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Avaliação in vitro do cultivo de fibroblastos gengivais humanos em matriz dérmica acelular / Evaluation of in vitro human gingival fibroblasts on the acellular dermal matrixRodrigues, Annelissa Zorzeto 21 May 2008 (has links)
A matriz démica acelular, MDA, figura dentre os biomateriais que têm por objetivo restaurar defeitos mucogengivais. A correção de defeitos mucogengivais a partir de constituintes autógenos são os procedimentos mais comumente usados, no entanto, em decorrência da quantidade insuficiente de tecido doador, esses procedimentos se tornam limitados. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar, in vitro, diferentes aspectos relacionados ao cultivo prévio de fibroblastos gengivais humanos em MDA. Fibroblastos gengivais humanos foram cultivados pela técnica do explante a partir de amostras de tecido gengival queratinizado removido de três pacientes saudáveis. A MDA foi cultivada com esses fibroblastos por períodos de 14 e 21 dias para posterior análise dos eventos de: adesão celular, proliferação e viabilidade. Os resultados mostraram que em 7 dias, os fibroblastos estavam aderidos, espraiados e dispersos sobre a superfície externa da MDA, em 14 dias formavam monocamada de células de morfologia alongada e quiescentes (Ki-67 negativos) em sua maioria, sendo apenas ocasionalmente observadas no interior da MDA. Em 21 dias a monocamada exibia menor densidade celular. Os resultados sugerem que o cultivo de fibroblastos em MDA em períodos de 14 dias permite boas condições de adesão e espraiamento das células sobre a matriz, porém, a alta densidade de fibras colágenas parece ser um fator limitante à migração celular. / Acellular Dermal Matrix, ADM, is a biomaterial that has been used in periodontal procedures to treat mucogingival defects. Mucogingival defects can be corrected by autogenous grafts that are the most common procedure used in periodontology, however, because of the limited source of donor\'s tissue this procedure became limited. The aim of this investigation was to verify, in vitro, different aspects related to human gingival fibroblasts seeding on to the ADM. Human gingival fibroblasts were established from explant cultures from the connective tissue of keratinized gingiva collected from three healthy patients. ADM was seeded with gingival fibroblasts for 14 and 21 days, and then cell adherence, proliferation and viability were analyzed. Results revealed that, at day 7, fibroblasts were adherent and spreading on the ADM surface, and were unevenly distributed, forming a discontinuous single cell layer, at day 14, a confluent fibroblastic monolayer lining ADM surface was noticed. At day 21, the cell monolayer exhibited a reduction in cell density. The results suggests that fibroblasts seeding on the ADM for 14 days can allow good conditions for cell adhesion and spread on the matrix, however, because of the high collagen fiber bundle density cell, migration inside the matrix was limited.
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Papel anti-fibrótico de PGE2 e BMP-7 na asma alérgica experimental. / Anti-fibrotic role of PGE2 and BMP-7 in experimental allergic asthma.Stumm, Camila Leindecker 19 June 2012 (has links)
A asma alérgica é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas que envolve ativação de fibroblastos pulmonares. Esta ativação é induzida por TGF-<font face=\"Symbol\">b e este processo é regulado por moléculas anti-fibróticas. Nosso objetivo foi elucidar mecanismos envolvidos na fibrose das vias aéreas em um modelo de asma. Na primeira parte, investigamos o eixo síntese/resposta da PGE2. A PGE2 e seu análogo forskolina inibiram síntese de colágeno I e proliferação de fibroblastos. Estas células apresentaram perda tempo-dependente na capacidade de sintetizar PGE2 sob estímulo com IL-1<font face=\"Symbol\">b, e menor expressão de COX-2 e mPGEs-1. Na segunda parte, estudamos a relação TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 na fibrose das vias aéreas. Há predomínio da molécula pró-fibrótica TGF-<font face=\"Symbol\">b1 sobre a molécula anti-fibrótica BMP-7 nos pulmões de animais asmáticos. Em fibroblastos, a BMP-7 inibe a síntese de colágeno tipo I induzida pelo TGF-<font face=\"Symbol\">b1 e as vias de SMAD-2, SMAD-3 e p38. O tratamento dos animais com BMP-7 causou diminuição significativa da fibrose. Os resultados implicam estes mecanismos na fibrose das vias aéreas na asma. / Allergic asthma is a chronic inflammatory disease of the airways that involves activation of lung fibroblasts. This activation is induced by TGF-<font face=\"Symbol\">b and this process is regulated by anti-fibrotic molecules. Our goal was to elucidate mechanisms involved in airway fibrosis in an animal model of asthma. In the first part, we investigated the PGE2 synthesis/response axis. PGE2 and its analog forskolin inhibited collagen I synthesis and proliferation of fibroblasts. These cells showed a time-dependent loss in the ability to synthesize PGE2 under IL-1<font face=\"Symbol\">b stimulation, and downregulated COX-2 and mPGEs-1. In the second part, we studied the ratio TGF-<font face=\"Symbol\">b1/BMP-7 in airway fibrosis. There is predominance of the pro-fibrotic TGF-<font face=\"Symbol\">b1 over the anti-fibrotic BMP-7 in the lungs of asthmatic animals. In fibroblasts, BMP-7 inhibits TGF-<font face=\"Symbol\">b1-induced type I collagen synthesis and the SMAD-2, SMAD-3 and p38 pathways. Treatment of the animals with BMP-7 caused significant decrease in fibrosis. The results implicate these mechanisms in airway fibrosis in asthma.
