O objetivo deste estudo foi estabelecer cultura primária de células derivadas da granulação óssea (GO) de seres humanos para determinar seu padrão de crescimento in vitro e determinar os efeitos biológicos de três membranas reabsorvíveis feitas de colágeno (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) em culturas de fibroblastos gengivais humanos (FGH) e células da granulação óssea (GO). Foram coletadas amostras de tecido ósseo presente no alvéolo de cicatrização de dois pacientes adultos saudáveis sistemicamente com indicação de cirurgia periodontal regenerativa pela técnica do enxerto ósseo em neoformação. Imediatamente após a coleta, as amostras foram transportadas ao laboratório de cultura de células para estabelecimento da cultura primária. As células foram cultivadas em atmosfera úmida, contendo 5% CO2 a 37oC. A curva de crescimento das células foi determinada por meio de contagem de células viáveis. Após a caracterização da curva de crescimento, foram realizadas a caracterização da amostra por meio de determinação da atividade de fosfatase alcalina e de mineralização. Posteriormente, os efeitos de três diferentes tipos de membranas colágenas sobre a proliferação de células GO e FGH foram investigados por meio do teste MTT. As amostras foram divididas em oito grupos: (1) células FGH em meio DMEM (C-FGH); (2) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-FGH); (3) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-FGH); (4) células FGH em meio DMEM condicionado com membrana ColaTape (CT-FGH); (5) células GO em meio DMEM (C-GO); (6) células GO em meio DMEM condicionado com membrana GenDerm (GD-GO); (7) células GO em meio DMEM condicionado com membrana BioGide (BG-GO); (8) células GO em meio DMEM condicionado com membrana CollaTape (CT-GO). O teste de proliferação celular mostrou que houve aumento significativo (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas) do número de células vitais presentes na cultura nos dias 3 (90,8%), 5 (132,50%), 7 (137,50%) e 10 (227,50%) em relação ao controle (dia 0). Foram observadas atividade de fosfatase alcalina e de mineralização in vitro. Houve aumento do número de células FGH e GO viáveis em todos os grupos (p< 0.05; ANOVA para medidas repetidas). Houve maior efeito proliferativo nas células FGH e GO nos grupos GD e CT, com diferenças estatisticamente significantes entre os grupos (p< 0.05; Mann Whitney) apenas no período de 96 horas. Esses achados sugerem que as células GO apresentam alta atividade de proliferação e síntese, sendo compatíveis com células de linhagem osteoblástica. Duas membranas colágenas testadas exerceram maior ação proliferativa tardia sobre osteoblastos, indicando sua eficácia na regeneração dos tecidos periodontais. / The aim of this study was to establish primary culture of cells derived from human bone granulation tissue (GO) in order to determine its growth pattern in vitro and the biological effects of three absorbable collagen membranes (BioGide®, GenDerm®, CollaTape®) in human gingival fibroblasts (FGH) and human bone granulation (GO) cell cultures. Samples of bone tissue present at healing sockets of two systemically healthy adults with indication of periodontal regenerative therapy by the newly forming bone were collected. Immediately after, samples were transported to the laboratory of cell culture to the establishment of primary cultures. Cells were cultivated in humid atmosphere with 95% CO2 at 37oC. Cells growth pattern were determined by counting of viable cells. After characterization of growth pattern, samples were characterized according to alkaline phosphatase activity and mineralization detected by alizarin red. Afterwards, the effects of three different types of collagen membranes on GO and FGH cells were investigated by MTT test. Samples were divided into eight groups: (1) FGH cells in DMEM (C-FGH); (2) FGH in DMEM conditioned by GenDerm® membrane (GD-FGH); (3) FGH in DMEM conditioned with BioGide® (BG-FGH); (4) FGH in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-FGH); (5) GO cells in DMEM (C-GO); (6) GO cells in DMEM conditioned by GenDerm® (GD-GO); (7) GO cells in DMEM conditioned by BioGide® (BG-GO); (8) GO cells in DMEM conditioned by CollaTape® (CT-GO). Cell proliferation test showed a significant (p< 0.05; ANOVA for repeated measures) increase in the number of vital cells present in the culture at days 3 (90.8%), 5 (132.50%), 7 (137.50%) and 10 (227.50%) compared to control (dia 0). It was observed alkaline phosphatase activity and mineralization in vitro. There was an increase in the number of FGH and GO viable cells at all groups (p< 0.05; ANOVA for repeated measures). Greater proliferative effect at FGH and GO cells at GD and CT groups, with significant differences between groups (p< 0.05; Mann Whitney) only at 96 hs. Two of the collagen membranes tested exerted greater late proliferative effects on osteoblasts, suggesting its efficacy in the regeneration of periodontal tissues.

