Orientador: Gisele Faria / Banca: Andrea Soares da Costa Fuentes / Banca: Mário Tanomaru-Filho / Resumo: A solução de ácido peracético (AP) vem sendo citada na literatura odontológica como uma possível solução irrigadora de canais radiculares. Ele apresenta a vantagem de reunir em um só produto atividade antibacteriana e capacidade de remoção de tecido orgânico e de smear layer. Para a seleção da solução irrigadora de canais radiculares deve-se levar em consideração não somente os seus benefícios terapêuticos, mas também os possíveis efeitos citotóxicos, uma vez que ela pode entrar em contato com os tecidos periapicais. O objetivo deste estudo foi investigar a citotoxicidade e o mecanismo de agressão celular do AP em comparação com o hipoclorito de sódio (NaOCl) sobre fibroblastos L929 por meio de avaliação metabólica, estrutural, ultraestrutural e de morte celular (necrose e/ou apoptose). As células foram incubadas com diferentes concentrações do AP a 1% e do NaOCl a 2,5%, por 10 minutos. Após este período, foram avaliados o metabolismo celular por meio do ensaio do metiltetrazólio (MTT), a morfologia externa das células em microscópio eletrônico de varredura, a ultraestrutura em microscópio eletrônico de transmissão, o citoesqueleto por meio de marcação para actina e α- tubulina, o tipo de morte celular (necrose ou apoptose) por citometria de fluxo. Os resultados foram analisados empregando ANOVA de dois fatores e pós-teste de Bonferroni (α=0.05). Observou-se que o AP apresentou maior citotoxicidade do que o NaOCl. As alterações no metabolismo, na viabilidade, nos filamentos d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The solution peracetic acid (PA) has been reported in the dental literature as a possible root canal irrigating solution. It has the advantage of attending together in one product antibacterial activity and ability to remove of organic tissue and smear layer. For selection of root canal irrigating solution it should take into account not only its therapeutic benefits, but also the possible cytotoxic effects, since it can contact the periapical tissues. The aim of this study was to evaluate the aggression mechanism of 1% AP compared with 2.5% sodium hypochlorite (NaOCl) on L929 fibroblasts through metabolic evaluation, structural, ultrastructural and cell death (necrosis and / or apoptosis). The cells were incubated with different dilutions of the 1% AP and 2.5% NaOCl for 10 minutes. After this period, it was evaluated the cell metabolism by methyl tetrazolium (MTT) assay, the cell external morphology in scanning electron microscope, the ultrastructure in transmission electron microscope, the cytoskeleton by marking to actin and α-tubulin, the type of cell death (necrosis or apoptosis) by flow cytometry. The results were analyzed using two-way ANOVA and Bonferroni post-test (α = 0.05). It was observed that the AP showed higher cytotoxicity than NaOCl. Changes in metabolism, viability, in actin filaments and microtubules, surface morphology and ultraestrtura cells were observed at lower dilutions AP when compared to NaOCl. Cell death caused for both the AP and for NaOCl occurre... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rosana Rossi Ferreira / Banca: João Paulo de Castro Marcondes / Banca: Dejair Caitano do Nascimento / Resumo: Introdução: A Engenharia de Tecidos consiste na regeneração de órgãos e tecidos, obtidos através da coleta de partes de órgãos ou tecidos do indivíduo, que, dissociados em células, são cultivadas sobre suportes biológicos ou sintéticos (scaffolds), tendo como principal premissa o reestabelecimento e recuperação da funcionalidade do tecido lesado ou perdido. Esta tecnologia, portanto, abre novos caminhos para gerar transplantes funcionais e vitais. Dentro da Engenharia Biomédica e de Biomateriais, o Laboratório de Engenharia Celular do Hemocentro de Botucatu possui, desde 2001, pesquisas na área de produção de curativos biológicos, que são aqueles que interagem de forma ativa nas diversas fases do processo