Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 567180 bytes, checksum: c6e7ebd48ed3a1d70a13bb1e86f0d3a6 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alternative methods that use a combination of nematophagous fungi associated with organic mineral fertilizer have been little used and shall be studied further, since they present potential for nematode control in addition to supplement fertility and improve soil biota. Moreover, there is a growing demand of the society, which has become more demanding on the use of management practices more environmentally appropriate. Thus, the objective of this work was to test the compatibility of an organic mineral fertilizer based on castor bean cake to Pochonia chlamydosporia for the control of Meloidogyne javanica in lettuce. Two tests were performed to study the viability of P. chlamydosporia in Rizomax (which contains fungus P. chlamydosporia), and UFV-TM100 (organic mineral fertilizer) with or without addition of water. One hundred grams of UFV-TM100 and 1 g of Rizomax were placed in a 3-L plastic bag with no addition of water. The bag was sealed and vigorously shaken until homogenization of the mixture and kept in a closed room. The determination of the CFU of P. chladoutmydosporia was carried out on days 0, 15, 30 and 45 both in pure Rizomax and Rizomax + UFV-TM100. The same methodology was used in the second test, but with the addition of water in the mixture and determination of CFU of P. chlamydosporia was carried out on days 0, 7 and 14. The number of CFU of P. chlamydosporia did not increase within the addition of water in Rizomax in the assessed period; however, the number of CFU was reduced by 27, 54 and 100% in the Rizomax + UFV-TM100 on days 0, 7 and 14, respectively, for the product Rizomax. The number of CFU of P. chlamydosporia in Rizomax did not decrease in the test with no addition of water, but the number of P. chlamydosporia in Rizomax + UFV-TM100 was reduced by 30% on day 45 in comparison to day 0, 15 and 30. A third test was conducted to study the colonization by P. chlamydosporia in a substrate in the presence of UFV-TM100. One litter of substrate was poured in a 5-L plastic bag containing 18 g of UFV- TM100 and 0.18 g of Rizomax. The bag was sealed and shaken vigorously for two minutes to homogenize the mixture, which was distributed into three 200 mL plastic glasses. A second treatment, with no UFV-TM100, was used to evaluate the development of P. chlamydosporia in the absence of UFV-TM100. The substrate in each of the plastic glass was kept moist and samples were taken on days 0 and 14 to determine the number of CFU of P. chlamydosporia. The CFU number of P. chlamydosporia did not differ between Rizomax and Rizomax + UFV-TM treatments in the evaluation periods but the CFU number for P. chlamydosporia was 61% higher on day 14 than on day 0. A forth test was carried out to study the effect of the doses of Rizomax on the growth of lettuce and on the development of M. javanica. Plastic pots containing 2 L of substrate received 36 g of UFV - TM100, and after 15 days, lettuce seedlings at 21 days of age were transplanted. Rizomax was added together with TM100-UFV at doses of 0, 0.36 and 0.45 g/kg substrate, which corresponded to 0, 1, and 1.25% Rizomax . The substrate in each pot was infested with 5,000 eggs of M. javanica on same day of incorporation of UFV- TM100 and Rizomax incorporation. The same doses of Rizomax , but in the absence of UFV - TM100 were tested as control treatment. Sixty days after transplanting, the diameter of the head of lettuce (cm) , the fresh matter weight , the dry matter weight, the fresh root system weight, the number of galls and eggs of M. javanica per gram of root system were evaluated. The diameter of the head of the lettuce, the weight of the shooting fresh matter and the weight of shooting dry matter increased by 41, 44 and 29% , respectively, in the presence of UFV-TM100. The number of gals and eggs per gram of root system was reduced up to 99% when UFV-TM100 + Rizomax were applied at the dose of 1.25%. The application of Rizomax in the absence of UFV-TM100pla root system and the numb also reduced the number of galls per root system and the number of galls per gram of root system, with reductions of up to 50 and 60%, respectively. Therefore, the use of organic mineral fertilizer with the addition of a biological control agent is an efficient alternative to the control of nematodes, in addition to improve plant development. / Métodos alternativos, utilizando a combinação de fungos nematófagos associados a um adubo organomineral têm sido pouco utilizados e devem ser mais estudados, visto que apresentam potencial de controle dos nematoides, além de suplementar a fertilidade e favorecer a biota do solo. Alia-se à isso a demanda crescente da sociedade, que está mais exigente quanto à utilização de práticas de manejo mais ecologicamente adequadas. