Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-22T17:53:29Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4424231 bytes, checksum: 751c03b840d885ffe4706122e3be0086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T17:53:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4424231 bytes, checksum: 751c03b840d885ffe4706122e3be0086 (MD5) Previous issue date: 2016-08-31 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Viruses of phytophatogens are present in the most diverse groups of hosts, infecting from Spiroplasma to nematode and playing an important role in the ecology of these hosts. Because of the potential as biological control agents, the discoveries about these viruses have increased which encourages the ecological management of plant diseases. In this context, this study aimed: isolate and characterize viruses that infect plant pathogenic fungi (1) and Ralstonia spp. in the Americas (2) and investigate antiviral defense mechanisms in Ralstonia spp. (3). In this thesis, three viruses were characterized at biological and molecular level. Two viruses infect bacteria, Ralstonia spp. and the third infect a fungus, Alternaria alternata. The bacterial virus displayed two propagation modes: pseudolysogenic for the RsIBR1 inovirus (Inoviridae) and lytic for the phiAP1 phikmvvirus (Podoviridae). RsIBR1 has been shown to dramatically change the phenotype of the host, while not causing cell lysis, converting the phytopathogenic R. pseudosolanacearum into a commensal bacterium. PhiAP1 was characterized as a new member of the genus Phikmvvirus, and the presence of exolisinas, in addition to the bactericidal properties and EPS degradation make this virus attractive for future proposals of the bacterial wilt management. In A. alternata, it was characterized Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), a new divergent mycovirus related to genus Gammapartitivirus. Its persistent lifestyle prevented to dissect completely the interaction, because in the absence of isogenic lineage, it is unclear whether the viral infection led to a conversion of a pathogen in a epiphytic or still if is responsible for controlling phenotypic plasticity expressed by the host. The presence of canonical CRISPR loci in Ralstonia spp. isolates suggested that, in these hosts, this system could compose the antiviral defense arsenal. However, here was demonstrated that in R. solanacearum, the CRISPR-Cas system is unable to acquire new spacers or interfere with foreign DNA, even in a state of priming. The expression of the Cas genes was not detected; indicating that Cas operon apparently is a suppressed transcriptional unit. Two genes h-ns, expressed in R. solanacearum CFBP2957 are candidates to the putative transcriptional repression of CRISPR. The BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) who escaped of infection by an alternative strategy to the CRISPR, were less competent, but still permissive to viral adsorption, and were able to survive under high inoculum pressure, which excludes the presence of abortive systems. Viral replication was also not detected and sequencing of two BIMs genome revealed the presence of particular mutations in genes encoding components of the secretory and motility pathways (such as Type II and Type IV), potentially involved in the antiviral resistance. Additional analyzes are being conducted to characterize in detail this defense strategy. In conclusion, the discovery and characterization of viruses infecting phytopathogens in Brazil expand the information on this diversity, little known in America, exposes the biotechnological potential of these natural enemies and reveals the important role of these viruses in the modulation and evolutionary course of their hosts / Vírus que infectam fitopatógenos são encontrados nos mais diversificados grupos de hospedeiros, infectando desde spiroplasmas a nematóides e desempenhando papel relevante na ecologia desses hospedeiros. Graças ao potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças de plantas. Neste contexto, este trabalho objetivou: Isolar e caracterizar vírus que infectam fungos fitopatogênicos (1) e os que infectam Ralstonia spp. no continente americano (2) e Investigar mecanismos de defesa antiviral in Ralstonia spp (3). Nesse trabalho, três vírus foram caracterizados a nível biológico e molecular. Dois deles infectam bactérias do complexo Ralstonia spp. e o terceiro infecta um fungo, Alternaria alternata. Os virus de bacterias isolados possuem dois modos de propagação distintos: pseudolisogênico, o inovírus RsIBR1 (Inoviridae) e lítico, o phikmvvirus phiAP1 (Podoviridae). RsIBR1 demonstrou ser capaz de alterar drasticamente o fenótipo do hospedeiro, convertendo a bactéria fitopatogênica R. pseudosolanacearum em uma comensal. PhiAP1 foi caracterizado como um novo membro do gênero Phikmvvirus, e a presença de exolisinas em adição as propriedades bactericida e de degradação de EPS o tornam atrativo para futuras propostas de manejo da murcha-bacteriana. Em A. alternata, foi caracterizado o Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), um novo micovírus divergente, relacionado ao gênero Gammapartitivirus. Seu estilo de vida persistente impediu dissecar por completo a interação, pois na