Gastrópodes terrestres secretam muco pela superfície corporal, quando se locomovem, para proteção do corpo contra injúria mecânica, dessecação ou contato com substâncias nocivas. O muco de moluscos tem sido estudado como fonte de novos compostos naturais com diversas atividades biológicas, entre elas a capacidade de induzir proliferação celular. O presente trabalho propôs o estudo do muco produzido pelas lesmas terrestres Phyllocaulis boraceiensis como agente indutor de proliferação celular e síntese de colágeno em cultura de fibroblastos humanos normais, células endoteliais e no reparo de processos cicatriciais no modelo de ferida cirúrgica da derme de camundongos. Fibroblastos tratados com proteínas do muco de P. boraceiensis em concentrações menores que 0,012 <font face=\"Symbol\">mg/µl apresentaram aumento nas taxas de proliferação avaliadas pelo método colorimétrico do MTT e em citometria de fluxo CSFE, mostrando um efeito dose-dependente. Os resultados obtidos mostraram que fibroblastos humanos normais e células endoteliais tratados com 0,012 g/<font face=\"Symbol\">ml de proteínas do muco, aumentaram significativamente a produção e secreção de elementos da matriz extracelular, como as fibras de colágeno. Houve a redução da produção de radicais livres lipídicos poli-insaturados. O ensaio de cicatrização da derme lesionada de camundongos Balb-c tratados com proteínas do muco de P. boraceiensis na concentração de 0,012 <font face=\"Symbol\">mg/µl induziu o reparo da cicatrização com maior eficácia e em menor tempo quando comparado ao grupo controle e aos tratados com a concentração de 0,18 <font face=\"Symbol\">mg/µl. Esses resultados corroboram a premissa de que o muco de P. boraceiensis, assim como o de outros gastrópodes, apresenta propriedade proliferativa das células envolvidas nos processos de cicatrização. / Mucus of molluscs has been studied as a source of new natural compounds with diverse biological activities, as ability to induce cell proliferation. The aim of this study is the potential use of mucus produced by land slugs Phyllocaulis boraceiensis as a promoter of cell proliferation and collagen synthesis in human fibroblasts, endothelial cells and in repair processes of healing wound skin of mice. Fibroblasts treated with P. boraceiensis mucus at concentrations below 0.012 <font face=\"Symbol\">mg/µl have high rates of proliferation as evaluated by the MTT and CFSE flow cytometer assays, proliferative effect was dose-dependent. Fibroblasts and endothelial cells treated with 0.012 <font face=\"Symbol\">mlowg/µl mucus induced a significant increase in production and secretion of extracellular matrix such as collagen fibers. There was a reduction in polyunsaturated lipid production. Healing assay of lesions in mice treated with mucus at 0.012 <font face=\"Symbol\">mg/µl induce repair of the scar more effectively and in less time when compared to the control group and those treated 0.18 <font face=\"Symbol\">mg/µl. These findings support the premise that the P. boraceiensis mucus demonstrates proliferative properties in cells involved in the healing process.

A homeostase da mama normal depende das interações entre células epiteliais e o estroma a elas associado. Estudos anteriores mostraram que no carcinoma mamário o estroma é constituído por células com diferentes funções. Estes elementos do estroma incluem fibroblastos, os quais modulam o comportamento tumoral, fornecendo fatores de crescimento e componentes de matriz extracelular. Nosso objetivo foi investigar a expressão gênica diferencial entre fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico ou não neoplásico e analisar a influência de células epiteliais normais (MCF10A) no perfil de expressão gênica de fibroblastos obtidos de tecido mamário neoplásico. Culturas primárias de fibroblastos foram estabelecidas e a expressão de vimentina e actina de músculo liso foi positiva. Foi realizada a co-cultura destas células com separação por insertos, o que permite a passagem de fatores solúveis, e o RNA foi extraído. Após a amplificação do RNAm foram sintetizadas sondas de cDNA, as quais foram marcadas com fluorocromos conjugados a deoxinucleotídeo, hibridizadas competitivamente sobre lâminas de vidro contendo 4.608 ORESTES criadas no Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP e os sinais fluorescente gerados foram quantificados. Após a normalização destes dados, os genes diferencialmente expressos, com False Discovery Ratio (FDR) menor que 0,05, foram selecionados para análises posteriores. Encontramos 283 genes diferencialmente expressos em fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico quando comparados àqueles derivados de tecido mamário não-neoplásico. Dentre estes genes, 187 foram quantitativamente regulados negativamente (com variação de expressão de 1,05 a 4,14) contra 96 regulados positivamente (variação de expressão de 1,17 a 7,73). A maioria destas alterações foram relacionadas ao transporte entre membranas, transdução de sinal e biosíntese. Estes resultados podem sugerir uma redução na expressão gênica durante o processo de transformação. Após a co-cultura com células MCF10A, encontramos 566 genes diferencialmente expressos nos fibroblastos derivados de tecido mamário neoplásico, 323 foram regulados negativamente (expressão variando de 1,09 a 10,62) e 243 regulados positivamente (variação de expressão de 1,03 a 16,62). A influência das células MCF10A na expressão gênica destes fibroblastos pôde