes de reparo de DNA na susceptibilidade ou refratariedade para carcinogênese. O objetivo do atual estudo foi analisar as principais alterações nos genes FANCD2 e FANCI utilizando PCR e digestão enzimática e, paralelamente, rastreamento dos éxons dos genes por meio do sequenciamento automático. A casuística foi formada por 137 mulheres com CM hereditário. Foram encontradas oito alterações em 33 indivíduos e cinco variantes exônicas não relatadas, novas. Por meio de análise estatística, houve a correlação entre indivíduos mutados e dados clínicos. Esse estudo foi de grande valia para a detecção de alterações que podem funcionar como estopim para o desenvolvimento do câncer em indivíduos com CM com histórico familiar sem mutações em genes de alta suscetibilidade, como também servir para caracterizar um tipo histológico distinto auxiliando na terapêutica futura / Abstract: Breast Cancer (BC) is the cancer type more commonly occurs among women with estimative of 49.240 new cases in 2010. The BC presents risk factors as: age, social-economic factors, ethnicity, hormone exposure, radiation, diet, physical exercises and familiar history. Besides the risk factors BC has prognosis factors measured in diagnostic. There's, at least, 20 subtypes of BC morphologically different. Corcerning molecular epidemiology, the BC is associated to many genes and in mutations in various genes as BRCA1 e 2, p53, PTEN. The FANCD2/FANCI complex have a key function of co-localize motif of DNA repair to proteins that directly act on homologue recombination as BRCA1 with FANCJ, RAD51, BRCA2/FANCD1 with FANCN. The discovery the BRCA2 is, actually, FANCD1 gene has leaded researchers to the new target in knowledge of natural history of disease.The aim of this study was to analyse alterations in FANCD2 and FANCI genes through PCR followed enzimatic restriction. At same time, was performed the screening of the genes exons. The casuistic was constituted from 137 women with hereditary breast cancer. We encountered eight alterations in 25 individuals and 5 exonic variants not reported. This study was very important with the purpose to detect alterations can be responsible by the cancer evolution in BC patients without mutations in high susceptibility genes and to server to characterize a distinct histological types to future therapeutic / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

Les sites fragiles communs (SFCs) sont des régions génomiques particulièrement sensibles au stress réplicatif et sont impliqués dans l’initiation et la progression du cancer. L’Anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique rare qui se caractérise principalement par une aplasie médullaire, des malformations congénitales ainsi qu’une forte prédisposition au cancer chez les patients (leucémies myéloïdes et tumeurs solides de la tête et du coup). L’instabilité génomique a été identifiée comme étant une source majeure de prédisposition des patients AF au cancer et les SFCs sont particulièrement sensibles dans cette maladie. L’AF est causée par la mutation de gènes codant des protéines participant à une voie moléculaire appelée voie FANC qui a été décrite dans la réparation des ponts inter-brins. Malgré l’importance de la voie FANC dans le maintien de la stabilité des SFCs, les mécanismes sous-jacents restent à élucider. Au cours de ma thèse, nous avons identifié un nouveau rôle de FANCD2 dans le maintien des SFCs. En effet, nous montrons que FANCD2 atténue l’expression des gènes présents au sein des SFCs maintenant leur stabilité. De plus, nous montrons que la transcription de ces gènes est nécessaire au recrutement et au rôle de FANCD2 au sein de ces régions. Enfin, nous avons identifié le stress métabolique comme étant un signal induisant l’expression des gènes des SFCs et que FANCD2 module cette réponse. La réduction de ce stress pourrait être une piste thérapeutique intéressante afin de prévenir l’instabilité des SFCs dans l’AF. / Common fragile sites (CFSs) are genomic regions prone to form breaks and gaps on metaphase chromosomes after replicative stress and promote genomic instability in the earliest steps of tumor development. Proteins involved in replication/repair of CFSs are necessary to prevent their instability. Among them is FANCD2, a key protein of the FANC pathway necessary to resolve inter-strand crosslinks and defective in Fanconi Anemia (FA). FA is a rare genomic instability disorder characterized by bone marrow failure, congenital abnormalities and predisposition to acute myeloid leukemia and epithelial cancer. Genomic instability in FA is supposed to predispose patients to cancers. Importantly, CFSs are more unstable in FA and chromosome breaks observed in FA cells occur preferentially at CFSs. During my PhD, we identified a new role of FANCD2 in CFS stability maintenance. We show that FANCD2 attenuates transcription of the large genes present at CFSs, preventing their instability. Moreover, we demonstrate that transcription is necessary for FANCD2 recruitment and function at CFSs. Importantly, we identified the metabolic stress as a signal triggering CFS gene expression and FANCD2 is necessary to modulate this response. Reducing this stress is a promising therapeutic issue to prevent CFS and genomic instability in FA.

