Made available in DSpace on 2017-07-10T19:24:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simone Maria Menegatti de Oliveira.pdf: 745176 bytes, checksum: 3a5240485b0941a0c7d894af6e3b5ade (MD5) Previous issue date: 2010-07-07 / 2-phenylethanol is the most used fragrance in the food, cosmetics and fragrance industry. It is mainly produced by chemical process, but with many impurities. The biotechnological process of production is feasible and is being studied with various microrganisms, among them, Geotrichum fragrans, Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus. The use of cassava wastewater as substrate in this process makes it less expensive and reduce environmental pollution caused by it. The objective or this work was to evaluate the production of 2-phenylethanol in the cultivation of Geotrichum fragrans, Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus in cassava wastewater, analyzing the effect of two carbon sources on production of the aroma, besides increasing the production of 2 - phenylethanol to the greater efficiency of conversion carbon source/2-feniletanol, varying concentrations of carbon source and phenylalanine at cassava wastewater. For this, the three microrganisms mentioned were cultured in 50mL cassava wastewater plus 50g.L-1 of glucose and 3g.L-1 of L-phenylalanine in sterile Erlenmeyer flasks, on shaker at 150 rpm, 24 ° C for 120 hours, to check the time of peak production of 2-phenylethanol and what microrganism largest producer. It was then checked the production of aroma with 50g.L-1 of glucose and fructose, while maintaining the same amount of L-phenylalanine. And finally, by fatorial design, were tested concentrations of glucose and L-phenylalanine, in order to obtain higher yield and bioconversion of 2-phenylethanol. The experimental model was validated. It was analyzed in the pH, COD, reducing sugars, L-phenylalanine and 2-phenylethanol. In the precipitate was quantified indirectly as biomass, the Volatile Suspended Solids. The results showed that S. cerevisiae was the best producer of 2-phenylethanol in the effluent of cassava starch, obtaining 0.74 g.L-1, followed by K. marxianus, with 0.19 g.L-1 and finally by G. fragrans with 0.08 g.L-1. Glucose was the best carbon source for obtention of 2- phenylethanol for S. cerevisiae and K. marxianus. There was no significant difference between the production of 2-phenylethanol using glucose or fructose for G. fragrans. The best combination of glucose and L-phenylalanine for production of 2-phenylethanol, was 20,0 and 5.5 g.L-1 respectively, obtaining production of 1.33 g.L-1of aroma in the validation. / O 2-feniletanol é a fragrância mais utilizada na indústria de alimentos, cosmética e de perfumes. É produzido principalmente por processo químico, porém com muitas impurezas. O processo biotecnológico de produção é viável e está sendo estudado com vários microrganismos, entre eles, o Geotrichum fragrans (GF), Saccharomyces cerevisiae (SC) e Kluyveromyces marxianus (KM). O uso de resíduo líquido de fecularia como substrato neste processo torna-o menos dispendioso, além de reduzir a poluição ambiental causada pelo mesmo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de 2-feniletanol no cultivo de GF, SC e KM em resíduo líquido de fecularia, analisando o efeito de duas fontes de carbono na produção do aroma, além de aumentar a produção de 2-feniletanol até a maior eficácia de conversão fonte de carbono/2-feniletanol, variando as concentrações da fonte de carbono e de fenilalanina no resíduo líquido de fecularia. Para isso, os três microrganismos citados foram cultivados em 50 ml de resíduo líquido de fecularia, acrescidos de 50 g.L-1 de glicose e 3 g.L-1 de L-fenilalanina, em frascos erlenmeyers estéreis, em agitador a 150 rpm, 24 ºC, por 120 h, para verificar o tempo de maior produção de 2-feniletanol e qual microrganismo maior produtor. Foi então verificada a produção de aroma com 50g.L-1 de glicose e frutose, mantendo a mesma quantidade de L-fenilalanina. E finalmente, através de planejamento fatorial, foram testadas concentrações de glicose e L-fenilalanina, a fim de se obter maior produção e bioconversão de 2-feniletanol. O modelo experimental foi validado. Analisou-se o pH, a DQO, os açúcares redutores, a L-fenilalanina e o 2-feniletanol. No precipitado foi quantificada a biomassa indiretamente como sólidos suspensos voláteis. Os resultados obtidos demonstraram que SC foi o melhor produtor de 2-feniletanol em água residual de fecularia de mandioca, obtendo 0,74 g.L-1, seguido pelo K. marxianus, com 0,19 g.L-1 e por último pelo G. fragrans, com 0,08 g.L-1. A glicose foi a melhor fonte de carbono para obtenção do 2-feniletanol para S. cerevisiae e K. marxianus. Não houve diferença significativa entre a produção de 2-feniletanol utilizando glicose ou frutose para o G. fragrans. A melhor conjugação dos níveis de glicose e L-fenilalanina para produção de 2- feniletanol foi de 20,0 e 5,5 g.L-1 respectivamente, obtendo produção de 1,33 g.L-1do aroma na validação.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