cicatricial, nos vários tipos de feridas. Diante da realidade de que o tratamento das feridas crônicas englobam altos custos econômicos, sociais e humanos, comprometendo a vida dos indivíduos acometidos e da necessidade de se otimizar e minimizar o impacto negativo do descarte de hemocomponentes excedentes da prática transfusional, o desafio é buscar alternativas de scaffolds para Terapia Celular. Objetivos: Avaliar o desempenho de diferentes arcabouços biológicos como a cola de fibrina, gel de plaquetas e membrana de quitosana dopada com fatores de crescimento extraídos de plaquetas, para cultura de células. Material e Métodos: Foi coletado um fragmento de pele e um de gordura de cinco pacientes diferentes. Estes tecidos foram submetidos a protocolos de dissociação mecânica, enzimática e por explante, seguido de isolamento, semeadura e expansão das células obtidas: células-tronco mesenquimais, fibroblastos e queratinócitos. As células foram cultivadas até ao menos a quarta passagem, caracterizadas e separadas em dois grupos: testes pré-scaffold e pós-scaffold, que consistiu nas análises de imunofenotipagem, imunocitoquímica, dosagem de citocinas inflamatórias no sobrenadante de cultura, teste do ... / Abstract: Introduction: Tissue engineering comprises in organ and proper tissue regeneration achieved by collecting small tissue fragments that are dissociated into cells and then cultivated into biological or synthetics scaffolds. The main characteristic of these constructs is their capacity to behave as their biological matrix counterparts, providing mechanical support and the required micro environment to the cells. This technology paves the way for the creation of functional and vital tissues for transplants. Within Biomedical Engineering and Biomaterials, the Cell Engineering Laboratory of the Botucatu Blood Transfusion Center has been investigating these topics since 2001, starting with the production of biological dressings. Biological dressings interact actively with the several phases of chronic wounds, which involves high economic, social and psychological costs, often condemning the patients quality of life. Considering this reality, the contribution of tissue engineering is to develop alternatives on cell therapy using scaffold technology. Aims: To assess the performance of different biological scaffolds such as fibrin glue, platelet gel and chitosan membrane for cell culture. Material and Methods: Five fragments of adipose tissue and skin were collected, dissociate with mechanical, enzymatic and explant techniques, and the resulting cells were seeded on tissue culture flasks, amplified and characterized using multiparameter techniques. Following characterization, these cells were cultivated into three different scaffolds made of fibrin glue, platelet gel and chitosan - which was performed in two distinct ways, on its natural form and incorporated with platelet-derived growth factors to analyze this interaction. Discussion and Results: cell cultures were amplified and cultivated making a good cell bank. However, keratinocytes were difficult to grow and the rest of experiments were unfeasible to drawn up. Immunocytochemistry analysis ... / Mestre

Orientadora: Silvana Martinez Baraldi Artoni / Banca: Isabel Cristina Boleli / Banca: Antônio Carlos Alessi / Banca: Joaquim Coutinho Netto / Banca: João José Lachat / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de cicatrização de uma fração de proteína extraída do látex da seringueira em diferentes concentrações (0,01% e 0,001%) associada a diferentes biomateriais (Fibracol plusÒ e ácido hialurônico a 1%). Utilizaram-se 36 coelhos albinos da raça Nova Zelândia Branco submetidos à realização de 4 feridas em cada orelha. Dividiu-se o experimento em etapas de acordo com a análise do período pós-operatório (3º, 7º, 14º e 21º dias), sendo utilizados 9 animais para cada etapa. Na primeira etapa (3º dia de pósoperatório), os animais foram numerados aleatoriamente de 1 a 9, sendo que em 3 animais, nas orelhas