L’anémie de Fanconi (FANC) est une maladie génétique humaine causant chez les patients une anémie sévère, une susceptibilité accrue à certains cancers, ainsi que des anomalies du développement dont un hypogonadisme. La voie FANC est impliquée dans la réponse au stress réplicatif et la réparation de l’ADN, et joue un rôle potentiel dans la régulation physiologique des cellules souches fœtales et adultes. Dans les modèles murins de la voie FANC, le phénotype majeur est une infertilité liée à un problème de développement du lignage germinal, qui est un paradigme pour l’étude des mécanismes contribuant à la pathologie. Notre étude a porté sur la caractérisation du défaut des cellules germinales primordiales (CGP) dans les embryons murins fancg-/-. Nous avons mis en évidence un défaut numérique des CGP très tôt dans le développement du lignage germinal dès les stades 9,5-10,5 jours post coïtum (jpc). Les CGP présentent un léger défaut de la prolifération à 10,5-11,5 jpc, mais aucun blocage de cycle. L’atteinte proliférative semble trop faible pour expliquer à elle seule la diminution drastique du nombre de CGP, ainsi que le profil mosaïque des gonades embryonnaires avec la présence de cordons dépourvus de CGP observé à 13,5 jpc. L’étude in vivo et ex vivo du comportement migratoire des CGP fancg-/- a permis de mettre en évidence des anomalies de la motilité des CGP, probablement liée à une activation anormale de la GTPase RAC1. Nous avons observé à 11,5 jpc une diminution du nombre de cellules au niveau du front de migration de la population de CGP. Ces anomalies entraîneraient ainsi un retard de migration et l’incapacité pour une fraction des GCP fancg-/- d’atteindre correctement les crêtes génitales à 11,5 jpc. La déplétion des CGP semble ainsi liée principalement à un défaut migratoire conduisant à une augmentation de la mort des CGP à 11,5 jpc, associé au défaut prolifératif intrinsèque des CPG fancg-/-. / Fanconi Anemia (FANC) is a genetic human disease, causing in patient a severe anemia, a higher risk to develop some cancers, and developmental anomalies including hypogonadism. The FANC pathway is involved in the replicative stress response and DNA repair, and has a potential role in the physiological regulation of fetal and adult stem cells. In mice models of the FANC pathway, the main phenotype is the sterility issue, associated to a developmental defect of the germ cell lineage, and is so a paradigm to study the pathology. Our study aimed to characterize the primordial germ cell (PGC) defect in fancg-/- mouse embryos. We showed a numerical defect of PGC early in the germ cell lineage development, as soon as 9.5–10.5 days post coitum (dpc). PGC show a mild defect of proliferation at 10.5–11.5 dpc, but no cell cycle arrest. This low proliferative defect can neither fully explain the drastic decrease of the PGC number, nor the mosaic profile of fetal gonads displaying cords without PGC at 13.5 dpc. In vitro and ex vivo studies of the migration behavior of fancg-/- PGC highlight abnormalities of the PGC’s motility, probably linked to abberant RAC1 GTPase activity. We also observed at 11.5 dpc a decrease of the cell number at the front of migration of the PGC population in 11.5 dpc fancg-/- embryos. Those motility defects could induce a migration delay, preventing a fraction of the fancg-/- PGC population to reach correctly the genital crests by 11.5 dpc. Hence, PGC depletion seems mainly linked to a migratory defect leading to increased cell death in PGC at 11.5 dpc, associated to an intrinsic proliferation defect of fancg-/- PGC.