Enxertos gengivais livres são importantes para garantir condições necessárias para o estabelecimento da homeostasia do periodonto de proteção. O processo de inflamação não ocorre por igual em todos os tecidos conjuntivos do organismo e os fibroblastos têm a capacidade de reagir a estímulos agressivos por meio de liberação de diversas citocinas, que desempenham importante função na formação do infiltrado inflamatório. Até o presente trabalho, não há relatos na literatura acerca da comparação do comportamento dos fibroblastos que compõem a mucosa palatina não marginal e dos fibroblastos provenientes de enxerto gengival livre (EGL) marginal em resistir aos estímulos agressores que ocorrem na doença periodontal. Dessa forma, a proposta do presente trabalho foi investigar se os fibroblastos da mucosa palatina não marginal mudariam seu perfil de secreção de citocinas quando enxertados na margem gengival. Foram coletadas biópsias da mucosa palatina no momento da cirurgia de EGL (período inicial) e após 4 meses (período final) no momento da cirurgia para recobrimento radicular. Os fibroblastos foram cultivados e estimulados com LPS de Porphyromonas gingivalis (Pg) e de Escherichia coli (Ec) por 24h e 48h para avaliação comparativa da expressão de citocinas e mediadores do reparo tecidual, como: IL-6, IL-8/CXCL8, MIP-1&#x3B1;/CCL3, TGF-&#x3B2;, VEGF e CXCL16. As citocinas foram quantificadas no sobrenadante das células por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA). Para a citocina IL-6, os fibroblastos da mucosa palatina não marginal mantiveram o mesmo perfil de secreção quando enxertados na área gengival marginal; para MIP-1&#x3B1; a secreção se mostrou aumentada de forma estatisticamente significativa pelos fibroblastos obtidos do enxerto gengival marginal após 48h de estímulo por Pg em comparação com os fibroblastos da área palatina não marginal; a secreção de IL-8 pelos fibroblastos da mucosa palatina não marginal foi maior em resposta ao desafio por LPS de Pg e os fibroblastos obtidos do enxerto gengival marginal exibiram secreção até mesmo sem o estímulo de LPS; apenas os fibroblastos do enxerto gengival marginal apresentaram secreção de TGF-&#x3B2;, mesmo na ausência de estímulo por LPS; a secreção de VEGF e CXCL16 não foi detectada pelos fibroblastos analisados. Conclui-se que os fibroblastos provenientes de uma mucosa palatina não marginal parecem se adaptar às condições locais quando enxertados na área gengival marginal, oferecendo evidência de sua participação efetiva na produção de mediadores inflamatórios importantes para o processo de homeostasia do periodonto marginal. / Free gingival grafts are important to ensure conditions for the establishment of homeostasis of the periodontal soft tissues. The process of inflammation does not occur the same way in all connective tissues and fibroblasts have the ability to respond to aggressive stimuli through the release of various cytokines, which play an important role in the inflammatory infiltrate formation. In literature, there are no studies comparing the behavior of fibroblasts from palatal mucosa (not marginal) and fibroblasts from marginal free gingival graft (FGG) regarding their resistance towards periodontal disease aggressive stimuli. Thus, the purpose of this study was to investigate whether fibroblasts from the palatal mucosa behave differently when grafted to the gingival margin considering their mechanism of cytokine secretion. Biopsies from the palatal mucosa were collected at the time of FGG surgery (initial period) and after 4 months (final period) when surgery for root coverage was performed. The fibroblasts were cultured and stimulated with LPS of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Escherichia coli (Ec) for 24 and 48 hours in order to make a comparative evaluation of cytokines and mediators of tissue repair expression, such as IL-6, IL-8/CXCL8, MIP-1&#x3B1;/CCL3, TGF-&#x3B2;, VEGF and CXCL16. Cytokines were measured in the cell supernatant by enzyme immunoassay (ELISA). For cytokine IL- 6, fibroblasts from palatal mucosa maintained the same secretion pattern when grafted to the gingival margin; for MIP-1&#x3B1; the secretion was significantly increased by fibroblasts from the marginal gingival graft after 48 hours of stimulation with Pg when compared to palatal mucosa fibroblasts; IL-8 secretion by palatal mucosa fibroblasts did not increase in response to Pg LPS challenge and fibroblasts from marginal gingival graft showed secretion even without the stimulus of LPS; only fibroblasts from marginal gingival graft showed secretion of TGF-&#x3B2;, even in the absence of LPS stimulation; VEGF and CXCL16 secretion by fibroblasts was not detected. It was concluded that fibroblasts from palatal mucosa seem to adapt to local conditions when grafted to the gingival margin area, providing evidence of its effective participation in the homeostasis of marginal periodontium through the production of important inflammatory mediators.

O objetivo deste estudo foi investigar in vitro a influência do tratamento de superfícies radiculares na adesão e proliferação de fibroblastos gengivais e de ligamento periodontal humano em fragmentos radiculares de dentes humanos extraídos por razões periodontais. Todos os fragmentos receberam raspagem e alisamento radicular (RAR), e em seguida aleatoriamente divididos em grupos, de acordo com a substância utilizada no tratamento de superfície (n= 15/grupo): ácido fosfórico 37% aplicado por 90s (AF90) ou 180s (AF180) (RAR); EDTA 24% aplicado por 90s (EDTA90) ou 180s (EDTA180); ácido cítrico pH 1.0 a 10% aplicado por 90s (AC90) ou 180s (AC180); ácido cítrico pH 1.0 a 10% associado à tetraciclina 50% por 90s (ACTC90) ou 180s (ACTC180); tetraciclina hidroclorídrica (50mg/ml) aplicada por 90s (TC90) ou 180s (TC180). O grupo controle foi composto por fragmentos tratados por meio de RAR seguido de lavagem em soro fisiológico. Após a realização dos tratamentos, os espécimes (n=3/grupo) foram preparados para análise em MEV com o objetivo de avaliar a descontaminação das superfícies radiculares por meio dos índices de rugosidade superficial (IRS), cálculo