ausência da linhagem isogênica, não foi possível confirmar se a infecção viral conduziu a uma conversão de um patógeno em um epifítico ou ainda se é responsável pelo controle da plasticidade fenotípica manifestada pelo hospedeiro. A presença de loci CRISPR canônicos entre isolados de Ralstonia spp. sugeriu que nesses hospedeiros esse sistema pudesse compor o arsenal de defesa antiviral. No entanto, aqui foi demonstrado que em R. solanacearum, o sistema CRISPR é incapaz de adquirir novos spacers ou interferir com DNA invasor, mesmo em estado de priming. A expressão dos genes Cas não foi detectada, indicando que o operon Cas aparentemente é uma unidade transcricional reprimida. Dois genes h-ns, expressos em R. solanacearum CFBP2957 são candidatos na execução da provável repressão do CRISPR. Foram obtidos BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) que escaparam da infecção por uma estratégia alternativa ao CRISPR. Os BIMs foram menos competentes, mas ainda permissivos a adsorção viral, e foram hábeis para sobreviver sob alta pressão de inóculo, o que exclui a presença de sistemas abortivos. A replicação viral também não foi detectada e o sequenciamento do genoma de dois BIMs revelou a presença de algumas mutações em genes que codificam proteínas componentes das maquinarias de secreção e motilidade bacteriana (Tipo II e Tipo IV), potencialmente envolvidas com o fenótipo da resistência. Análises adicionais estão sendo conduzidas para caracterizar em detalhes essa(s) estratégia(s) de defesa. Em conclusão, a descoberta e caracterização de vírus que infectam fitopatógenos no Brasil, além de ampliar as informações sobre essa diversidade, pouco conhecida na América, expõe o potencial biotecnológico desses inimigos naturais e revela o papel relevante desses vírus na modulação e curso evolutivo dos seus hospedeiros.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-19T16:19:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2766887 bytes, checksum: 6f8f01cd7e538b366f3e29fab1e9c82c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T16:19:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2766887 bytes, checksum: 6f8f01cd7e538b366f3e29fab1e9c82c (MD5) Previous issue date: 2017-07-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Brasil é o segundo produtor mundial de soja. Porém, estresses bióticos e abióticos tem limitado a expansão da produtividade. Nosso grupo de pesquisa do LBMP, BIOAGRO-UFV, tem observado que plantas transgênicas superexpressando BiP (Binding protein), chaperona com atividade associada à via UPR (unfolded protein response) e à modulação de eventos de PCD (programmed cell death), são mais tolerantes à seca pela manutenção da homeostase celular e retardo do acionamento da PCD. Dos fitopatógenos, a Pseudomonas syringae pv. tomato provoca reação de hipersensibilidade na soja, uma vez que a interação planta-bactéria é incompatível. Neste trabalho, foi caracterizado o perfil metabólico dos genótipos transgênico superexpressando BiP (C9) e selvagem (WT) por GC-MS. Foram também avaliados por LC-MS, a abundância de fito-hormônios e alguns metabólitos secundários alvos em resposta à interação de soja com P. s. pv. tomato para determinar alterações metabólicas nestes genótipos relacionadas com o fenótipo de morte celular e reações de hipersensibilidade. O acúmulo de aminoácidos, açúcares e ácidos orgânicos pode estar relacionado ao controle de danos ocasionado pelo estresse biótico, sendo menor em C9 devido à capacidade de BiP em manter a homeostase celular. Compostos como di- hidroesfingosina (DHS) e gama-aminobutirato (GABA) podem estar envolvidos com mecanismos de PCD em células visando restringir a colonização do tecido foliar por bactérias. Além disso, observou-se uma tendência para o aumento de ácido salicílico (SA) e ácido jasmônico (JA), embora os níveis de ácido abscísico (ABA) em C9 tenham sido menores, indicando o papel antagonista do ABA na via de sinalização mediada por SA/JA e síntese de fitoalexinas ao longo da infecção bacteriana. A considerável importância do SA e JA, que disparam vias de sinalização de controle microbiano, em C9 possivelmente está no controle negativo da PCD por BiP, que impede a contenção do patógeno por esta via. As concentrações de metabólitos secundários, por sua vez, sofreram o maior incremento ao longo do tempo, sobretudo daidzeína e genisteína, sendo maior em C9. Este acréscimo pode estar associado com as propriedades antimicrobianas das isoflavonas. Por isso, em plantas C9, a superexpressão de BiP atrasa a via de PCD, impedindo a contenção da colonização bacteriana em tempo hábil, sendo a ação antimicrobiana o mecanismo de resposta predominante em C9, ao passo que em WT predomina a via de PCD. / Brazil is the world's second largest soybean's producer. However, biotic and abiotic stresses have limited productivity expansion. Our research group at the LBMP, BIOAGRO-UFV, has observed that transgenic plants overexpressing BiP (Binding protein), chaperone with activity associated with pathway UPR (unfolded protein response) and modulation of PCD (programmed cell death) events, are more tolerant to drought by the maintenance of cellular homeostasis and retarding the activation of PCD. Plant pathogens, Pseudomonas syringae