ser vista através da desregulação da expressão de genes relacionados com a proliferação celular, adesão, apoptose e sobrevivência. / The homeostasis of normal breast depends on interactions between epithelial cells and their associated stroma. Previous studies indicated that in breast cancer carcinoma, tumor associated stromal cells with different functions appear to be emerged. These stromal elements include fibroblasts which modulate tumor behavior providing various growth factors and extracellular matrix components. Our aim was to evaluate the differential gene expression between fibroblasts derived from mammary tissue neoplasic or not and to analyze the influence of normal epithelial cells (MCF10A) on gene expression profile of fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue. Fibroblast primary cultures were established and expression of vimentin and smooth cell actin was positive. Co-culture of these cell types separated by inserts, which allow the passage of soluble factors, was done and total RNA was extracted. After mRNA amplification using a template-switching prime, cDNA probes were synthesized, labeled with fluorochrome conjugated deoxynucleotide, a competitive hybridization was undertaken onto cDNA microarray glass slides in which 4,608 ORESTES (open reading frame expressed sequence tags) from Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer/FAPESP bank were spotted and fluorescent signals were quantified. After normalization, the differentially expressed genes, at a False Discovery Ratio (FDR) less then 0.05, were selected for further analysis. We found 283 differentially expressed genes in fibroblasts obtained from neoplasic mammary tissue when compared with non neoplasic derived fibroblasts. Among these genes, 187 were quantitatively down regulated (fold ranging from 1.05 to 4.14) against 96 up regulated (fold ranging from 1.17 to 7.73). The majority of alterations were related to membrane transport, signaling transduction and biosynthesis. Overall these results could suggest a reduced gene expression along transformation process After coculture with MCF10A cells, we found 566 differentially expressed genes in neoplasic mammary tissue derived fibroblasts, 323 were down regulated (fold ranging from 1.09 to 10.62) and 243 up regulated (fold ranging from 1.03 to 16.62). MCF10A influence in mammary tissue neoplasic derived fibroblasts gene expression could be seen trough the deregulation of expression of some genes possibly related cell proliferation, adhesion, apoptosis and survival.

Orientador: Fernanda Gonçalves Basso / Resumo: A mucosite é um dos principais efeitos adversos do tratamento oncológico e apresenta influência significativa na morbidade e qualidade de vida dos pacientes submetidos a este tipo de tratamento. A etiopatogenia desta condição vem sendo relacionada não só a toxicidade direta dos quimioterápicos e radiação ionizante, mas também a uma ativação exacerbada da resposta inflamatória dos tecidos. Recentemente, o desenvolvimento e a severidade da mucosite oral também tem sido relacionada a expressão exacerbada de metaloproteinases (MMPs), que resulta na desorganização dos tecidos epitelial e conjuntivo e consequentemente, em atraso do processo de reparo. O manejo da mucosite oral tem sido baseado na utilização de agentes analgésicos tópicos, antibióticos e antifúngicos, bem como na aplicação da laserterapia de baixa intensidade (LBI). A LBI apresenta resultados positivos sobre as lesões de mucosite oral, porém, esta modalidade terapêutica requer a utilização de um equipamento de custo moderado e deve ser feita sob supervisão. Desta forma, novas estratégias preventivas e terapêuticas, que possam atuar na modulação da resposta inflamatória e na expressão de MMPs para diminuir a incidência e a severidade das lesões de mucosite oral e também acelerar o processo de reparo têm sido propostas. Estudos recentes demonstraram a efetividade de compostos naturais, como as antocianinas, na redução da incidência e severidade destas lesões. O objetivo desta pesquisa in vitro foi avaliar comparativam... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mucositis is the major adverse effect of oncological treatment and presents huge impact on oncological patients' morbidity and quality of life. Etiopathogenesis of oral mucositis has been not only related to a direct toxicity of chemotherapy drugs and radiant therapy, but also to an extended inflammatory reaction. Recently, development and severity of oral mucositis has also been associated to increased expression of metalloproteinases (MMPs), that results in disorganization of epithelial and connective tissues, leading to a delayed tissue healing. Treatment of oral mucositis is based on the application of topic analgesic and antimicrobial compounds, as also low-level lasertherapy (LLLT). LLLT shows positive outcomes on oral mucositis, however, this therapy requires the use of a moderate cost equipament and professional supervision. Therefore, new preventive and therapeutic strategies that can act on the modulation of inflammatory response as well as on MMPs expression could decrease the incidence and severity of oral mucositis, therefore enhancing oral mucosa healing. Recent studies demonstrated the effectiveness of natural compounds, such as antocyanins on the decreased incidence and severity of these lesions. Consequently, the aim of the present in vitro study were to assess the effects of proanthocyanidins (PAs, grape