Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Fanconi Anemia (FA), a chromosomal instability syndrome, is characterized by bone marrow failure, genetic malformations, and predisposition to malignancies like acute myeloid leukemia (AML) and solid tumors. FA is caused by germline bi-allelic mutations in one of 21 known FA pathway genes and somatic mutations in FA genes are also found in a variety of sporadic cancers. Recently, numerous reports have discovered that the protective function of the FA pathway extends beyond its canonical role in regulation of DNA repair in interphase. In particular, the FA pathway has been shown to function in essential mitotic processes including spindle assembly checkpoint (SAC), cytokinesis, and centrosome maintenance. Understanding of the mechanistic origins of genomic instability leading to carcinogenesis and bone marrow failure has important scientific and clinical implications. To this end, using a micronucleus assay, we showed that both interphase DNA damage and mitotic errors contribute to genomic instability in FA ex vivo and in vivo. Functional studies of primary FA patient cells coupled with super-resolution microscopy revealed that FANCA is important for centrosome dependent spindle assembly supporting the protective role of FA pathway in mitotic processes. Furthermore, we dissected the interactions between the FA pathway and cellular kinase networks by employing a synthetic lethality sh-RNA screen targeting all human kinases. We mapped kinases that were synthetically lethal upon loss of FANCA, particularly those involved in highly conserved signal transduction pathways governing proliferation and cell cycle homeostasis. We mechanistically show that loss of FANCA, the most abundant FA subtype, results in in premature degradation of the mitotic kinase BUBR1 and faster mitotic exit. We further demonstrate that FANCA is important for PCAF-dependent acetylation of BUBR1 to prevent its premature degradation. Our results deepen our understanding of the molecular functions of the FA pathway in mitosis and uncover a mechanistic connection between FANCA and SAC phosphosignaling networks. These findings support the notion that further weakening the SAC through targeting kinases like BUBR1 in FA-deficient cancers may prove to be a rational therapeutic strategy.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19269号 / 医博第4033号 / 新制||医||1011(附属図書館) / 32271 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 岩井 一宏, 教授 髙折 晃史, 教授 山田 亮 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第20668号 / 医博第4278号 / 新制||医||1024(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 武田 俊一, 教授 岩井 一宏, 教授 清水 章 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

L’anémie de Fanconi (FA) est une maladie congénitale rare résultant d’une mutation sur chaque allèle parental d’un gène FANC. Nous avons récemment identifié un variant d'épissage de FANCL contenant une exclusion de l'exon 4. Une analyse par minigène nous a permis de démontrer que le polymorphisme de séquence (SNP) rs7958831 augmente substantiellement le saut de l'exon 4 de FANCL, et que les porteurs de ce SNP ont une quantité significativement plus élevée de transcrits FANCL∆4. L'étude de fractions ribosomales nous a permis de confirmer que le transcrit alternatif est bel et bien traduit en protéine. Toutefois, une protéine de fusion FANCL∆4-GFP ne migre pas au noyau comme le fait FANCLwt-GFP. L'isoforme FANCL∆4 n'est pas en mesure d'accomplir la fonction principale de FANCL, soit de monoubiquitiner FANCD2. De plus, des cellules EUFA868 déficientes en FANCL complémentées avec FANCL∆4 ne retrouvent pas leur phénotype normal en test de survie et ont une proportion plus importante bloquée en phase G2/M. Ces résultats nous permettent de penser que le SNP rs7958831 pourrait moduler le risque de cancer du sein puisque l'isoforme FANCL∆4 ne semble pas fonctionnelle.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare, caractérisée par une défaillance de la moelle osseuse et une incidence accrue d'anomalies du développement et de cancer. Les protéines FANC sont impliquées dans la voie Fanconi pour réparer les pontages interbrins de l'ADN. En présence de dommages, la protéine FANCD2 est mono-ubiquitinée et s'accumule à la chromatine. Il est admis que FANCD2 occupe un rôle central dans la voie Fanconi, mais sa fonction biochimique exacte est inconnue. La purification de la protéine FANCD2 et de plusieurs fragments de la protéine, dans le but d'étudier leur capacité à lier l'ADN, a mené à l'identification de deux domaines de liaison à l'ADN. La perte de l'un ou l'autre de ces domaines empêche la localisation de la protéine FANCD2 aux foyers de réparation suite à l'induction de dommages, suggérant que ces domaines sont essentiels pour la fonction de FANCD2.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25486号 / 医博第5086号 / 新制||医||1073(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 伊藤 貴浩, 教授 万代 昌紀, 教授 松田 文彦 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