Made available in DSpace on 2017-05-12T14:48:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simone Maria Menegatti de Oliveira.pdf: 745176 bytes, checksum: 3a5240485b0941a0c7d894af6e3b5ade (MD5) Previous issue date: 2010-07-07 / 2-phenylethanol is the most used fragrance in the food, cosmetics and fragrance industry. It is mainly produced by chemical process, but with many impurities. The biotechnological process of production is feasible and is being studied with various microrganisms, among them, Geotrichum fragrans, Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus. The use of cassava wastewater as substrate in this process makes it less expensive and reduce environmental pollution caused by it. The objective or this work was to evaluate the production of 2-phenylethanol in the cultivation of Geotrichum fragrans, Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces marxianus in cassava wastewater, analyzing the effect of two carbon sources on production of the aroma, besides increasing the production of 2 - phenylethanol to the greater efficiency of conversion carbon source/2-feniletanol, varying concentrations of carbon source and phenylalanine at cassava wastewater. For this, the three microrganisms mentioned were cultured in 50mL cassava wastewater plus 50g.L-1 of glucose and 3g.L-1 of L-phenylalanine in sterile Erlenmeyer flasks, on shaker at 150 rpm, 24 ° C for 120 hours, to check the time of peak production of 2-phenylethanol and what microrganism largest producer. It was then checked the production of aroma with 50g.L-1 of glucose and fructose, while maintaining the same amount of L-phenylalanine. And finally, by fatorial design, were tested concentrations of glucose and L-phenylalanine, in order to obtain higher yield and bioconversion of 2-phenylethanol. The experimental model was validated. It was analyzed in the pH, COD, reducing sugars, L-phenylalanine and 2-phenylethanol. In the precipitate was quantified indirectly as biomass, the Volatile Suspended Solids. The results showed that S. cerevisiae was the best producer of 2-phenylethanol in the effluent of cassava starch, obtaining 0.74 g.L-1, followed by K. marxianus, with 0.19 g.L-1 and finally by G. fragrans with 0.08 g.L-1. Glucose was the best carbon source for obtention of 2- phenylethanol for S. cerevisiae and K. marxianus. There was no significant difference between the production of 2-phenylethanol using glucose or fructose for G. fragrans. The best combination of glucose and L-phenylalanine for production of 2-phenylethanol, was 20,0 and 5.5 g.L-1 respectively, obtaining production of 1.33 g.L-1of aroma in the validation. / O 2-feniletanol é a fragrância mais utilizada na indústria de alimentos, cosmética e de perfumes. É produzido principalmente por processo químico, porém com muitas impurezas. O processo biotecnológico de produção é viável e está sendo estudado com vários microrganismos, entre eles, o Geotrichum fragrans (GF), Saccharomyces cerevisiae (SC) e Kluyveromyces marxianus (KM). O uso de resíduo líquido de fecularia como substrato neste processo torna-o menos dispendioso, além de reduzir a poluição ambiental causada pelo mesmo. O objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de 2-feniletanol no cultivo de GF, SC e KM em resíduo líquido de fecularia, analisando o efeito de duas fontes de carbono na produção do aroma, além de aumentar a produção de 2-feniletanol até a maior eficácia de conversão fonte de carbono/2-feniletanol, variando as concentrações da fonte de carbono e de fenilalanina no resíduo líquido de fecularia. Para isso, os três microrganismos citados foram cultivados em 50 ml de resíduo líquido de fecularia, acrescidos de 50 g.L-1 de glicose e 3 g.L-1 de L-fenilalanina, em frascos erlenmeyers estéreis, em agitador a 150 rpm, 24 ºC, por 120 h, para verificar o tempo de maior produção de 2-feniletanol e qual microrganismo maior produtor. Foi então verificada a produção de aroma com 50g.L-1 de glicose e frutose, mantendo a mesma quantidade de L-fenilalanina. E finalmente, através de planejamento fatorial, foram testadas concentrações de glicose e L-fenilalanina, a fim de se obter maior produção e bioconversão de 2-feniletanol. O modelo experimental foi validado. Analisou-se o pH, a DQO, os açúcares redutores, a L-fenilalanina e o 2-feniletanol. No precipitado foi quantificada a biomassa indiretamente como sólidos suspensos voláteis. Os resultados obtidos demonstraram que SC foi o melhor produtor de 2-feniletanol em água residual de fecularia de mandioca, obtendo 0,74 g.L-1, seguido pelo K. marxianus, com 0,19 g.L-1 e por último pelo G. fragrans, com 0,08 g.L-1. A glicose foi a melhor fonte de carbono para obtenção do 2-feniletanol para S. cerevisiae e K. marxianus. Não houve diferença significativa entre a produção de 2-feniletanol utilizando glicose ou frutose para o G. fragrans. A melhor conjugação dos níveis de glicose e L-fenilalanina para produção de 2- feniletanol foi de 20,0 e 5,5 g.L-1 respectivamente, obtendo produção de 1,33 g.L-1do aroma na validação.