pv. tomato provokes hypersensitivity reaction in soybean, since it is an incompatible interaction. In this work, the metabolic profile of the transgenic genotypes overexpressing BiP (C9) and wild type (WT) by GC-MS. We also evaluated by LC-MS, the abundance of phytohormones and some target secondary metabolites in response to the interaction of soybean with P. s. pv. tomato to determine metabolic changes in these genotypes related to cell death phenotype and hypersensitivity reactions. The accumulation of amino acids, sugars and organic acids may be related to damage control caused by biotic stress, being lower in C9 due to BiP's ability to maintain cellular homeostasis. Compounds such as dihydrosphingosine (DHS) and gamma aminobutyric acid (GABA) may be involved with PCD mechanisms in cells with the aim of to restrain the colonization of foliar tissue by bacteria. Furthermore, there was a tendency for increased salicylic acid (SA) and jasmonic acid (JA), although abscisic acid (ABA) levels have been lower in C9 plants, indicating the ABA antagonist role in the SA-mediated or JA-mediated signaling pathway and phytoalexin synthesis throughout the bacterial infection. The considerable importance of SA and JA, which trigger pathways of microbial control signaling, in C9 is possibly in the negative PCD control by BiP, which prevents the containment of the pathogen for this pathway. Concentrations of secondary metabolites suffered the greatest increase over time, especially daidzein and genistein, being higher in C9 plants. This increase may be associated with the antimicrobial properties of isoflavones. Therefore, in C9 plants, the overexpression of BiP delays the PCD pathway, preventing bacterial colonization in a timely manner, and the antimicrobial action is the predominant response mechanism in C9, whereas in WT, the PCD pathway predominates.

Xylella fastidiosa (Xf) é o agente etiológico causador de doenças em uma grande variedade de cultivos de grande importância econômica, causando a c1orose variegada dos citros, uma das doenças mais danosas à indústria de citros no Brasil. Os genomas de algumas cepas deste fitopatógeno foram completamente seqüenciados promovendo assim estudos funcionais do genoma em larga escala. Neste trabalho nós nos propusemos a investigar o perfil de transcrição de Xf através da técnica microarranjos (no título da dissertação microarrays, mas a partir de agora usaremos microaarranjos) de DNA usando todo o genoma do fitopatógeno e cultivando-a sob meio definido variando a concentração de glicose. O objetivo inicial deste trabalho era observar se Xf comportava-se da mesma forma que Xac, que tem a expressão de goma aumentada devido ao aumento da concentração de glicose do meio. Nossas análises revelaram que enquanto os transcritos relacionados à goma não se mostraram afetados com a concentração de glicose, genes que codificam para análogos a Colicina-V e precursores de fimbria foram induzidos em alta concentração de glicose. Baseados nestes resultados, nós propusemos um modelo de mecanismo de produção e defesa contra a Colicina em Xf. / Abstract not available.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo / Con el fin de evaluar la virulencia y características genéticas de aislados chilenos de Botrytis cinerea con distinta sensibilidad a iprodione, se seleccionaron nueve aislados altamente resistentes (EC50: 1,35 – 2,47 μg·mL-1) y cuatro aislados sensibles (EC50: 0,26 – 0,31 μg·mL-1). La virulencia se evaluó en plántulas de pepino (Cucumis sativus L.) mediante inoculación de discos de agar con micelio del hongo de tres días de edad y en bayas de vid (Vitis vinífera L.) Thompson Seedless con distinto grado de madurez (7°, 14° y 17° Brix), mediante inoculación de una suspensión conidial (equivalente a 2·105 conidias·mL-1). Posterior a la inoculación las plántulas de pepino se mantuvieron a 20-25°C y 100% de humedad relativa y las bayas de vid en cámaras de crecimiento a 20°C. La evaluación se realizó mediante medición del diámetro de la lesión en la zona de inoculación luego de 96 y 72 horas en hojas de pepino y bayas de vid, respectivamente. Los resultados obtenidos fueron sometidos a un ANDEVA simple y en las dos pruebas de virulencia realizadas los aislados de Botrytis cinerea resistentes y sensibles presentaron niveles de agresividad similares. La caracterización genética de los aislados se realizó amplificando mediante PCR el gen bos1 asociado a resistencia de Botrytis cinerea a dicarboximidas, utilizando 5 pares de partidores específicos. Posteriormente los productos de PCR purificados fueron secuenciados por Macrogen USA Corp. El análisis de las secuencias nucleotídicas de los nueve aislados resistentes detectó un cambio aminoacídico en la posición T1259A de la proteína. En ocho de éstos fueron detectadas las mutaciones I365N y R104Q y en el aislado restante un cambio en la posición I365S y una sustitución en la posición L849V. Esta última sustitución no ha sido descrita previamente desconociéndose su implicancia en el nivel de resistencia. En ninguno de los cuatro aislados sensibles secuenciados, el gen bos1 presentó mutaciones asociadas a resistencia a dicarboximidas. / In order to evaluate the virulence and genetic characteristics to Chilean isolates