seed extract), naringenin (NA, proanthocyanidins-derived synthetic compound), also denominated flavanones, and LLLT as modulators for synthesis of interleukin-6 and MMPs from gingival fibroblasts. Cells were isolated from the papillary gingival tissue of a young (24 years) and healthy individual by enzymatic digestion, then cultured and submitted to different treatments. The influence of two chemotherapeutic agents (5-fluorouracil - 5-FU and methotrexate - MTX) and inflammatory cytokines (TNF-α, IL-6 and -8) on the induction of MMP-2 and -9 synthesis and gene expression were ... (Complete abstract electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000417269-Texto+Completo-0.pdf: 7052589 bytes, checksum: b8a2e5d51c24356d22c269d755b3d73d (MD5) Previous issue date: 2009 / According to Mandelbaum, 2003, healing involves many events and situations, requiring basic knowledge of different fields. Thus, multidisciplinary action is needed for the lesion to heal well. Tissue repair occurs in two ways: by the regeneration of functional activity of the tissue or by healing. This research is an experimental study aiming at comparing the effects of 2% papain, AGE and saline solution when used in circular skin lesions 2cm in diameter, with full thickness on the dorsum of EPM-I Wistar rats. Twelve male rats were used, divided into three groups: C1 (AGE group), C2 (control group) and C3 (papain group), all of them submitted to daily dressing changes after cleaning with bidistilled water solution. Based on the results obtained, we found that the product AGE, during the seven-day period, did not favor fibroblast expression, which can be explained by the intense adherence of cotton gauze to the lesion bed, thus impairing the histological material analyzed by immunohistochemistry. During the same phase, as regards collagen, we observed that treatment with 2% papain was at its lowest peak when compared to the other treatments, which can be attributed to its potentially sulfidric effect, thus wearing down the collagen fibers. According to the statistical method used, ANOVA, it was found that there was no significant difference between the treatments proposed in this research. / Conforme Mandelbaum, 2003 a cicatrização envolve muitos eventos e situações, exigindo conhecimento básico de diversas áreas, portanto uma atuação multidisciplinar se faz necessária para uma boa evolução da lesão. O reparo do tecido se dá através de duas formas: pela regeneração da atividade funcional do tecido ou pela cicatrização. Esta pesquisa trata-se de um estudo experimental tendo por finalidade comparar os efeitos da papaína 2%, AGE e soro fisiológico quando utilizados em lesões cutâneas circulares com dimensionamento de dois centímetros de diâmetro e espessura total no dorso de ratos da linhagem EPM-I Wistar. Utilizou-se doze ratos machos divididos em três grupos: C1 (grupo AGE), C2 (grupo controle) e C3 (grupo papaína), todos submetidos a trocas diárias de curativos após limpeza com solução de água bidestilada. Com base nos resultados obtidos verificamos que o produto AGE, durante o período de sete dias, não favoreceu a expressão de fibroblastos, o que pode ser explicado pela intensa aderência da gaze de algodão no leito da lesão, prejudicando, assim, o material histológico analisado por imunoistoquímica. Nesta mesma fase, em relação ao colágeno, observamos que o tratamento com papaína 2% apresentou seu menor pico quando comparado aos outros tratamentos, o que pode ser atribuído a seu efeito potencialmente sulfídrico, realizando assim um desgaste nas fibras colágenas. Conforme o método estatístico utilizado, ANOVA, constatou-se não haver diferença significativa entre os tratamentos propostos nesta pesquisa.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que componen alrededor del 70% del total de células del corazón. Estás células son responsables de la mantención de la matriz extracelular del corazón dando soporte mecánico a los cardiomiocitos. Cuando el corazón es dañado, se inicia un proceso de remodelamiento del tejido cardiaco que puede progresar a una insuficiencia cardiaca. Uno de los factores importantes del remodelamiento es la secreción de colágeno a cargo de los fibroblastos. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas éstas, deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (ER). Cuando aumenta la demanda de proteínas que se deben plegar, el ER entra en un estrés que gatilla una respuesta que se llama Respuesta a Proteínas Mal Plegadas (UPR). Si esta respuesta no es capaz de devolver la homeostasis a la célula, se ejecuta un proceso de apoptosis. En este estudio se determinó que el fármaco Tapsigargina es capaz de disminuir la viabilidad de cultivos de fibroblastos cardiacos de manera concentración y tiempo –dependiente a una concentración de 10 nM, además induce proteínas que son parte de la vía UPR como BiP, eIF2α, PDI, ATF4 y CHOP ésta última está muy ligada a los procesos de muerte en las células. En la literatura se ha reportado que el ácido 4-fenilbutirico (4-PBA) se comporta como una chaperona química. Demostramos que al preincubar los cultivos con 4-PBA los efectos antes mostrados por Tapsigargina quedan anulados. También se estudió la implicancia de la UPR provocada por Tapsigargina sobre la secreción de colágeno soluble y también se vieron los efectos del 4-PBA sobre la secreción de colágeno soluble los cultivos, demostrándose la capacidad del 4-PBA de modular la secreción de colágeno.

