Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatische Erkrankungen 1 1.2 Die rheumatoide Arthritis 2 1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2 1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3 1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4 1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6 1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9 1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10 1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11 1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12 1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13 1.7 Ziel 13 1.7.1 Fragestellungen 14 2 Material und Methoden 16 2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16 2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16 2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16 2.1.3 Die BALB/c-Maus 17 2.2 Tierversuchsplan 18 2.3 Zellkultur 19 2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 2.3.2 Reagenzien 20 2.3.3 Durchführung 21 2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22 2.5 Histologische Aufarbeitung 23 2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23 2.5.2 Reagenzien 24 2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26 2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27 2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.8 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31 3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32 3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35 3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38 3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41 3.2.1 Zellinvasion 41 3.2.2 Pannusformation 45 3.2.3 Knorpeldestruktion 48 3.2.4 Gesamtscore 51 3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56 3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56 3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59 3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62 3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63 4 Diskussion 64 4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65 4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65 4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67 4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69 4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70 4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71 4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73 4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74 4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75 4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76 4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78 4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81 4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83 4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85 4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86 4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87 4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89 Zusammenfassung 94 Literaturverzeichnis 99 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116 Eigenständigkeitserklärung VIII Danksagung IX

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Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit bevorzugtem Befall der Gelenke. Es bestimmen Knorpel- und Knochendestruktionen das Krankheitsbild. Eine Schlüsselrolle in der Pathogenese nehmen proliferierende, synoviale Fibroblasten (RASF) durch Auflösung der extrazellulären Matrix (EZM), durch Interaktion mit immunkompetenten Zellen und durch Produktion pro-inflammatorischer Zytokine ein. Die vorliegende Arbeit zeigt die Migrationseigenschaften von RASF und zwei verschiedenen murinen (LS48) und humanen (TK188) Fibroblastenzelllinien in einem In-vitro-Migrationsassay. Es wird der Einfluss von Antikörpern sowie verschiedener EZM-Komponenten auf die Migration der Zelllinien untersucht. Die nachfolgende Analyse phänotypischer Charakteristika stellt dabei die besondere Rolle der genannten Fibroblastenzelllinien heraus, welche eine Reihe von Gemeinsamkeiten untereinander und mit RASF besitzen. Sie zeigen ebenso erhöhte Migrationsaktivität unter dem Einfluss eines Chemoattraktants und besitzen ähnliche Destruktionsmuster von Kollagenmatrizen. Beide Zellreihen exprimieren mehr RASF-typische Proteasen, Adhäsionsmoleküle und immunologisch agierende Proteine als nicht pathologisch transformierte Fibroblasten. Ebenso weisen sie eine gesteigerte Stoffwechselaktivität und Proliferationstätigkeit auf. Diese in vitro erbrachten Hinweise auf mögliche Knorpeldestruktionen sollten Anlass für weitere In-vivo-Studien zu den genannten Zelllinien geben.