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Avaliação genética e imunológica de famílias com deficiências nos componentes C3 ou Fator I do Sistema Complemento e a influência dessas deficiências na expressão gênica de fibroblastos de pele humana. / Genetic and immunologic evaluation of families with deficiencies on C3 or Factor I components of Complement System and influence of this deficiencies on gene expression of human skin fibroblasts.Delcolli, Maria Isabel Mesquita Vendramini 29 June 2012 (has links)
Avaliamos as causas moleculares da deficiência de C3 ou de FI em 07 pacientes, chegando a caracterizar a causa molecular em cinco deles. As mutações encontradas em cada um dos pacientes foram: C3def3 - C364G troca Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, troca Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, troca Arg187Stop; FIdef6 e -7 - Inserção 1382<font face=\"Symbol\">DAT, códon de parada prematura 13 bases a montante. Além disso, analisamos se a ausência dessas proteínas levava a alterações na expressão gênica em fibroblastos de pele de pacientes deficientes de C3 ou de FI em relação a indivíduos normais e saudáveis através de ensaios com microarranjos de cDNA. Confirmamos uma tendência à alteração da expressão através de PCR em tempo real dos genes CHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B e MASP1 nos deficientes de C3; dos genes SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 e JAKMIP3 nos deficientes de FI e o gene ETV6 nos dois grupos de pacientes. Dessa forma, podemos sugerir que deficiências das proteínas C3 e FI podem possivelmente influenciar a expressão de outros genes neste tipo de célula. / We investigated C3 and Factor I deficiency in 07 patients and could characterize the molecular basis in five of them. The mutations found were: C3def3 - C364G change Arg102Gly; G2481C (Val807); A4956G (Val1632); FIdef2 - G693A, change Gly162Asp; FIdef3 e -4 - C767T, change Arg187Stop; FIdef6 e -7 - insertion 1382<font face=\"Symbol\">DAT, Stop codon generation after 13 bp. Furthermore, we analyzed if the absence of these proteins cause alterations in gene expression profiles in skin fibroblasts from C3 and FI deficients compared to fibroblasts from normal individuals by cDNA microarrays. We confirmed a tendency of altered gene expression by Real Time PCR atCHNRB1, CAV1, PSMB1, PI4K2B and MASP1 genes on C3 deficients, SPRY2, PSMA5, PGM2L1, GOLPH3 and JAKMIP3 on FI deficient and ETV6 gene in both groups. Thus, we concluded that C3 and FI deficiencies could affect gene expression profiles in skin fibroblasts.
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Efeitos da elevada concentração de glicose sobre a reciclagem de integrinas contendo a subunidade b1 em fibroblastos. / Effects of high glucose concentration on the recycling of b1-containing integrins in fibroblasts.Monteiro, Kelly Salzmann 03 October 2014 (has links)
Introdução: In vivo ou in vitro a exposição de fibroblastos a alta concentração de glicose promove um aumento do estresse oxidativo e consequentemente prejudica a migração celular, assim como a maturação da adesão. Além disso, a elevada concentração de glicose reduz a expressão de diferentes integrinas na superfície celular devido alterações na síntese do receptor e sua reciclagem. Objetivo: Avaliar os efeitos da elevada concentração de glicose no tráfego de vesículas contendo EEA1 (endossomos primários), Rab4 (via rápida da reciclagem), Rab11 (via lenta de reciclagem) e Rab7 (endossomos de degradação) em fibroblastos NIH3T3. Métodos: células foram cultivadas em meio contendo baixa concentração de glicose (LG, 5 mM) ou em alta concentração (HG 25 mM) durante 21 dias antes de realizar os experimentos. EEA1, Rab4, Rab11 e Rab7 expressão e distribuição foram avaliados por western blotting e imunofluorescência, respectivamente. Resultados: Células expostas à alta concentração não apresentaram diferenças na expressão e distribuição das proteínas EEA1 e Rab7, enquanto a expressão de Rab11 foi reduzida em 30%. Conclusão: a alta concentração de glicose altera a via lenta da reciclagem contendo Rab11, afetando potencialmente a reciclagem de integrinas e outros receptores e a sua expressão na superfície celular. / Background: In vivo or in vitro exposure of fibroblasts to high glucose concentrations (HG) promotes oxidative stress and consequently impairs cell migration, also inhibiting adhesion maturation. Additionally, HG reduces the expression of different integrins on the cell surface, potentially due to altered receptor synthesis and recycling. Aim: to evaluate the effects of HG on the trafficking vesicles containing EEA1 (early endosomes), Rab4 (fast recycling pathway) and Rab7 (endocytic degradation pathway) on NIH3T3 fibroblasts. Methods: cells were cultured under low glucose (LG, 5 mM) or HG (25 mM) concentrations during 21 days before the assays. EEA1, Rab4 and Rab7 expression and distribution were evaluated by western blotting and immunofluorescence, respectively. Results: HG did not affect proteins EEA1 and Rab7 expression and distribution, whereas Rab11 expression was reduced by 30%. The number of vesicles containing Rab11 was also significantly reduced in HG cells. Conclusion: high glucose alters the slow recycling endocytic pathway via Rab11, potentially affecting integrins and other receptors synthesis and expression on the cell surface.
