Xylella fastidiosa é o agente causal de uma série de doenças que ocorrem em plantas economicamente importantes como laranjeiras, videiras e cafeeiros, causando no Estado de São Paulo prejuízos relevantes à indústria citrícola. Esta bactéria Gram-negativa é restrita ao xilema das plantas e à porção anterior do trato digestório dos insetos vetores das famílias Cicadellidae e Cercopidae, conhecidos como cigarrinhas. Tentativas de elucidar os mecanismos de virulência e patogenicidade adotados por esta bactéria apontam a formação do biofilme como etapa fundamental para o estabelecimento da infecção e o consequente desenvolvimento da doença na planta, mas fatores adicionais parecem contribuir, tais como a produção de toxinas. As bacteriocinas são proteínas com atividade antibiótica contra cepas próximas à espécie produtora e que já foram associadas à virulência e patogenicidade de outras bactérias. Uma varredura in silico no genoma de X. fastidiosa 9a5c revelou 13 sequências codificadoras de microcinas putativas no cromossomo. Transcritos de todos esses genes foram detectados por RT-qPCR em culturas de X. fastidiosa 9a5c, e análises comparativas com genomas públicos (cepas Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 e GB514) e recém sequenciados por nosso grupo de pesquisa (cepas U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x e Fb7) revelaram que cada cepa possui seu próprio arsenal de bacteriocinas. Diferenças encontradas in silico entre os loci de bacteriocinas nas cepas foram demonstradas experimentalmente. Nossos resultados comprovam a variabilidade predita nos quatro clusters de bacteriocinas que identificamos, o que é esperado para genes relacionados à adaptação e patogenicidade. Destes loci, três foram detectados por RT-PCR como transcritos policistrônicos. Nossa tentativa de detectar essas proteínas em culturas de X. fastidiosa (através de sequenciamento de polipeptídeos por HPLC-MS/MS) foi capaz de identificar uma das bacteriocinas putativas e, portanto, o conjunto de nossas observações apóia a continuidade dos estudos para elucidar o papel das bacteriocinas na fisiopatologia de X. fastidiosa. / Xylella fastidiosa is the causal agent of diseases that affect several economically important crops such as sweet orange trees, grapevines and coffee trees, causing in the State of São Paulo considerable losses mainly to the citrus industry. This Gram-negative bacterium is restricted to the plant xylem and to the upper gastrointestinal tract of its insect vectors, the sharpshooters from the Cicadellidae and Cercopidae families. Attempts to elucidate the virulence and pathogenicity pathways employed by this bacterium point the biofilm formation as a fundamental step for the establishment of the infection and the consequent development of the plant disease, but additional factors seem to contribute to these processes, such as the production of toxins. Bacteriocins are proteinaceous antibiotics that act against closely-related species and have been previously associated with virulence and pathogenicity in other bacteria. An in silico screening of the X. fastidiosa 9a5c genome revealed 13 coding sequences as putative microcins in the chromosome. Transcripts from all those genes were detected through RT-qPCR in X. fastidiosa 9a5c cultures, and comparative analyses on the public genomes (Temecula1, Dixon, Ann-1, M23, M12, EB92-1 and GB514) plus the ones recently sequenced by our group (U24d, J1a12, 3124, Hib4, Pr8x and Fb7) revealed that each strain possesses its own arsenal of bacteriocins. Differences found in silico among the loci in all strains were experimentally confirmed. Our results demonstrated the predicted variability in the four bacteriocins clusters as expected for adaptation and pathogenicity-related genes. Three out of the four bacteriocins loci were detected by RT-PCR as polycistronic transcripts. Our attempt to detect these proteins in X. fastidiosa cultures (using HPLC-MS/MS polypeptide sequencing) identified one of the putative bacteriocins, and therefore our observations warrant further efforts to elucidate the role of bacteriocins in the X. fastidiosa physiopathology.