Human caretaker genes play a central role in the DNA damage response. Their defects cause a number of rare diseases which show genetic instability and increased propensity to malignant cell growth. The first of these diseases to be described in this thesis is Fanconi anemia (FA), a rare chromosome instability disorder with recessive inheritance characterized by progressive bone marrow failure, variable congenital malformations, and cancer predisposition. There are at least 13 FA complementation groups (FA-A, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), each representing mutations in a distinct gene. To date, except FANCI all the corresponding genes have been identified, denoted as FANC-A, B, C, D1/BRCA2, D2, E, F, G, J/BRIP1/BACH1, L/PHF9, M/Hef and N/PALB2.Further information is provided in chapters 1 and 2. FA cells are characterized by high sensitivity to DNA crosslinking agents and to elevated oxygen tension, but it is controversial whether they are also radiosensitive. Systematic testing (chapter 3) of primary skin fibroblast cultures from all currently known FA complementation groups revealed no increased sensitivity towards ionizing radiation (IR) and ultra-violet light (UV) when growing cells at physiological (5% v/v) oxygen levels. Despite considerable interstrain variations FA cells showed no systematic differences to cell cultures derived from healthy controls, whereas positive controls (Ataxia telangiectasia and Cockayne syndrome) proved highly sensitive to IR or UV. Lack of radiosensitivity was also shown for the FANCD2 gene, a central gene in the FA/BRCA pathway whose mutational inactivation was studied in a large patient cohort. FA patients excluded previously from complementation groups FA-A, -C, E, F, G or L were screened for mutations in FANCD2. Even though mutation analysis of FANCD2 is complicated by the presence of pseudogene regions, biallelic FANCD2 mutations were identified in a series of 32 patients (chapter 4). The predominant types of mutations result in aberrant splicing causing exon skipping, exonisation of intronic sequence, activation of cryptic and creation of new 3´ splice sites. Many alleles were recurrent and could be associated with ethnicity. Interestingly, residual FANCD2 protein was observed in all available patient cell lines, and functionality was indicated by the presence of the monoubiquitinated FANCD2 isoform. This suggests that viability of FA-D2 patients depends on the presence of hypomorphic or leaky mutations. In chapter 5 the worldwide second FA patient belonging to complementation group FA-L is reported. Genetic analysis of patient derived fibroblasts revealed heterozygosity for a 5-bp deletion (exon 7) and a missense substitution (exon 11). In contrast to the tested fibroblasts two independent lymphoid cell lines proved resistant to the DNA crosslinking agent mitomycin C and showed proficient FANCD2 monoubiquitination. The functional reversion due to a compensating mutation in the splice acceptor site results in aberrant splicing and the restoration of the open reading frame. However, the revertant mosaicsm was restricted to the lymphatic cell lines such that there was no clinical improvement involving the other hematopoietic cell lineages, and bone marrow transplantation was required to treat the patients bone marrow failure. A direct link of Fanconi anemia to other DNA repair processes was provided by the identification of the BRCA1 interacting protein 1, BRIP1/BACH1, as a genuine FA gene (chapter 6). Genetic mapping of consanguineous Inuit families resulted in the identification of truncating