Botrytis cinerea of with different sensitivity to iprodione, were selected nine highly resistant isolates (EC50: 1, 35 to 2.47 μg·mL-1) and four susceptible isolates (EC50: 0.26 to 0.31 μg·mL-1). The virulence was evaluated inoculating cucumber seedlings (Cucumis sativus L.) with three days old Botrytis cinerea mycelium and different ripe (7 °, 14 ° 17 ° Brix) Thompson Seedless grape berries (Vitis vinifera L.) with a conidial suspension (2·105 conidia·mL-1). Cucumber seedlings were kept at 20-25°C and relative humidity 100% and grape berries in growth chambers at 20°C. The evaluation was done measuring the lesion diameter after 96 and 72 hours in cucumber leaves and grape berries, respectively. The results were subjected to a simple ANOVA and in both virulence tests carried out, the sensitive and resistant Botrytis cinerea isolates showed similar levels of aggressiveness. The genetic characterization was performed by PCR amplification of the dicarboximide resistance associated Botrytis cinerea bos1 gene, by means of five specific primers. The purified PCR product was sequenced by Macrogen USA Corp. By means of sequences analysis the bos1 gene nucleotide, in all the nine resistant isolates was detected an amino acid change at the T1259A protein position. The I365N and R104Q mutations were detected in eight of the isolates and in the other isolate a change in the position I365S and a substitution at position L849V. The latter substitution has not been previously detected and it implications on resistance is unknown. The bos1 gene showed no mutations associated to the resistance to dicarboximides in any one of the four susceptible isolates sequenced.

Tesis para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo y al grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias mención Sanidad Vegetal / El repilo del olivo, causado por el hongo Fusicladium oleagineum, es considerado la enfermedad más importante del olivo (Olea europaea) y está extendida en todas las áreas del mundo donde éste se cultiva: Cuenca del Mediterráneo, Sudáfrica, California, Sudamérica y Australia. En Chile, la superficie de olivos ha ido en aumento y se estimó en 24.000 ha para el año 2010. Esta enfermedad provoca defoliaciones prematuras que tienen como consecuencia un debilitamiento progresivo del árbol y una disminución importante de la productividad. La medida de control más utilizada es la aplicación de fungicidas, en forma preventiva, por lo tanto es importante conocer la epidemiología de la enfermedad, para lograr un adecuado control. La utilización de cultivares resistentes es otra forma de lucha contra la enfermedad, pero la información existente al respecto es contradictoria debido a que la mayoría de los trabajos se refieren a observaciones de campo. Este trabajo tuvo como objetivo conocer los períodos críticos de infección, establecer la dinámica de esporulación del hongo y evaluar la susceptibilidad de 6 cultivares de olivo Arbosana, Bossana, Coratina, Frantoio, Koroneiki y Leccino inoculados artificialmente con F. oleagineum bajo condiciones de campo. Los períodos críticos de infección se establecieron en tres huertos, en la región de Coquimbo, Metropolitana y de Valparaíso, estos fueron similares siendo los meses de otoño-invierno los más severos, con una fuerte dependencia de parámetros climáticos principalmente precipitaciones, pero además, se observó la importancia del agua libre producto de rocíos que da inicio a las infecciones. La dinámica de esporulación se estableció para dos huertos, ubicados en la región de Atacama y Metropolitana, confirmándose dos períodos de mayor esporulación, otoño y primavera, sin embargo, si las condiciones de humedad lo permiten F. oleagineum puede producir conidias durante todo el año. El estudio de susceptibilidad de 6 cultivares de olivo se llevó a cabo en un huerto de la región Metropolitana, donde se determinó que los cultivares Bossana y Coratina son susceptibles a la enfermedad y los cultivares Arbosana, Frantoio, Koroneiki y Leccino son moderadamente susceptibles. / The olive leaf spot caused by Fusicladium oleagineum (Castagne) is widespread in the Mediterranean basin and other world regions were olive trees are grown. The disease causes premature defoliation which result in a progressive weakening of the tree and a significant decrease in productivity. It is important to understand the epidemiology of the fungus to achieve adequate control of the disease. In this work the critical periods of infection were established for the Coquimbo, Valparaíso and Metropolitan regions, where the higher disease incidence occurred during the fall and winter months, with a strong dependence of climatic parameters mainly rainfall, but disease was observed to occur before the first fall rains as a result of morning dew. The sporulation dynamics of F. oleagineum in one orchard in the Atacama and one orchard in the Metropolitan Regions were also determined. Fall and spring time were confirmed as the periods with the highest sporulation. Finally, the susceptibility of 6 olive cultivars was studied in a commercial orchard located in the Metropolitan Region. Bossana and Coratina were susceptible while Arbosana, Frantoio, Koroneiki and Leccino were moderately susceptible.