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi testar a compatibilidade de um fertilizante organomineral à base de torta de mamona com o fungo Pochonia chlamydosporia, visando o controle de Meloidogyne javanica em alface. Dois testes foram realizados para estudar a viabilidade de P. chlamydosporia nos produtos Rizomax (contém o fungo P. chlamydosporia), e UFV-TM100 (fertilizante organomineral), com e sem adição de água. Foram colocados em saco plástico de 3 L, 100 g de UFV-TM100 e 1 g de Rizomax, sem adição de água. O saco foi fechado e agitado vigorosamente até homogeneização da mistura e mantido em uma sala fechada. A determinação do número de UFC de P. chlamydosporia foi realizada aos 0, 15, 30 e 45 dias, tanto no produto Rizomax puro como na mistura Rizomax + UFV-TM100. Para o segundo teste foi utilizada a mesma metodologia, porém com adição de água e a determinação do número de UFC de P. chlamydosporia foi realizada aos 0, 7, e 14 dias. No teste com adição de água não houve decréscimo do número de UFC de P. chlamydosporia no produto Rizomax no período estudado, porém o número de UFC de P. chlamydosporia na mistura Rizomax + UFV-TM100 foi reduzido em de 27, 54 e 100%, respectivamente, aos 0, 7 e 14 dias em relação ao produto Rizomax. No teste sem adição de água não houve decréscimo do número de UFC de P. chlamydosporia no produto Rizomax no período estudado, porém o número de UFC de P. chlamydosporia na mistura Rizomax + UFV-TM100 foi reduzido em 30% aos 45 dias em relação aos 0, 15 e 30 dias. Um terceiro teste foi realizado com objetivo de estudar a colonização de um substrato por P. chlamydosporia na presença do UFV-TM100. Um litro de substrato foi colocado em um saco plástico de 5 L contendo 18 g de UFV-TM100 e 0,18 g de Rizomax. O saco foi fechado e agitado vigorosamente por dois minutos para homogeneizar a mistura, a qual foi distribuída em três copos plásticos de 200 mL de capacidade cada. Um segundo tratamento, sem UFV-TM100, foi utilizado para avaliar o desenvolvimento de P. chlamydosporia na ausência do UFV-TM100. O substrato em cada copo plástico foi mantido úmido e amostras foram retiradas aos 0 e 14 dias para determinar o número de UFC de P. chlamydosporia. Não houve diferença no número de UFC de P. chlamydosporia entre os tratamento Rizomax e Rizomax + UFV-TM no períodos de avaliação, porém o número de UFC de P. chlamydosporia foi 61% maior aos 14 dias com relação ao 0 dia. Um quarto teste foi realizado para estudar o efeito das doses do produto Rizomax nas variáveis de crescimento da alface e no desenvolvimento de M. javanica. Vasos plásticos contendo 2 L de substrato receberam 36 g de UFV- TM100 e, após 15 dias, mudas de alface com 21 dias de idade foram transplantadas. Juntamente com o UFV-TM100, adicionou-se o produto Rizomax nas doses de 0, 0,36 e 0,45 g/2 Kg de substrato, as quais corresponderam a 0, 1 e 1,25% de Rizomax. O substrato em cada vaso foi infestado com 5000 ovos de M. javanica no mesmo dia da incorporação do UFV-TM100 e Rizomax. Como tratamento testemunha, foram testadas as mesmas doses de Rizomax, porém na ausência do UFV-TM100. Após 60 dias do transplantio, avaliou-se o diâmetro da cabeça da alface (cm), o peso da matéria fresca, o peso da matéria seca, o peso do sistema radicular fresco, o número de galhas e de ovos de M. javanica por sistema radicular e o número de galhas e de ovos de M. javanica por grama de sistema radicular. Na presença do produto UFV-TM100 houve aumento de 41, 44 e 29% no diâmetro da cabeça da alface, no peso da matéria fresca da parte aérea e no peso da matéria seca da parte aérea, respectivamente. O número de galhas e ovos pos grama de sistema radicular sofreram reduções de até 99% quando aplicado o UFV- TM100 + Rizomax na dose de 1,25%. A aplicação do Rizomax na ausência do UFV- TM100 também reduziu o número de galhas por sistema