mutations in BRIP1. In contrast to most of the other FA patients FANCD2 monoubiquitination was intact, linking these patients to complementation group FA-J. Biallelic mutations in BRIP1 were found in eight additional patients, one of whom was assigned previously to FA-J by somatic cell fusion. Therefore it could be shown that the postulated FANCJ gene is identical with BRIP1. This finding emphasizes the close connection between the BRCA- and the FA-family of genes, both involved in the DNA damage response. Biallelic mutations in BRCA2/FANCD1 cause a severe form of Fanconi anemia with childhood malignancies. Recently, a BRCA2 interacting protein was identified as a “partner and localizer of BRCA2” (PALB2) which confers cellular MMC resistance. A candidate gene approach revealed biallelic mutations in seven FA patients that developed solid tumors in early childhood (chapter 7). Patient cells show no or little PALB2 protein, lack of MMC induced RAD51 foci formation, and high chromosomal instability. Transduction of PALB2 cDNA complemented the MMC sensitive phenotype. Therefore, biallelic mutations in PALB2 cause a new subtype of FA, denoted as FA-N, which is connected with a high and early cancer risk. With respect to one of the most prominent but least understood caretaker gene syndromes, Fanconi anemia, this thesis has expanded our knowledge as follows: 1. refutation of major cellular radiosensitivity of FA cell lines regardless of complementation group, 2. detection of hypomorphic mutations and residual protein levels as a prerequisite for viability of the FANCD2 gene, 3. description of the worldwide second patient belonging to complementation group FA-L whose lymphocytes exhibit a novel type of somatic reversion, 4. participation in the discovery and functional characterization of two novel FA genes (FANCJ and FANCN). The last chapter of the thesis deals with a DNA repair pathway that is activated following exposure to ionizing radation. One of the central proteins responding to radiation-induced DNA damage is the product of the ATM gene which signals to a myriad of other proteins in response to DNA double strand breaks, including the NMR complex. This complex formed by the NBS1/MRE11/RAD50 proteins is thought to act as a specifi c sensor of DNA double-strand breaks. Mutations of MRE11 and NBS1 are associated with the radiation sensitivity syndromes Ataxia-telangiectasia-like disorder (AT-LD) and Nijmegen breakage syndrome (NBS), respectively. Chapter 8 presents the first ever identified patient with RAD50 deficiency due to biallelic germline mutations in the RAD50 gene. An 18-year-old German girl who has a variant form of NBS without immunodeficiency was found to be compound heterozygous for a nonsense mutation and the loss of the natural termination signal in the RAD50 gene. RAD50 protein expression was reduced to less than one tenth of normal in her fibroblasts and lymphoblastoid cells. At the nuclear level, RAD50 deficiency was associated with a high frequency of spontaneous chromatid exchanges and with the failure to form MRE11 and NBS1 nuclear foci in response to irradiation. ATM autophosphorylation, phosphorylation of p53 at serine 15 and the transcriptional induction of p21/WAF1 mRNA were reduced, and there was no evidence for Ser343 phosphorylation of NBS1 in RAD50 defi cient cells following irradiation. These defects could be complemented by expression of wildtype RAD50 cDNA. Our data shows that RAD50 modulates, like NBS1 and MRE11, the ATM-mediated DNA damage response and the G1/S cell cycle checkpoint. In addition, RAD50 appears to be required