Colletorichum acutatum é o agente causal da Podridão Floral dos Citros (PFC), doença que em determinadas condições ambientais constitui-se em fator limitante à produção citrícola em várias regiões produtoras do mundo. Além da PFC, esse fungo causa antracnose em outros hospedeiros, sendo um dos patógenos que mais acarreta danos em frutíferas tropicais, subtropicais e temperadas no mundo. O trabalho teve como objetivos estudar a especificidade patogênica e compatibilidade vegetativa entre isolados de C. acutatum dos citros e de outros hospedeiros como: goiaba, pimentão, morango e pêssego. Para os estudos de especificidade patogênica, foram realizadas inoculações cruzadas entre isolados de citros e dos outros hospedeiros visando verificar se os diferentes isolados são capazes de causar sintomas de PFC em flores de citros e antracnose em frutos. Foram também obtidos, a partir dos mesmos isolados, mutantes deficientes na absorção de nitrogênio (mutantes nit). Esses foram caracterizados fenotipicamente e pareados a fim de verificar por meio de estudos de compatibilidade vegetativa a capacidade de recombinação entre si, gerando heterocários com patogenicidade alterada. Para verificar a ocorrência de possíveis alterações na patogenicidade dos heterocários formados, foi feita a inoculação dos heterocários e dos isolados parentais nos seus respectivos hospedeiros de origem. Nos ensaios de inoculação cruzada, houve grande variação quanto à patogenicidade dos isolados inoculados. Isolados provenientes de citros e de goiaba causaram lesões em flores de citros, isso demonstra a ausência de especificidade entre isolados dos dois hospedeiros. Porém, isolados provenientes de pimentão, pêssego e morango não foram capazes de causar sintomas em flores de citros o que indica a existência de especificidade desses isolados. Os isolados provenientes dos citros e de outros hospedeiros foram capazes de causar antracnose em goiaba, morango e pêssego, mas apenas os isolados de pimentão causaram antracnose em pimentão. Alguns isolados de citros foram capazes de recombinar entre si e com isolados de goiaba, pimentão e morango. Dos heterocários formados, dois foram caracterizados quanto a sua patogenicidade, Het 3 e Het 5. Como resultado, o heterocário proveniente do isolado de citros com goiaba (Het 5) comportou-se de forma semelhante à um de seus parentais. O heterocário proveniente de citros com pimentão (Het 3), mostrou-se mais agressivo do que seus parentais quando inoculados em pimentão. Com esses estudos pode-se concluir que existe especificidade patogênica entre isolados de C. acutatum de diferentes hospedeiros, entretanto, isolados de diferentes hospedeiros podem recombinar entre si e gerar heterocários com características patogênicas alteradas. / Colletorichum acutatum is the causal agent of postbloom fruit drop (PFD).This disease is a limiting factor for citrus production under specifics environmental conditions in several regions of the world. In addition to the PFD, this fungus causes anthracnose on other hosts. It is one of the pathogens that cause more damage in tropical, subtropical and temperate fruit around the world. This work aimed to study the specificity pathogenic and vegetative compatibility among isolates of C. acutatum from citrus and other hosts: guava, pepper, strawberry and peach. For studies of pathogenic specificity, cross inoculations were performed among isolates from citrus and other hosts in order to verify whether different strains are capable of causing symptoms of PFD in citrus flowers and fruit anthracnose. Furthermore, it was obtained from the same isolates, nitrate-nonutilizing mutants (nit mutants). They were phenotypically characterized and paired to verify, by means of vegetative compatibility studies, the ability of recombination between them, generating heterokaryons with altered pathogenicity. In order to verify the occurrence of possible changes in the pathogenicity of the heterokaryons formed, parental isolates and heterokaryons were inoculated in their respective original hosts. In cross-inoculation tests, there was a great variation in the isolates pathogenicity. Isolates from citrus and guava caused lesions on citrus blossoms; this demonstrates the absence of pathogenic specificity between isolates of the two hosts. However, isolates from pepper, peach and strawberry were unable to induce symptoms on citrus flowers showing the existence of specificity of these isolates. The strains from citrus and other hosts were able to cause anthracnose on guava, strawberry and peach, but only isolates of pepper caused anthracnose on pepper. Some isolates from citrus were able to recombine among themselves and with isolates from guava, peppers and strawberries. From the heterokaryons obtained, two of them had their pathogenicity characterized: Het 3 and Het 5. As a result, the heterokaryon derived from citrus and guava (Het 5) behaved similarly to one of their parental isolates. The heterokaryon derived from citrus and pepper (Het 3) was more aggressive than their parental isolates when inoculated in pepper. With these results we can conclude that there is specificity between pathogenic strains of C. acutatum from different hosts. However, isolates from different hosts can recombine with each other and generate heterokaryons with altered pathogenic characteristics.

Fungos endofíticos estão presentes em plantas de diversos ambientes e produzem compostos com amplas propriedades químicas e aplicações, tanto na área médico-farmacológica quanto na agronômica. Entretanto, ainda há muito a ser investigado sobre seu potencial biotecnológico, principalmente em locais pouco explorados. As ilhas apresentam um ambiente particular e altamente vulnerável, tornando-as locais promissores na busca de organismos pouco comuns ou ainda endêmicos. Sendo assim, neste trabalho foi realizado o isolamento e estudo químico e biológico de fungos endofíticos isolados de 2 espécies plantas do gênero Anthurium da Ilha de Alcatrazes-SP. Para isto, fragmentos foliares das plantas A. loefgrenii (HRCB 46467) e A. alctrazense (HRCB 46465 - endêmica da ilha) foram inoculados em 10 meios de cultivo com diferentes composições, resultando no isolamento de 106 fungos endofíticos. Por meio de análises químicas por MALDI-TOF-MS e ensaio biológico contra fitopatógenos, foram selecionados 3 fungos para estudo. Estes foram identificados por técnicas morfológicas e moleculares como sendo Penicillium citrinum (P2MSF2F3), Penicillium