esquerdas, as feridas foram tratadas com solução salina (T1) e nas orelhas direitas, as feridas foram tratadas com membrana de Fibracol plus® + FrHb1 a 0,01% (T2). Em outros 3 animais, realizaram-se os mesmos procedimentos, diferenciando os tratamentos, onde nas feridas das orelhas esquerdas o tratamento foi com Fibracol plus® (T3) e nas feridas das orelhas direitas Fibracol plus® + FrHb1 a 0,001% (T4). Nos 3 animais restantes, seguiram-se os mesmos procedimentos, inserindo nas feridas das orelhas esquerdas ácido hialurônico a 1% + FrHb1 a 0,01% (T5) e nas feridas das orelhas direitas ácido hialurônico a 1% + FrHb1 a 0,001% (T6). Os animais foram sacrificados no 3º dia de pós-operatório e as feridas foram analisadas macroscopicamente e em seguida separadas para a análise histológica. Estes procedimentos foram repetidos para as etapas de 7, 14 e 21 dias de pós-operatório. Os segmentos de tecidos com as feridas foram fixados em solução de Bouin por 24 horas, e processados rotineiramente, para inclusão em paraplast e posterior avaliação histológica e morfométrica. A morfometria foi realizada por meio do sistema... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the potential for healing of a fraction of protein extracted from the latex of rubber trees in different concentrations (0.01% and 0.001%) associated with various biomaterials (Fibracol plus®1 and hyaluronic acid to 1%). There were used 36 New Zealand White rabbits underwent achievement of 4 wounds on each ear. The experiment was divided into stages according to the analysis of the postoperative period (3, 7, 14 and 21 days), and 9 animals used for each step. In the first stage (day 3 post-surgery), animals were randomly numbered from 1 to 9, with 3 animals in the left ear, the wounds were treated with saline (T1) and the right ear, the wounds were treated with membrane of Fibracol plus® + FrHb1 to 0.01% (T2). In 3 other animals, the same procedures were held, differing treatments, where the wounds of the left ear they were treated with Fibracol plus® (T3) and the wounds of the right ears Fibracol Plus® + FrHb1 to 0.001% (T4). In the 3 remaining animals, there was followed by the same procedures, including the ears wounds hyaluronic acid at 1% + FrHb1 to 0.01% (T5) and right ears wounds of hyaluronic acid 1% + FrHb1 a 0.001% (T6). The animals were sacrificed at 3 days postoperatively and the wounds were examined macroscopically and then separated for histological analysis. These procedures were repeated on the steps of 7, 14 and 21 days postoperatively. The segments of the injured tissues were fixed in Bouin solution for 24 hours and routinely processed for inclusion in paraplastic and subsequent histologic and morphometric evaluation. The morphometry was performed using the image analyzing system (Image Pro-PLUS2) and the evaluation of healing was done by enumeration of leukocytes and fibroblasts. The data were subjected to statistical analysis (ANOVA and Tukey test at 5%)... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son los mayores responsables de la secreción y renovación de la matriz extracelular (MEC). Por otro lado, bajo condiciones patológicas como en el post-infarto al miocardio, los fibroblastos cardiacos se diferencian a miofibroblastos, células con un fenotipo mucho más activo en cuanto a la producción de la MEC, además ambos elementos celulares son claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Uno de los mayores reguladores de la población cardiaca es el Sistema Renina-Angiotensina (RAS) y se ha reportado que en una situación post-infarto este sistema se encuentra sobre-activado, específicamente la enzima convertidora de angiotensina y el receptor subtipo AT1 de angiotensina (AT1R). Nuestro modelo experimental consideró sobrexpresar el AT1R en ambos tipos celulares con el uso de adenovirus y evaluar si angiotensina II (Ang II) modula la viabilidad celular. Nuestros resultados demuestran que la estimulación con Ang II conduce a una masiva muerte del fibroblasto cardiaco neonato que