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Estudo genético-clínico e molecular em pacientes portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações / Clinical and molecular study in patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformationsZandoná Teixeira, Aline Cristina 01 October 2013 (has links)
INTRODUÇÃO: As alterações cromossômicas são a primeira suspeita etiológica em indivíduos com múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. Verifica-se que em alguns pacientes esse fenótipo está associado a alterações pigmentares como as manchas cutâneas. Porém, nem sempre o resultado do cariótipo em sangue periférico para esses pacientes revela alterações cromossômicas. Dessa forma, a análise cromossômica de outro tecido, como a cultura e cariotipagem dos fibroblastos da pele, torna-se importante para verificar a ocorrência de mosaicismo oculto que poderia explicar o fenótipo clínico. OBJETIVOS: Padronizar e implantar um protocolo para cultura de fibroblastos de pele humana, oriunda de manchas cutâneas de pacientes com atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. Estabelecer o método de cariotipagem molecular de fibroblastos em tecido epitelial e realizar a correlação com o fenótipo. MÉTODOS: Os pacientes foram provenientes do ambulatório de Genética do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). Foram realizados cariótipos de fibroblastos de pele de 15 pacientes com cariótipo de sangue periférico normal, portadores de manchas cutâneas associadas ao atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou malformações. A análise citogenética dos fibroblastos foi feita a partir de biópsia cutânea das manchas, seguida dos seguintes procedimentos: cultura de fibroblastos, processamento, cariotipagem por bandamento G e análise citogenética molecular. RESULTADOS: Dentre os 15 casos estudados, 8 apresentaram isocromosomo de 12p (síndrome de Pallister-Killian), 1 apresentou um mosaicismo sexual atípico e os outros 6 apresentaram resultado normal. CONCLUSÃO: A análise cromossômica de fibroblastos foi imprescindível para o diagnóstico de pacientes com manchas cutâneas associadas à múltiplas anomalias congênitas, atraso de desenvolvimento neuropsicomotor e/ou deficiência cognitiva. A abordagem diagnóstica adequada é fundamental para conduzir o tratamento de forma apropriada e para definir o prognóstico desses pacientes, sendo também imprescindível para a realização do aconselhamento genético / INTRODUCTION: Chromosomal aberrations are the first suspected etiology in individuals with multiple congenital anomalies, developmental delay and/or intellectual disability. This phenotype is sometimes associated with pigmentary skin anomalies. However, in some cases the peripheral blood cells karyotype is normal. Therefore, the cytogenetic analysis of other tissues such as culture and karyotyping of skin fibroblasts is important to verify the occurrence of cryptic mosaicism that may explain the clinical phenotype. OBJECTIVES: To standardize and set a protocol for culture of human skin fibroblasts. To perform molecular karyotyping of fibroblasts and establish the correlation with phenotype. METHODS: Patients were recruited from the outpatient clinic of the Genetics Unit of Instituto da Criança do Hospital das Clínicas d Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (ICR-HCFMUSP). The karyotypes of skin fibroblasts were performed in 15 patients with normal blood karyotype, presenting with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The cytogenetic analysis of fibroblasts was made from skin biopsy of the spots, followed by fibroblast culture, processing, karyotyping by G-banding analysis and molecular cytogenetics. RESULTS: Among the 15 cases studied, 8 showed isochromosome 12p (Pallister-Killian syndrome), 1 had atypical sexual mosaicism and the other 6 had normal results. CONCLUSION: The cytogenetic analysis of skin fibroblasts is crucial for the diagnosis of patients with pigmentary skin anomalies associated with developmental delay and/or malformations. The proper diagnosis is fundamental for the appropriate treatment, to define prognosis for these patients and essential for the genetic counselling
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Estudo de expressão gênica e de comportamento celular em células de indivíduos portadores de craniossinostoses sindrômicas / Gene expression and cell behavior study in cells from individuals with syndromic craniosynostosisFanganiello, Roberto Dalto 04 February 2010 (has links)
Um dos grupos de doenças mais importante que acomete o desenvolvimento da caixa craniana humana é o das craniossinostoses, caracterizado pelo fechamento prematuro de uma ou mais suturas cranianas. Entre as formas mendelianas das craniossinostoses sindrômicas, mutações dominantes em FGFR2 são uma das causas mais frequentes e estão associadas às síndromes de Apert, de Crouzon e de Pfeiffer. A sinalização intracelular subseqüente à ativação de FGFR2, tanto selvagem quanto mutante, é bastante intrincada e pode sofrer inúmeras bifurcações. As porções iniciais destas vias, imediatamente subsequentes à ativação do receptor, são relativamente bem compreendidas. Grande parte, porém, do controle dessas vias, principalmente no que tange a regulação transcricional e sua associação com alterações em comportamentos celulares, não é entendido. Assim sendo, os objetivos gerais deste trabalho foram: 1) estudar o potencial de diferenciação e o perfil diferencial de transcrição gênica de culturas primárias de células fibroblastóides isoladas a partir do periósteo