Orientador: Carlos Rossa Júnior / Banca: José Eduardo Cezar Sampaio / Banca: Ana Paula Vieira Colombo / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar in vitro o efeito do condicionamento radicular com fator de crescimento de fibroblastos básico (b-FGF) sobre a morfologia e densidade de fibroblastos. Para tal, blocos de dentina com 4 mm2 de área de superfície foram obtidos de raízes de dentes humanos extraídos devido severo envolvimento periodontal, sendo instrumentados manualmente e autoclavados. Noventa amostras foram selecionadas aleatoriamente e distribuídas em 3 grupos segundo o tratamento de superfície prévio ao condicionamento com o b-FGF: sem tratamento - controle; 50 mg/mL de cloridrato de tetraciclina e EDTA a 24%. As 30 amostras de cada um destes 3 grupos foram distribuídas em 3 subgrupos quanto à dose de b-FGF: 0 æg/mL - controle; 50 æg/mL e 125 æg/mL. Após os tratamentos, as amostras foram incubadas a 37º C e 98% de umidade com 2mL de meio Eagle, sendo 1mL com fibroblastos de linhagem contínua (células McCoy) na concentração de 1 x 105 células/mL e 1mL meio sem células, por 24 h. Após as 24 h, as amostras foram submetidas a preparo de rotina para MEV e então, fotomicrografadas nos aumentos de 500X (densidade celular) e 1000X (morfologia celular). Em seguida, as fotomicrografias foram avaliadas por 3 examinadores treinados, calibrados, independentes e cegos, os quais verificaram morfologia e densidade celular segundo os escores propostos por Gamal et al. (1998) e Jenkins et al. (1988), respectivamente. A aplicação da Análise de Regressão pela Técnica da Árvore demonstrou haver diferenças estatisticamente significantes para a densidade celular (p<0,0001) entre os grupos EDTA, tetraciclina e controle, sendo que também houve diferenças entre as doses de 0/50 æg e 125 æg de b-FGF nas amostras condicionadas com EDTA (p<0,0001) e entre as doses de 0 e 50/125 æg de b-FGF nas amostras condicionadas com tetraciclina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The aim of this study was to evaluate in vitro the effect of the root surface conditioning with basic fibroblast growth factor (b-FGF) about morphology and density of fibroblasts. Dentin slices of with 4 mm2 of surface area were obtained from roots of teeth extracted due to severe periodontal involvment. These were scaled and sterilized. Ninety samples were randomly distributed into 3 groups according to treatment before application of b-FGF: non-treated - control; 50mg/mL of tetracycline HCl and EDTA 24%. The thirty samples of each group were distributed into 3 subgroups according to the concentration of b-FGF: 0 æg/mL - control; 50 æg/mL and 125 æg/mL. After treatments, the samples were incubated at 37ºC and 98% humidity with 1mL of Eagle Medium with 1 x 105 cells/mL of fibroblast from continuos lineage (McCoy Cells) plus 1mL this solution without cells during 24 hours. The samples were submitted to routine preparation for SEM and photographed at 500x (density celular) and 1000x (morphology celular). Three independent and blind examiners evaluated the fibroblast's morphology and density, according to Gamam et al. (1998) and Jenkins et al. (1998), respectively. Classification and Regression Trees test results indicated significant differences on the density (p<0,0001) among EDTA, tetracycline and control groups with also differences between concentrations of 0/50æg and 125æg of b-FGF at the samples conditioning with EDTA (p<0,0001) and between concentrations of 0 and 50/125 æg of b-FGF at the samples conditioning with tetracycline(p<0,0001). The results of this test to morphology indicated significant differences between treatment or non-treatment with b-FGF, and that concentration of 125 æg demonstrated to be more favorable than the concentration of 50 æg. In conclusion, the treatment of root surfaces with b-FGF influenced the density... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Introdução: Sabendo-se que o estímulo neurogênico de origem nociceptiva é considerado o deflagrador primário do processo de cicatrização da pele, que o CGRP e SP aumentam a proliferação de fibroblastos in vitro, e diante da falta de estudos correlacionando CGRP, SP e p53 e apoptose em queloide torna-se importante investigar se os neuropeptídeos da pele podem influenciar a expressão de p53 e a apoptose no queloide. Uma possível associação entre neuropeptídeos e o gene p53 poderia representar um novo caminho para um melhor entendimento fisiopatogênico das cicatrizes patológicas fibroproliferativas e, por conseguinte, o advento de tratamentos mais específicos. Objetivo: Investigar a expressão do gene p53 e o índice apoptótico em culturas de fibroblastos de queloide, submetidos à ação dos neuropeptídeos CGRP e SP. Métodos: Foram cultivados fibroblastos de queloide em meio de