sobrexpresa el AT1R (FCN-AdAT1R) de una manera tiempo-dependiente. Ang II gatilla la apoptosis por la vía mitocondrial, promoviendo el aumento de los niveles de Bax, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (mΔψ) y la fragmentación de la caspasa 3. Los efectos producidos por Ang II sobre los FCN-AdAT1R fueron bloqueados por Losartan (antagonista específico AT1R) y por los inhibidores de la vía de la fosfolipasa C -proteínakinasa C (PLC-PKC), U73122 y Gö6976, respectivamente. Por otra parte, los miofibroblastos cardiacos neonatos que sobrexpresan el AT1R (MCN-AdAT1R), fueron menos propensos que los FCN-AdAT1R a los efectos inducidos por Ang II, en cuanto a muerte celular, apoptosis y aumentos en los niveles de Bax. La diferente sensibilidad a la apoptosis producida por Ang II por parte de los MCN-AdAT1R se debió en parte al cambio del fenotipo celular Nuestros resultados demuestran que Ang II ocasiona apoptosis del FCN-AdAT1R por la vía AT1R-PLC-PKC y que esta depende de la vía mitocondrial / The cardiac fibroblasts are main cells involved in secretion and turnover to extracellular matrix protein (ECM). Under pathological conditions characterized by inflammation, as in myocardial infarction, they are differentiated to cardiac myofibroblast, which are cells with a more active phenotype, producing higher ECM protein. Both cellular types are key elements in the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Renine-angiotensin-system (RAS) is the most important regulator of cardiovascular system, and have been reported that after myocardiac infarction the RAS is up-regulated, specifically angiotensin converting enzyme (ACE) and angiotensin type 1 receptor (AT1R). In our experimental model using adenovirus to overexpress the AT1R in cardiac fibroblast (FCN-AT1R), we evaluated the Ang II effects on cell viability. Ours results show that Ang II triggers FCN-AdAT1R death, in a time-dependent manner. The death cell produced for Ang II in our model was apoptosis by mitochondrial pathway, through an increase Bax expression, loss of mitochondrial membrane potential (mΔψ) and caspase 3 activation. These effects were blocked by Losartan (specific antagonist of AT1R) and by phospholipase C-proteinkinase C (PLC-PKC) inhibitors, U73122 and Gö6976 respectively. For other hand, cardiac myofibroblast that overespressing AT1R (MCN-AdAT1R) were less sensible than FCN-AdAT1R to effect of Ang II on death cell, apoptosis and expression of Bax. The different sensibility to apoptosis Ang II-induced was due to the different phenotype. Ours results show that Ang II triggers apoptosis of FCN-AdAT1R by AT1R-PLC-PKC pathway through mitochondrial disruption

Os fibroblastos são atualmente considerados componentes ativos da resposta imune porque estas células expressam receptores do tipo Toll (TLRs), são capazes de reconhecer padrões moleculares associados a patógenos e mediar a produção de citocinas e quimiocinas durante a inflamação. A resposta imune inata do hospedeiro a lipopolissacarídeos (LPS) de Porphyromonas gingivalis é incomum, já que diferentes estudos relataram que este LPS pode ser um agonista para TLR2 e um antagonista ou agonista para TLR4. A sinalização por TLRs envolve proteínas adaptadoras, como MyD88 e TRAM, que são necessárias para a transdução do sinal até o núcleo para que ocorra a transcrição de RNAm para os mediadores da inflamação. O objetivo deste estudo foi investigar e comparar se a sinalização por meio de TLR2 ou TLR4 poderia afetar a produção de Interleucina (IL)-6, IL-8 e CXCL12 em fibroblastos humanos gengivais (HGF) e fibroblastos humanos de ligamento periodontal (HPLF). Objetivamos também comparar a participação das moléculas adaptadoras MyD88 e TRAM na expressão do RNAm dos mesmos alvos. Material e Métodos: Após silenciamento mediado por RNA de interferência de TLR2, TLR4, MyD88 ou TRAM, confirmado por RT-qPCR, HGF e HPLF, provenientes de três dadores voluntários, foram estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis ou com dois agonistas