for nuclear localization of MRE11, and for NBS1 focus formation, underlining its importance for the proper function of the NMR complex. Owing to the studies performed within the framework of this thesis, RAD50 deficiency can now be added to the growing list of human caretaker gene syndromes with pronounced radiosensitivity that is distinctive at both the cellular and the clinical level from deficiencies involving the other members of the NMR complex. / Die sogenannten “Caretaker”-Gene spielen eine zentrale Rolle in der zellulären Antwort auf DNA Schäden. Mutationen in diesen Genen führen zur Ausprägung von einigen seltenen Erbkrankheiten, die sich durch genetische Instabilität und in vielen Fällen durch erhöhtes Krebsrisiko auszeichnen. Eine dieser Erkrankungen, die im Rahmen dieser Arbeit untersucht wurde, ist Fanconi Anämie (FA). Dabei handelt es sich um eine sehr seltene chromosomale Instabilitätserkrankung, die einem rezessiven Erbgang folgt. Der klinische Phänotyp von FA ist gekennzeichnet durch ein variables Spektrum von kongenitalen Fehlbildungen, progressivem Knochenmarksversagen und einer Prädisposition für Neoplasien. Durch somatische Zellfusionstudien und in einigen Fällen durch direkte genetische Zuordnung konnten bisher 13 Komplementationsgruppen definiert werden (FAA, B, C, D1, D2, E, F, G, I, J, L, M and N), von denen jede einen Defekt in einem bestimmten Gen widerspiegelt. Inzwischen sind, mit Ausnahme von FANCI, alle korrespondierenden FA Gene identifiziert. Ein Überblick über den aktuellen Stand ist in den Kapiteln 1 und 2 dieser Arbeit zu finden. Zellen von FA-Patienten zeichnen sich durch eine hohe Sensitivität gegenüber DNA quervernetzenden Substanzen und einer hohen Empfindlichkeit gegenüber einer erhöhten Sauerstoffkonzentration aus. Zur Frage der Radiosensitivität von FA-Zellen gab es bisher nur widersprüchliche Daten. Mit Hilfe einer systematischen Analyse von primären Fibroblasten aller (zum Zeitpunkt der Untersuchung) bekannten Komplementationsgruppen konnte gezeigt werden, dass unter physiologischen Sauerstoffkonzentrationen keine erhöhte Sensitivität gegenüber ionisierender Strahlung (IR) und ultraviolettem Licht (UV) besteht (Kapitel 3). Trotz einigen Zellinien-spezifischen Schwankungen waren die Unterschiede zwischen Patientenzellen und gesunden Kontrollen marginal, verglichen mit der eindeutig erhöhten Sensitivität von Zellen positiver Kontrollen (Ataxia telangiactasia (IR Kontrolle) bzw. Cockayne Syndrom (UV-Kontrolle)). Die in Kapitel 3 nachgewiesene fehlende Radiosensitivität von FA-Zellen ist im Kontext des FANCD2-Gens von besonderem Interesse, da diesem Gen eine Schlüsselposition im FA/BRCA Doppelstrangbruch-Reparaturweg zukommt. Das Screening von FA-Patienten, bei denen bereits eine Zuordnung zu den Komplementationsgruppen FA-A, C, E, F, G und L ausgeschlossen war, führte zur Identifikation einer Reihe von FA-D2 Patienten. In einer großen Kohortenstudie wurden 29 FA-D2 Patienten mit klinischen Informationen sowie 3 zusätzliche FA-D2 Patienten hinsichtlich ihrer Mutationen in FANCD2 untersucht (Kapitel 4). Für alle 32 Patienten konnten biallelische Mutationen nachgewiesen werden, auch wenn das Vorhandensein von pseudogenen Regionen die Mutationsanalyse erschwerte. Wie in keinem der anderen FA-Gene führt die Mehrzahl der Mutationen in FANCD2 zu verändertem Spleißenverhalten, wie zum Beispiel zur Exklusion eines Exons, zur Exonisation intronischer Bereiche, der Aktivierung von kryptischen oder der Erzeugung von neuen 3´ Spleißstellen. Viele Allele wurden mehrfach gefunden und konnten einem ethnischen Hintergrund zugeordnet