radicular e número de galhas por grama de sistema radicular, com reduções de 50 e 60%, respectivamente. Assim, na aplicação do fertilizante organomineral com a adição de um agente de controle biológico é uma alternativa eficiente de controle de nematoides, além de aumentar o desenvolvimento das plantas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2563568 bytes, checksum: e5cef4ec163c1c100192c5a2bbc10855 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / The foliar anthracnose of rubber tree causes necrotic lesions and wrinkling of the leaflets, which can lead to premature defoliation, reducing leaf area. Since the first reports of occurrence of anthracnose, several species of Colletotrichum have been listed as its purported causal agent. However, in Brazil, no study has been conducted for this purpose. For this reason, the objectives of the present study were: to generate information about the identity of the causal agent of foliar anthracnose of rubber tree by morphological and molecular phylogenetic analyses; and to develop procedures for the molecular diagnosis of Colletotrichum spp. associated with the disease. Isolates belonging to three complexes of Colletotrichum species were found: C. acutatum complex; C. gloeosporioides complex; and C. boninense complex. Primers were designed based on the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) region which allowed the amplification of specific bands for Colletotrichum associated with each of the three species complexes. / Os sintomas da antracnose foliar da seringueira são tipicamente lesões necróticas que podem causar o enrugamento dos folíolos e, em etapas avançadas, a desfolha prematura, reduzindo a área foliar. Desde o relato inicial da doença, várias espécies de Colletotrichum são mencionadas como sendo o agente etiológico. No Brasil, até o momento, nenhum estudo foi realizado com o propósito de identificar as espécies associadas à antracnose foliar da seringueira. Por essa razão, estabeleceu-se como objetivo gerar informações acerca da natureza do agente etiológico da antracnose da seringueira, mediante caracterização morfológica e análises filogenéticas moleculares. Outro objetivo foi desenvolver procedimento para o diagnóstico molecular de Colletotrichum spp. associadas à seringueira. Isolados de Colletotrichum spp. foram obtidos de folhas de seringueira, diferentes regiões genômicas foram sequenciadas e as principais características morfológicas de relevância taxonômica foram estudadas. Isolados pertencentes a três complexos de espécies de Colletotrichum foram identificados: complexo C. acutatum; complexo C. gloeosporioides; e complexo C. boninense. Primers desenhados com base na região que codifica para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) permitiram a amplificação de bandas específicas para os isolados de Colletotrichum associados a cada um dos três complexos de espécies mencionados.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1312640 bytes, checksum: f59984d596fc23251bdcc4b712cc574a (MD5) Previous issue date: 2014-07-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Rust fungi are obligate parasites that secrete diverse proteins during their interaction with host plants. These proteins promote parasitism by manipulating the host metabolism and interfering with its defense responses. Effector proteins can be recognized by proteins coded by plant resistance genes, in which case they are called avirulence proteins. Six loci containing genes that confer varying degrees of resistance to P. pachyrhizi (Rpp) have been reported, and several genes encoding proteins secreted by the fungus have been identified. However, effector proteins (Avr proteins) recognized by soybean Rpp proteins have not yet been identified. Thus, the objective of this study was to identify proteins secreted by P. pachyrhizi (PPUFV02) able to activate or suppress defense responses in soybean, through the functional analysis of ten candidate effector genes using the TTSS of P. savastanoi pv. glycinea 1462 (EDV system). Among the ten effectors tested in 11 soybean genotypes resistant to the mono-pustule isolate PPUFV02 of P. pachyrhizi, source of candidate genes, PHPA_RSP_71 stood out for contributing to greater disease severity in genotype PI 594538- A and lower in genotype PI 594754. The PHPA_RSP_23 effector was also interesting for additional functional studies