cultura com adição de CGRP e SP, e controle. O índice apoptótico, e o ciclo celular foram determinados por citometria de fluxo e a marcação de proteínas-chave da apoptose por espectrofotometria. A atividade celular foi avaliada ao longo do tempo e em períodos determinados, por MTT. A morfologia celular foi avaliada por microscopia confocal. Resultados: Foi padronizado um modelo de explante baseado nas diferenças biológicas das regiões específicas do queloide. A atividade celular em fibroblastos de queloide variou ao longo do tempo, sendo diferente entre os subgrupos celulares mas similar dentro de um mesmo subgrupo, mas não foi afetada pela adição de CGRP, SP ou CGRP+SP. Fibroblastos de queloide das regiões periférica e central apresentaram maior expressão de p53 do que fibroblastos da pele adjacente ao queloide, de cicatriz normotrófica ou de pele normal, adjacente à cicatriz normotrófica. CGRP, SP e CGRP+SP provocaram uma diminuição na expressão de p53 em fibroblastos de queloide das regiões periférica e central em relação aos outros subgrupos estudados. Conclusão: CGRP, SP e CGRP+SP provocaram uma diminuição na expressão de p53 em fibroblastos de queloide. / Introduction: Given that nociceptive neurogenic stimulation is considered the primary trigger of the healing process in the skin, that CGRP and SP increase fibroblast proliferation in vitro, and given the lack of studies correlating CGRP, SP p53 and apoptosis in keloid, it becomes important to investigate whether skin neuropeptides can influence the expression of p53 and apoptosis in keloid. A possible association between neuropeptides and p53 gene could represent a new path to a better physiopathogenic understanding of pathological fibroproliferative scars and, therefore, the advent of more specific treatments. Objective: To investigate the expression of p53 gene and the apoptotic index in keloid fibroblast cultures exposed to the action of the neuropeptides CGRP and SP. Methods: Keloid fibroblasts were grown in culture medium with or without the addition of CGRP and SP. The apoptotic index and cell cycle were determined by flow cytometry and the labeling of apoptosis key proteins was done by spectrophotometry. Cell activity was evaluated over time by MTT. Cell morphology was analyzed by confocal microscopy. Results: An explant model for keloid fibroblast isolation and culture based on the biological differences of its specific regions was standardized. Cellular activity in keloid fibroblasts varied over time and was different among the fibroblasts subgroups but similar within the same subgroup, however was not affected by the addition of CGRP, SP or SP + CGRP. Keloid fibroblasts derived from peripheral and central regions had higher p53 expression than fibroblasts derived from the skin adjacent to the keloid scar, fibroblasts derived from normotrophic scar or from normal skin adjacent to the normotrophic scar. CGRP, SP and SP + CGRP caused a decrease in p53 expression in keloid fibroblasts of peripheral and central regions compared to all other subgroups studied. Conclusion: CGRP, SP and SP + CGRP caused a decrease in p53 expression in keloid fibroblasts. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:13:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 elvia_esparza_ioc_dout_2014.pdf: 5839066 bytes, checksum: 29e89c3117f3207c7a4df861cc312204 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-06-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A expressão de arginase-1 (Arg1) está associada com a patogênese da leishmaniose visceral (LV), embora os mecanismos que norteiam a sua regulação na doença não sejam adequadamente conhecidos. Nesta tese foram explorados os mecanismos de regulação da Arg-1 no modelo experimental hamster, a fim de aplicar o conhecimento para o tratamento da doença. Encontrou-se que células infectadas in vitro com Leishmania (Leishmania) donovani expressaram Arg-1 e inhibiram a produção do óxido nítrico, o que contribuiu para o aumento da carga parasitária. A regulação da Arg1 dependeu do fator de transcrição STAT-6, que foi ativado de forma independente da IL-4. Para explorar outros mecanismos envolvidos na ativação de STAT-6 foi utilizada uma biblioteca quimica de 80 inibidores dos receptores tirosine quinases (RTK) e uma membrana microarranjo revestidas com anticorpos contra proteínas phosphoriladas dos RTK. Desta forma, foi possível identificar a ativação do receptor do fator de crescimento de fibroblasto-1 (FGFR-1) e o receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I (IGF-IR) nos macrofagos. Além disso, realizou-se uma caracterização mais detalhada da cascata de fosporilação canônica dessos receptores. Experimentos in vitro mostraram que macrófagos infectados com L. donovani aumentaram a transcrição de Arg1 quando foram