A cistinose é uma desordem sistêmica de estocagem autossômica recessiva hereditária rara, causada pelo transporte deficiente de cistina através da membrana lisossomal.. O acúmulo excessivo de cistina dentro dos lisossomos leva à destruição tecidual por mecanismos ainda não totalmente compreendidos. O acúmulo de cistina no sistema nervoso central pode provocar sintomas neurológicos tais como: convulsões, tremores e retardo mental. A hipertriptofanemia é uma desordem metabólica rara, provavelmente causada por um bloqueio na conversão do triptofano a quinurenina, acumulando triptofano e alguns de seus metabólitos no plasma e tecidos dos pacientes. Os pacientes apresentam retardo mental leve a moderado com respostas afetivas exageradas, mudanças periódicas de humor, comportamento hipersexual, e ataxia, além de erosões cutâneas de hipersensibilidade e retardo no crescimento. A fenilcetonúria é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência severa na atividade da enzima fenilalanina hidroxilase hepática que converte fenilalanina em tirosina. Esta doença é bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de fenilalanina e seus metabólitos, fenilpiruvato, fenillactato, fenilacetato, feniletilamina e O-hidroxifenilacetato no sangue e outros tecidos. Pacientes não tratados podem apresentar severo retardo mental e psicomotor e, em alguns pacientes, irritabilidade, movimentos despropositados, reflexos diminuídos dos tendões, convulsões, formação deficiente de mielina e microcefalia. Apesar de haver um consenso sobre o papel da fenilalanina no dano cerebral, os mecanismos pelos quais a fenilalanina é neurotóxica parece serem múltiplos e ainda pouco conhecidos. Estas 3 doenças: fenilcetonúria, hipertriptofanemia e cistinose são caracterizadas como Erros Inatos do Metabolismo. Os pacientes afetados por qualquer uma destas patologias apresentam uma característica clínica comum: o dano cerebral. Considerando que o metabolismo energético parece estar alterado nas três doenças e que a piruvatoquinase é uma enzima crucial para o metabolismo da glicose e liberação/armazenamento de energia para o cérebro, decidimos estudar o efeito dos três aminoácidos acumulados nestas doenças (fenilalanina, triptofano e cistina) sobre a atividade desta enzima em córtex cerebral de ratos, já que a alteração da atividade dessa enzima poderia contribuir para o dano cerebral característico nestes pacientes. Os estudos in vitro e in vivo mostraram que a o fenilalanina e o triptofano inibem a atividade da piruvtoquinase e que esta inibição pode pode ser prevenida por alanina. Quanto à cistina, os estudos in vitro mostraram que este aminoácido inibe a atividade da piruvatoquinase por dois mecanismos distintos, um dos quais parece envolver os grupos tiólicos da enzima e que pode ser prevenido e revertido pela cisteamina. Os estudos cinéticos sugeriram que a piruvatoquinase possui um sítio de ligação para aminoácidos (e talvez para alguns derivados de aminoácidos, como o fenilpiruvato) regulando a atividade da enzima. Se a inibição da atividade da piruvatoquinase também ocorrer nos pacientes afetados pelas doenças estudadas, é possível que medidas tais como a suplementação dietética de alanina e de glicose para os pacientes com fenilcetonúria e hipertriptofanemia e de cisteamina para os pacientes com cistinose, sejam benéficas. Entretanto, mais estudos são necessários antes de considerar o uso de tais medidas para os pacientes.