L'anémie de Fanconi (FA) est une maladie rare et les patients présentent des malformations congénitales, des problèmes hématologiques et une prédisposition à certains cancers. Jusqu'à maintenant, 13 protéines FA ont été identifiées, dont 8 (FANC- A, B, C, E, F, G, L, M) s'associent pour former un complexe qui permet l'ubiquitination de FANCD2 et FANCI. Les autres protéines FA sont impliquées au niveau de la réparation de l'ADN ce qui ne permet pas d'expliquer en totalité le phénotype des patients. Récemment, HES1, effecteur de la voie de Notch, a été identifié comme un partenaire essentiel à la formation du complexe FA. HES1 est connue pour être impliquée dans le développement et l'hématopoïèse. L'interaction d'HES1 avec le complexe FA altérée pourrait expliquer en partie le phénotype des patients. L'objectif principal est de créer un peptide inhibiteur visant à altérer la liaison d'HES1 avec le complexe FA, sans toutefois modifier les autres fonctions d'HES1 dans la cellule. Un deuxième objectif est d'identifier de nouveaux partenaires au complexe FA afin de mieux comprendre le lien génotype-phénotype. L'identification d'un peptide inhibiteur a été réalisée premièrement par la sélection de quatre régions d'HES1 (les acides aminés 90-123, 86-121, 76-111 et 152-190) et deuxièmement par le criblage d'une banque de peptides aléatoires avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²². Le système double hybride en levure a été utilisé pour vérifier les interactions directes entre les peptides et les membres du complexe FA et ces interactions ont été testées dans un modèle cellulaire par la technique de co-immunoprécipitation. L'identification de nouveau partenaire au complexe FA a été réalisée par le criblage d'une banque d'ADNc de moelle osseuse avec FANCE. Le criblage avec FANCG¹⁻¹¹²⁺³⁹⁰⁻⁶²² a permis d'identifier deux peptides, mais leur activité inhibitrice n'a pas été évaluée. Les quatre régions d'HES1 semblent n'avoir aucun effet sur la liaison entre HES1 et le complexe FA. Le criblage de la banque d'ADNc n'a pas permis d'identifier de nouveaux partenaires à FANCE. Des études approfondies sont nécessaires pour confirmer les effets des peptides sur la liaison entre HES1 et le complexe FA.

On compte aujourd’hui plus de 2000 patients dans le monde affectés par l’anémie de Fanconi (AF). Cette maladie rare est causée au niveau cellulaire par un défaut de réparation d’un type très particulier de lésions de l’ADN : les pontages inter-brins (ou ICLs, pour Interstrand CrossLink). Ceux-ci peuvent compromettre la transcription et la réplication, et donc à long terme la survie cellulaire. Pour y faire face, plus d’une vingtaine de protéines sont impliquées dans la voie FA-BRCA, chargée de détecter et d’activer la réparation de ces lésions dangereuses pour la cellule. Au niveau macroscopique, les manifestations de l’AF sont vastes et pas systématiquement présentes, ce qui en complique le diagnostic : pancytonémie, malformations développementales congénitales et prédisposition à certains cancers. Comme la plupart des symptômes ne sont pas spécifiques à l’AF, les enjeux et l’intérêt de son étude deviennent multiples. L’anémie de Fanconi offre un modèle d’étude particulièrement intéressant, qui permet d’explorer des mécanismes aussi variés que la cancérogenèse, l’hématopoïèse, la gamétogenèse et la réparation de l’ADN. Les connaissances sur le mécanisme moléculaire à proprement parler sont grandissantes, même si de nombreuses interrogations persistent. Parmi elles, le rôle précis du complexe ID2, formé des protéines FANCI et FANCD2, reste nébuleux. De plus en plus d’études décrivent des fonctions exclusives à FANCD2, laissant formuler l’hypothèse que la protéine FANCI pourrait elle aussi posséder ses propres rôles. Cependant, les études biochimiques ont certaines limites, comme par exemple l’impossibilité d’étudier in