sintéticos de TLR2, Pam2CSK4 e Pam3CSK4, por 6 horas. A expressão do RNAm e das proteínas IL-6, IL-8, e CXCL12 foram avaliados por qRT-PCR e ELISA, respectivamente. Resultados: A expressão do RNAm de TLR2 foi regulada em HGF, mas não em HPLF por todos os estímulos. O silenciamento de TLR2 diminuiu IL-6 e IL-8 em resposta ao LPS de P. gingivalis, Pam2CSK4 e Pam3CSK4 de maneira semelhante, em ambas as subpopulações de fibroblastos (p<0,05). Por outro lado, a produção de CXCL12 permaneceu inalterada pelo silenciamento de TLR2 ou TLR4. No caso do silenciamento de MyD88 e TRAM, em ambos os subtipos de fibroblastos, o RNAm para os mesmos alvos também teve sua expressão diminuída (p<0,05). Já a expressão constitutiva de CXCL12 foi aumentada com o silenciamento de MyD88 ou TRAM (p<0,05). Conclusão: Estes resultados sugerem que a sinalização por meio de TLR2, por fibroblastos, as células residentes mais numerosas em gengiva e ligamento periodontal, pode controlar a produção de IL-6 e IL-8, que por sua vez contribuem para a patogênese periodontal, mas não interfere nos níveis de CXCL12, uma quimiocina importante no processo de reparação. Concluímos também que o silenciamento de MyD88 ou TRAM é capaz de diminuir o aumento da transcrição gênica de IL-6 e IL-8 provocado por LPS de P. gingivalis, embora a expressão constitutiva de CXCL12 seja regulada positivamente. / Fibroblasts are now seen as active components of the immune response because these cells express Toll-like receptors (TLRs), recognize pathogen associated molecular patterns and mediate the production of cytokines and chemokines during inflammation. The innate host response to lipopolysaccharide (LPS) from Porphyromonas gingivalis is unusual in that different studies have reported that it can be an agonist for TLR2 and an antagonist or agonist for TLR4. TLRs signaling pathway involves adaptor proteins, like MyD88 and TRAM, which are crucial for signal transduction to the nucleus and mRNA expression of inflammatory mediators. This study investigated and compared whether signaling through TLR2 or TLR4 could affect the production of IL-6, IL-8 and CXCL12 in both human gingival fibroblasts (HGF) and human periodontal ligament fibroblasts (HPLF). The role of MyD88 and TRAM on the mRNA expression of the same targets were also evaluated. Methods: After small interfering RNA-mediated silencing of TLR2, TLR4, MyD88 or TRAM, confirmed by RT-qPCR, HGF and HPLF from three volunteer donors were stimulated with P. gingivalis LPS or with two synthetic ligands of TLR2, Pam2CSK4 and Pam3CSK4, for 6 hours. IL-6, IL-8, and CXCL12 mRNA expression and protein production were evaluated by RT-qPCR and ELISA, respectively. Results: TLR2 mRNA expression was upregulated in HGF but not in HPLF by all the stimuli applied. Knockdown of TLR2 decreased IL-6 and IL-8 in response to P. gingivalis LPS, Pam2CSK4 and Pam3CSK4 in a similar manner in both fibroblasts subpopulations. Conversely, CXCL12 remained unchanged by TLR2 or TLR4 silencing. For MyD88 or TRAM silencing, IL-6 and IL-8 mRNA were also decreased, in both fibroblasts subtypes. However CXCL12 mRNA constitutive expression was increased by siMyD88 or siTRAM. Conclusion: These results suggest that signaling through TLR2 by fibroblasts, the most numerous resident cells in gingiva and periodontal ligament, may control the production of IL-6 and IL-8, which in turn contribute to periodontal pathogenesis, but does not interfere with CXCL12 levels, an important chemokine in the repair process. Also, MyD88 or TRAM knockdown may decrease the IL-6 and IL-8 LPS-induced upregulation and increase the constitutive CXCL12 mRNA.

Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-&#x3B1; foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1&#x3B2; e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-&#x3B2;, IL-1&#x3B2;, TNF-&#x3B1;, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-&#x3B1; production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1&#x3B2; and IL-13 was dependent of TLR2.