Introdução: Estudos recentes, utilizando vários protocolos, têm demonstrado que pacientes com Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH) podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de fenilalanina (Phe) mediante a administração de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Determinar, em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH, a responsividade à administração de dose única de BH4 por meio de um protocolo incluindo o teste de sobrecarga simples de Phe e o teste combinado de sobrecarga de Phe+BH4. Métodos: Foram incluídos no estudo pacientes com idade ≥ 4 anos, em tratamento dietético e que possuíam mediana de Phe plasmática inferior a 10mg/dL no ano anterior à inclusão. Foram realizados teste de sobrecarga simples de Phe, utilizando 100mg/kg de L-Phe (Teste 1) e teste combinado de Phe+BH4, utilizando 100mg/kg de L-Phe e 20mg/kg de BH4 (Teste 2), com intervalo de uma semana entre ambos. A ingestão do BH4 ocorreu após três horas da ingestão da Phe. Foram realizadas coletas de sangue no ponto basal e após três, 11 e 27h da ingestão de Phe (T0, T1, T2 e T3 dos testes 1 e 2, respectivamente). Para ser considerado responsivo, o paciente deveria apresentar evidência de redução dos níveis de Phe associada à administração do BH4 de acordo com pelo menos um dos seguintes critérios: critério A – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 dos Testes 1 e 2; critério B – análise das diferenças, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 dos Testes 1 e 2 e critério C – análise da diferença, em percentual, das áreas abaixo da curva de Phe entre os Testes 1 e 2. A classificação de responsividade foi também comparada com quatro critérios adicionais: critério D – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T2 do Teste 2; critério E – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe nos pontos T1 e T3 do Teste 2; cinco pacientes participaram de estudo anterior do grupo e foram também classificados através do critério F – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 8h da sobrecarga simples com BH4 e do critério G – análise da diferença, em percentual, dos valores de Phe após 24h da sobrecarga simples com BH4. Para todos os critérios foi utilizado como ponte de corte redução ≥ 30%. Resultados: Dezoito pacientes, com mediana de idade de 12 anos, participaram do estudo. Dez pacientes apresentavam a forma Leve de HPA-PAH e oito a forma Clássica. Seis pacientes foram considerados responsivos de acordo com os critérios adotados (Clássica: 2; Leve: 4). Houve concordância de responsividade entre os critérios A e B em relação ao C (Índice Kappa=0,557; p=0,017). Dos pacientes com genótipo disponível (n=16), seis possuíam dados de responsividade ao BH4 descritos na literatura, que foram concordantes com os encontrados no presente estudo. Conclusão: Dados relativos à responsividade, tipo de HPA-PAH e genotipagem estão de acordo com descrito na literatura. Haja vista a diferença de responsividade dos pacientes ao BH4 conforme o critério de classificação utilizado, salienta-se a importância de uma definição cautelosa de responsividade e que não seja baseada em um único critério. A comparação entre a sobrecarga simples de Phe e combinada de Phe+BH4 parece ser um critério adequado para avaliar responsividade ao BH4 em pacientes com HPA-PAH que apresentam bom controle metabólico quando em tratamento dietético. / Introduction: Recent studies using different protocols showed that patients with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH) may have a reduction in phenilalanine (Phe) plasma concentrations after tetrahydrobiopterin (BH4) administration. Objective: To determine responsiveness to the administration of a single dose of BH4, in a sample of Brazilian patients with HPA-PAH using a protocol that includes the simple Phe loading test and the combined Phe+BH4 loading test. Methods: Patients included in the study were ≥ 4 years of age; their median Phe plasma concentration was ≤ 10mg/dL, and all underwent dietary treatment in the 12 months before inclusion in the study. Participants received a simple Phe loading test using 100mg/kg L-Phe (Test 1) and a combined Phe+BH4 loading test using 100mg/kg L-Phe and 20mg/kg /BH4 (Test 2) at a one-week interval. BH4 was ingested three hours after Phe ingestion. Blood samples were collected at baseline and three, 11 and 27h after Phe ingestion (time points T0, T1, T2 and T3 in Tests 1 and 2). To be classified as responsive, there should be evidence that the patient had a reduction in Phe levels associated with BH4 administration according to at least one of the criteria used: criterion A – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Tests 1 and 2; criterion B – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Tests 