simplicissimum (P210-4F2) e Aureobasidium melanogenum (P7AF2F3). No estudo dos metabólitos secundários de P. citrinum foi isolado o composto citrinina, o qual apresentou atividade inibitória do crescimento micelial dos fitopatógenos Colletotrichum gloeosporioides (MIC= 125 μg mL-1), Colletotrichum lindemuthianum (MIC= 0,48 μg mL-1), Phomopsis sojae (MIC= 250 μg mL-1) e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (MIC= 125 μg mL-1). Outras frações obtidas do meio metabólico de P. citrinum (fração F3a3 e citrinina) apresentaram atividade inibitória (100% de inibição) à formas promastigotas de Leishmania infantum. No estudo dos metabólitos secundários de P. simplicissimum foi obtida a fração F2b, ativa contra L. infantum (100% de inibição), da qual foram isolados os compostos andrastina A e penicisoquinolina, sendo o primeiro relato de sua produção por esta espécie, além de outros 5 compostos ainda não identificados. No estudo dos metabólitos secundários de A. melanogenum foi isolado o composto metil-orselinato, relatado pela primeira vez para este fungo. Do mesmo fungo foi obtida a fração F1d2l ativa contra L. infantum (100% inibição), da qual foram isolados 2 compostos ainda não identificados. Este é o primeiro relato de fungos isolados de antúrios da ilha de Alcatrazes, bem como do estudo de seus metabólitos secundários. Este trabalho apresenta contribuição no conhecimento sobre fungos endofíticos e seu potencial metabólico, com aplicações nas áreas agronômica e médico-farmacológica. / Endophytic fungi are present in plants in various environments and produce compounds with wide chemical properties and applications, both in the medical and in agronomic field. However, much remains to be investigated about their biotechnological potential, especially in unexplored places. Islands have a particular and highly vulnerable environment, making them promising sites in search of unusual or endemic organisms. Thus, this work represents the isolation and chemical and biological study of endophytic fungi isolated from 2 species of plants of the genus Anthurium of Alcatrazes island-SP. For this, leaf fragments from plants A. loefgrenii (HRCB 46467) and A. alcatrazense (HRCB 46465 - endemic plant from the Island) were inoculated onto 10 culture media with different composition, resulting in the isolation of 106 endophytic fungi. Three strains were selected to be studied through chemical analysis by MALDI-TOF-MS and bioassay against phytopathogens. These were identified by morphological and molecular techniques as Penicillium citrinum (P2MSF2F3), Penicillium simplicissimum (P210-4F2) and Aureobasidium melanogenum (P7AF2F3). In the study of secondary metabolites of P. citrinum it was isolated the compound citrinin, which showed inibitory activity against the plant pathogens Colletotrichum gloeosporioides (MIC= 125 μg mL-1), Colletotrichum lindemuthianum (MIC= 0.48 μg mL-1), Phomopsis sojae (MIC= 250 μg mL-1) and Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli (MIC= 125 μg mL-1). Other fraction obtained from the metabolic extract of P. citrinum (F3a3 fraction and citrinin), showed inibitory activity (100% inibition) to Leishmania infantum promastigotes. In the study of secondary metabolites of P. simplicissimum it was obtained F2b fraction, active against L. infantum (100% inhibition), which were isolated andrastin A and penicisoquinoline compounds, the first report of its production for this species, as well 5 unidentified compounds. In the study of secondary metabolites from A. melanogenum was isolated the methyl-orsellinate compound, first reported for this fungus. From the same strain was obtained F1d2l fraction, active against L. infantum (100% inhibition), from which were isolated 2 unidentified compounds. This is the first report of fungi isolated from Alcatrazes Island anthuriums and the study of their secondary metabolites. This study presents contribution to knowledge of endophytic fungi and their metabolic potential with applications in the medical and agronomic fields.

Los hongos fitopatógenos atacan a los diferentes cultivos agrícolas, y son los principales causantes de enfermedades como la roya, mildiu, podredumbre; siendo muy destructivos por su rápido crecimiento, su reproducción explosiva y su fácil expansión. Actualmente se buscan nuevas técnicas amigables con el ambiente que puedan controlar el ataque de agentes patógenos. Una de estas técnicas innovadoras es el uso de extractos de plantas que producen componentes químicos que tienen el potencial de reducir o detener por completo el crecimiento de hongos fitopatógenos. Se evalúa el efecto antifúngico de los extractos etanólicos de las hojas de Phyllanthus niruri (“Chanca piedra”) y Minthostachys mollis (“Muña”) en cultivos in vitro de Botrytis cinerea. Las plantas fueron recolectadas en el departamento de Cusco, fueron lavadas y secadas en estufa de 45°C durante 5 horas. Luego se prepararon los extractos etanólicos que fueron filtrados, concentrados y esterilizados. El hongo Botrytis cinerea fue aislado de aguaymanto con la técnica de cámara húmeda. La evaluación del efecto etanólico se realizó en los medios de Agar Papa Dextrosa (APD) y Agar con harina de kiwicha, cada uno contenía diferentes concentraciones de extractos (0; 1; 2,5; 5; 7,5 y 10 %) y cada concentración estaba compuesta por tres pruebas con cuatro repeticiones cada una. En total se evaluó 72 placas por cada medio y se tomó cuatro mediciones del crecimiento micelial por placa cada día durante una semana. Se observó que la concentración mínima inhibitoria (CMI) para el extracto de Phyllanthus niruri en medio APD y kiwicha es 5% y 2.5% respectivamente, mientras que para el extracto de Minthostachys mollis es 5% en ambos medios. Esto puede deberse a que ambos extractos presentan similares metabolitos secundarios como alcaloides y compuestos fenólicos. Los resultados evidencian que los extractos de Phyllanthus niruri y Minthostachys mollis tienen potencial antifúngico frente a Botrytis cinerea. / Tesis