das suturas coronais de pacientes acometidos por síndrome de Apert (heterozigotos para a mutação de ganho de função p.Ser252Trp em FGFR2, a mutação mais comum em pacientes com esta síndrome) e 2) estudar o potencial de diferenciação osteogênico e o perfil transcricional respectivamente de células mesenquimais e de tecido provenientes de sutura coronal de um modelo murino para Síndromes de Crouzon/Pfeiffer (heterozigotos para a mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, a mutação mais comum associada a estas síndromes). Certificamo-nos da expressão gênica e proteica de FGFR2 nas células fibroblastóides humanas e de Fgfr2 nas células mesenquimais murinas. Em seguida, testamos o potencial osteogênico (in vitro e in vivo ) e adipogênico (in vitro ) das células de pacientes com Síndrome de Apert, comparadas a células do mesmo tecido mas de indivíduos sem esta mutação e o potencial osteogênico (in vitro ) das células mesenquimais de camundongos portadores da mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, comparadas a células também das suturas coronais mas de animais selvagens. O potencial de diferenciação das células mutantes, nos dois grupos de experimentos, foi muito aumentado em relação ao potencial das células livres destas mutações. Conduzimos experimentos de microarrays de expressão gênica (sistema CodeLink) com 7 amostras de culturas primárias de células de pacientes com S. de Apert e as comparamos com 7 amostras de culturas primárias controles. Identificamos 263 genes com valores de expressão estatisticamente diferentes (SNR ≥ |0.4|, P ≤ 0,05) nas amostras de pacientes com S. de Apert quando comparadas às controles (118 superexpressos, 145 subexpressos). Categorias funcionais enriquecidas foram regulação de proliferação celular, metabolismo de nucleotídeos, regulação de expressão gênica, adesão celular, organização de matriz extracelular e cascata PI3K MAPK. Para a validação deste experimento constatamos superexpressão, por PCR em tempo real, de genes identificados como superexpressos na assinatura de expressão associada às células mutadas, além de verificarmos o mesmo comportamento destes genes em células controles tratadas com FGF2 exógeno para superativação do receptor. Os experimentos de expressão gênica com os tecidos de suturas coronais do modelo murino foram feitos com 15 amostras de tecidos de animais mutantes em 3 grupos de 5 e comparadas a amostras de mesmo tecido de animais selvagens agrupadas da mesma forma. Identificamos três listas de genes diferencialmente expressos: a primeira contendo 188 transcritos (P ≤0,05, FC ≥ 1,5,sendo 91 superexpressos e 97 subexpressos), e as outras duas filtradas previamente para coeficiente de variação < 50% dentro de cada grupo, contendo 488 transcritos (P ≤0,05, FC ≥ 1,2, sendo 183 superexpressos e 305 subexpressos) e 31 transcritos (P ≤0,05, FC ≥ 1,5, sendo 11 superexpressos e 20 subexpressos). Categorias funcionais mais enriquecidas foram crescimento, proliferação e ciclo celular, diferenciação celular, sinalização célula-célula, resposta imune mediada por células e sinalização por receptor Wnt. Estes resultados nos permitiram: a) demonstrar que células fibroblastóides de periósteo craniano de paciente portadores de S. de Apert (mutação p.Ser252Trp em FGFR2) e células mesenquimais do modelo murino para S. de Crouzon e Pfeiffer, portador da mutação p.Cys342Tyr em Fgfr2, apresentam potencial osteogênico aumentado, agregando evidências que sugerem que esta alteração de comportamento celular tem função fundamental no desencadeamento das craniossinostoses nestas síndromes; b) revelar assinaturas de expressão gênicas associadas a estas mutações nas condições estudadas, que podem reger este comportamento celular anormal; c) identificar um novo grupo de genes associados à patofisiologia da Síndrome de Apert ou às características fenotípicas do modelo murino investigado, podendo também ser genes candidatos a outras craniossinostoses de causa desconhecida. / Craniosynostosis is one of the most important group of diseases linked to the development of the human skull and is characterized by the premature fusion of one or more cranial sutures. Dominant mutations in FGFR2 are frequent molecular causes amongst the mendelian inherited forms of the syndromic craniosynostosis and are associated to Apert, Crouzon and Pfeiffer syndromes. The intracellular signaling pathways following the activation of wild type or mutant FGFR2 are very complex due to several possible bifurcations. The initial portions of these pathways, immediately following the receptor activation, are relatively well delineated. However the great majority of the events related to the control of these pathways is still not well understood, mainly concerning its transcriptional regulation and its association to other cell behavior anomalies. Therefore the key scopes of this work were: 1) to study the differentiation potential and the differential gene expression profile of primary fibroblastoid cell cultures isolated from the periosteum of the coronal sutures of Apert Syndrome patients (heterozygous for the mutation p.Ser252Trp in FGFR2, the most common cause of the Apert Syndrome condition) and 2) to study the osteogenic differentiation potential and the transcriptional profile of mesenchymal cells and tissue isolated from the coronal sutures of a mouse model for the Crouzon and Pfeiffer Syndromes (heterozygous for the p.Cys342Tyr mutation in Fgfr2, the mutation most commonly associated to these syndromes). We assured the FGFR2 /FGFR2 gene and the protein expression in human fibroblastoid cells