1 and 2; and criterion C – analysis of percentage differences of the areas under the Phe curve for Tests 1 and 2. Responsiveness classifications were also compared according to four additional criteria: criterion D – analysis of percentage differences of the Phe values at time points T1 and T2 for Test 2; criterion E – analysis of percentage differences of Phe values at time points T1 and T3 for Test 2; criterion F – analysis of percentage difference of Phe values 8h after simple BH4 loading used for five patients that participated in a previous study conducted by the same authors; and criterion G – analysis of percentage difference of Phe values 24 h after simple BH4 loading, also used for the patients in the same previous study. The cut-off point for all criteria was a reduction of ≥ 30%. Results: Eighteen patients (median age = 12 years) were included in the study. Ten patients had mild HPA-PAH and eight, classical HPA-PAH. Six patients were responsive according to the criteria used (Classical: 2; Mild: 4). Responsiveness was concordant for criteria A and B when compared with criterion C (kappa=0.557; p=0.017). Of the patients whose genotype was available (n=16), six had data about BH4 responsiveness described in the literature, and these data were in agreement with our findings. Conclusion: Data about responsiveness, HPA-PAH type and genotype were in agreement with those described in the literature. The difference in BH4 responsiveness of patients according to classification criterion emphasizes the importance of a careful definition of responsiveness not based on a single criterion. The comparison of simple Phe loading and combined Phe+BH4 loading seems to be an adequate criterion to evaluate responsiveness to BH4 in patients with HPA-PAH and good metabolic control when following a dietary treatment.

Introdução: A Hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPAPAH) é um erro inato do metabolismo no qual ocorre aumento dos níveis séricos de fenilalanina (Phe). Estudos recentes, realizados em várias populações, demonstraram que pacientes com HPA-PAH podem apresentar redução das concentrações plasmáticas de Phe mediante a administração oral de tetrahidrobiopterina (BH4). Objetivo: Identificar em uma amostra de pacientes brasileiros com HPA-PAH aqueles que são responsivos à administração de BH4 por via oral. Métodos: Para um paciente ser incluído no estudo, era necessário ter diagnóstico de HPA-PAH e idade igual ou superior a 7 anos, estar em tratamento dietético e apresentar nível de Phe igual ou superior a 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. No dia anterior à sobrecarga de BH4 (Dia 1), os pacientes foram submetidos a três coletas de sangue para mensuração dos níveis de Phe. No Dia 2, os pacientes receberam dose única de 20mg/Kg de BH4. As coletas de sangue foram, então, realizadas nos pontos de hora: 0, 4 e 8h (Dia 2) e 24h (Dias 3) após a ingestão do medicamento. Os níveis de Phe foram determinados através da espectrometria de massa in tandem. Foram utilizados dois critérios para definir a presença de responsividade ao BH4: Critério 1: redução 30% de Phe após 8h da administração do medicamento; Critério 2: redução 30% de Phe após 24h da administração do medicamento. Resultados: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo, com mediana de idade de 14 anos, sendo 66,7% do sexo masculino. Onze apresentavam a forma clássica da doença e três a forma atípica. Três (forma clássica: 1, forma atípica: 2) e cinco (forma clássica: 2, forma atípica: 2 e forma não-definida: 1) pacientes foram considerados responsivos ao BH4 conforme critérios 1 e 2, respectivamente. Os níveis de Phe plasmáticos do dia anterior ao teste de sobrecarga não demonstraram variação nos pontos de hora (p=0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora do dia pré e pós BH4, encontrou-se variação significativa entre eles (p=0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo, para os pacientes com dados disponíveis (n=6) mostrou que a mesma é multifatorial. Conclusão: Nossos achados estão de acordo com a literatura, e indicaram que um número considerável de pacientes brasileiros com HPA-PAH poderá ser beneficiado com a administração oral de BH4. / Introduction: Hyperphenylalaninemia by phenylalanine hydroxylase deficiency (HPAPAH) is an inborn error of metabolism in which increased serum levels of phenylalanine (Phe) occur. Recent studies on several populations showed that patients with HPA-PAH can have their serum levels reduced when receiving oral tetrahydrobiopterin (BH4). Objective: to identify in a sample of Brazilian HPA-PAH the patients who are responsive to the oral administration of BH4. Methods: the following inclusion criteria were used: diagnosis of HPA-PAH, age 7 years, on dietary treatment and Phe levels 6 mg/dL in all tests performed one year prior to the inclusion in this study. On the day before the BH4 challenge (Day 1) 3 blood samples were obtained to measure Phe levels. Blood samples were also obtained at time points 0, 4, 8 hours (Day 2) and 24 h (Day 3) after the intake of the medication. Phe levels were determined by tandem mass spectrometry. Criteria used to define responsiveness to BH4 were: Criterion 1: Phe reduction 30% 8 hours after BH4 administration; Criterion 2: Phe reduction 30% 24 hours after BH4 administration. Results: a total of 18 patients with a mean age of 14 years were included in this study; of those, 66.7% were male. Eleven presented the classical form of the disease and 3, the atypical form. Three patients (classical form: 1, atypical form: 2) and 5 (classical form: 2; atypical form: 2; undefined form: 1) were considered responsive to BH4 according to criteria 1 and 2, respectively. Phe serum levels on the Day 1 did not show any change on the established time point schedule (p=0.523). However, when comparing levels of Phe between Days 1 and 2, significant variation was found (p=0.006). The phenotype – genotype association analysis of patients with available data (n=6) showed that the association is multifactorial. Conclusion: In accordance with the literature, our findings show that many Brazilian patients with HPA-PAH can benefit from the oral administration of BH4.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Retido.pdf: 19733 bytes, checksum: 6aad255badc436a06364517de2344ab6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-31 / Universidade Federal de Minas Gerais / The project "Metabolic, enzymatic and genetic studies of the endophytic fungus P. brasilianum" resulted in biosynthetic studies of bisphenylpropanoid amides, the brasilimides, confirming the origin of these substances via phenylpropanoid biosynthesis pathway, very unusual in fungi. PAL activity, the first enzyme involved in this biosynthetic route was successfully evaluated and the conditions of PAL production by P. brasilianum were optimized (culture medium and induction of PAL adding Phe to the culture), and the incubation conditions of the enzymatic reaction. The specificity of the PAL enzyme was studied, and the enzyme showed activity toward all substrates tested, including acting as TAL (tyrosine ammonia lyase). In vivo studies throught the addition of different substrates lead to N-acetylation confirmed by spectroscopy data. The genome of the fungus P. brasilianum was sequenced, and extensive studies through bioinformatics lead to the gene encoding PAL enzyme. From molecular biology studies, the enzyme was cloned and expressed as recombinant PAL fused to a SUMO protein and a his-tag at the N- terminus of the protein in pETSUMO vector expressed in E. coli BL21 (DE3) to obtain the best conditions for enzyme overexpression in its soluble form. The purification process of the recombinant enzyme was studied from a single purification step (affinity chromatography) by pH gradient elution, obtaining a high degree of purity confirmed by one-dimensional electrophoresis. The pure recombinant PAL enzyme obtained was characterized by MS and biochemically yielding Km values of 4,8 mM. Recent studies seem to point out that there is a relationship between the production of brasiliamides when the fungus is subjected to stress conditions. The PAL enzyme appears to be involved in defense mechanisms in this fungus, as has been described for plants. / O projeto "Estudos metabólicos, enzimáticos e genéticos do fungo endofítico P. brasilianum" tratou de investigações biossintéticas das amidas bisfenilpropanoídicas, as brasiliamidas, confirmando a origem fenilpropanoídica destas substâncias, muito incomum em fungos. A atividade da enzima Fenilalanina amônia-liase, primeira da rota biossintética, foi avaliada pela primeira vez no fungo em estudo, e as condições da produção de PAL por P. brasilianum foram otimizadas (meio de cultivo e indução ao adicionar fenilalanina ao cultivo), assim como as condições de incubação da reação enzimática. A especificidade da enzima foi determinada a qual se apresentou altamente promíscua em todos os substratos testados, inclusive atuando como TAL (tirosina amônia-liase). In vivo, a adição de diferentes precursores ao meio de cultivo levou a N-acetilação destes confirmado por dados espectroscópicos. O genoma do fungo P. brasilianum foi sequenciado, e através de extensos estudos de bioinformática pode-se determinar o gene que codifica a enzima PAL. A partir de estudos de biologia molecular foi possível clonar e expressar a enzima PAL recombinante fusionada a uma proteína SUMO e uma cauda polihis no N-terminal da