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-26T18:43:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 557115 bytes, checksum: 0b1630547cb96e187f6cd9997552fe07 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-26T18:43:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 557115 bytes, checksum: 0b1630547cb96e187f6cd9997552fe07 (MD5) Previous issue date: 2003-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Métodos alternativos, como controle biológico, uso de plantas antagônicas e extratos de diferentes espécies e partes de plantas, têm sido estudados para o manejo de nematóides fitoparasitas. A pimenta malagueta contém capsaicina e capsainóides, responsáveis pelo seu ardor e por atuar como irritante do sistema nervoso de vários animais. A decomposição de brássicas, como a mostarda, libera compostos tóxicos com efeito nematicida. O alho possui compostos sulfurosos que podem atuar no controle de diversos patógenos. Este trabalho teve como objetivos: 1) avaliar atividade nematicida de extratos botânicos de pimenta malagueta (Capsicum frutescens), mostarda (Brassica campestris) e alho (Allium sativum) sobre o nematóide das galhas, Meloidogyne javanica, em tomateiro; 2) comparar o efeito dos extratos botânicos selecionados com um produto comercial (Champon®) e um produto contendo capsaicina, capsainóides e alil isotiocianato, em diferentes concentrações, sobre M. javanica em tomateiro; 3) avaliar o efeito dos extratos botânicos e dos produtos contendo capsaicina, capsainóides e alil isotiocianato sobre a eclosão dos juvenis de M. javanica; 4) avaliar o efeito dos extratos botânicos e dos produtos contendo capsaicina, capsainóides e alil isotiocianato sobre a inativação dos juvenis de M. javanica. Foram produzidos extratos cetônicos de frutos de pimenta, bulbos de alho e parte aérea de plantas de mostarda e extrato clorofórmico de frutos de pimenta. Para isso cada parte da planta a ser utilizada foi moída e submetida à extração. Foi testado óleo comercial de mostarda juntamente com os demais extratos. O estudo sobre o efeito dos extratos de pimenta, mostarda e alho e de óleo de mostarda sobre Meloidogyne javanica foi realizado em casa de vegetação com a avaliação da redução do número de galhas e ovos em raízes de tomateiro e em testes para avaliação da inibição da eclosão e inativação de juvenis foram realizados em laboratório. Foi avaliado ainda o efeito dos extratos sobre o desenvolvimento das plantas infectadas pelo peso e altura das plantas em casa de vegetação. No primeiro experimento foi feita uma seleção dos extratos que, em alta concentração, apresentaram atividade nematicida sem causar fitotoxidez. Extratos clorofórmico e cetônico de pimenta e o óleo de mostarda foram os que apresentaram melhores resultados no experimento de seleção. Após a seleção dos extratos, foram comparadas diferentes concentrações do extrato emulsificado. Um produto comercial importado dos Estados Unidos (Champon®) e um produto, que encontra-se em fase experimental, contendo capsaicina, capsainóides e alil isotiocianato também foram avaliados em diferentes concentrações. O óleo de mostarda e os produtos à base de capsaicina, capsainóides e alil isotiocianato inibiram significativamente a eclosão de juvenis de M. javanica. No experimento onde se avaliou a inativação de juvenis de M. javanica, os extratos de pimenta, mostarda e alho mostraram eficiência apenas em altas concentrações, mas o óleo de mostarda e os produtos a base de capsaicina, capsainóides e allil isotiocianato mostraram-se eficientes em todas as concentrações testadas. Dos resultados obtidos, conclui-se que extratos botânicos e produtos à base de ingredientes naturais podem ser uma boa opção para o controle de M. javanica. / Alternative methods, such as biological control, antagonistic plants and extracts from different plant parts and species have been studied for the management of nematodes. The red hot chili pepper fruit contains capsaisin and capsainoids, responsible for its burning and for acting as an irritant to the nervous system of various animals. The decomposition of brassics, such as mustard, releases toxic compounds with nematicidal effects. Garlic presents sulfurous components which may control several plant pathogens. This work had the following objectives: 1) to evaluate the nematicidal activity of botanical extracts from chili pepper (Capsicum frutescens), mustard (Brassica campestris) and garlic (Allium sativum) on the root-knot nematode, Meloidogyne javanica, in tomato; 2) to compare the most efficient botanical extract with a brand product and with a product in development, both containing capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate, testing in different concentrations, for the control of M. javanica in tomato; 3) to evaluate the effects of the extracts and of the products with capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate on the M. javanica egg hatching; 4) to evaluate the effects of the extracts and of the products with capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate on the inactivation of M. javanica second-stage juveniles. Cetonic extracts were obtained from chili pepper fruits, from garlic bulbs and from leaves of mustard, and chloroformic extract from chili pepper fruits. Each plant part was ground before the extraction. Commercial mustard oil was tested along with the other extracts. The effects on the chili pepper, mustard and garlic extracts as well as the mustard oil on the control of M. javanica were evaluated in a bioassay in the greenhouse by measuring reductions of number of galls and eggs in tomato roots, and the tests on the egg hatching and juvenile inactivation were conducted in the laboratory. The effects of the extracts on plant development was studied measuring weight and size of the infected plants in the green house. In the first experiment extracts which controlled the nematode without being phytotoxic, even in a high concentration, were selected. The chloroformic and cetonic extracts of chili pepper and the mustard oil presented the best performance. After the selection, different concentration of the products in emultion were tested in the control of the nematode. An commercial product imported from the USA (Champon ® ) and a product in development in the University of Viçosa, both containing capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate, were evaluated also, in different concentrations. The mustard oil and the products containing capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate inhibited significantly M. javanica egg hatching. Inactivation of juveniles occurred with chili, mustard and garlic extracts only at high concentration, but the mustard oil and the products with capsaicin, capsainoids and allyl isothiocyanate were effective in all the tested concentrations. From the observed results it is possible to conclude that botanical extracts and products with natural ingredients may be