on soybean and tobacco, since the results indicated a possible activation of defense response in soybean, in general (all genotypes), and a possible suppression of cell death in tobacco. The effector activity of these candidate genes was not confirmed by analysis of bacterial growth in soybean and tobacco (non-host plant). On the other hand, it is possible that these effects are due to an interference of the effector with the function of the TTSS, making it necessary to conduct protein secretion assays to confirm or reject these hypotheses. Overall, the genotype Williams 82 showed resistance to Psg 1462 and can be used as negative control for disease in functional analysis in soybean. It was not possible to confirm N. benthamiana as an appropriate plant for functional studies of induction/suppression of HR when using Psg 1462, since it is possible that the bacterial isolate is pathogenic to this species. The pEDV6 vector in general was stable in the Psg1462(pEDV6::PHPA_RSP) clones and did not alter the ability of the bacteria to multiply in planta, confirming the EDV as a good system for functional analysis of P. pachyrhizi candidate effector genes in soybean using TTSS of Psg 1462. The inoculation method by dipping was not suitable for functional analysis in soybean because, in general, showed highly variable results. The inoculation method by vacuum was the best suited for this purpose, since it introduced greater uniformity in the severity of symptoms observed. / Os fungos causadores de ferrugens são parasitas obrigatórios que secretam diversas proteínas durante sua interação com plantas hospedeiras. Essas proteínas promovem o parasitismo por meio da manipulação do metabolismo do hospedeiro e interferência em suas respostas de defesa. As proteínas efetoras podem ser reconhecidas pelas proteínas codificadas pelos genes de resistência da planta, sendo, neste caso, denominadas proteínas de avirulência. Seis locos contendo genes que proporcionam diferentes graus de resistência à P. pachyrhizi (Rpp) já foram relatados e vários genes que codificam proteínas secretadas por esse fungo já foram identificados. No entanto, ainda não foram identificadas as proteínas efetoras (proteínas Avr) reconhecidas pelas proteínas Rpp de soja. Desse modo o objetivo deste trabalho foi identificar proteínas secretadas por P. pachyrhizi (PPUFV02), capazes de ativar ou suprimir respostas de defesa em soja, através de uma análise funcional de 10 genes candidatos a efetores, utilizando o SST3 de P. savastanoi pv. glycinea 1462 (sistema EDV). Dos dez efetores testados nos 11 genótipos de soja resistentes ao isolado monopostular de P. pachyrhizi PPUFV02, fonte dos genes candidatos, PHPA_RSP_71 se destacou por contribuir para uma maior severidade da doença no genótipo PI 594538-A e menor no genótipo PI 594754. O efetor PHPA_RSP_23 também se mostrou interessante para novos estudos funcionais em soja e tabaco, uma vez que os resultados indicaram possível ativação de resposta de defesa em soja de forma geral (em todos os genótipos) e possível supressão de morte celular em tabaco. A atividade efetora desses genes candidatos não foi confirmada pela análise de crescimento bacteriano em soja e em tabaco (planta não hospedeira). Por outro lado, há uma possibilidade de esses efeitos serem devido a uma interferência do efetor com a funcionalidade do SST3, necessitando-se de estudos de secreção da proteína para confirmar ou refutar estas hipóteses. De forma geral o genótipo Williams 82 se mostrou resistente à Psg 1462, podendo ser utilizado como controle negativo para doença nas análises funcionais. Não foi possível confirmar N. benthamiana como uma planta adequada para estudos funcionais de indução/supressão de HR ao se utilizar Psg 1462, uma vez que é possível que este isolado bacteriano seja patogênico a esta espécie. O vetor pEDV6 de forma geral apresentou estabilidade nos clones Psg1462(pEDV6::PHPA_RSP) e não alterou a capacidade de multiplicação da bactéria in planta, confirmando o EDV como um bom sistema para análise funcional de genes de P. pachyrhizi candidatos a efetores em soja, utilizando o SST3 de Psg 1462. O método de inoculação por mergulho não se mostrou adequado para as análises funcionais em soja, uma vez que apresentou de forma geral alta variabilidade nos resultados, sendo o método de inoculação a vácuo mais indicado para este fim por ter apresentado maior uniformidade na severidade dos sintomas observados.