Determina la capacidad antagonista de actinomicetos aislados de la rizósfera de plantaciones de papa colectadas en la localidad de Andahuaylas en la región de Apurímac, frente a cuatro hongos fitopatógenos de importancia agrícola: Fusarium sp., Lasiodiplodia sp., Rhizoctonia solani y Phytophthora infestans. Se aisla 49 cepas de actinomicetos, en su mayoría caracterizadas fenotípicamente como Streptomyces sp. El 69,4% (34) de estas cepas inhibe el crecimiento del hongo Fusarium sp., el 44,9% (22) presenta capacidad antagónica frente a Lasiodiplodia sp., el 55,1% (27) es antagonista de Rhizoctonia solani y el 46,9% (23) frente a Phytophthora infestans; mientras que el 38.8% (19) es antagonista de los cuatro hongos evaluados. Se observa que el crecimiento de los actinomicetos se ve fuertemente influenciado por las bajas temperaturas y pHs bajos. Los extractos orgánicos de la cepa AND 24 obtenidos con diclorometano y etil acetato revelan actividad antifúngica frente a Lasiodiplodia sp., mientras que el extracto butanólico muestra actividad antifúngica frente a Fusarium sp. El análisis filogenético del gen del ADNr 16S revela que el actinomiceto en cuestión es probablemente Streptomyces sampsonii. Concluye que los actinomicetos rizosféricos de la papa son excelentes productores de compuestos bioactivos capaces de inhibir notablemente el desarrollo de hongos fitopatógenos, por lo que se considera como potenciales candidatos a ser utilizados en programas de control biológico de plagas que afectan la papa. / Tesis

Fungos fitopatogênicos veiculados por sementes de soja podem causar sérios prejuízos à cultura, bem como danos diretos reduzindo o poder germinativo, vigor e emergência das sementes. A detecção e identificação precisa de fitopatógenos é uma das estratégias mais importantes para iniciar as medidas preventivas ou curativas no controle de doenças de plantas. Para se evitar a introdução e propagação de patógenos em áreas onde ainda não ocorrem, uma atenção especial deve ser tomada na detecção de agentes patogênicos em sementes. Os métodos tradicionalmente utilizados para detectar e identificar fungos em sementes são, muitas vezes, demorados, laboriosos e exigem um conhecimento extenso de taxonomia clássica. Métodos moleculares têm sido utilizados para detectar, identificar e quantificar uma longa lista de fungos fitopatogênicos. A técnica da reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) é atualmente considerada a mais eficiente para a detecção de fitopatógenos, não exigindo conhecimentos taxonômicos especializados para interpretar seus resultados. Considerando a importância e as implicações da diagnose rápida e bem sucedida de agentes patogênicos em sementes de soja, este estudo teve como objetivo estabelecer uma metodologia para elevar a eficiência de detecção dos fungos fitopatogênicos Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum truncatum, Phomopsis spp. e Corynespora cassiicola, encontrados com maior frequência em sementes de soja, por meio de qPCR. Iniciadores e sondas de hidrólise TaqMan® foram projetados para os diferentes patógenos e avaliados quanto à sua especificidade e sensibilidade. Curvas padrões, baseando-se em diluições seriadas dos DNAs alvos de iniciadores e sondas específicas, foram estabelecidas para a quantificação desses patógenos. Amostras de sementes de soja naturalmente infectadas, provenientes dos Estados de Goiás, Minas Gerais e Paraná, foram submetidas a testes de detecção por meio de qPCR e métodos tradicionais, para fins de comparação. De todos os iniciadores e sondas projetados, apenas os de Phomopsis spp. e S. sclerotiorum apresentaram-se específicos e sensíveis, viabilizando sua utilização na detecção desses patógenos. Por meio dos testes tradicionais de detecção, Phomopsis spp. apresentou incidência máxima de 2,75% em uma amostra de Minas Gerais e S. sclerotiorum não foi detectado em nenhuma das amostras avaliadas. O método de qPCR proporcionou a detecção de Phomopsis spp. em todas as amostras testadas, alcançando o nível de incidência máximo de 6,75%. em amostra de Minas Gerais. S. sclerotiorum não foi detectado em nenhuma das amostras avaliadas pelo método de qPCR. Comparando-se os métodos de detecção testados, a qPCR foi mais sensível na detecção de Phomopsis spp. em sementes de soja. / Seed-born pathogenic fungi in soybean can cause serious damage to the crop, as well as direct damage by reducing seeds germination, vigor and emergence. The detection and accurate identification of plant pathogens is one of the most important strategies to initiate preventive and curative measures in the management of plant diseases. Particular attention should be taken in the detection of pathogens in seeds in order to avoid introduction and spread of pathogens in areas where they do not occur. The traditionally used methods for detection and identification of seed-born pathogenic fungi are often time consuming, laborious and require extensive knowledge of classical taxonomy. Molecular methods have been used to detect, identify and quantify a long list of plant pathogenic fungi. Quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) is currently considered the most