and Fgfr2 /Fgfr2 expression in the mesenchymal murine cells. We tested the (in vitro and in vivo ) osteogenic and the (in vitro ) adipogenic potentials of the Apert Syndrome patients cells compared to cells from the same tissue but from subjects without this mutation and the (in vitro ) osteogenic potential of mesenchymal cells from mice bearing the p.Cys342Tyr mutation in Fgfr2 compared to coronal suture cells but from wild type mice. On both experiments the differentiation potential of the mutant cells were very increased when compared to the potential of the wild type cells. We conducted gene expression microarray experiments (CodeLink system) using 7 samples from primary cultures of cells from Apert Syndrome patients compared to 7 samples from primary control cultures. We identified 263 genes with significantly different expression (SNR ≥ |0.4|, P ≤ 0,05) associated to the Apert Syndrome profile (118 upregulated, 145 downregulated). Enriched functional cathegories were regulation of cell proliferation, nucleotide metabolism, gene expression regulation, cell adhesion, extracellular matrix organization and PI3K MAPK cascades. In order to validate this gene expression signature we confirmed through Real-Time PCR the upregulation of genes identified as upregulated in the Apert cell profile in samples from the microarray experiment and in control cells treated with exogenous overactivate the receptor. The gene expression experiments with the coronal suture tissues from the mouse model were performed with 15 samples of mutant animal tissue in 3 groups of 5 and compared to samples from the same tissue of wild type animals, with identical grouping. We identified three sets of differentially expressed genes: the first set containing 188 transcripts (P ≤0,05, FC ≥ 1,5, 91 upregulated e 97 downregulated), and the other two filtered for coeficient of variation < 50% in each group, containing 488 transcripts (P ≤0,05, FC ≥ 1,2, sendo 183 upregulated and 305downregulated) e 31 transcripts (P ≤0,05, FC ≥ 1,5, 11 upregulated and 20 downregulated). The most enriched functional categories were growth, proliferation and cell cycle, cell differentiation, cell-to-cell signaling, cell mediated immune response and Wnt receptor signaling. These results allowed us: a) to demonstrate that fibroblastoid cells from coronal periosteum PF Apert Syndrome patients (p.Ser252Trp mutation in FGFR2) and mesenchymal cells from the coronal tissue of the mouse model for Crouzon and Pfeiffer syndromes (bearing the p.Cys342Tyr in Fgfr2) have enhanced osteogenic potential, summoning evidences suggesting that this cell behavior alteration have a fundamental role to the craniosynostotic process in these syndromes; b) to unravel gene expression signatures linked to these mutations in the studied conditions, that could orchestrate this abnormal cell behavior; c) to identify a ser of genes associated to the pathophysiology of Apert Syndrome and to the phenotypic characteristics of the animal model investigated, which might be candidate genes to other craniosynostosis of unknown cause.
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"Avaliação da expressão dos receptores de interleucina-8, CXCR1 e CXCR2, e da atividade proliferativa em fibroblastos de quelóide e de pele normal" / Determination of the interleukin-8 receptors CXCR1 and CXCR2, and proliferative activity in keloids and normal skin fibroblastsAbdo Filho, Décio 05 September 2006 (has links)
O quelóide é um tumor fibroso benigno que ocorre durante a cicatrização da pele em indivíduos geneticamente predispostos. A cicatrização é um processo biológico complexo e depende da interação de diferentes estruturas teciduais e de um grande número de tipos celulares residentes e infiltrativos, que produzem citocinas. A interleucina 8 (IL-8), citocina pró-inflamatória, é super-expressa pelos fibroblastos durante o desenvolvimento do tecido de granulação, acelerando o processo de cicatrização. Como o quelóide resulta de uma reparação tecidual anormal após lesão da pele, o presente estudo teve por objetivo determinar a expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e CXCR2, e a capacidade proliferativa, pelo ciclo celular, dos fibroblastos queloideanos cultivados e extraídos ex vivo, por citometria de fluxo. Fibroblastos de cicatriz queloideana e de pele normal foram obtidos de 21 pacientes da raça negra, com idade variando entre 10 e 40 anos, de lesões com até 2 anos de evolução. Em nosso estudo constatamos expressão reduzida dos receptores para a IL-8, CXCR1(35,7%±11,2) e CXCR2 (27,8%±11,3), em fibroblastos de cicatriz queloideana cultivados, comparando com a pele normal (44,1±16,2 e 46,3±27,1 respectivamente). Entretanto, essa diferença só foi significante para o receptor CXCR2. A baixa expressão desses receptores poderia ser decorrente da atividade de metaloproteinases, que regulam a expressão de proteínas da superfície celular, através de clivagem enzimática, ou a capacidade reduzida de internalização e a reciclagem de receptores, mantida por filamentos de actina do citoesqueleto, que nos fibroblastos do quelóide estão diminuídos. Em relação ao ciclo celular de fibroblastos cultivados do quelóide e da pele normal, verificamos diferenças não significantes da capacidade de replicação (fase S do ciclo celular) e de apoptose. No quelóide observamos significante aumento de células na fase G2/M, indicando aumento da velocidade de divisão celular. Para confirmar esses achados estudamos o ciclo celular de fibroblastos extraídos ex vivo, da porção periférica e central do quelóide e da pele normal. Os