tratados com os ligantes dos RTK, o FGF-2 e o fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-I), sugerindo que estes RTK tinham um papel na regulação da Arg1 na LV Quando inibidores químicos do FGFR-1 e IGF-IR foram testados em macrófagos infectados, a Arg1 e o STAT-6 foram inibidos sugerindo uma ligação entre essas vias. De fato, a estimulação com FGF-2 e IGF-I aumentou a fosforilação e a ativação transcripcional do STAT-6, e se observou um efeito aditivo quando a citocina IL-4 foi adicionada, demonstrando a interação positiva destas vias. A inibição do STAT-6 mediante interferência de RNA impediu ou diminuiu significativamente a Arg-1 induzida nos macrófagos infectados e estimulados com FGF-2 e por IGF-I. respectivamente, indicando um papel chave do STAT-6 na Arg-1 induzida pelos RTK. A relevância destes achados experimentais para os seres humanos foi avaliada em cultivos de sangue total de doadores sadios estimulados in vitro e no plasma de crianças durante a doença ativa, um mês, seis meses e até um ano após tratamento. Foi observado um aumento de Arg-1 após o estimulo in vitro com IL-4 e FGF-2 ou IGF-I, consistente com o achado no modelo hamster. Nos pacientes, os níveis plasmáticos de Arg-1 não mudaram com a evolução da doença após e o tratamento e o FGF-2 só apresentou um aumento associado com a resolução um ano após tratamento. Em conclusão, os sinais comuns ativados através do FGF-1R e IGF-IR convergem com a IL-4 para ativar STAT-6 e a transcrição de Arg-1 na LV experimental, mas determinar o papel destes fatores de crescimento na LV humana requer estudos adicionais. Este estudo propõe a base mecanicista da regulação da Arg1 mediada pela convergência da sinalização RTK e IL-4R ao STAT-6 na LV e sugere que os inibidores RTK são de utilidade potencial como tratamento adjuvante da doença / Arginase - 1 (Arg1) expression is associated with the pathogenesis of visceral leishmaniasis (VL) but the mechanisms that lead to its up - regulation on disease are not completelly k nown . The objective of this thesis project was to explore the mecanistic ba sis of Arg - 1 regulation in the experimental hamster model of VL with the aim to apply the knowledge to the treatment of the disease. We found that cells infected in vitro with Leishmania donovani expressed Arg1 and that nitric oxide production was inhibite d , contibuting to the increased parasite burden. Arg - 1 regulation was dependent of the transcription factor STAT - 6, but the activation of this transcription factor was independent of IL - 4 cytokine. To explore other mechanisms involved in activation of STAT - 6 and the expression of Arg1 we used a chemical library of 80 tyrosine kinase receptor (RTK) inhibitors and a protein array with antibodies against phosphorylated RTKs. This allowed identify the activation of fibroblast growth factor receptor - 1 (FGFR - 1) a nd insulin - like growth factor receptor (IGF - IR) and the canonical down - stream signaling cascade. Macrophages infected in vitro with L. donovani increased transcription of Arg1 when treated with RTK ligands (FGF - 2, IGF - I), suggesting a role of these RTKs in the regulation of the Arg1 in LV. C hemical inhibitors of the activated receptors were used to assess the effect on infected macrophages. We found that inhibitors of FGFR - 1 and IGF - IR inhibited parasite burden, Arg1 and STAT - 6, suggesting a connection betw een these routes. Furthermore, the simultaneous stimulation of RTKs with its ligands FGF - 2 or IGF - I and IL - 4 increased the phosphorylation and transcriptonal activation of STAT - 6 and increased Arg1 in an additive manner, showing a positive interaction betw een these signaling cascades. STAT - 6 inhibition by RNA interference prevented or significantly diminished the induction of Arg - 1 in macrophages stimulated with FGF - 2 and IGF - I respectively, indicating a key role of the STAT - 6 on Arg - 1 induced by RTKs. The relevance of these experimental findings to humans was evaluated in stimulated whole blood cultures of healthy donor’s o r plasma of children during active disease, 1 month, 6 months or after 1 year of treatment . We found that the Arg - 1 induced by in vitro stimulation with IL - 4 and FGF - 2 or IGF - I, was consistent with the animal model. However, in the patients plasmatic Arg - 1 did not change over the follow - up, while FGF - 2 increased only after 1 year of treatment. We conclude that the signals activated throu gh FGFR - 1 and IGF - I converge to IL - 4 to activate STAT - 6 and induce Arg - 1 in experimental VL . This study propose that the mecanistic basis of the regulation of Arg1 in VL is mediated by the convergence of RTK signaling pathways and IL - 4R to STAT - 6 and sugge st the potential utility of RTK inhibitors as adjuvant treatment for the disease.