efficient technique for the detection of pathogens because it does not require specialized taxonomical knowledge to interpret its results. Given the importance and implications of rapid and successful diagnosis of seed-born pathogenic fungi in soybean, this study aimed to establish a qPCR methodology to increase the detection efficiency of plant pathogenic fungi Sclerotinia sclerotiorum, Colletotrichum truncatum, Phomopsis spp. and Corynespora cassiicola, the most commonly occurring seed-born pathogenic fungi. Primers and TaqMan® hydrolysis probes were designed for these four pathogens and tested for specificity and sensitivity. Standard curves were established to quantify these pathogens, based on serial dilutions of the target DNA and specific primers and probes. Samples of naturally infected soybean seed from the states of Goiás, Minas Gerais and Paraná were subjected to detection tests using qPCR and traditional methods, for comparison purposes. From all primers and probes designed, only those for Phomopsis spp. and S. sclerotiorum showed up specificity and sensitivity, enabling their use to detect of these pathogens. Detection by traditional tests, resulted in a maximum Phomopsis spp. incidence of 2.75% in a sample from Minas Gerais and S. sclerotiorum was not detected in any of the samples. The detection and quantification of these pathogens by qPCR revealed the presence of Phomopsis spp. in all tested samples, the highest incidence level of 6.75% in a sample from Minas Gerais. S. sclerotiorum was not detected in any sample assessed by qPCR method. In comparison with traditional methods, qPCR was more sensitive in detecting Phomopsis spp. in soybean seeds.

A teca (Tectona grandis L.f.) é uma espécie arbórea bastante utilizada em áreas de reflorestamento, sendo a terceira espécie entre as folhosas tropicais mais plantadas do planeta. Durante todo o seu ciclo vegetativo, a teca pode ser afetada por um grande número de doenças, tendo nos fungos os principais agentes fitopatogênicos. Dentre as doenças que ocorrem na cultura, à ferrugem causada por Olivea neotectonae T.S. Ramakr. & K. Ramakr (=Chaconia tectonae T.S. & K. Ramark), destaca-se como a mais importante. A produção de mudas de teca é realizada principalmente por sementes, que é um importante veículo de transmissão de diversos patógenos. Devido à escassez de informações relacionadas à sanidade das sementes de teca utilizadas no Brasil para seu cultivo, objetivou-se com o capítulo I identificar e quantificar os fungos associados às sementes de teca, a patogenicidade desses microrganismos às mudas e a transmissibilidade semente-plântula. Para o teste de sanidade foram utilizadas sementes adquiridas nos estados do TO, GO e SP; os tratamentos utilizados foram sementes desinfestadas e não desinfestadas, e sementes com e sem mesocarpo. O ensaio foi conduzido utilizando o método do papel de filtro (Blotter test). Para o teste de patogenicidade em mudas, utilizaram-se os isolados de Fusarium sp., Botryodiplodia sp., Alternaria sp. e Plenodomus sp. De forma geral, foi possível identificar os seguintes gêneros de fungos nas sementes: Fusarium, Trichoderma, Botryodiplodia, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cladosporium, Alternaria e Plenodomus. Foi observada maior ocorrência de fungos nas sementes dos estados de Goiás e de São Paulo. Apenas os gêneros Fusarium sp. e Botryodiplodia sp. foram patogênicos às mudas de teca. Houve baixa transmissibilidade semente-plântula, sendo que apenas os gêneros fitopatogênicos Fusarium sp. e Alternaria sp. foram transmitidos. No capítulo II, foi realizado o estudo epidemiológico da ferrugem da teca com a análise da dinâmica temporal da doença em árvores adultas, correlacionando o comportamento da doença com as variáveis climáticas, para entender o comportamento da epidemia e, consequentemente, estabelecer alternativas para o adequado manejo. A doença foi monitorada a cada sete dias em plantas adultas escolhidas aleatoriamente para a avaliação da incidência e severidade, sendo esta quantificada com auxílio de uma escala de notas. Com esses dados obtiveram-se as curvas de progresso da doença ajustando aos modelos matemáticos monomolecular, logístico e de Gompertz. Foi calculada a área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD) para incidência e severidade. Os dados de incidência e severidade foram correlacionados com as variáveis climáticas, precipitação, temperatura e umidade relativa média. Verificou-se a incidência da ferrugem logo nas primeiras avaliações, aumentando exponencialmente até o período de 98 dias da avaliação. Maior índice de severidade da doença foi detectado aos 147 dias, com severidade igual ou superior a 75%. Observou-se maior AACPD para a incidência. Houve correlação negativa e significativa entre a severidade com a temperatura mínima. Infere-se, com este resultado, uma tendência de aumento da severidade da ferrugem da teca com a diminuição da temperatura nas condições avaliadas. O modelo de Gompertz foi o que melhor se ajustou aos dados de severidade da ferrugem da teca. / Teak (Tectona grandis L.f.) is an arboreal species widely used in reforestation areas and is the third