residual (ICR), perda de substância dentária (IPSD), presença de restos teciduais (IPRT), remoção de smear layer (IRSL), abertura dos túbulos dentinário (ATD) e smear layer remanescente (SLR) em fotomicrografias em aumentos de 500x e 1000x. Em 6 espécimes de cada grupo, foram plaqueados 104 fibroblastos gengivais (FGH-1), e em outros 6, 104 fibroblastos de ligamento periodontal humano (FLP-1). Após 24h foram fixados 6 espécimes por grupo (n=3/grupo) e após 48h os outros 6 espécimes (n=3/grupo), para análise em microscópio eletrônico de varredura. Para determinar a adesão e proliferação celular, o número de células aderidas à superfície nos dois períodos de avaliação foi determinado em triplicatas por um examinador independente A comparação entre os grupos foi realizada pelo método Kruskal-Wallis complementado pelo teste de Dunn para variáveis não lineares, e por meio de análise de variância múltipla (ANOVA) complementado pelo teste de Tukey para as variáveis lineares. A comparação entre os pares nos períodos de 24 e 48 horas foi realizada por meio do método ANOVA pósteste Sidak para variáveis lineares, e Kruskal Wallis pós-teste Dunn para variáveis não lineares. Foi adotado nível de significância de 5% em todos os testes. Não houve diferença estatisticamente significante para IRS, IPSD, IPRT, IRSL, ATD e SLR. Houve maior quantidade de cálculo residual nos grupos TC90 (3,66 ± 0,57; mediana = 4) e AF180 (3,66 ± 0,57; mediana = 4), enquanto que o grupo AC90 (1,33 ± 0,57; mediana = 1) mostrou quantidade significativamente menor de cálculo residual. Encontrou-se uma adesão significativamente maior de células FGH-1, no grupo EDTA180 (170 ± 77,99) no período de 24 horas, e maior efeito proliferativo (48 horas) no grupo TC90 (172,90 ± 65,38). Para células FLP-1, observou-se uma adesão significativamente maior no grupo ACTC90 (74,67 ± 98,84) no período de 24 horas e maior efeito proliferativo (48 horas) no grupo AC90 (173,8 ± 139,6). A partir dos resultados obtidos, sugere-se que a substância a ser utilizada para o condicionamento das superfícies radiculares seja escolhida de acordo com os objetivos do tratamento periodontal: quando se objetiva a formação de nova inserção conjuntiva o uso do EDTA ou AF por 180s ou da tetraciclina por 90s; para regeneração dos tecidos periodontais, sugere-se o uso de AC por 90s. / The aim of this study was to evaluate in vitro the influence of root surface conditioning on adhesion and proliferation of gingival and periodontal ligament fibroblasts on human root fragments of teeth extracted for periodontal reasons. Fragments received scaling and root planning (SRP), and were then randomly allocated into groups according to the substance used for root surface treatment (n= 15/grupo): phosphoric acid 37% applied for 90s (PA90) or 180s (PA180); EDTA 24% applied for 90s (EDTA90) or 180s (EDTA180); 10% citric acid pH 1.0 applied for 90s (CA90) or 180s (CA180); 10% citric acid pH 1.0 associated to tetracycline HCL 50% applied for 90s (CATC90) or 180s (CATC180); tetracycline hydrocloride (50mg/ml) applied for 90s (TC90) or 180s (TC180). Control group was composed by SRP treated root fragments, followed by saline solution washing. After treatment completion, specimens (n=3/grupo) were prepared for scanning electronmicroscopy (SEM) analysis, aiming at evaluation of its surfaces according to the following indexes: superficial roughness (SR); residual calculus (RC); loss of tooth substance (LT); tissue residual (TS), smear layer removal (SLR), dentin tubules opening (DTO) and smear layer residual (SLR) in photomicrographs on 500x and 1000x magnifications. In 6 specimens of each group 104 gingival fibroblasts (HGF-1) were plated; and over another 6 specimens, 104 periodontal ligament fibroblasts (PLF-1). After MEV evaluation, the number of cells adhered to the root surfaces over 24h and 48h were assessed by a calibrated examiner in triplicates. Groups comparison were analyzed through Kruskal-Wallis post-test Dunn for comparisons for non-linear variables, and ANOVA post-test Tuckey for linear variables. Comparison between pairs over 24 and 48 hours was accessed through Kruskal-Wallis post-test Dunn for non-linear variables, and ANOVA post-test Sidak for linear variables. Significance level of 5% was adopted in all tests. There was no statistical difference for SR, LT, TS, SLR, DTO and SLR. Although there was higher amounts of residual calculus on groups TC90 (3,66 ± 0,57; median = 4) and FA180 (3,66 ± 0,57; median = 4) while group CA90 (1,33 ± 0,57; median = 1) showed statistically less residual calculus. A singnificantlly higher HGF-1 cell count was found on EDTA180 (170 ± 77,99) on 24-hour period and a higher proliferative effect (48 hours) on group TTC90 (172,90 ± 65,38). A significantly higher cell adhesion for (PLF-1) was found on group ACTC90 (74,67 ± 98,84) at 24-hour assessment, and higher proliferative effect (48 hours) for AC90 (173,8 ± 139,6). From the data here exposed, it is suggested that the substance election for root surface conditioning should be based on the treatment primary goal: when a new connective tissue adhesion is aimed, EDTA or PA for 180s or TTC for 90s should be chosen; on the other hand, for periodontal regeneration, CA for 90s should be the best option.