proteína em vetor pETSUMO expresso em E. coli BL21(DE3) obtendo-se, dessa maneira, as melhores condições para superexpressão enzimática na forma solúvel. O processo de purificação da enzima recombinante foi estudado a partir de um único passo de purificação (coluna de afinidade) por gradiente de pH, obtendo alto grau de pureza comprovado através de eletroforese monodimensional. A enzima PAL recombinante pura obtida foi caracterizada por MS e bioquimicamente obtendose valores de Km de 4,8 mM. Estudos parecem deixar claro que exista uma relação entre a produção de brasiliamida A quando o fungo é submetido a situações de estresse, seguindo mesmo comportamento relatado em plantas e, portanto, a enzima PAL parece estar envolvida em mecanismos de defesa neste fungo.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2236.pdf: 4508455 bytes, checksum: da224f07c31e180bc11a5171a3f168f6 (MD5) Previous issue date: 2009-02-12 / Universidade Federal de Minas Gerais / In the present work it was developed analytical methodologies for investigation of biosynthesis of bis-phenylpropanoyl amides, using labeled precursors in the culture medium. The effect of different nitrogen sources on the bis-phenylpropanoyl amides production was also evaluated. These amides are reported as antiparasitary compounds and they also showed activity against gram-positive Bacillus subtilis in bioassays conducted at LaBioMMi (DQ/UFSCar). The analytical methodologies developed were based on High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Mass Spectrometry techniques, mainly electrospray ionization (ESI) and MS/MS. Using the methodologies developed for preparative liquid chromatography it were isolated the bis-phenylpropanoyl amides, brasiliamide A and B and other secondary metabolites co-produced. Liquid chromatography coupled with mass spectrometry techniques allowed fragmentation studies which lead to selective detection experiments of brasiliamides in mediums enhanced with different nitrogen sources. The quantitative analysis (HPLC/UV-MS/MS) indicated great influence of the amino acid L-phenylalanine on the bis-phenylpropanoyl amides production. From these results, the biosynthesis of the phenylapropanoids was investigated using [2-13CPhe]. The RMN 13C and HPLC/UV-MS analysis showed the incorporation of two amino acid units on brasiliamides structure formed by the phenylpropanoids pathway, which is uncommon in fungi. The first phenylpropanoid pathway step was evaluated throw using enzymatic extract with Phenylalanine ammoniolyase (PAL). The HPLC/UV analysis indicates the formation of cinnamic acid from Lphenylalanine. / ESTUDOS BIOSSINTÉTICOS DE AMIDAS BIS-FENILPROPANOÍDICAS PRODUZIDAS PELO FUNGO Penicillium brasilianum, UM ENDOFÍTICO DE Melia azedarach. Foi o título do trabalho no qual foram desenvolvidas metodologias de análise para a investigação da biossíntese de amidas bisfenilpropanoídicas, pela adição de precursores isotopicamente marcados ao meio de cultura e otimização da produção destas amidas pelo micro-organismo quando submetido à variadas fontes nitrogenadas. As amidas, substâncias relatadas como bons antiparasitários, apresentaram também atividade contra a bactéria gram-positiva Bacillus subtilis. As metodologias de análise desenvolvidas foram baseadas em cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e técnicas de espectrometria de massas com ionização por Electrospray (ESI). A utilização da técnica de cromatografia líquida em escala preparativa permitiu o isolamento das amidas bis-fenilpropanoidicas, brasiliamida A e B e ainda, metabólitos secundários co-produzidos com estes compostos. A utilização do acoplamento entre as metodologias de análise LC/MS permitiu, através de estudos de fragmentação MS/MS, determinar condições otimizadas para a detecção seletiva das amidas nos meios de cultura, enriquecidos com diferentes fontes nitrogenadas. As análises quantitativas por HPLC/UV-MS/MS indicaram que o aminoácido L-fenilalanina intensifica a produção das brasiliamidas no extrato fúngico, e, a partir destes resultados, a rota biossintética dos fenilpropanóides produzidos pelo fungo P. brasilianum foi avaliada com a adição de [2-13C-Phe]. As análises dos extratos enriquecidos com aminoácido isotopicamente marcado via RMN 13C e HPLC/UV-MS, indicaram a incorporação de duas unidades do aminoácido L-fenilalanina na estrutura das brasiliamidas e a rota biossintética foi estabelecida a partir do caminho geral dos fenilpropanóides, metabólitos pouco reportados em fungos. A primeira etapa da rota biossintética foi avaliada usando extratos de ensaios enzimáticos com a enzima Fenilalanina Amônioliase (PAL), onde se visualizou a formação do ácido cinâmico a partir do aminoácido Phe através de monitoramento por HPLC/UV.