In dieser Arbeit wurden Genexpressionsprofile diffuser und intestinaler Magenadenokarzinome mittels Microarray-Technik erstellt. Der intestinale Typ konnte als stark proliferierender Tumor mit signifikanter Überexpression von zellzyklusrelevanten Genen definiert werden, während der diffuse Typ als stark stromaabhängig mit signifikanter Überexpression von Genen der extrazellulären Matrix hervortrat. Thrombospondin 4 (THBS4) wurde dabei als das am stärksten differentiell exprimierte Gen identifiziert, wobei seine mRNA in diffusen Tumoren eminent überexprimiert wird. Immunhistochemische Studien bestätigten diese starke Überexpression auf Proteinebene und zeigten, dass THBS4 eine übermäßig angereicherte extrazelluläre Komponente des Tumorstromas ist. Kolokalisierungsstudien zeigten zudem, dass THBS4-positive Zellen auch positiv für Vimentin und Smooth muscle actin (alpha) sind. Diese Ergebnisse belegen, dass THBS4 von Tumor-assoziierten Fibroblasten (TAF) exprimiert wird. Dies konnte durch zusätzliche in vitro Experimente bestätigt werden, die aufzeigten, dass TAF von diffusen Tumoren eine stärkere THBS4-mRNA Expression aufweisen als normale Fibroblasten des Magens. Abschließend konnten in vitro Kokultur-Studien aufdecken, dass die THBS4-Expression in Fibroblasten durch Tumorzellen diffuser Magentumore transkriptionell stimuliert wird. Metastasenbefall regionaler Lymphknoten (N+) ist bei den meisten Magenadenokarzinomdiagnosen bereits vorhanden. Dieser ist der stärkste derzeit verfügbare Parameter zur Abschätzung der Prognose, reicht aber für eine eindeutige Vorhersage nicht aus. Um ergänzende molekulare Prognoseindikatoren zu identifizieren, wurden aus den Microarray-Daten Gene, deren Expression mit dem klinischen Verlauf von N+ Patienten korreliert, extrahiert. Einige dieser Gene, z.B. RAN binding protein 17 und ras-related associated with diabetes, konnten mittels quantitativer real-time PCR als Marker für verkürztes progressionsfreies Überleben validiert werden. / In this work, gene expression profiles of diffuse and intestinal-type gastric adenocarcinomas were established using the microarray technique. The intestinal type was identified to be a highly proliferative entity with significant overexpression of cell cycle-relevant genes, whereas the diffuse type was proven to be strongly stroma-dependent with significant overexpression of extracellular matrix genes. Thrombospondin 4 (THBS4) was identified as the gene most differentially expressed between the two types with vast mRNA overexpression in diffuse-type tumors. Immunohistochemical studies proved overexpression on protein level and elucidated that THBS4 is a heavily accumulated extracellular constituent of the tumor stroma. Colocalization studies uncovered that THBS4-positive cells are also positive for vimentin and alpha-smooth muscle actin. These data signify that THBS4 is expressed by subpopulations of cancer-associated fibroblasts (CAFs). This was further evidenced by in vitro experiments demonstrating that THBS4 mRNA expression is increased in CAFs of diffuse-type tumors compared to normal gastric fibroblasts. Finally, in vitro coculture studies revealed that transcriptional THBS4 expression in fibroblasts is stimulated by diffuse-type gastric tumor cells. Metastatic involvement of regional lymph nodes (N+) usually accompanies diagnosis of gastric adenocarcinoma and is currently considered the most important parameter for assessment of prognosis. However, estimation of prognosis based on this parameter alone is not sufficiently reliable. In order to identify additional molecular prognosis markers, genes whose expression correlates with clinical outcome of N+ patients were extracted from the microarray data. Via quantitative real-time PCR, several genes, e.g. RAN binding protein 17 and ras-related associated with diabetes, were successfully validated to allow an expression-based stratification of patients with respect to disease-free survival.

The term "pattern formation" refers to the process by which order unfolds in development. The present thesis deals with a particular aspect of molecular pattern formation during vertebrate embryogenesis. The model system in the focus of this study is the zebrafish, Danio rerio. In the early developmental phases of the zebrafish, Fibroblast growth factors (Fgfs) are involved in the molecular patterning of various tissues, including two regions of the brain, the forebrain and the midbrain-hindbrain region, affecting cellular processes as diverse as cell proliferation, differentiation, and axonal targeting. The goal of this study was to better understand the mechanisms by which Fgf signaling regulates pattern formation and embryogenesis. I addressed this question on several levels, investigating the extent of intracellular signaling (MAPK activation) relative to sources of Fgf expression, and the transcriptional