A biomodificação radicular empregando ácido cítrico tem sido utilizada visando à reinserção dos tecidos periodontais a raízes expostas à doença periodontal. Entretanto, a grande diversidade metodológica entre os estudos ainda não possibilitou o estabelecimento de um protocolo amplamente aceito quanto à concentração e tempo de aplicação do ácido. Assim, 32 dentes extraídos por doença periodontal avançada forneceram 63 fragmentos radiculares que, após raspagem manual, foram divididos nos seguintes grupos de tratamento: Grupo AC-10-90: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 90 segundos; Grupo AC-10-120: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 120 segundos; Grupo AC-10-180: desmineralização com ácido cítrico a 10% em pH 1, durante 180 segundos; Grupo AC-50-90: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 90 segundos; Grupo AC-50-120: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 120 segundos; Grupo AC-50-180: desmineralização com ácido cítrico a 50% em pH 1, durante 180 segundos; Grupo C (controle): lavagem com soro fisiológico. Sobre as superfícies tratadas foram cultivados fibroblastos do ligamento periodontal humano por 24, 48 e 72 horas. A ampliação dos túbulos dentinários, morfologia celular e a porcentagem das superfícies radiculares recobertas por células foram avaliadas em microscopia eletrônica de varredura. As imagens microscópicas das superfícies recobertas por células foram comparadas pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de Dunn e na ampliação dos túbulos pelo teste de variância a dois critérios (ANOVA) complementado pelo teste de Tukey, em 5% de significância, ambos realizados por um programa computadorizado comparando os resultados entre os grupos. A Com exceção do grupo C, em todos os grupos houve aumento crescente da cobertura da superfície radicular por fibroblastos com o tempo. A maior área de cobertura foi apresentada pelo grupo AC-10-90 (98,82±2,57%) às 24 horas e essa diferença foi significante (p<0,001) em comparação aos grupos AC-50-90 (64,94±20,60%), AC-50-180 (56,59±35,42%) e C (0,06±0,24%). Nas demais comparações de tempo de aplicação e tempo de cultura, predominou a superioridade dos grupos tratados por ácido cítrico a 10% sobre os de 50%, porém, sem significância estatística. Todos os grupos teste foram significantemente superiores aos controle em todos os tempos de cultura. O menor valor médio para o diâmetro dos túbulos dentinários expostos pelos tratamentos foi apresentado pelo grupo AC-10-90 (4,55±0,69 &#x3BC;m) que diferiu significantemente (p<0,001) dos grupos AC-10-120 (5,33±0,95 &#x3BC;m), AC-10-180 (5,54±1,56 &#x3BC;m) e AC-50-180 (5,56±1,22 &#x3BC;m). Esse último apresentou a maior ampliação, porém sem diferença significante em relação aos demais grupos. Os fibroblastos apresentaram-se mais espalhados, achatados e com menor definição de limites nos grupos tratados com ácido cítrico a 10% do que nos de 50%, cujas células apresentavamse fusiformes e arredondadas. Concluiu-se que o ácido cítrico a 10% por 90 segundos produziu superfície mais favorável à proliferação celular com características morfológicas de estágios mais avançados de diferenciação e área de cobertura superficial por fibroblastos mais extensa no período inicial de cultura do que na concentração de 50%. A ampliação dos túbulos dentinários pareceu não influenciar a cobertura superficial por fibroblastos. Estudos subsequentes devem investigar a influência das propriedades químicas do agente biomodificador radicular para contribuir para a elucidação das diferenças produzidas no comportamento celular. / The root biomodification employing citric acid has been used in order to reattach periodontal tissues to root surface exposed to periodontal disease. However, the methodological diversity among studies has not allowed the establishment of a widely accepted protocol as the concentration and time of acid application. Thus, 32 teeth were extracted due to advanced periodontal disease, so that 63 root fragments were provided. After scaling and root planning, the fragments were divided into the following treatment groups : AC-10-90 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 90 seconds; AC-10-120 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 120 seconds; AC-10-180 group: demineralization with 10% citric acid at pH 1 for 180 seconds; AC-50-90 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 90 seconds; AC-50-120 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 120 seconds; AC-50-180 group: demineralization with 50% citric acid at pH 1 for 180 seconds; group C (control) : rinsing with saline solution. On the treated surfaces, fibroblasts from human periodontal ligament were cultured by 24, 48 and 72 hours. The enlargement of the dentinal tubules, cell morphology and the percentage of root surface covered by cells were evaluated by scanning electron microscopy. Those microscopic images from the root surfaces covered by cells were compared by the nonparametric Kruskal-Wallis test followed by Dunn\'s test and the enlargement of tubules by two variance (ANOVA) complemented by the Tukey test, both performed by a computer program comparing the results between the groups, at 5% significance. With the exception of group C, all groups showed increasing coverage of the root surface by fibroblasts over time. The largest area of coverage was presented by AC-10-90 (98.82±2.57%) at 24 hours and this difference was significant (p <0.001) compared to AC-50-90 (64.94±20.60%), AC-50-180 (56.59±35.42%) and C (0.06±0.24%). In other comparisons the application time and culture time groups treated with citric acid at 10% were superior to groups of 50%, without statistical significance. All test groups were significantly better than the control ones at all times of culture. The shortest average diameter of dentinal tubules exposed by the treatments was presented by AC-10-90 (4.55±0.69 &#x3BC;m) group that differed significantly (p<0,001) from AC-10-120 (5 groups 33±0.95 &#x3BC;m), AC-10-180 (5.54±1.56 &#x3BC;m) and AC-50-180 (5.56±1.22 &#x3BC;m). This last showed the highest enlargement, but without significant difference compared to the other groups. The fibroblasts were more spread, flattened and had less identifiable limits in the groups treated with citric acid 10% than those in 50% which cells had become rounded and spindle. It was concluded that the demineralization with 10% citric acid for 90 seconds produced more favorable surface to cell proliferation, more morphological characteristics of later stages of differentiation and larger surface area coverage by fibroblasts in the initial periods of culture than any of the groups treated with 50% citric acid. The enlargement of dentinal tubules did not seem to influence the surface coverage by fibroblasts. Subsequent studies should investigate the influence of the chemical properties of the root conditioner agent on the root surfaces in order to contribute to the elucidation of the differences produced in the cell behavior.