werden. In allen verfügbaren lymphoblastoiden Patienten-Zelllinien wurde residuales FANCD2-Protein detektiert, wobei das Vorhandensein der monoubiquitinylierten Isoform auf ein funktionelles Protein hindeutet. Zusammen mit der Tatsache, dass in keinem der Patienten eindeutige biallelische Nullmutationen nachgewiesen werden konnten, ist somit offenbar das Vorhandensein von hypomorphen Mutationen und entsprechendem Restprotein für die Lebensfähigkeit von FA-D2 Patienten essentiell. In Kapitel 5 wird der weltweit zweite FA Patient vorgestellt, welcher der Komplementationsgruppe FA-L zugeordnet werden konnte. Die genetische Analyse von primären Fibroblasten dieses Patienten führte zum Nachweis einer 5 Basen umfassenden Deletion in Exon 7 sowie zu einer Missense-Mutation in Exon 11. Im Gegensatz zu den untersuchten Fibroblasten zeigten zwei unabhängig etablierte lymphoblastoide Zellinien keine erhöhte Sensitivität gegenüber Mitomycin C, was auf einer somatische Reversion beruhen kann. Diese Vermutung wurde durch den Nachweis einer induzierbaren Monoubiquitinylierung von FANCD2 in Lymphoblasten bestätigt. Die funktionelle Reversion basiert auf einer zur Deletion in cis befindlichen kompensatorischen Mutation im Spleiß-Akzeptor von Exon 7, die zu einem veränderten Spleißprodukt und der Wiederherstellung des Leserahmens führt. Die somatische Reversion beschränkt sich jedoch auf die lymphatischen Zellreihen und hatte daher nur einen partiellen Einfluss auf den Krankheitsverlauf. Ein allgemeines Knochenmarksversagens machte eine Transplantation unumgänglich. Die Konditionierung wurde jedoch auf das vorhandene hämatopoietische Mosaik abgestimmt, um eine Graft vs. Host Reaktion zu vermeiden. Die Identifizierung des BRCA1 interagierenden Proteins 1 (BRIP1/BACH1) als ein bona fide FA-Gen (Kapitel 6) verdeutlicht die direkte Verknüpfung des FA/BRCA DNA Reparaturweges mit anderen DNA Reparaturwegen. Trunkierende Mutationen in BRIP1 wurden in zwei blutsverwandten Eskimofamilien mittels genetischer Positionsanalysen gefunden. Im Gegensatz zu den meisten anderen FA Patienten war die Monoubiquitinylierung von FANCD2 trotz MMC Empfindlichkeit intakt, was für eine Zuordnung zur Komplementationsgruppe FA-J sprach. Biallelische Mutationen in BRIP1 wurden in 8 weiteren Patienten gefunden, von denen einer ursprünglich durch somatische Zellfusion zu FA-J zugeordnet wurde. Dadurch konnte gezeigt werden, dass das postulierte FANCJ Gen mit BRIP1 identisch ist. Als eines der wenigen FA Gene besitzt BRIP1 bekannte funktionelle Domänen (DNA Helikase), die somit biochemisch für die Entschlüsselung des FA/BRCA Weges genutzt werden können. Biallelische Muatationen in FANCD1, welches identisch mit dem bekannten Brustkrebsgen BRCA2 ist, führen zu einer besonders schweren Form von Fanconi Anämie, die bereits im frühen Kindesalter mit einem sehr hohen Krebsrisko verbunden ist. Kurz vor Abschluss dieser Arbeit gelang die Charakterisierung eines mit BRCA2 interagierendes Proteins, welches als „partner und localizer of BRCA2“ (kurz PALB2) bezeichnet wurde und offenbar zelluläre Resistenz gegenüber Mitomycin C (MMC) bedingt. Ein genetischer Screen von bisher nicht-klassifizierten FA-Patienten führte zur Identifizierung von sieben Patienten mit biallelischen Mutationen in PALB2 (Kapitel 7). Alle Patienten entwickelten bereits im frühen Kindesalter bösartige Tumore. Der zelluläre Phänotyp von PALB2- defizienten Zellen weist eine Störung der MMC induzierten RAD51 Foci-Bildung auf. Darüberhinaus zeigen PALB2-defiziente Zellen eine spontane chromosomale Instabilität, die durch eine MMC-Gabe stark erhöht