fibroblastos da porção periférica apresentaram porcentagem significantemente maior de células com capacidade replicativa, fase S do ciclo (22,9% ± 11,6), em relação à porção central (4,7% ± 2,9) e à pele normal (6,8% ± 4,9), e maior velocidade de divisão celular, fase G2/M (18,6 ± 12,0), em relação à porção central (35,6 ± 7,0) e pele normal (32,3 ± 6,9). Verificamos que a porção central apresentou maior porcentagem de células em apoptose (7,0% ± 2,1), comparado à porção periférica (4,9% ± 1,9) e pele normal (2,0% ± 0,86). Esses dados indicam que as células da porção periférica do quelóide parecem ser responsáveis pela elevada taxa de proliferação, justificando o crescimento expansivo a partir das margens da cicatriz queloideana, com desenvolvimento de lesão semelhante a tumor, bem como a porção central ser responsável pela fibrose, contendo células quiescentes e apoptóticas. Esses resultados sugerem modulação diferencial das reações celulares através das vias de sinalização para proliferação ou morte celular programada. Neste sentido, a baixa expressão dos receptores da IL-8, CXCR1 e principalmente de CXCR2, nos fibroblastos do quelóide sugere capacidade reduzida da IL-8 em promover cicatrização acelerada. A baixa atividade da IL-8 sobre os fibroblastos queloideanos estaria promovendo desregulação da resposta inflamatória e com isso atraindo novas células inflamatórias para o local e produzindo sinais alterados, como grande produção da citocina TGFβ. Essa desregulação do processo de cicatrização, com alteração de citocinas e da matriz extracelular, poderia ser responsável pelas duas populações de fibroblastos, uma proliferativa na periferia e outra quiescente e apoptótica na porção central. Finalizando, podemos concluir que nossos resultados correspondem às alterações histológicas e clínicas do quelóide que se expande nos limites da lesão. / A keloid is a benign fibrous tumor that occurs during wound healing in genetically predisposed individuals. Healing is a complex biological process and depends on the interaction of different tissue structures and a great number of resident and infiltrative cell types. The interleukin-8 (IL-8), a proinflammatory chemokine, showed higher expression in fibroblasts during the development of the granulation tissue, promoting more rapid tissue maturation. Since keloids result from abnormal wound healing, the objective of the present study was to determine the expression of CXCR1 and CXCR2, IL-8 receptors, and the proliferation capacity, throughout the cell cycle, of the keloid fibroblasts extracted ex vivo and those submitted to in vitro cultivation. Normal skin and keloid scar fibroblasts were obtained from 21 African-Brazilian patients, aged from 10 to 40 years, whose lesions had evolved for no longer than 2 years. Expression of receptors and the cell cycle was assessed by flow cytometry. We showed lower expression of the CXCR1 (35,7% ± 11,2) and CXCR2 (27,8%±11,3) in keloid fibroblasts, when compared with normal skin (44,1 ± 16,2 e 46,3 ± 27,1 respectively), but the difference was not significant for the CXCR1 receptor. This lower expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could be due to the action of metalloproteinases, which regulate the surface protein enzymatically, or fibroblastic cytoskeleton conditions, which influence receptor internalization and recycling. The distribution assessment of cell cycle phases of fibroblasts cultivated from keloid scars and normal skin did not show significant difference in replication capacity and apoptosis. The keloid fibroblasts presented a significantly higher proportion of cells in the G2/M phase, suggesting higher rate of cell division. To confirm these results we studied the cell cycle of fibroblasts extracted ex vivo, now separated by central and peripheral portions of keloid and normal skin. The peripheral fibroblasts showed significant high cell proportions in phase S (22,9% ± 11,6), compared with the central portion (4,7% ± 2,9) and normal skin (6,8% ± 4,9), and higher cells in division phase G2/M (18,6% ± 12,0), compared with the central portion (35,6% ± 7,0) and normal skin (32,3% ± 6,9). The central portion showed higher proportion of apoptosis (7,0% ± 2,1), compared with the peripheral portion (4,9% ± 1,9) and normal skin (2,0% ± 0,86). These results suggest that the keloid peripheral cells could be responsible for the proliferation rate, justifying the expansive keloid growth at the borders of the keloid scar, in a similar fashion to tumor development and the central portion being responsible for fibrosis, with quiescent and apoptotic cells. These results suggest a differentiated modulation of cell reactions by signal pathways for programmed cellular proliferation or death. In this sense, the low expression of the IL-8 receptors CXCR1 and CXCR2 in keloid fibroblasts suggests a diminished capacity of IL-8 to promote accelerated healing. This low expression of IL-8 receptors in keloid fibroblasts could promote the dysregulation of the inflammatory response and thus attract more inflammatory cells to the site, producing different signals, such as a high production of the TGFβ cytokine. This dysregulation of the healing process, with changed cytokine and extracellular matrix expression, could be responsible for two different cell populations of fibroblasts, one proliferation at the periphery and the other fibrotic at the center of the lesion, with apoptotic and quiescent cells. Finally, we conclude that our results correspond to the histological and clinical changes of keloids that grow beyond the wound boundaries.