O ligamento periodontal e o tecido gengival são formados por tecido conjuntivo frouxo, sendo constituídos por diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório, e com a produção de componentes da matriz extracelular fundamentais para o reparo, como por exemplo, o colágeno. Assim sendo, este trabalho teve como objetivo: Avaliar e comparar a expressão e a produção de prócolágeno tipo I, IL6, MIP1 e SDF1 por fibroblastos humanos, cultivados de ligamento periodontal e de tecido gengival, estimulados por lipopolissacarídeo (LPS) de Porphyromonas gingivalis. Foram coletados ligamentos periodontais de terceiros molares não irrompidos e biópsias de gengiva de um mesmo indivíduo (n=3). Estes tecidos foram picotados e mantidos em meio de cultura adequado para fibroblastos, que foram utilizados na quarta passagem. Após adesão dos fibroblastos a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo 0,1 10 g/mL de LPS de P. gingivalis foi adicionado às placas em duplicata. O sobrenadante e as células foram coletados após 1, 6 e 24 horas e analisados por ELISA e PCR em tempo real, respectivamente. A análise estatística foi realizada por meio do programa GraphPad Prism, aplicandose o teste ANOVA a 1 critério com nível de significância de 5%. A expressão de prócolágeno tipo I mostrouse - ligeiramente diferente entre fibroblastos de ligamento periodontal e de gengiva. A produção de IL6, MIP1 e SDF1 foi significativamente maior em fibroblastos gengivais. A citocina IL6 foi produzida de maneira tempodependente com LPS de P gingivalis, principalmente por fibroblastos gengivais. Para MIP1, os fibroblastos gengivais mostraram maior produção com a menor concentração de estímulo (0,1g/ml). Para SDF1, foi detectada produção constitutiva que foi inibida com o aumento da concentração de LPS ao longo do tempo nestas mesmas células. Já para fibroblastos de ligamento periodontal, não foi observado um padrão homogêneo e linear, apesar de a produção basal de SDF1 também existir, porém em níveis bem mais discretos, como aquele observado para a produção de MIP1. A capacidade dos fibroblastos modificarem o padrão de produção dessas citocinas frente ao estímulo com LPS de P. gingivalis reforça a importância dessas células no contexto da resposta imune do indivíduo frente à doença periodontal. / The fibroblast is considered an important cell in periodontitis because it is the predominant cell type in the periodontal connective tissue. When challenged by different agents, fibroblasts respond through the release of substances, such as cytokines and chemokines that participate in an active way in the inflammatory process as well as the production of basic components of the extracellular matrix for repair, like collagen. The aim of this study was to: to evaluate and to compare the expression and production of type I procollagen, IL6, MIP1 and SDF1 by cultured human periodontal ligament and gingival fibroblasts challenged with lipopolyssacharide from Porphyromonas gingivalis. Human periodontal ligament and gingival fibroblasts were cultured from biopsies of the same donor and were used on the fourth passage. After confluence in 24well plates, the culture medium alone (control) or with 0,1 10 ug/mL of LPS from P. gingivalis were added and after 1, 6 and 24 hours, the supernatant and the cells were collected and analysed by ELISA and Real time PCR, respectively. Data were analysed by GraphPad Prism Program (1 way ANOVA test) and a significance level of 5% was adopted. Procollagen type I expression by Real Time PCR differ between periodontal ligament and gingival fibroblasts. In vitro experiments revealed that IL6, MIP 1 and SDF1 production were significantly greater in gingival fibroblasts when compared to periodontal ligament. In addition, IL6 was upregulated in a timedependent manner, mainly by the gingival fibroblasts. On one hand, MIP1 was stimulated with a low concentration (0,1ugml) of LPS by gingival fibroblasts. On the other hand, SDF1 was constitutively secreted by the same cells but its production was inhibited when challenged by a higher concentration of LPS from P gingivalis. In general, periodontal ligament fibroblasts did not show a pattern of production of these cytokines under the challenge with LPS, despite of the basal production of SDF1 in lower levels than gingival cells and the low production of MIP1 over time. The differential ability of the gingival and periodontal ligament fibroblasts to secrete these cytokines emphasizes their crucial role in the inflammatory microenvironment and in the host immune response to periodontal disease.

Equinodermos são bem conhecidos pelas suas grandes capacidades regenerativas, principalmente em processos mais complexos como a reposição de membros e órgãos. Porém pouco se sabe sobre processos aparentemente mais simples como a cicatrização. Tem sido descrito que um dos principais mecanismos envolvidos neste evento é o remodelamento da matriz extracelular e que existem células responsáveis por isto. Entretanto, vários detalhes do processo e do exato papel destas células ainda não são muito claros. Neste trabalho, foram estudados os estágios do processo de cicatrização em Holothuria grisea Selenka, 1867 (Holothuriidae). A lesão foi induzida através de uma incisão perfurando a parede do corpo do animal até alcançar a cavidade celomática. Através de análises histológicas, foram acompanhadas as mudanças estruturais e os mecanismos celulares que ocorrem no intervalo de doze horas a trinta dias após a injúria. Foi observado que houve um rápido fechamento da ferida através da síntese de novas fibras de colágeno, e que fibroblastos e duas populações de esferulócitos estão envolvidos neste processo. São discutidas as prováveis funções destes tipos celulares e possíveis diferenças funcionais entre os esferulócitos. / Echinoderms are well known by their regenerative capabilities, mostly in complex events such as the reconstruction of internal organs or entire body parts. However, the knowledge on apparently simpler processes such as wound healing is relatively scarce. It has been described that extracellular matrix remodeling is the main mechanism, and it involves participation of different cells populations. However, the specific function of these cell types is still under debate. In this work, the wound healing process in Holothuria grisea Selenka, 1867 (Holothuriidae) was studied. The lesion was made by an incision through the body wall up to the coelomic cavity. The local changes in cell types and the reorganization of the extracellular matrix were accompanied from 12 hours to 30 days after the injury. Soon after the wound, the organism responded with a localized contraction, followed by cell migration and synthesis of new collagen fibers. Four different cell types were observed, including two different types of spherulocytes. The probable functions of these cells are discussed.