vitro des processus biologiques trop complexes. La création de modèles animaux peut être une solution. Pour répondre aux interrogations portées sur les fonctions de la protéine FANCI, nous avons décidé de caractériser un nouveau modèle murin Fanci-/- et de le comparer à la souris Fancd2-/-, déjà décrite dans la littérature. Nos résultats indiquent d’une part plusieurs rôles épistatiques avec FANCD2 et d’autre part un rôle propre dans le cadre de la gamétogenèse. En conclusion, cette thèse apporte un tout nouveau modèle animal pour étudier l’AF et plus spécifiquement FANCI. Elle apporte aussi les preuves physiologiques d’un rôle de FANCI indépendant au complexe ID2, ce qui viendrait nuancer le mécanisme biochimique actuellement établi. / Nowadays, about 2000 patients have been diagnosed with Fanconi Anemia (FA). At a cellular level, this rare disease is caused by a defect in reparing a specific type of DNA damage: Interstrand CrossLinks (ICLs). Both transcription and replication can be compromised by ICLs, and therefore long term cell survival. The FA-BRCA pathway is in charge of detecting DNA lesions caused by ICLs and activating their repair, and counts now more than twenty proteins. At a macroscopic level, FA diagnosis is complex due to various and not systematic symptoms: pancytonemia, congenital and developmental defects, and cancer predisposition. As most of FA symptoms are not exclusive to the disease, concerns and interests are multiple. As a consequence, Fanconi Anemia represents an interesting model of study, when it comes to work on oncogenesis, hematopoiesis, gametogenesis, and DNA repair. The description of the molecular mechanism is improving, although many questions remain. Among them, the exact role of the ID2 complex, formed by FANCI and FANCD2 proteins, remains nebulous. More and more studies have been describing unique functions for FANCD2, leading to the hypothesis of independent functions for FANCI. As complex physiological processes can not be studied in vitro, creating and studying animal models represents an interesting alternative. In order to answer the questions raised on FANCI functions, we have decided to create and characterize the new Fanci-/- mouse model, with a possible comparison with the already described Fancd2-/- mouse. Our results show epistatic roles with FANCD2 on one hand, and independent functions of FANCI during gametogenesis on the other hand. To conclude, this thesis brings a strong and new mouse model to study Fanconi Anemia and more specifically the roles of FANCI. It also gives some physiological proofs that FANCI can act independently of the ID2 complex, which could slightly nuance the actual molecular pathway.

L’anémie de Fanconi (AF) est une maladie génétique récessive caractérisée par des anomalies congénitales, une défaillance progressive de la moelle osseuse, une hypersensibilité aux pontages inter-brins de l’ADN (ICLs) et une susceptibilité à développer le cancer. La voie AF implique au minimum 20 gènes FANC (FANCA-FANCU) et les protéines encodées par ces gènes interagissent également dans une voie cellulaire connue permettant la résistance des cellules aux ICLs de l’ADN. Les agents pontants qui génèrent les ICLs lient de manière covalente les deux brins de l’ADN, créant de ce fait une obstruction physique aux processus cellulaires qui nécessitent le déroulement des deux brins d’ADN tels que la réplication de l’ADN et la transcription. La monoubiquitination de FANCI et FANCD2 par la E3 ubiquitine ligase FANCL est l’évènement culminant de l’activation de la voie AF. Ce processus est dépendant des protéines FANC ayant un rôle en amont de cette étape. Le complexe moléculaire formé par FANCI et FANCD2 coordonne plusieurs événements de la voie AF à la suite de sa monoubiquitination. Tout au long de mon travail de doctorat, nous avons étudié différents aspects de la voie de l’anémie de Fanconi. Nous avons montré deux importants domaines de liaison à l’ADN dans FANCD2 dans lesquels se trouvent six acides aminés polaires, principalement des résidus lysines, très conservés à travers l’évolution. Ces domaines contribuent de manière importante à la liaison à l’ADN dépendante des charges spécifiques. Un de ces domaines de liaison à l’ADN s’avère être également une séquence de localisation nucléaire (NLS) dont la mutation empêche la localisation nucléaire de FANCD2. Les mutants cytoplasmiques de FANCD2 ont aboli leur monoubiquitination et