species among the most planted tropical hardwoods in the world. Throughout their vegetative cycle, teak can be affected by a large number of diseases having in fungi the main phytopathogenic agents. Among the diseases that occur in culture, rust caused by Olivea neotectonae T.S. Ramakr. & K. Ramakr (=Chaconia tectonae T.S. & K. Ramark), stands out as the most important. The production of teak seedlings is mainly through seeds, which is an important vehicle for transmission of various pathogens. Due to the scarcity of information related to health of teak seeds used in Brazil for its cultivation, the aim of chapter I was to identify and quantify the fungi associated with teak seeds, the pathogenicity of these microorganisms to seedlings and seed-seedling transmissibility. For sanity test were utilized seeds acquired in TO, GO and SP states, the treatments were disinfested seeds and without disinfestation and seeds with and without mesocarp. We conducted the test using a filter paper method (Blotter test). To pathogenicity test in seedlings, we utilized the isolates of Fusarium sp., Botryodiplodia sp., Alternaria sp. and Plenodomus sp. To evaluate the fungal seedling-transmission were used 100 seeds of each location. Overall, it was possible to identify the following genera of fungi in seeds: Fusarium, Trichoderma, Botryodiplodia, Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Cladosporium, Alternaria and Plenodomus. There was a higher occurrence of fungi in the seeds of Goiás and São Paulo states. Only the Fusarium sp. and Botryodiplodia sp. were pathogenic to teak seedlings. There was low seed-seedling transmissibility, and only the pathogenic genera Fusarium sp. and Alternaria sp. were transmitted. In chapter II, was performed an epidemiological study of teak rust with the analysis of the temporal dynamics of disease in adult trees, correlating the disease behavior of climate variables, to understand the epidemic's behavior and thus establish alternatives to appropriate management. The disease was monitored every seven days at ten plants randomly chosen to evaluate the incidence and severity, this being quantified with assistance of a grade scale. With these data were obtained the disease progress curves by adjusting the mathematical models monomolecular, logistic and Gompertz. The area under the disease progress curve (AACPD) was calculated for incidence and severity. The incidence and severity data was correlated with the climatic variables, precipitation, temperature and medium relative humidity. The rust incidence was verified from the earliest evaluations, exponentially increasing until 98 days of evaluation. Higher index of severity was detected with 147 days, with a severity greater or equal to 75%. A higher AACPD was observed for the incidence. There was a negative and significant correlation between the severity with the minimum temperature. It is inferred, with this result, a tendency of increasing of severity of teak rust with the decreasing of temperature in the evaluated conditions. The Gompertz model was the best adjusted to the data severity of the teak rust.

Xanthomonas citri (X. citri), causador do cancro cítrico, afeta muitas áreas de cultivo de citros com impacto comercial. Transportadores ABC foram relatados como essenciais para a patogênese de X. citri. O gene nrtT codifica a proteína periplasmática responsável pelo suposto transporte de nitrato/nitrito/taurina. Neste trabalho, mostramos que a deleção de nrtT não afeta o crescimento de X. citri, porém reduz e atrasa os sintomas do cancro durante a infecção em folhas de citros. Observamos redução na produção de goma xantana e capacidade de aderência na linhagem mutante. A proteína NrtT foi expressa monomérica e monodispersa. Foram observadas alterações na estrutura secundária e aumento da estabilidade térmica de NrtT na presença de MOPS, indicando ser este um possível ligante de NrtT. A proteína PotF descrita como ligadora de putrescina não sofre alteração significativa na estabilidade térmica na presença de putrescina, entretanto, dados de SAXS mostram alterações na estrutura possivelmente decorrentes da ligação com putrescina. / Xanthomonas citri (X. citri), which causes citrus canker, affects many citrus growing areas with commercial impact. ABC transporters have been reported as essential for the pathogenesis of X. citri. The nrtT gene encodes the periplasmic protein responsible for the alleged transport of nitrate/nitrite/taurine. In this work, we show that nrtT deletion does not affect the growth of X. citri, but delays and reduces the symptoms of cancer during infection of citrus leaves. We observed a reduction in the production of xanthan gum and adhesion capacity in the mutant strain. The NrtT protein was expressed monomeric and monodisperse. There were changes in the secondary structure and increased thermal stability NrtT in the presence of MOPS, indicating that this was a possible binder NrtT. The PotF protein described as putrescine-binding is not significantly altered thermal stability in the presence of putrescine, however, SAXS data shows changes in the structure possibly resulting from connection with putrescine.