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1631185 bytes, checksum: 1a2583b9096adafba72549267dc3ce2e (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Asian soybean rust (ASR) caused by Phakopsora pachyrhizi fungus is the most important fungal disease that threatens soybean cultivation. Nowadays the main disease control procedure is administering fungicides from the triazole and strobilurin groups. However, using rust resistant or tolerating varieties is the best alternative for controlling the disease, as it reduces production costs, facilitates dealing with the disease and reduces possible environmental impact caused by usage of fungicides. Until now, five genes were identified in soybean (Rpp1 to 5) that are resistant to P. pachyrzi. However, there are new accesses that feature resistance and which inheritance is unknown. The objective of this work was studying the resistance inheritance of the PI 587905 access to the monopustular isolate PPUFV02 and demonstrating its relationship of the identified gene(s) to already described genes through genetic mapping by using microsatellite markers. A segregating F2 population was obtained for resistance by crossing access PI 587905 with the susceptible cultivar Conquista; this population was made of five subpopulations (23C 1 to 5) from different F1 plants. Plants from 23C-1 F2 population were inoculated in the V2-V3 stage in controlled conditions, with monopustular isolate PPUFV02 of P. pachyrizi and evaluated eight, ten, twelve and fourteen days after inoculation. Segregation pattern indicated that resistance is governed by a gene with partial dominance (χ2 = 1.86 p= 39.48%). Analysis with microsatellite markers indicated that the resistance gene is located in the linkage group G (LG-G) in the interval Sct_187-Sat_064 that contains the Rpp1 locus, suggesting that the resistance gene in access PI 587905 is a part of Rpp1 gene or another linked gene. Subpopulations 23C-2 to 5 were planted with the purpose of obtaining more plants with informative recombination events between the loci Sct_187 and Sat_064. Fenotyping of these plants was made in an identical way to the 23C-1 subpopulation; however genotyping was performed only in susceptible plants. From the group analysis of all subpopulations four F2 plants were obtained. They featured informative recombination events between the loci Sct_187 and Sat_064. Those can be used for deep mapping in this region, aiming to precisely locate the resistance gene and its future positional cloning. Markers Sct_187r2 and Sat_064 will also be suitable for use in assisted selection programs with molecular markers aiming introgression of the resistance gene in PI 587905 and its pyramid connection with other genes resistant to ASR in commercial soybean cultivars. / A ferrugem asiática da soja (FAS) causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi é a principal doença fúngica da cultura da soja. Atualmente a principal medida de controle da doença é a aplicação de fungicidas dos grupos dos triazóis e estrobilurinas. Todavia, a utilização de variedades resistentes ou tolerantes à ferrugem é a melhor alternativa para o controle da doença, por reduzir os custos de produção, facilitar o manejo da doença e reduzir os possíveis impactos ao ambiente ocasionados pelo uso de fungicidas. Na soja, até o momento, foram identificados cinco genes (Rpp1 a 5) de resistência a P. pachyrhizi. Contudo, existem novos acessos que apresentam resistência à FAS e cuja herança não é conhecida. Este trabalho teve por objetivo estudar a herança da resistência do acesso PI 587905 ao isolado monopustular PPUFV02 e demonstrar a relação do(s) gene(s) identificado(s) com os genes já descritos, por meio do mapeamento genético, utilizando marcadores microssatélites. Foi obtida uma população segregante F2 para a resistência pelo cruzamento do acesso PI 587905 com a cultivar suscetível Conquista. Essa população foi constituida de cinco subpopulações (23C- 1 a 5) oriundas de plantas F1 distintas. As plantas da subpopulação 23C-1 F2 foram inoculadas no estágio V2-V3, em condições controladas, com o isolado monopustular PPUFV02 de P. pachyrhizi, e avaliadas aos oito, dez, doze e quatorze dias após a inoculação. O padrão de segregação obtido revelou que a resistência é governada por um gene com dominância