furent incapables de promouvoir la monoubiquitination de FANCI, de même que l’association à la chromatine. Lorsque les défauts de transport nucléaire sont complémentés par un NLS hétérologue, il en résulte une réduction de la monoubiquitination de FANCD2. Ainsi, nos résultats suggèrent que le domaine de liaison à l’ADN et le NLS identifiés dans cette étude soient des régions cruciales de FANCD2. Les cassures double-brins de l’ADN (CDB) sont un autre aspect de la voie de AF qui a fait l’objet de nos études. Les CDB sont des structures intermédiaires formées au moment du décrochage (« unhooking ») du pont inter-brin lors du processus de résolution des ICLs. Nous avons attribué de nouvelles fonctions pour la protéine FANCG dans l’inhibition de la résection des extrémités d’ADN générées par la CDB, affectant ainsi le choix de la voie de réparation de l’ADN. Cette fonction de FANCG est indépendante des autres protéines FANC ayant un rôle en amont, à l’exception de la protéine FANCA. Nous avons également mis en lumière de nouvelles fonctions pour les protéines AF/cancer du sein BRCA2 et PALB2 aux fourches de réplication bloquées. Puis, nous avons également montré qu’un rôle pour ces protéines consiste en la stimulation de la polymérase eta (Polη) afin d’initier la synthèse de l’ADN. En effet, BRCA2 et PALB2 interagissent avec Polη et sont requises pour le recrutement de cette polymérase aux fourches de réplication bloquées. De plus, elles stimulent la synthèse d’ADN dans la D-Loop via la stimulation de la Polη, un élément essentiel à ce processus. Nous concluons donc que PALB2 et BRCA2, en plus de leurs fonctions dans la stimulation de la formation de la D-Loop par RAD51, jouent un rôle crucial dans la synthèse d’ADN associée à la recombinaison via la réparation de l’ADN régulée par la Polη. / Fanconi anemia (FA) is a recessive genetic disorder characterized by congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, DNA interstrand cross-links (ICLs) hypersensitivity, and cancer susceptibility. The FA pathway consists of at least 20 FANC genes (FANCA-FANCU), and the encoded protein products interact in a common cellular pathway to gain resistance against DNA ICLs. The ICL-producing agents covalently cross-link two DNA strands and thus, are obstructions to processes which requires unwinding of the two DNA strands such as DNA replication, and transcription. FA pathway activation culminates in the monoubiquitination of FANCD2 and FANCI proteins by E3 ubiquitin ligase FANCL, a process dependent on other upstream FA proteins. The molecular complex formed by FANCI and FANCD2 coordinates multiple events in the FA pathway upon its monoubiquitination. Throughout my doctoral work, we studied various aspects of the FA pathway. We have demonstrated two major DNA binding motifs (DBMs) in FANCD2, comprising of six evolutionally conserved polar amino acids predominantly consisting of lysine, which contributed to the specific charge dependent DNA binding. One of the DBM also consisted of a nuclear localization sequence (NLS), disruption of which abrogated the nuclear localization of FANCD2. The cytoplasmic mutants of FANCD2 had abolished monoubiquitination and were unable to promote FANCI monoubiquitination and chromatin association. Complementation of the nuclear transport defect by a heterologous NLS resulted in the reduction of FANCD2 monoubiquitination. Our results suggest that the DNA binding and NLS identified in this study are crucial regions of FANCD2. DNA double-strand breaks (DSB) are produced as one of the structural intermediates upon ICL unhooking step. We assigned novel functions to the FA protein FANCG in limiting the DNA end-resection, and thus it affects the repair pathway choice. This function of FANCG is independent of other upstream FA proteins except FANCA. We also reveal new functions for FA/breast cancer proteins BRCA2 and PALB2 at blocked replication forks and show a role for these proteins in stimulating polymerase eta (Polη) to initiate DNA synthesis. PALB2 and BRCA2 interact with Polη, and are required to sustain the recruitment of Polη at blocked replication forks. PALB2 and BRCA2 stimulate Polη-dependent DNA synthesis on Displacement loop (D-loop) substrates. We conclude that PALB2 and BRCA2, in addition to their functions in stimulating D-loop formation by RAD51, play crucial roles in the initiation of recombination-associated DNA synthesis by Polη-mediated DNA repair.