responses of cells to Fgf signaling during embryogenesis. By a macroarray analysis, I identified putative transcriptional targets of Fgf signaling in late gastrulation, providing a set of molecules that are likely to act as functional players in relaying the patterning information encoded by Fgf signals. Among those are the secreted signaling molecules Chordin and Wnt8, as well as Isthmin, a novel secreted molecule that I found capable to interfere with anterior embryonic patterning. In addition, I identified two ETS domain transcription factors, Erm and Pea3, which constitute bona fide integrators of FgfR signaling. By gain- and loss-of-function studies, I demonstrate that transcript levels of erm and pea3 are tightly regulated by Fgf signaling. Detailed analysis of the expression patterns of erm and pea3 along with other Fgf target genes also provides evidence for a differential read-out of Fgf concentration in the embryo, consistent with a role of Fgf as a vertebrate morphogen. The discovery of novel molecular components downstream of Fgf receptor activity paves a way to characterize previously unknown or underestimated developmental roles of Fgfs in the molecular patterning of the forebrain, the eye and parts of the neural crest.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit bevorzugtem Befall der Gelenke. Es bestimmen Knorpel- und Knochendestruktionen das Krankheitsbild. Eine Schlüsselrolle in der Pathogenese nehmen proliferierende, synoviale Fibroblasten (RASF) durch Auflösung der extrazellulären Matrix (EZM), durch Interaktion mit immunkompetenten Zellen und durch Produktion pro-inflammatorischer Zytokine ein. Die vorliegende Arbeit zeigt die Migrationseigenschaften von RASF und zwei verschiedenen murinen (LS48) und humanen (TK188) Fibroblastenzelllinien in einem In-vitro-Migrationsassay. Es wird der Einfluss von Antikörpern sowie verschiedener EZM-Komponenten auf die Migration der Zelllinien untersucht. Die nachfolgende Analyse phänotypischer Charakteristika stellt dabei die besondere Rolle der genannten Fibroblastenzelllinien heraus, welche eine Reihe von Gemeinsamkeiten untereinander und mit RASF besitzen. Sie zeigen ebenso erhöhte Migrationsaktivität unter dem Einfluss eines Chemoattraktants und besitzen ähnliche Destruktionsmuster von Kollagenmatrizen. Beide Zellreihen exprimieren mehr RASF-typische Proteasen, Adhäsionsmoleküle und immunologisch agierende Proteine als nicht pathologisch transformierte Fibroblasten. Ebenso weisen sie eine gesteigerte Stoffwechselaktivität und Proliferationstätigkeit auf. Diese in vitro erbrachten Hinweise auf mögliche Knorpeldestruktionen sollten Anlass für weitere In-vivo-Studien zu den genannten Zelllinien geben.

The term "pattern formation" refers to the process by which order unfolds in development. The present thesis deals with a particular aspect of molecular pattern formation during vertebrate embryogenesis. The model system in the focus of this study is the zebrafish, Danio rerio. In the early developmental phases of the zebrafish, Fibroblast growth factors (Fgfs) are involved in the molecular patterning of various tissues, including two regions of the brain, the forebrain and the midbrain-hindbrain region, affecting cellular processes as diverse as cell proliferation, differentiation, and axonal targeting. The goal of this study was to better understand the mechanisms by which Fgf signaling regulates pattern formation and embryogenesis. I addressed this question on several levels, investigating the extent of intracellular signaling (MAPK activation) relative to sources of Fgf expression, and the transcriptional responses of cells to Fgf signaling during embryogenesis. By a macroarray analysis, I identified putative transcriptional targets of Fgf signaling in late gastrulation, providing a set of molecules that are likely to act as functional players in relaying the patterning information encoded by Fgf signals. Among those are the secreted signaling molecules Chordin and Wnt8, as well as Isthmin, a novel secreted molecule that I found capable to interfere with anterior embryonic patterning. In addition, I identified two ETS domain transcription factors, Erm and Pea3, which constitute bona fide integrators of FgfR signaling. By gain- and loss-of-function studies, I demonstrate that transcript levels of erm and pea3 are tightly regulated by Fgf signaling. Detailed analysis of the expression patterns of erm and pea3 along with other Fgf target genes also provides evidence for a differential read-out of Fgf concentration in the embryo, consistent with a role of Fgf as a vertebrate morphogen. The discovery of novel molecular components downstream of Fgf receptor activity paves a way to characterize previously unknown or underestimated developmental roles of Fgfs in the molecular patterning of the forebrain, the eye and parts of the neural crest.