A deficiência da desidrogenase de acilas-CoA de cadeia média (MCAD) é um defeito da oxidação de ácidos graxos (DOAG) bioquimicamente caracterizada pelo acúmulo de acilcarnitinas de cadeia média (MCAC) em tecidos e líquidos biológicos de indivíduos afetados. Clinicamente os pacientes apresentam sintomas neurológicos como letargia e coma, geralmente desencadeados por episódios de descompensação metabólica. Outros distúrbios importantes entre os DOAG são as deficiências da proteína trifuncional mitocondrial (MTPD) e da desidrogenase de 3-hidroxiacilas-CoA de cadeia longa (LCHADD) que são caracterizadas pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia longa e seus derivados 3- hidroxilados (LCHFA). Geralmente, os pacientes afetados apresentam disfunção cardíaca e hepática podendo também apresentar sinais de comprometimento neurológico. Até o momento, a hipoglicemia e a toxicidade dos ácidos graxos acumulados têm sido relacionados com a fisiopatologia dessas doenças, embora os mecanismos responsáveis pelo dano tecidual não são bem conhecidos. Assim, foram investigados os efeitos dos MCAC e LCHFA sobre importantes parâmetros da função redox e homeostase energética mitocondrial em cérebro e coração de ratos, bem como a produção de superóxido e morte celular em culturas de fibroblastos da pele de pacientes afetados por essas doenças. Primeiramente, observamos que as MCAC induzem dano oxidativo lipídico e proteico, além de reduzir as defesas antioxidantes não enzimáticas em cérebro de ratos, provavelmente através da indução de radicais hidroxil e peroxil. Além disso, evidenciamos aumento dos níveis de superóxido e de morte celular em fibroblastos de pacientes afetados pela MTPD em condições padrão de cultivo indicando uma exposição crônica a níveis mais elevados de superóxido e uma vulnerabilidade à morte celular. Fibroblastos de pacientes afetados pelas MTPD e MCADD também apresentaram aumento dos níveis de superóxido quando cultivadas em condições de estresse metabólico, contudo não houve aumento de morte celular. Finalmente, a morte celular foi mais pronunciada em fibroblastos afetados pela MTPD em comparação com pacientes afetados pela MCADD, além de apresentar uma forte correlação com a produção de superóxido, sugerindo que esses eventos são provavelmente associados. Por outro lado, observamos que LCHFA prejudicam a homeostase energética em mitocôndrias de coração devido a um efeito desacoplador da fosforilação oxidativa evidenciado pelo aumento do estado 4 da respiração e diminuição da razão de controle respiratório, pela redução do potencial de membrana, do conteúdo de NAD(P)H e da produção de H2O2. O ácido 3- hidroxitetradecanóico (3 HTA) também induziu inchaço mitocondrial provavelmente como consequência da abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP) uma vez que a ciclosporina A (CsA), um inibidor clássico da abertura do poro, impediu esse efeito em mitocôndrias cardíacas carregadas com Ca2+. LCHFA também dissipadaram o potencial de membrana, diminuíram o coneúdo de NAD(P)H e de ATP na presença ou ausência de Ca2+ em mitocondriais de córtex cerebral. Além disso, na presença de Ca2+, 3 HTA induziu inchamento mitocondrial e liberação de citocromo c, que ativa rotas apoptóticas. 3 HTA também afetou a homeostase de Ca2+ evidenciado por uma reduzida capacidade de retenção de Ca2+ pela mitocôndria e induziu a produção de H2O2 na presença de Ca2+. Essas alterações foram prevenidas pelo vermelho de rutênio (RR), um bloqueador da captação mitocondrial de Ca2+, e por CsA mais ADP, inibidores da abertura do mPTP, o que implica o seu envolvimento nesses efeitos. Em contraste, LCHFA não causaram dano oxidativo nem alteraram as defesas antioxidantes em coração de ratos jovens. Em conjunto, nós demonstramos que MCAC e LCHFA que se acumulam em pacientes afetados pelas deficiências da MCAD e MTP/LCHAD, respectivamente, são potencialmente tóxicos para as funções mitocondriais essenciais em cérebro e coração de ratos. Além disso, demonstramos que fibroblastos de pacientes com MTPD cultivados em condições padrão estão sob estresse oxidativo, que é acentuado quando os fibroblastos são submetidos a condições de estresse metabólico. Presume-se que esses mecanismos fisiopatológicos podem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelo dano tecidual característico desses pacientes. / The medium chain acyl-CoA dehydrogenase (MCAD) deficiency is a fatty acid oxidation disorder (FAOD) biochemically characterized by accumulation of medium-chain acylcarnitines (MCAC) in tissues and biological fluids of affected individuals. The clinical presentation includes neurological symptoms as lethargy and coma, generally followed by episodes of metabolic decompensation. Other important FAOD are the mitochondrial trifunctional protein (MTPD) and the long-chain 3- hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (LCHADD) deficiencies that are characterized by accumulation of long-chain fatty acids and their 3-hydroxylated (LCHFA) derivatives. Usually, affected patients present cardiac and hepatic dysfunction and may present signs of neurological impairment. So far, hypoglycemia and the toxicity of accumulating fatty acids have been related with the pathophysiology in these disorders, although the mechanisms responsible for tissue damage are poorly known. Thus, we investigated the effects of MCAC and LCHFA on important parameters of mitochondrial redox and energetic homeostasis in brain and heart of rats, as well as superoxide production and cell death in skin fibroblasts from patients affected by these diseases. First, we observed that MCAC induced lipid and protein oxidative