O processo de interferência de RNA refere-se ao silenciamento pós transcricional seqüência-específico de genes em animais e plantas capaz de ser promovido por dsRNA homólogo à seqüência do gene silenciado. Este processo pode ser aplicado como terapia, que apresenta como vantagens a especificidade pelos alvos escolhidos, a possibilidade de tratar uma enorme gama de doenças genéticas, além do fato de ser muito potente e eficaz. Contudo, o principal desafio consiste em manter a estabilidade dos siRNAs nos fluidos biológicos, visto que estes são bastante susceptíveis à excreção renal e a degradação por RNAses. Com isso, reforça-se a necessidade de sistemas de liberação adequados, que sejam capazes de manter a estabilidade dos siRNAs por tempo suficiente para que atinjam os órgãos alvo da terapia e promover sua liberação sustentada. De particular interesse são determinadas proteínas e peptídeos de transdução (PTDs) que podem ser ligados a fármacos hidrofílicos e assim tornam possível com que estes atravessem membranas. Neste sentido, muitos sistemas carreadores não-virais tem sido estudados para a veiculação de siRNA, sendo de cunho inovador o desenvolvimento de sistemas de liberação nanoestruturados baseados em cristais líquidos funcionalizados com peptídeos de transdução de membrana para a veiculação tópica de siRNAs. Desta forma, nanopartículas de cristais líquidos de fase hexagonal contendo ou não os aditivos catiônicos polietileimina (PEI) e oleilamina (OAM) foram funcionalizadas com peptídeos de transdução de membranas TAT (TAT) ou penetratin (PNT). Os sistemas obtidos foram complexados com siRNA por interação eletrostática e caracterizados através de medidas de tamanho de partícula/ polidispersividade, potencial zeta e eficiência de complexação. A citotoxicidade dos sistemas foi avaliada em fibroblastos L929 pelo ensaio do MTT e por citometria de fluxo e a avaliação da transfecção in vitro foi realizada por citometria de fluxo e por microscopia de fluorescência. Os sistemas contendo PEI ou OAM apresentavam potencial zeta positivo e foram capazes de complexar o siRNA adicionado na concentração de 10 ?M. Os estudos em culturas celulares demonstraram que os sistemas contendo ácido oleico (AO) foram mais eficientes quanto à transfecção em células de fibroblastos L929 e esta eficiência de transfecção foi aumentada com a funcionalização com o peptídeo TAT. A partir daí, os sistemas selecionados foram avaliados quanto a penetração cutânea in vivo. Os sistemas nanodispersos formados por MO/AO/PEI proporcionaram uma maior liberação de siRNA na pele e a eficiência de supressão de TNF-alfa em modelo animal de inflamação cutânea foram maiores que formulações controle. Com isso, demonstrou-se que os sistemas desenvolvidos são promissores para a futura aplicação na terapia gênica tópica de doenças cutâneas inflamatórias. / The RNA interference process refers to the sequence-specific posttranscriptional silencing of genes in animals and plants capable of being promoted by dsRNA that are homologous to the sequence of the silenced gene. This process can be applied as therapy, which presents advantages such as the specificity to the chosen targets, the possibility to treat a variety of genetic diseases, besides being very potent and efficacious. However, the major hurdle consists in keeping the siRNAs stability in the biological fluids, because they are susceptible to renal clearance and degradation by RNAses. Thus, there is the need for suitable delivery systems, capable of maintaining the stability of siRNAs for sufficient time so they can reach the target organ in the therapy and promote sustained release. Of particular interest are certain proteins and peptides transduction domains (PTDs) that can be connected to hydrophilic drugs and thus make it possible to cross cell membranes. Within this context, many non-viral vectors have been studied for siRNA vehiculation which makes innovative the present study because it aims at the development of nanostructured delivery systems based on liquid crystals functionalyzed with membrane transduction peptides for the topical vehiculation of siRNAs. Thus, hexagonal phase liquid crystal nanoparticles containing or not the cationinc polyethylenimine (PEI) and oleylamine (OAM) were functionalyzed with membrane transduction peptides TAT (TAT) or penetratin (PNT). The obtained systems were complexed with siRNA by eletrostatic interaction and characterized for particle size, polidispersity, zeta potential and complexation efficiency. The cytotoxicity of the formulations was performed with L929 fibroblasts by MTT assay and flow cytometry and the in vitro transfection was evaluated by flow cytometry and fluorescence microscopy. The systems containing PEI or OAM presented positive zeta potential and could complex siRNA at the concentration of 10 ?M. The cell culture studies demonstrated that the systems containing oleic acid (OA) were the most efficient to transfect L929 cells and the transfection efficiency was enhanced with the functionalization with the TAT peptide. Thereafter, the selected systems were evaluated for the in vivo skin penetration. The nanosdispersed systems composed of MO/OA/PEI functionalyzed with TAT resulted in a higher siRNA penetration and release in the skin, promoting higher TNF alfa supression in animal model of cutaneous inflammation, compared to the control formulations. Hence, we demonstrated that the developed systems are promising for the treatment of inflammatory skin diseases.

Fibroblastos são as células mais numerosas encontradas nos tecidos orais como gengiva, ligamento periodontal e polpa dental. Além de exercerem função estrutural, estas células também desempenham papel importante na resposta imune destes tecidos através do reconhecimento de antígenos e produção de mediadores inflamatórios e citocinas. Evidências apontam ainda para o fato de que fibroblastos não constituem um grupo único de células. Sendo assim, os objetivos deste estudo foram: (I) avaliar a produção diferencial de fibroblastos de gengiva, ligamento periodontal e polpa dental de dentes permanentes e decíduos quanto à produção das quimiocinas CCL3 e CXCL12; (II) avaliar a produção de pró-colágeno I pelas células de polpa e (III) avaliar a expressão diferencial dos fibroblastos quanto a microRNAs. Dentes recentemente extraídos (terceiros molares hígidos) e fragmentos de gengivas saudáveis de três pacientes adultos foram obtidos no Laboratório de Farmacologia e Fisiologia Clínica da Faculdade de Odontologia de Bauru. Caninos decíduos de dois pacientes com indicação para extração por motivos ortodônticos foram obtidos na Clínica de Odontopediatria da mesma unidade. Culturas primárias de fibroblastos de gengiva (n=3), ligamento periodontal (n=3) e polpa de dente permanente (n=3) e polpa dental de dente decíduo (n=2) foram estabelecidas a partir de tecidos humanos por meio de técnica de explant. Após a quarta passagem, a produção de CCL3 e de CXCL12 foi avaliada após estímulo com concentrações crescentes (0 10 µg/mL) de ácido