a good option for the control of M. javanica. / Dissertação importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-05-15Bitstream added on 2014-06-13T20:23:22Z : No. of bitstreams: 1 moreira_rfc_dr_jabo.pdf: 545090 bytes, checksum: 6b6b5062d2bd5f7bc8ff1ca523e6a689 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) / Comon Fund For Comidities, International Cocoa Organization / Vassoura-de-bruxa e podridão de Moniliophthora, causadas pelos fungos Crinipellis perniciosa e Moniliophthora roreri, respectivamente, são as doenças de maior impacto econômico da cultura do cacau e estão presentes na maioria dos países produtores do Continente Americano. Evidências biológicas e moleculares comprovam que estes fitopatógenos estão intimamente relacionados. O uso de resistência genética através de dones resistentes de cacaueiro, é a medida mais eficiente no controle destas doenças. O conhecimento sobre as populações destes fungos é importante na geração de informações para o programa de melhoramento genético do cacau visando resistência. Marcadores moleculares RAPO e SSR foram usados para analisar a estrutura genética de populações destes fitopatógenos. No geral, as populações do Brasil, Equador, Peru e Trinidad agruparam-se de acordo com o país de origem, apresentando maior variabilidade dentro e não entre países, com presença de subpopulações. A população do Brasil apresentou maior diversidade genotípica em comparação com as demais. A transferibilidade de pares de primers SSR de C. perniciosa para M. roreri foi satisfatório. Populações de M. roreri do Equador e Peru apresentaram alta diferenciação genética interpopulacional, sendo que a do Peru apresentou maior variabilidade. / Witches' broom and fresty pod hot, caused by Crinipellis perniciosa and Moniliophthora roreri, are the most important disease of cacao in the American Continent. Biological and molecular data have shown that these pathogen are closely related. Resistance is the most efficient method to control these diseases. Therefore, information about the population structure of these cacao pathogen are important to support the breeding programo Molecular markers such as RAPD and SSR were used to analyzed the genetic structure of C. perniciosa and M. roreri frem the American Continent. Populations of C. perniciosa clustered according to their country of origin, with more variability within than between countries, revealing the presence of subpopulations. C. perniciosa Brazilian populations presented higher genotypic diversity than C. perniciosa from other countries. The transferability of C. perniciosa-SSR to M. roreri was positive. On the contrary, high interpopulation variability was observed between Ecuador and Peru, being M. roreri from Peru much more diverse than Ecuador.

Submitted by Izabel Franco (izabel-franco@ufscar.br) on 2016-10-03T17:39:45Z No. of bitstreams: 1 DissLCDS.pdf: 1437971 bytes, checksum: b520fddddb51565a19856b3d8f57911f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T18:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLCDS.pdf: 1437971 bytes, checksum: b520fddddb51565a19856b3d8f57911f (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T18:29:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissLCDS.pdf: 1437971 bytes, checksum: b520fddddb51565a19856b3d8f57911f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T18:29:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLCDS.pdf: 1437971 bytes, checksum: b520fddddb51565a19856b3d8f57911f (MD5) Previous issue date: 2016-06-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Insect symbionts may have unknown functions in the interaction between insect-plant and insect with microorganisms that co-inhabit the same space. The objective of this study was to investigate the antagonism potential of symbiont microbiota from oral secretion D. saccharalis collected in the field, against Fusarium verticillioides and Colletotrichum falcatum pathogens commonly found inside the cane. For this, 4° and 5° instar caterpillars were collected inside sugarcane varieties RB-835 054 and SP- 813 250, and brought to the lab inside the cane stalks. The microbiota of oral secretion was transferred to two selective media, NA (nutrient agar) for bacteria and DRBC (dicloran Rose Bengal Chloramphenicol) for yeast. Based on morphology and coloration of the colonies twenty colonies of bacteria and yeast were selected. Four culture media were tested in co-cultivation of F. verticillioides and C. falcatum versus bacteria or yeast isolates: PDA (potato, dextrose, agar), YEPD (yeast extract, peptone, dextrose), CCS (supplemented cane broth) and NA (Nutrient Agar). The most suitable culture medium for growth of most microorganisms was BDA. Antagonism potential of 82 bacterial isolates and 87 yeast isolates to C. falcatum and F. verticillioides was assessed using a visual scale of categories 1 to 4, with 4 being the maximum degree of antagonism. Isolates that allocated category greater than or equal to 2 were evaluated in co-culture with C. falcatum and F. verticillioides as the percentage of growth inhibition. It was possible to identify four isolates of bacteria which have the potential to inhibit growth of pathogens and 9 isolates with the same potential but with much lower percentages. These results demonstrate that some isolates of bacteria and yeast may influence the relationship between the bit-rot complex and sugarcane plant, may in future be used as a biological control of these pathogens or have some molecules of biotechnological interest extracted and purified. / Simbiontes de insetos podem ter funções desconhecidas na interação entre insetoplanta e do inseto com microrganismos que co-habitam o mesmo espaço. O objetivo desse estudo foi investigar o potencial de antagonismo da microbiota simbionte, presentes na secreção oral de Diatraea saccharalis, com os fitopatógenos Fusarium verticillioides e Colletotrichum falcatum que habitam o colmo de cana-de-açúcar. Para isso, foram coletadas, nas variedades de cana RB-835054 e SP-813250, lagartas de 4° e 5° instar e trazidas para o laboratório junto aos toletes de cana. A microbiota da secreção oral foi transferida para dois meios de cultura seletivos, NA (nutrient agar) para bactérias e DRBC (Dicloran Rosa-de-Bengala Cloranfenicol) para leveduras. Baseado na morfologia e coloração das colônias, foram selecionadas, vinte colônias de bactéria e também de levedura de 5 lagartas. Foram testados quatro meios de cultura: BDA (batata, dextrose, agar), YEPD (yeast extract, peptone, dextrose), CCS (caldo-de-cana suplementado) e NA para os testes de cultivo pareado. O meio de cultura mais adequado para o crescimento da maioria dos microrganismos foi o BDA. O potencial de antagonismo de 82 isolados de bactéria e 87 isolados de levedura a C. falcatum e F. verticillioides foi avaliado através de uma escala visual de categorias de 1 a 4, sendo 4 o grau máximo de antagonismo. Os isolados a que foi atribuída categoria maior ou igual a dois foram avaliados em co-cultivo com C. falcatum e F. verticillioides quanto à porcentagem de inibição do crescimento. Foi possível identificar 4 isolados de bactéria que tem o potencial de inibir o crescimento dos fitopatógenos e 9 isolados com o mesmo potencial, porém com porcentagens menores. Esses resultados demonstram que alguns isolados de bactérias e leveduras podem influenciar na relação existente entre o complexo broca-podridão e a planta de cana-de-açúcar, podendo, futuramente, serem utilizados como controle biológico desses fitopatógenos ou terem algumas moléculas de interesse biotecnológico extraída e purificada.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1252953 bytes, checksum: 5c4901cfbd21633e7c02d3de0ad4790a (MD5) Previous issue date: 2014-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Endophytic fungi are those living at least a part of their life cycle within plant tissue, apparently without causing any damage to their hosts. These microorganisms have been studied for their capacity to produce secondary metabolites of biotechnological interest, and also for their ability for biological control of phytopathogens. Endophytic fungi have been isolated from a wide variety of plant species, including crops such as common bean (Phaseolus vulgaris L.). Fungi from the genus Diaporthe were abundant in the endophytic community of this legume. The objectives of this study were to evaluate the antimicrobial activity and the potential use of endophytic fungi of P. vulgaris in the control of phytopathogens of bean, and to analyze phylogenetic relationships and genetic variability of endophytic fungi of the genus Diaporthe isolated from P. vulgaris. Dual culture assays were performed between ninety endophytic fungi and four phytopathogenic fungi (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Sclerotinia sclerotiorum) to assess for the ability of endophytic fungi inhibit the growth of phytopathogens. The isolates that were able to inhibit the four phytopathogens tested were selected for cultivation and obtention of metabolites crude extracts. These extracts were evaluated for antibacterial and antifungal activity. The sequences of the ITS region of rDNA of the isolates of the genus Diaporthe from common bean, along with the partial sequences of the genes encoding translation elongation factor 1-α, β-tubulin and calmodulin were used for the study of the phylogenetic relationships of these isolates. Molecular markers based on sequences of retrotransposons, IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) and REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), were used for the analysis of genetic variability. It was found that endophytic fungi of common bean are able to inhibit the in vitro growth of phytopathogenic fungi and that metabolites crude extracts of endophytic exhibit significant antimicrobial activity especially regarding the inhibitory activity against Gram-positive bacteria (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis and Staphylococcus aureus). Diaporthe sp., D. infecunda, D. melonis and D. phaseolorum are members of the endophytic fungal community in the common bean as verified by multilocus phylogenetic analysis. Cluster analysis, conducted with pooled data from IRAP and REMAP markers, was consistent regarding what was observed in multilocus phylogeny and revealed the existence of high genetic variability, particularly among isolates of D. infecunda. It was concluded that the metabolites crude extracts of endophytic fungi of common bean exhibit promising antimicrobial activity; that endophytic fungi used in this study have the potential to control phytopathogens that affect the bean crop; the multilocus phylogenetic approach was more effective than individual analysis of ITS sequences in the study of phylogenetic relationships of endophytic fungi of the genus Diaporthe from common bean and that IRAP and REMAP markers can be employed in the study of genetic variability of this genus of fungi. / Fungos endofíticos são aqueles que vivem, em pelo menos uma parte de seu ciclo de vida, no interior de tecidos vegetais, sem causar aparentemente qualquer dano a seus hospedeiros. Esses micro-organismos têm sido estudados em relação à capacidade de produzirem metabólitos secundários de interesse biotecnológico e quanto ao potencial de controle biológico de fitopatógenos. Fungos endofíticos já foram isolados de uma ampla variedade de espécies vegetais, incluindo culturas agrícolas como o feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). O gênero Diaporthe foi um dos mais abundantes na comunidade endofítica dessa leguminosa. Os objetivos do presente estudo foram avaliar a atividade antimicrobiana e o potencial de uso de fungos endofíticos de P. vulgaris no controle de fitopatógenos da cultura do feijoeiro e analisar as relações filogenéticas e a variabilidade genética de fungos endofíticos do gênero Diaporthe isolados de P. vulgaris. Ensaios de cultura dupla entre 90 isolados endofíticos e quatro fungos fitopatogênicos (Colletotrichum lindemuthianum, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum) foram realizados para verificar a capacidade dos isolados endofíticos inibirem o crescimento dos fitopatógenos. Os isolados que foram capazes de inibir os quatro fitopatógenos testados foram selecionados para cultivo e obtenção de extratos brutos de metabólitos. Esses extratos foram avaliados quanto à atividade antibacteriana e antifúngica. As sequências da região ITS do rDNA dos isolados do gênero Diaporthe do feijoeiro, juntamente com as sequências parciais dos genes codificam o fator de elongação da tradução 1-α, β-tubulina e calmodulina, foram utilizadas para o estudo das relações filogenéticas desses isolados. Marcadores moleculares baseados em sequências de retrotransposons, IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) e REMAP (Retrotransposon-Microsatellite Amplified Polymorphism), foram utilizados para a análise de variabilidade