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Reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos murinos: envolvimento de receptores de reconhecimento de patógenos (TLR2 e CD14) e a proteína adaptadora MyD88Pinheiro, Cláudia Ramos 21 June 2013 (has links)
Os tecidos pulpar e periodontal são frequentemente agredidos por fatores ambientais como calor, trauma mecânico e micro-organismos, sendo estes considerados o fator etiológico principal das periodontopatias e periapicopatias. Dentre as células residentes desses tecidos, especial atenção tem sido dada ao papel dos fibroblastos no desenvolvimento da resposta imune. Fibroblastos são células que respondem à estímulos microbianos e existem evidências do papel de receptores do tipo Toll (TLR) no reconhecimento desses estímulos. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o reconhecimento de Candida albicans por fibroblastos gengivais e pulpares. Para tal, fibroblastos isolados a partir de tecido gengival e pulpar de camundongos do grupo controle e deficientes de TLR2, CD14 e MyD88 foram avaliados quanto à expressão de TLRs e moléculas de superfície, resposta proliferativa e produção de citocinas (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6), após a estimulação com agonistas de TLR2, TLR4 e C. albicans. Fibroblastos gengivais e pulpares, apesar de provenientes de tecidos diferentes, apresentaram características morfológicas semelhantes. Contudo, a cinética de crescimento dos fibroblastos gengivais deficientes de MyD88 foi mais lenta, e fibroblastos pulpares demoraram mais tempo para surgir a partir dos fragmentos de tecido. A ausência de TLR2 e da molécula adaptadora MyD88 não afetaram a produção de colágeno Tipo I pelos fibroblastos gengivais. Entretanto, fibroblastos deficientes de CD14 apresentaram baixa produção de colágeno. Ademais, os fibroblastos gengivais expressaram TLR2, TLR3, TLR4, assim como as moléculas de adesão ICAM-1 e CD44. A ausência de TLR2 e CD14 interferiu na resposta proliferativa de fibroblastos gengivais e pulpares, respectivamente. O reconhecimento de C. albicans por fibroblastos gengivais e pulpares modulou a produção das citocinas. A produção de TNF-α foi dependente da sinalização via MyD88, CD14 e TLR2, enquanto que a produção de IL-1β e IL-13 foi dependente de TLR2. / Pulpal and periapical tissue are frequently injured by heat, mechanical trauma and microorganisms, which are considered the main etiological factor of periodontal and endodontic diseases. Among these tissue resident cells, special attention has been given to fibroblasts in the immune response. Fibroblasts are cells that recognize pathogens through Toll like receptors (TLR). The aim of this study was to evaluate the recognition of Candida albicans by pulpal and gingival fibroblasts from TLR2, CD14, MyD88 knockout mice and control group mice. The results were analyzed concerning the expression of TLR(s) and surface molecules, proliferative response and citokynes production (TGF-β, IL-1β, TNF-α, IL-13 e IL-6) after the cells stimulation with TLR2, TLR4 and C.albicans agonists. Gingival and Pulpal fibroblasts, even isolated from different tissue, showed morphological similarities; however, gingival fibroblast deficient of MyD88 show lower proliferative response and pulpa l fibroblasts needed more time to detach from tissue fragments. The production of Type I collagen was affected in gingival cells deficient of CD14. Gingival fibroblasts expressed TLR2, TLR3, TLR4, and the adhesion molecules (ICAM-1 and CD44). The absence of TLR2 and CD14 interfered with the proliferative response of pulpal and gingival fibroblasts, respectively. The recognition of C. albicans by gingival and pulpal fibroblasts modulated the citokynes production. TNF-α production after the recognition of C. albicans was dependent from MyD88, CD14 and TLR2 molecules, whereas the production of IL-1β and IL-13 was dependent of TLR2.
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Uso da frutose-1,6-bisfosfato no tratamento da fibrose pulmonar experimentalJost, Renan Trevisan 10 March 2017 (has links)
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Previous issue date: 2017-03-10 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Pulmonary fibrosis is a specific form of interstitial pneumonia characterized by progressive worsening of dyspnea and lung function and associated with a poor prognosis. In addition to the idiopathic cause, pulmonary fibrosis may be caused by drugs such as bleomycin (BLM) - used in lymphomas and germinative tumors treatments. Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) is a high energy endogenous glycolytic compound that has antifibrotic, anti-inflammatory and immunomodulatory effects. The aim of this study was to assess the effect of FBP on BLM-induced pulmonary fibrosis model in mice and investigate its effect using a human embryonic lung fibroblast (MRC-5) culture system. C57BL/6 were divided into Control, FBP, BLM and BLM plus FBP. A single dose of bleomycin (7.5 U/kg) was administered intratracheally in mice and survival, body weight, Ashcroft Score and histological analysis (hematoxylin-eosin, Masson?s trichrome and picrosirius) were performed. Pulmonary function and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were also evaluated after a single dose of bleomycin (1.2 U/kg ? intratracheally). Treatment with FBP (500 mg/kg) was given on day 0 intraperitoneally. Fibroblasts (MRC-5 cells) were used to access the effect of FBP in