lipoteicóico de Enterococcus faecalis (EfLTA), lipopolissacarídeo de Porphyromonas gingivalis (PgLPS) ou LPS de Escherichia coli (EcLPS) por ELISA após 1, 6 e 24 h. O RNAm para as quimiocinas no grupo estimulado com EcLPS por 24 h foi avaliado por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase quantitativa. A produção de pró-colágeno I por células de polpa estimuladas com EfLTA e PgLPS foi avaliada por imunofluorescência. O perfil de expressão de microRNAs foi investigado por ensaio de microarranjo. A produção de CCL3 foi aumentada (p< 0,05) pelos antígenos empregados, porém de maneira mais evidente para EcLPS em células de gengiva. A quimiocina CXCL12 foi detectada em níveis basais em todos os grupos de células, porém em maiores quantidades em fibroblastos de gengiva seguidos pelos de ligamento periodontal. A adição dos antígenos diminuiu a produção de CXCL12 de maneira distinta entre células e entre antígenos (p< 0,05). Fibroblastos de polpa decídua não apresentaram qualquer alteração na produção desta quimiocina pelos antígenos (p> 0,05). No período experimental de 24 h, a expressão do RNAm para CXCL12 não foi alterada enquanto a de CCL3 não foi detectada. A produção de pró-colágeno I se mostrou aumentada (p< 0,05) na presença do desafio antigênico em células de polpa com exceção para fibroblastos de polpa permanente que apresentaram diminuição na produção desta proteína quando estimulados com EfLTA. Em condições basais, fibroblastos do mesmo doador apresentaram perfil distinto de expressão de microRNAs envolvidos com a produção das proteínas-alvo deste estudo. A expressão de imunomiRs por EcLPS também se mostrou modificada de maneira distinta entre os fibroblastos, em especial os de ligamento periodontal. Com base nestes resultados, pode-se concluir que fibroblastos de diferentes tecidos orais apresentam comportamento diferencial frente a antígenos bacterianos comumente relacionados a patologias que afetam a cavidade oral. / Fibroblasts are the dominant cells within oral tissues such as gingiva, periodontal ligament and dental pulp. Besides the architectural maintenance of the connective tissues, fibroblasts are also involved in connective tissue immune response through antigen recognition and production of inflammatory mediators and cytokines. Recent studies also demonstrated that fibroblasts do not constitute a unique group of cells. Taken this togeter, the objectives of the present study were: (I) to evaluate the production of the chemokines CCL3 and CXCL12 by human gingival, periodontal ligament as well as permanent and deciduous dental pulp fibroblasts; (II) to evaluate the production of procollagen I by dental pulp fibroblasts and (III) to evaluate the differential pattern of expression of microRNAs by the oral fibroblasts. Recently extracted teeth (non-carious third molars) and fragments of healthy gingiva from three adults were obtained at the Laboratory for Clinical Pharmacology and Physiology at Dental School of Bauru. Deciduous canines from two patients with orthodontic indication for extraction were obtained at Pediatrics Clinics of Dental School of Bauru. Primary cultures of fibroblasts from gingiva (n=3), periodontal ligament (n=3) as well as permanent pulp (n=3) and deciduous pulp (n=2) were established through an explant technique. After the fourth passage, fibroblasts were challenged with increasing concentrations (0 10 µg/mL) of Enterococcus faecalis lipoteichoic acid (EfLTA), Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide (PgLPS) or Escherichia coli LPS (EcLPS) for 1, 6 and 24 h. The chemokines were assessed through ELISA while the mRNA for CCL3 and CXCL12 (EcLPS at 24 h) were assessed through reverse transcription followed by quantitative polymerase chain reaction. The expression of microRNAs was screened through a microarray assay. The production of CCL3 on cell supernatants was detected in all cellular groups, with higher amounts at gingival fibroblasts. EcLPS induced more important chemokine differences compared to the other antigens. CXCL12 basal levels were higher for gingival fibroblasts followed by periodontal ligament ones, but also detected in dental pulp fibroblasts. The production of this chemokine was decreased by stimulation in a different fashion for each antigen and cell type. Deciduous pulp fibroblasts did not display any differences in CXCL12 synthesis even in the presence of the microbial challenge. No differences were detected at mRNA level for CXCL12, while no expression for CCL3 could be detected at 24 h. Increased production of procollagen type I was observed for dental pulp cells in general, with the only exception for permanent pulp cells which displayed decreased production of the protein with EfLTA. Microarray analysis showed differential expression pattern of microRNAs comparing unstimulated cells from the same donnor. EcLPS was able to alter immunomiRs expression in some of the cellular groups, in particular periodontal ligament fibroblasts. In conclusion, our results showed that fibroblasts from distinct oral tissues display differential behavior against bacterial antigens commonly related to the diseases that affect the oral cavity.

Memoria para optar el título de Bioquímico / Triclosán es un agente antibacteriano ampliamente utilizado en productos cosméticos y de higiene oral (jabones, desodorantes, dentífricos, colutorios, etc.) como agente desinfectante. Sin embargo, estudios recientes han sugerido que este fármaco podría tener un papel en el control de la inflamación y retrasar el avance de la enfermedad periodontal. La inflamación crónica en esta patología y la destrucción de los tejidos periodontales, pueden estar asociadas a la elevada activación de plasminógeno a plasmina mediada por Uroquinasa (uPA), una serin-proteasa altamente expresada en esta enfermedad, involucrada en la remodelación tisular y activación de diversas otras proteasas que participan en la degradación de la matriz extracelular (MEC). Por otra parte, en la enfermedad periodontal se encuentra una mayor presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS), niveles elevados de metaloproteasas y citoquinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), lo que en conjunto con los demás factores, contribuyen a la destrucción de la MEC. En el presente estudio se estudió la capacidad de Triclosán para interferir la actividad y producción de uPA y ROS en cultivos primarios de fibroblastos gingivales humanos (FGH) estimulados con TNF-α y peróxido de hidrógeno (H2O2), además de determinar la relación entre la actividad y expresión de uPA con la inducción de vías de señalización intracelulares NFkB, JNK y MEK/ERK1/2, la activación de plasminógeno, el estado redox intracelular y la modulación de estas por Triclosán. Las células fueron estimuladas con TNF-α y Terbutil Peróxido (t-BOOH) un análogo orgánico de H2O2 de mayor estabilidad y con capacidad de penetrar membranas celulares. Se utilizaron distintos inhibidores específicos para las diferentes rutas; de la actividad de MAPquinasas se utilizó