genética. Foi constatado que os fungos endofíticos do feijoeiro comum são capazes de inibir o crescimento in vitro de fungos fitopatogênicos e, que extratos brutos de metabólitos de isolados endofíticos exibem atividade antimicrobiana significativa, principalmente em relação à atividade inibitória sobre bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, B. subtilis e Staphylococcus aureus). Por meio de análise filogenética multilocus, verificou-se que Diaporthe sp., D. infecunda, D. melonis e D. phaseolorum são integrantes da comunidade fúngica endofítica do feijoeiro comum. A análise de agrupamento, realizada com os dados dos marcadores IRAP e REMAP em conjunto, foi coerente em relação ao que foi verificado na filogenia multilocus e, revelou a existência de grande variabilidade genética, sobretudo entre os isolados de D. infecunda. Concluiu-se que extratos brutos de metabólitos de fungos endofíticos do feijoeiro exibem atividade antimicrobiana promissora; que fungos endofíticos utilizados neste estudo apresentam potencial para controle de fitopatógenos que acometem a cultura do feijoeiro; que a abordagem filogenética multilocus foi mais efetiva que análise individual de sequências de ITS no estudo das relações filogenéticas de fungos endofíticos do gênero Diaporthe do feijoeiro e que marcadores IRAP e REMAP podem ser empregados no estudo de variabilidade genética de fungos desse gênero.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-04T10:24:50Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-12-04T10:27:57Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-04T10:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paulo Roberto da Mota - 2015.pdf: 1806908 bytes, checksum: d6798b75ceeef2f456ddde6fbf387e77 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-08-28 / Fungi of the genus Trichoderma have emerged as biological control agents, especially those belonging to the species Trichoderma harzianum with various mechanisms involved include production of antibiotics, mycoparasitism, competition for nutrients and host plant resistance induction. Mycoparasitism is a sequential process that involves recognition of the host contact, adhesion, expression of specific genes and secretion of secondary metabolites. Several hydrolytic enzymes are involved in this process among them chitinases, beta-glucanases and proteases. Recent studies of T. harzianum interaction with some pathogens have shown that other enzymes may also be involved in this mechanism, among which alphamannosidase. Alpha-mannosidase has an essential role in the recycling of glycoproteins in filamentous fungi, but little is known about the role of these enzymes in mycoparasitism. This study aims to characterize the expression of T. alphamannosidase gene harzianum after growth in cell wall of Sclerotinia sclerotiorum (SS), Fusarium solani (FS) and Fusarium oxysporum (FO) as well as during the interaction in vivo . It was used as a control cell wall T. harzianum (TH). Also, jobs obtaining mutants of this gene in T. harzianum were performed. Our data show that alpha-mannosidase gene was highly expressed as T. harzianum grown in the presence of cell wall SS (4.5X), FS (18X) and FO (75X) compared to the control TH (1X). In comparison situation it was noticed a 75X greater expression in TH x FO state during contact as compared with the control (TH x TH). In other situations of confrontation did not observe a significant increase in expression. The promoter region, the selection mark and the terminator region of the alpha-mannosidase of T. harzianum gene was cloned into the pRS426 vector, and the deletion cassette was assembled by the recombination technique in Saccharomyces cerevisiae. Then, these vectors were used for transformation of T. harzianum and transformants were obtained by selection on plates containing hygromycin b. Approximately 50 transformants were obtained, but none of the alpha-mannosidase gene was successfully deleted. Obtaining more transformants is necessary for us to have a mutant alpha-mannosidase gene deleted. / Fungos do gênero Trichoderma têm se destacado como agentes de controle biológico, principalmente aqueles pertencentes à espécie Trichoderma harzianumcom vários mecanismos envolvidos incluem produção de antibióticos, micoparasitismo, competição por nutrientes e indução de resistência da planta hospedeira. Micoparasitismo é um processo sequencial que envolve reconhecimento do hospedeiro, contato, adesão, expressão de genes específicos e secreção de metabólitos secundários. Várias enzimas hidrolíticas estão envolvidas neste processo dentre elas quitinases, beta-glucanases e proteases. Estudos recentes de interação de T. harzianum com alguns fitopatógenos tem demonstrado que outras enzimas podem também estar envolvidas neste mecanismo, dentre elas as alfamanosidases. As alfa-manosidases tem um papel fundamental na reciclagem de glicoproteínas em fungos filamentosos, mas pouco se sabe sobre o papel destas enzimas no micoparasitismo. Este trabalho tem como objetivo a caracterização da expressão do gene de alfa-manosidase de T. harzianumapós crescimento em parede celular de Sclerotinia sclerotiorum (SS), Fusarium solani (FS) e Fusarium oxysporum (FO), bem como durante a interação in vivo. Como controle foi utilizado parede celular de T. harzianum (TH). Além disto, trabalhos de obtenção de mutantes deste gene em T. harzianum foram realizados. Nossos dados mostraram que o gene de alfa-manosidase foi altamente expresso quando T. harzianum cresceu na presença de parede celular de SS (4.5X), FS (18X) e FO (75X) quando comparado com o controle TH (1X). Em situação de confronto foi observado uma expressão de 75X maior na situação TH x FO durante o contato, quando comparado com o controle (TH x TH). Na outras situações de confronto não observamos um aumento significativo de expressão. A região promotora, a marca de seleção e a região terminadora do gene da alfa-manosidase de T. harzianumfoi clonado no vetor pRS426 e o cassete de deleção foi montado através da técnica de recombinação em Saccharomyces cerevisiae . Em seguida, estes vetores foram utilizados para a transformação de T. harzianume os transformantes foram obtidos por seleção em placas contendo higromicina b. Aproximadamente 50 transformantes foram obtidos, mas em nenhum deles o gene da alfa-manosidase foi deletado com sucesso. A obtenção de mais transformantes se faz necessário para que possamos ter um mutante com o gene da alfa-manosidase deletado.