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-24. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:25:18Z : No. of bitstreams: 1 000827283_20170224.pdf: 283674 bytes, checksum: dd520c1ed7fd12eef6d12c03881b2835 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-02-24T13:00:36Z: 000827283_20170224.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-02-24T13:01:25Z : No. of bitstreams: 1 000827283.pdf: 3781778 bytes, checksum: ae88a63cf2f06243e8181037551b4933 (MD5) / Este trabalho descreve o estudo fitoquímico do extrato etanólico de Paspalum atratum Swalen (Poaceae). O gênero Paspalum é o mais importante das gramíneas no Brasil e possui características compatíveis com a utilização no pastejo. Fenilpropanoides foram isolados por métodos cromatográficos (CC, CLAE) pela primeira vez neste gênero. Estes fenilpropanoides foram identificados como: (R)-ácido rosmarínico, (AR, 1), ácido 3-O-cafeoilquínico (2), fenilalanina (3), ácidos cis- e trans-coumaroilquínico (4 e 5), ácido 5-O-cafeoilquínico (6), ácido 4-O-cafeoilquínico (7) e ácido cafeico (8) pela análise de seus dados de EM, RMN de 1H e de 13C, incluindo COSY, HMBC, HSQC, TOCSY-1D e DOSY, e pela comparação destes dados com aqueles descritos na literatura para estas substâncias. A substância majoritária no extrato etanólico foi o AR (4,4%). Esta foi usada como padrão em análises qualitativas e quantitativas do extrato. Um método eficiente em CLAE-DAD para determinação de AR no extrato foi estabelecido (r2 = 0,9979). O limite de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ) foram 4,00 e 12,13 μg/mL respectivamente, e a faixa de linearidade foi 12,1-100,0 μg/mL. As precisões intradia e interdia do método foram avaliadas pela análise das soluções de padrão AR. O desvio padrão da área do pico do analito foi utilizado como parâmetro de avaliação da precisão intradia, compreendendo o intervalo de 1,57-2,06%. A precisão interdia (7 dias) do método compreendeu o intervalo de 0,54-1,69%. A recuperação, avaliada pela adição do padrão AR, foi satisfatória (75-78%. / This work describes the phytochemical study on ethanol extract from aerial parts of Paspalum atratum Swalen (Poaceae). The Paspalum genus is one of the most important grasses in Brazil and has characteristics compatible with its utilization in pastures for cattle. Phenylpropanoids were isolated by chromatographic methods (CC and HPLC) for the first time in this genus. These phenylpropanoids were identified as (R)-rosmarinic acid (RA, 1), 3-O-caffeoylquinic acid (2), phenylalanine (3), cis- and trans-3-O-coumaroylquinic acids (4 and 5), 5-O-caffeoylquinic acid (6, chlorogenic acid), 4-O-caffeoylquinic acid (7), and caffeic acid (8) by analyses of their MS, 1H and 13C NMR data, including COSY, HMBC, HSQC and DOSY, and comparison of these data with those reported in the literature for these type of compounds. The major compound isolated from the ethanol extract was RA (4.4%). It was used as standard for qualitative and quantitative analyses of extract. An efficient HPLC-DAD method for determination of RA in extract was established (r2 = 0.9979). The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 4.00 and 12.13 μg/mL, respectively, and the validated range was 12.1-100.0 μg/mL. The intra-day and inter-day precisions of the method were evaluated by analyzing the blank solution spiked by RA. The standard deviation (SD) as evaluation parameter for the intra-day precision of peak area of target analyte was in the range of 1.57-2.06%. The inter-day precision (7 days) of the method was in the range of 0.54-1.69%. Satisfactory recovery (75-78%), evaluated by standard additions method, was achieved.