PD98095, inhibidor selectivo de MEK1 y SP600125, inhibidor selectivo de JNK. Para inhibir la activación de la vía NF-kB se ocupó el péptido SN50 y su péptido control SN50M. Además de utilizó el inhibidor de la enzima productora del radical superóxido NADH/NAD(P)H oxidasa (DPI), el antioxidante intracelular y precursor de glutatión (NAC), la enzima convertidora de H2O2 catalasa y por último Triclosán, con el fin de interferir la actividad y producción de uPA. Esta fue analizada por zimografía y Western-blot respectivamente. La expresión del ARNm de uPA fue evaluada a través de RT-PCR. La activación de las vías de señalización intracelulares JNK y ERK-1/2 fueron analizadas por Western-blot. La activación de NF- B fue analizada por inmunofluorescencia. Se evaluó la producción intracelular de ROS utilizando el fluoróforo DCHF-DA. Se comprobó que TNF-α es un fuerte estímulo para la producción y actividad de uPA. Triclosán disminuyó la actividad de esta (de forma dosis dependiente) y su expresión (ARNm y proteína), además de inhibir la conversión de plasminógeno a plasmina estimuladas por TNF-α. Se observó también que la actividad de uPA estimulada con esta citoquina es dependiente de las rutas de señalización asociadas a NF-kB y JNK. TNF-α indujo la fosforilación de JNK y producción del factor de transcripción río debajo de JNK c-Jun, las cuales fueron inhibidas por Triclosán, sin embargo no se observaron cambios en la activación de la vía NF-kB. Además, NAC, DPI y catalasa inhibieron la actividad y producción de uPA estimulada por TNF-α. El pro-oxidante t-BOOH indujo la actividad y producción de uPA de forma dosis dependiente y activó la vía ERK-1/2. Triclosán y el inhibidor de ERK-1/2 PD98059 inhibieron la producción y activación de uPA estimuladas con t−BOOH. Se observó que Triclosán posee la capacidad de inhibir la activación de la vía ERK-1/2 estimulada por t BOOH, además de reducir los niveles de ROS intracelulares estimulados con TNF-α, de forma similar que NAC y DPI. Estos resultados sugieren que Triclosán puede tener un efecto protector en la enfermedad periodontal al disminuir la inflamación y destrucción tisular asociados a la actividad de uPA y producción de ROS con la consiguiente remodelación del tejido conectivo gingival. Se sugiere entonces que Triclosán posee una actividad antioxidante intracelular no descrita antes en la literatura, lo que junto con lo anterior podría explicar en parte su efecto protector previamente reportado en estudios clínicos, y sugiere que estos pueden ser aspectos adicionales de su efecto clínico en la destrucción periodontal

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está constituido por numerosos tipos celulares, de los cuales el 90% corresponde a cardiomiocitos y fibroblastos. Los fibroblastos representan dos tercios de la población celular del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Estas células tienen la capacidad de responder a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores indicando que pueden responder de manera autocrina; y por la acción de TGF-1, se diferencian a miofibroblastos, un fenotipo celular altamente secretor de colágeno y principal encargado del proceso de cicatrización. Por otro lado, existen numerosos antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardiacos, la activación de las vías de transducción que conducen al aumento del AMPc contribuye a la reducción de la fibrosis cardiaca, por regular procesos antifibróticos entre ellos disminuir la adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Recientemente se ha descrito en la literatura a la proteína EPAC-1 (del acrónimo exchange protein activated directly by cAMP), quien a través de las GTPasas pequeñas Rap 1 y Rap 2 modula secreción de colágeno y migración. Sin embargo, no existen antecedentes de si EPAC-1 regula en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos la adhesión y migración celular; y la contracción de geles de colágeno. Por lo anterior, en este trabajo se estudió los niveles de expresión de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos, y si EPAC-1 regula los procesos antes mencionados. Para ello, se utilizaron estímulos que aumentan el AMPc (forskolina e isoproterenol) y el agonista directo de EPAC-1 Me-AMPc. Nuestros resultados mostraron que en fibroblastos cardiacos forskolina y Me-AMPc aumentaron la adhesión celular, y este efecto fue menor con isoproterenol; mientras que en miofibroblastos se observó un aumento en la adhesión sólo con el agonista de la EPAC-1. Por otro lado, forskolina, isoproterenol y Me-AMPc, inducen una mayor migración de fibroblastos, mientras que en miofibroblastos no se observaron efectos con esos estímulos. Finalmente, en fibroblastos cardiacos no se observaron efectos sobre la contracción de geles de colágeno. Conclusión: EPAC regula diferencialmente la adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos cardiacos, indicando que participa de manera muy importante en procesos asociados al remodelamiento cardiaco / The heart is composed of many cell types, of which 90% were cardiomyocytes and fibroblasts. Fibroblasts represent two thirds of the heart cell population and are mainly responsible for the turnover of extracellular matrix proteins. These cells have the capacity to respond to a variety of cytokines, growth factors and express their receptors indicating that they can respond in an autocrine manner; and by the action of TGF-1, they are differentiated into myofibroblasts, a cellular phenotype highly secreting of collagen and main cell involved of the healing process. On the other hand, there are numerous reports that show that in cardiac fibroblasts, the activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes including adhesion, migration and myofibroblastic differentiation. Recently has been described the protein EPAC-1 (exchange protein activated by cAMP), who through the small GTPases Rap 1 and 2, modulates secretion of collagen and migration. However, there is no data on whether EPAC-1 regulates cardiac fibroblasts and myofibroblasts adhesion and migration, and contraction of collagen gels. Therefore, in this work we studied in cardiac fibroblasts and myofibroblasts the expression levels of EPAC-1, and if EPAC-1 regulates the above mentioned processes. To do this, we used stimuli that increase cAMP (forskolin and isoproterenol) and direct agonist of EPAC-1 (Me-cAMP). Our results showed that in cardiac fibroblasts Me-cAMP and forskolin increased cell adhesion, and this effect was less with isoproterenol, while in myofibroblasts showed an increased adhesion only with the agonist of EPAC-1. Furthermore, forskolin, isoproterenol and Me-cAMP, induced an increased migration of fibroblasts, myofibroblasts whereas no effects were observed with these stimuli. Finally, cardiac fibroblasts showed no effects on collagen gel contraction. Conclusion: EPAC differentially regulates adhesion and migration of cardiac fibroblasts and myofibroblasts, indicating that it play an important role in processes associated with cardiac remodeling