werden kann. Die Transduktion von PALB2 cDNA führt zur Reduktion der MMC induzierten G2 Phasen Arretierung und zur Reversion des MMC-sensitiven Phänotyps. Biallelische Mutationen in PALB2 verursachen somit eine Form von Fanconi Anämie, die mit hohem Krebsrisiko verbunden ist. PALB2 wird nach der gängigen FA-Nomenklatur als FANCN bezeichnet und liegt der neu definierten Komplementationsgruppe FA-N zugrunde. Die vorliegende Arbeit hat in mehreren Punkten zur Verbesserung des derzeitigen Wissenstandes über die komplexe genetisch bedingte Erkrankung Fanconi Anämie beigetragen 1. trotz molekularer Wechselwirkung von FA-Proteinen mit Komponenten aus anderen DNA-Reparatursystemen zeigen Zellen von FA Patienten unabhängig von der Komplentationsgruppe weder Strahlen- noch UV-Sensitivität; 2. die Existenz von hypomorphen Mutationen in FANCD2 und das Auftreten von Restprotein korreliert offenbar mit der Lebensfähigkeit von biallelischen Mutationen im FANCD2 Gen. 3. unter den bisher nicht klassifizierten Patienten wurde der weltweit zweite Patient der Komplementationsgruppe FA-L gefunden, in dessen Blutzellen ein neuartiger Mechanismus von somatischer Reversion nachgewiesen werden konnte 4. die Beteiligung an der Identifizierung und funktionellen Charakterisierung von zwei neuen FA-Genen (FANCJ und FANCN), welche die FA-abhängigen DNA-Reparaturwege direkt mit den Brustkrebsgenen BRCA1 und BRCA2 in Verbindung bringen. Das letzte Kapitel der Arbeit befasst sich mit einem DNA-Reparaturweg, der insbesondere nach Strahlenexposition aktiviert wird. Eines der zentralen Proteine, das an der Erkennung von strahleninduzierten DNA Schäden beteiligt ist, ist die Kinase ATM. Eine Reihe von Proteinen wird von ATM phosphoryliert, womit eine DNA Schadensantwort bei Doppelstrangbrüchen ausgelöst wird. Der NMR-Proteinkomplex, bestehend aus NBS1, MRE11 und RAD50, ist an der Aktivierung der ATM Kinase beteiligt und wird daher als ein Sensor für DNA Doppelstrangbrüche angesehen. Biallelische Mutationen in MRE11 und NBS1 führen zu den Radiosensitivitätssyndromen „Ataxia telangiectasia-like disease“ (AT-LD) bzw. „Nijmegen breakage syndrome“ (NBS). In Kapitel 8 wird der erste Patient mit RAD50 Defizienz vorgestellt. Bei einer 18 jährigen Patientin mit einem NBS- ähnlichem klinischem Phänotyp, jedoch ohne Immundefizienz, wurden eine prämature Stopp- Mutation und der Verlust des natürlichen Translationsterminations-Signals gefunden. Die Expression von RAD50 ist in Fibroblasten und Lymphozyten der Patientin auf weniger als 10% reduziert. Auf zellulärer Ebene ist eine hohe Chromosomenbruchrate, eine dosisabhängige Arretierung in der G2 Phase des Zellzyklus, Defekte in den G1 und S Phase Kontrollpunkten, sowie das Fehlen der IR-induzierten Relokalisation von NBS1 und MRE11 zu beobachten. Korrekte Relokalisation und normale Phosphorylierungsmuster wurden experimentell durch transiente Transfektion von RAD50 cDNA wiederhergestellt, was die Bedeutung von RAD50 für diese Prozesse belegt. Die vorgestellten Daten zeigen, dass RAD50, ebenso wie NBS1 und MRE11, die ATM abhängige DNA Schadensantwort und die G1/S Zellzykluskontrolle moduliert. RAD50 scheint für die nukleäre Lokalisation von MRE11, sowie für die induzierte Relokalisation von MRE11 und NBS1 in nukleäre Foci notwendig zu sein. Als Ergebnis dieser Untersuchungen kann die RAD50-Defizienz zu der wachsenden Liste von Caretaker-Syndromen als eine neue Radiosensitivität-Erkrankung hinzugefügt werden. Das Krankheitsbild unterscheidet sich trotz enger molekularer Interaktion zwischen RAD50, NBS1 und MRE11 im NMR-Komplex von den Defekten in diesen Genen.