A fototerapia com laser em baixa intensidade tem sido utilizada na odontologia em várias patologias bucais para o controle de dor e cicatrização. O objetivo do estudo foi comparar o efeito da fototerapia no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana usando irradiações com energia total aplicada de uma vez ou fracionada. Após a determinação da metodologia, a linhagem celular FP5 (1 x 103 células por poço) cresceu em placas de cultivo de 96 poços (1 para cada grupo experimental) em déficit nutricional (meio suplementado com 5 % de SFB). A irradiação laser foi realizada com laser de diodo InGaAlP (comprimento de onda 685 nm, 40mW, área do feixe 0,0028cm2) usando a técnica pontual, no modo contínuo e em contato. As energias totais foram aplicadas em irradiações únicas de 0,12 J (G1), 0,24J (G2), 0,36 J (G3). Essas energias totais foram fracionadas em múltiplas irradiações de 0,12 feitas com intervalos de 6 horas: duas para G4 e três para G5. Grupos não irradiados de células cultivadas em déficit nutricional (5 % SFB, G6) e em condições nutricionais regulares (10 % SFB, G7) foram usadas como controles negativo e positivo respectivamente. O número de células foi indiretamente obtido pela mensuração da atividade celular mitocondrial 24 horas após a primeira irradiação. Os dados em quadruplicata foram comparados pelo teste ANOVA complementado pelo teste de Tukey (p <= 0,05). Houve diferença significante entre os grupos. O controle positivo (G7) apresentou número de células significantemente maior quando comparado ao controle negativo (G6). Esse número foi similar aos dos grupos submetidos a irradiações múltiplas (G4 e G5). Os grupos irradiados uma única vez (G1 a G3) apresentaram número de células significantemente menores que aqueles do controle positivo e dos grupos com múltiplas irradiações. Com base na metodologia empregada concluiu-se que o fracionamento das energias de irradiação potencializa o efeito bioestimulador da fototerapia com laser em baixa intensidade no crescimento de fibroblastos de polpa dentária humana. / Phototherapy with low intensity lasers has been used in dentistry in several oral pathologies for pain and healing control. The aim of this study was to compare the effect of phototherapy on human dental pulp fibroblasts growth using irradiations with whole energy delivered at once or fractioned. After the determination of the methodology, the FP5 cell line (1x 103 cells per well) was grown in 96 wells-microtritation plates (one for each experimental group) in nutritional deficit (medium supplemented with 5% fetal bovine serum-fbs). Laser irradiation was carried out with an InGaAlP diode laser (?-685nm, 40 mW, spot size 0.028 cm2) using the punctual technique, at continuous mode and in contact. The whole energies were delivered in single irradiations of 0.12J (G1), 0.24J (G2), 0.36J (G3). These whole energies were fractioned in multiple irradiations of 0.12J done with 6h-intervals: two for G4 and three for G5. Non-irradiated groups of cell cultured in nutritional deficit (5% fbs; G6) and in nutritional regular condition (10 % fbs; G7) were used as negative and positive controls, respectively. The number of cells was indirectly assessed by measuring the cell mitochondrial activity 24 hours after the first irradiation. The data from four replicates were compared by the ANOVA complemented by the Tukey\'s test (p <= 0.05). There were significant differences amongst the groups. The positive control (G7) presented significantly higher number of cells when compared to the negative control (G6). This number was similar to those of multiple irradiation groups (G4 and G5). The single irradiated groups (G1 to G3) presented cell numbers significantly smaller than those of positive control and multiple irradiated groups. Under the conditions of this study it was concluded that multiple irradiations of fractioned energies improve the biostimulatory effect of the phototherapy with low intensity laser on the growth of dental pulp fibroblasts.