As proteínas inibidoras de poligalacturonases (PGIPs) presentes na parede celular são capazes de limitar o potencial destrutivo da poligalacturonase (PG) fúngica e, assim, constituem um tipo importante dentre os diversos sistemas de defesa do tecido vegetal frente à infecção fúngica. No mamão, o ataque fitopatogênico é o principal causador de danos pós-colheita, e sua alta susceptibilidade pode estar relacionada com a baixa eficácia ou pouca abundância dos meios de defesa anti-fitopatogênica. Uma vez que isso pode estar relacionado com as PGIPs e nada se conhece sobre o papel dessas proteínas nesse fruto, o objetivo do trabalho foi clonar os genes das PGIPs de mamoeiro e definir seu padrão de expressão em diferentes órgãos e tecidos e ao longo do amadurecimento. Para tanto, foram identificadas no genoma do mamoeiro, a partir de critérios que definem a identidade de uma PGIP, duas prováveis sequências dentre 13 candidatas iniciais. Ambas foram clonadas a partir das sequências genômicas e de cDNA, sequenciadas e sua identidade confirmada, sendo denominadas Cppgip4 e Cppgip6. As análises de expressão relativa em diversos tecidos e idades fisiológicas do mamoeiro demonstraram que os dois genes apresentaram diminuição da expressão com o desenvolvimento dos frutos, sendo que com a polpa apresentou redução dos níveis de expressão relativa de Cppgip4 em até 18 vezes dos 30 dias pós-antese (DPA) ao 9 dias pós-colheita (DPC). Na casca também houve redução significativa da expressão com o desenvolvimento. Para a expressão absoluta, nos frutos, sementes, caules, raízes e folhas, o número de cópias de ambos os transcritos decresceu com o desenvolvimento, sendo cerca de cem mil vezes mais abundante para Cppgip6 que para Cppgip4. As tentativas de expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris não geraram resultado positivo, provavelmente em virtude das condições ideais de indução ainda não terem sido estabelecidas corretamente para o ensaio. A atividade de PGIPs extraídas diretamente do tecido foi medida por análise de difusão em ágar empregando pectinase de Aspergillus niger e revelou uma tendência à diminuição da porcentagem de inibição à medida que os frutos se desenvolveram, em concordância com os resultados da análise por qPCR. O conjunto de resultados sugere que a expressão varia com o estádio de desenvolvimento do fruto e é tecido-específica, possivelmente em resposta à diferente susceptibilidade dos tecidos ao ataque fitopatogênico, indicando que menores níveis de transcritos e atividade no amadurecimento, período de maior susceptibilidade, poderiam sinalizar para a regulação do processo degradativo marcando o início da senescência. / Polygalacturonase inhibiting proteins (PGIPs) present in plant cell walls are able to inhibit the destructive action of fungal polygalacturonase (PG). In this way, they constitute an important type of plant defense system against fungal infections. In papaya fruit, the pathogenic attack is the main cause of post harvesting loss, and its high susceptibility may be related to the low efficiency or low abundance of anti-phytopathogenic defense. Since this fact could be related to PGIPs expression and little is known about the response of these proteins in the fruit, the aim of the present work was to clone the genes of PGIPs papaya fruit and set their expression pattern in different organs and tissues throughout fruit ripening. Thus, two probable PGIP sequences among 13 initial candidates were identified in the papaya genome by using specific criteria. Both sequences were cloned from cDNA and genomic samples, sequenced and confirmed its identity, and then being named Cppgip4 and Cppgip6. Analysis of relative expression in various tissues at different physiological stages demonstrated that both genes were down regulated during fruit development. The relative expression levels of Cppgip4 in papaya pulp was reduced by 18 times from the 30 days post-anthesis (DPA) to the 9 days post-harvest (DPH). Similarly, gene expression in papaya peel was significant down regulated during fruit development. Absolute expression analysis revealed gene expressions in the fruit pulp, seed, stem, root and leaf were also down regulated within development. Moreover, Cppgip6 gene expression was a hundred thousand times more abundant than Cppgip4. The recombinant protein expression in Pichia pastoris did not result positive, probably because of the ideal conditions of induction have not been properly established the yet. The activity of PGIPs extracted directly from the tissue was measured by the agar diffusion assay using pectinase from Aspergillus niger and showed decrease of inhibition during fruit developed in accordance with the results of the qPCR analysis. Based on the results it is possible to suggest the expression of these genes varies temporally with the developmental stage of the fruit and is tissue-specific, possibly in response to the different susceptibility of tissues to pathogenic attack. In addition, the lowest levels of PGIP expression were achieved at the fruit ripening, when the susceptibility to fungal infection is high and could signal for regulating the degradation process characterized by the onset of senescence.