damage, and reduced the antioxidant non-enzymatic defenses in rat brain, probably through induction of hydroxyl and peroxyl radicals. Furthermore, we evidenced increased superoxide levels and cell death in skin fibroblasts from MTP deficient patients under standard growing conditions indicating a chronic exposure to higher superoxide levels and a vulnerability to cell death. In addition, cells from MCADD and MTPD patients cultured under metabolic stress conditions presented increased levels of superoxide, although cell death was not increased. Finally, cell death was more pronounced in fibroblasts from MTP compared to MCAD deficient patients, and presented a strong correlation with superoxide production, suggesting that these events are probably associated. On the other hand, we observed that LCHFA provoked an impairment of heart mitochondrial energetic homeostasis, by behaving as uncouplers of oxidative phosphorylation, evidenced by increase of state 4 respiration and decrease of the respiratory control ratio, by reducing the membrane potential, the NAD(P)H content and H2O2 production. 3-Hydroxytetradecanoic acid (3 HTA) also induced mitochondrial swelling probably as a consequence of the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening once cyclosporin A (CsA), a classical inhibitor, prevented this effect in heart mitochondria loaded with Ca2+. LCHFA also dissipated membrane potential, diminished NAD(P)H content and decreased ATP content in the presence or absence of Ca2+ in cerebral cortex mitochondrial preparations. Moreover, 3 HTA induced mitochondrial swelling and cytochrome c release in the presence of Ca2+, which activates apoptotic cascades. 3 HTA also affected Ca2+ homeostasis evidenced by a diminished mitochondrial Ca2+ retention capacity and induced hydrogen peroxide production in the presence of Ca2+. These alterations where prevented by ruthenium red (RR), a blocker of mitochondrial Ca2+ uptake, and by CsA plus ADP, inhibitors of the mPTP, implying its involvement in these effects. In contrast, LCHFA did not cause oxidative damage nor altered the antioxidant defenses in heart of young rats. Taken together, we demonstrated that MCAC and LCHFA found accumulated in patients affected by MCAD and MTP/LCHAD deficiencies, respectively, are potentially toxic to essential mitochondrial functions in rat brain and heart. We also found that fibroblasts from MTP deficient patients cultured under basal growing conditions are under oxidative stress that is accentuated when cultured metabolic stress conditions are used. It is presumed that these pathomechanisms may be responsible, at least in part, for the tissue damage characteristic of these patients.

Submitted by Midyan Daroz Guastali null (midyandaroz@yahoo.com.br) on 2017-01-03T01:56:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Midyan Daroz Guastali.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) Previous issue date: 2016-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência de obtenção de células de pluripotência induzida (iPS) em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de mecanismo viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de infecção e qual o tipo de célula é mais eficiente para reprogramação celular. Ambos os tipos celulares foram infectados com vetores virais e transposons contendo os genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, KLF-4; as células transformadas foram avaliadas quanto a morfologia, imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e também quanto as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim as células reprogramadas foram induzidas a se diferenciarem em tecidos dos 3 folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à infecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos (7 dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi lenta, com a 1ª passagem realizada 30 dias após a infecção em comparação com as colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Não foi verificada reprogramação efetiva as infecções com transposons em nenhum dos dois tipos celulares. Conclui-se que o método de infecção por vetor viral em células do cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e que em ambos os tipos celulares, o mecanismo de transposons não resultou em células reprogramadas. / Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and non-viral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry and flow cytometry with the typical pluripotent stem cells markers and also for the changes caused in the gene expression profile of the cells by the PCR real time method; finally reprogrammed cells were induced to reprogram to differentiate into three germ layers tissues. The results showed that fibroblasts and cord cells subjected to viral infection presented pluripotent cell characteristics such as morphology, positive staining for antibodies and specific gene expression, immunocytochemistry of the formed embryoid bodies also showed labeling for ectoderm, mesoderm and endoderm. Despite the time to start colonies formation is very similar (7 days for fibroblasts and 6 days for cord cells), the expansion of reprogrammed fibroblasts colonies was slow, with the 1st performed 30 days post-infection in comparison with umbilical cord colonies, in which the 1st pass on cord colonies after 15 days. No effective reprogramming of transposon infections was observed in either cell type. It is concluded that the method of viral vector infection in umbilical cord cells is more efficient than in fibroblasts and that in both cell types, the mechanism of transposons did not result in reprogrammed cells. / FAPESP: 2012/18735-4