vitro. In vivo, FBP increased survival rate and reduced the body weight loss when BLM and BLM plus FBP were compared (p< 0.05). FBP also prevented the loss of pulmonary function caused by BLM and decreased BALF inflammatory cells. The level of fibrosis and the superficial collagen density were lower in the lungs of animals that received BLM plus FBP as compared to BLM only (p<0.05). In vitro, FBP (0.62 and 1.25 mM) had inhibitory activity on MRC-5 cells and was able to induce senescence in fibroblasts. These results showed that FBP has the potential of reducing the toxic effects of BLM and may provide supportive therapy for conventional methods used for the treatment of cancer. / A fibrose pulmonar ? uma forma espec?fica de pneumonia intersticial caracterizada por piora progressiva da dispneia e da fun??o pulmonar e associada a um mau progn?stico. Al?m da causa idiop?tica, a fibrose pulmonar pode ser causada por drogas como a bleomicina (BLM) - usada no tratamento de linfomas e tumores germinativos. A frutose-1,6-bisfosfato (FBP) ? um composto glicol?tico end?geno de alta energia que possui efeitos antifibr?ticos, anti-inflamat?rios e imunomodulador. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da FBP sobre um modelo de fibrose pulmonar induzida por BLM em camundongos e investigar seu efeito utilizando um sistema de cultura de fibroblastos de pulm?o embrion?rio humano (MRC-5). Camundongos C57BL/6 foram divididos em grupos Controle, FBP, BLM, BLM + FBP. Foi administrada uma dose ?nica de bleomicina intratraqueal (7,5 U/kg) para avaliar a sobreviv?ncia, o acompanhamento do peso corporal, o escore Ashcroft e a histologia (hematoxilina-eosina, tricr?mio de Masson e picrosirius). Para avaliar a fun??o pulmonar e o lavado broncoalveolar (LBA) foi administrada uma dose ?nica de bleomicina a 1,2 U/kg por via intratraqueal. O tratamento com FBP (500 mg/kg) foi administrado no dia 0 intraperitonealmente. Fibroblastos (c?lulas MRC-5) foram utilizados para acessar o efeito da FBP in vitro. In vivo, a FBP aumentou a taxa de sobreviv?ncia e reduziu a perda de peso corporal quando BLM e BLM mais FBP foram comparados (p <0,05). FBP tamb?m previne a perda de fun??o pulmonar causada por BLM e diminuiu as c?lulas inflamat?rias no LBA. O grau de fibrose e a densidade superficial de col?geno foi menor nos pulm?es de animais que receberam BLM mais FBP comparado com BLM apenas (p <0,05). In vitro, a FBP (0,62 e 1,25 mM) apresentou actividade inibidora em c?lulas MRC-5 e foi capaz de induzir a senesc?ncia em fibroblastos. Estes resultados mostraram que a FBP tem o potencial de reduzir os efeitos t?xicos da bleomicina e pode proporcionar terapia de suporte para m?todos convencionais de pacientes que utilizam essa terapia para o tratamento do c?ncer.
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Papel do MuRF1 e MuRF2 sobre aspectos estruturais e funcionais de mioblastos e fibroblastos musculares esqueléticos. / Role of MuRF1 and MuRF2 on functional and structural aspects of myoblasts and fibroblasts skeletal muscle cells.Silvestre, João Guilherme de Oliveira 08 August 2016 (has links)
As E3 ligases MuRF1 e MuRF2 tem sido descritas com importantes papéis na estabilidade de proteínas da estrutura muscular, além de contribuírem para marcação de proteínas que devem ser degradadas. Nosso objetivo foi verificar o papel de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação de células miogênicas, além de caracterizar seu papel em fibroblastos. Foram utilizados animais nocautes para MuRF1 e MuRF2 e verificamos o processo de regeneração 28 dias após a injeção de cardiotoxina no tibial anterior. Posteriormente, através de análises in vitro, realizamos o silenciamento de MuRF1 e MuRF2 utilizando RNAis e verificamos a capacidade de diferenciação de células miogênicas. Os resultados mostram que os animais nocautes apresentaram aumento de marcadores adipogênicos. Além disso, as células silenciadas com RNAis apresentaram queda na formação de miotubos e um aumento em marcadores adipogênicos. Em fibroblastos, identificamos as E3 ligases MuRF1 e MuRF2 e o RNAi nessas células prejudicou o processo de migração. Esses resultados realçam a importância de MuRF1 e MuRF2 na diferenciação miogênica além de sugerir um importante papel para a formação correta do citoesqueleto durante a migração celular. / The E3 ligases MuRF1 and MuRF2 has been proposed to act as a linker for myofibril machinery, also by acting as an Atrogene during muscle wasting. Our aim was to verify the role of MuRF1 and MuRF2 during the myogenic differentiation of skeletal muscle and its role on skeletal muscle fibroblasts. We used MuRF1 and MuRF2 knockout mice and analyzed the regenerative process. Using in vitro analyzes, we silenced MuRF1 and MuRF2 expression by siRNA. Our results suggest that knockout mice had an important impairment on skeletal muscle regeneration, showing positive staining to white adipocytes. Moreover, siRNA on myogenic primary cultures showed impaired myotube formation and increase the expression of adipogenic markers. Another interesting finding was that skeletal muscle fibroblasts can express MuRF1 and MuRF2, and its silencing by siRNA impairs the migration capacity of fibroblasts. These results demonstrate the importance of MuRF1 and MuRF2 during myogenic differentiation of skeletal muscle and an important role at intracellular coordination of stress fiber formation of skeletal muscle fibroblasts.
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