A asma alérgica é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas que envolve ativação de fibroblastos pulmonares. Esta ativação é induzida por TGF-<font face=\"Symbol\">b e este processo é regulado por moléculas anti-fibróticas. Nosso objetivo foi elucidar mecanismos envolvidos na fibrose das vias aéreas em um modelo de asma. Na primeira parte, investigamos o eixo síntese/resposta da PGE2. A PGE2 e seu análogo forskolina inibiram síntese de colágeno I e proliferação de fibroblastos. Estas células apresentaram perda tempo-dependente na capacidade de sintetizar PGE2 sob estímulo com IL-1<font face=\"Symbol\">b, e menor expressão de COX-2 e mPGEs-1. Na segunda parte, estudamos a relação TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 na fibrose das vias aéreas. Há predomínio da molécula pró-fibrótica TGF-<font face=\"Symbol\">b1 sobre a molécula anti-fibrótica BMP-7 nos pulmões de animais asmáticos. Em fibroblastos, a BMP-7 inibe a síntese de colágeno tipo I induzida pelo TGF-<font face=\"Symbol\">b1 e as vias de SMAD-2, SMAD-3 e p38. O tratamento dos animais com BMP-7 causou diminuição significativa da fibrose. Os resultados implicam estes mecanismos na fibrose das vias aéreas na asma. / Allergic asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that involves activation of lung fibroblasts. This activation is induced by TGF-<font face=\"Symbol\">b and this process is regulated by anti-fibrotic molecules. Our goal was to elucidate mechanisms involved in airway fibrosis in an animal model of asthma. In the first part, we investigated the PGE2 synthesis/response axis. PGE2 and its analog forskolin inhibited collagen I synthesis and proliferation of fibroblasts. These cells showed a time-dependent loss in the ability to synthesize PGE2 under IL-1<font face=\"Symbol\">b stimulation, and downregulated COX-2 and mPGEs-1. In the second part, we studied the ratio TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 in airway fibrosis. There is predominance of the pro-fibrotic TGF-<font face=\"Symbol\">b1 over the anti-fibrotic BMP-7 in the lungs of asthmatic animals. In fibroblasts, BMP-7 inhibits TGF-<font face=\"Symbol\">b1-induced type I collagen synthesis and the SMAD-2, SMAD-3 and p38 pathways. Treatment of the animals with BMP-7 caused significant decrease in fibrosis. The results implicate these mechanisms in airway fibrosis in asthma.

Avaliamos as causas moleculares da deficiência de C3 ou de FI em 07 pacientes, chegando a caracterizar a causa molecular em cinco deles. As mutações encontradas em cada um dos pacientes foram: C3def3 - C364G troca Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, troca Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, troca Arg187Stop; FIdef6 e -7 - Inserção 1382<font face=\"Symbol\">DAT, códon de parada prematura 13 bases a montante. Além disso, analisamos se a ausência dessas proteínas levava a alterações na expressão gênica em fibroblastos de pele de pacientes deficientes de C3 ou de FI em relação a indivíduos normais e saudáveis através de ensaios com microarranjos de cDNA. Confirmamos uma tendência à alteração da expressão através de PCR em tempo real dos genes CHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B e MASP1 nos deficientes de C3; dos genes SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 e JAKMIP3 nos deficientes de FI e o gene ETV6 nos dois grupos de pacientes. Dessa forma, podemos sugerir que deficiências das proteínas C3 e FI podem possivelmente influenciar a expressão de outros genes neste tipo de célula. / We investigated C3 and Factor I deficiency in 07 patients and could characterize the molecular basis in five of them. The mutations found were: C3def3 - C364G change Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, change Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, change Arg187Stop; FIdef6 e -7 - insertion 1382<font face=\"Symbol\">DAT, Stop codon generation after 13 bp. Furthermore, we analyzed if the absence of these proteins cause alterations in gene expression profiles in skin fibroblasts from C3 and FI deficients compared to fibroblasts from normal individuals by cDNA microarrays. We confirmed a tendency of altered gene expression by Real Time PCR atCHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B and MASP1 genes on C3 deficients, SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 and JAKMIP3 on FI deficient and ETV6 gene in both groups. Thus, we concluded that C3 and FI deficiencies could affect gene expression profiles in skin fibroblasts.