Colletorichum acutatum é o agente causal da Podridão Floral dos Citros (PFC), doença que em determinadas condições ambientais constitui-se em fator limitante à produção citrícola em várias regiões produtoras do mundo. Além da PFC, esse fungo causa antracnose em outros hospedeiros, sendo um dos patógenos que mais acarreta danos em frutíferas tropicais, subtropicais e temperadas no mundo. O trabalho teve como objetivos estudar a especificidade patogênica e compatibilidade vegetativa entre isolados de C. acutatum dos citros e de outros hospedeiros como: goiaba, pimentão, morango e pêssego. Para os estudos de especificidade patogênica, foram realizadas inoculações cruzadas entre isolados de citros e dos outros hospedeiros visando verificar se os diferentes isolados são capazes de causar sintomas de PFC em flores de citros e antracnose em frutos. Foram também obtidos, a partir dos mesmos isolados, mutantes deficientes na absorção de nitrogênio (mutantes nit). Esses foram caracterizados fenotipicamente e pareados a fim de verificar por meio de estudos de compatibilidade vegetativa a capacidade de recombinação entre si, gerando heterocários com patogenicidade alterada. Para verificar a ocorrência de possíveis alterações na patogenicidade dos heterocários formados, foi feita a inoculação dos heterocários e dos isolados parentais nos seus respectivos hospedeiros de origem. Nos ensaios de inoculação cruzada, houve grande variação quanto à patogenicidade dos isolados inoculados. Isolados provenientes de citros e de goiaba causaram lesões em flores de citros, isso demonstra a ausência de especificidade entre isolados dos dois hospedeiros. Porém, isolados provenientes de pimentão, pêssego e morango não foram capazes de causar sintomas em flores de citros o que indica a existência de especificidade desses isolados. Os isolados provenientes dos citros e de outros hospedeiros foram capazes de causar antracnose em goiaba, morango e pêssego, mas apenas os isolados de pimentão causaram antracnose em pimentão. Alguns isolados de citros foram capazes de recombinar entre si e com isolados de goiaba, pimentão e morango. Dos heterocários formados, dois foram caracterizados quanto a sua patogenicidade, Het 3 e Het 5. Como resultado, o heterocário proveniente do isolado de citros com goiaba (Het 5) comportou-se de forma semelhante à um de seus parentais. O heterocário proveniente de citros com pimentão (Het 3), mostrou-se mais agressivo do que seus parentais quando inoculados em pimentão. Com esses estudos pode-se concluir que existe especificidade patogênica entre isolados de C. acutatum de diferentes hospedeiros, entretanto, isolados de diferentes hospedeiros podem recombinar entre si e gerar heterocários com características patogênicas alteradas. / Colletorichum acutatum is the causal agent of postbloom fruit drop (PFD).This disease is a limiting factor for citrus production under specifics environmental conditions in several regions of the world. In addition to the PFD, this fungus causes anthracnose on other hosts. It is one of the pathogens that cause more damage in tropical, subtropical and temperate fruit around the world. This work aimed to study the specificity pathogenic and vegetative compatibility among isolates of C. acutatum from citrus and other hosts: guava, pepper, strawberry and peach. For studies of pathogenic specificity, cross inoculations were performed among isolates from citrus and other hosts in order to verify whether different strains are capable of causing symptoms of PFD in citrus flowers and fruit anthracnose. Furthermore, it was obtained from the same isolates, nitrate-nonutilizing mutants (nit mutants). They were phenotypically characterized and paired to verify, by means of vegetative compatibility studies, the ability of recombination between them, generating heterokaryons with altered pathogenicity. In order to verify the occurrence of possible changes in the pathogenicity of the heterokaryons formed, parental isolates and heterokaryons were inoculated in their respective original hosts. In cross-inoculation tests, there was a great variation in the isolates pathogenicity. Isolates from citrus and guava caused lesions on citrus blossoms; this demonstrates the absence of pathogenic specificity between isolates of the two hosts. However, isolates from pepper, peach and strawberry were unable to induce symptoms on citrus flowers showing the existence of specificity of these isolates. The strains from citrus and other hosts were able to cause anthracnose on guava, strawberry and peach, but only isolates of pepper caused anthracnose on pepper. Some isolates from citrus were able to recombine among themselves and with isolates from guava, peppers and strawberries. From the heterokaryons obtained, two of them had their pathogenicity characterized: Het 3 and Het 5. As a result, the heterokaryon derived from citrus and guava (Het 5) behaved similarly to one of their parental isolates. The heterokaryon derived from citrus and pepper (Het 3) was more aggressive than their parental isolates when inoculated in pepper. With these results we can conclude that there is specificity between pathogenic strains of C. acutatum from different hosts. However, isolates from different hosts can recombine with each other and generate heterokaryons with altered pathogenic characteristics.