parcial (χ2= 1,86 p= 39,48%). As análises com marcadores microssatélites revelaram que o gene de resistência está localizado no grupo de ligação G (LG-G), no intervalo Sct_187- Sat_064 que contém o loco Rpp1, sugerindo que o gene de resistência do acesso PI 587905 é um alelo do gene Rpp1 ou de um novo gene ligado. As subpopulações 23C-2 a 5 foram plantadas com o intuito de se obterem mais plantas com eventos de recombinação informativos entre os locos Sct_187 e Sat_064. A fenotipagem dessas plantas foi realizada de maneira idêntica à da subpopulação 23C-1, contudo foi realizada a genotipagem apenas das plantas suscetíveis. Da análise conjunta de todas as subpopulações foram obtidas quatro plantas F2 que apresentaram eventos de recombinação informativos entre os locos Sct_187 e Sat_064, que podem ser utilizadas para o mapeamento fino nessa região, visando à localização precisa do gene de resistência e sua futura clonagem posicional. Os marcadores Sct_187r2 e Sat_064 também poderão ser utilizados em programas de seleção assistida por marcadores moleculares visando à introgressão do gene de resistência do PI 587905 e à sua piramidação com outros genes de resistência à FAS em cultivares comerciais de soja.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2830202 bytes, checksum: 646d57cf2258798f7f8bcfe375e2b6ab (MD5) Previous issue date: 2009-03-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Hydnangium sp. is a basidiomycetous fungus that is capable of forming ectomycorrhiza with Eucalyptus species. The in vitro mycorrhization system is widely used for mycorrhizal interactions studies, becoming a simple and reproducible system for the symbiosis-regulated genes expression analysis. In this work, the in vitro mycorrhization system for the Hydnangium sp. and Eucalyptus grandis interaction was performed for the colonization, differentiation and functioning phases for the ectomicorriza formation. The colonization phase were verified after five days of inoculation with the Hydnangium sp., the differentiation phase after ten days and the functioning phase after 20 days of inoculation. The extern morphology was analyzed by stereomicroscopy and the section microscopy was performed for the mantle and Hartig net detection. The total RNA extraction was performed for each phase, with the objective of to analyze genes expression. However, the material quantity from roots of 130 seedlings for each phase was insufficient for the transcripts detection through RTPCR. The intron analysis of the partial sequences of the genes that encode ATP sintase (atp) and acetyl-CoA acetyltransferase (aat) of Hydnangium sp. enabled two introns identification in partial sequence of atp gene (53 and 65 bp), while in partial sequence of aat gene were identified three introns (52, 52 e 46 bp). All introns analyzed have the canonical sequence 5 GT 3 AG on splicing sites, ranging the adjacent nucleotides. The phylogenetic analysis, using the partial sequences of amino acids of atp and aat genes, enabled the correct group separation, corroborating the Hydnangium sp. classification as belonging the same family of Laccaria bicolor. / Hydnangium sp. é um fungo basidiomiceto capaz de formar ectomicorriza com espécies de Eucalyptus. Os sistemas de micorrização in vitro vêm sendo largamente utilizados para estudar interações micorrízicas, tornando-se um sistema simples e reproduzível para as análises de expressão de genes envolvidos na interação. Neste trabalho, a técnica de micorrização in vitro para a interação do fungo Hydnangium sp. com E. grandis foi realizada para as fases de colonização, diferenciação e funcionamento da ectomicorriza. A fase de colonização foi verificada após cinco dias de inoculação com Hydnangium sp., a fase de diferenciação após 10 dias e a fase de funcionamento após 20 dias de inoculação. A morfologia externa foi analisada por lupa e foram avaliados cortes microscópicos para a detecção do manto e da rede de Hartig. A extração de RNA total foi realizada para cada uma das fases, com o objetivo de analisar a expressão gênica. Entretanto, a quantidade de material proveniente de raízes de 130 plântulas para cada fase, foi insuficiente para a detecção de transcritos por meio de RTPCR. A análise dos íntrons das seqüências parciais dos genes que codificam ATP sintase (atp) e acetil-CoA acetiltransferase (aat) de Hydnangium sp. permitiu a identificação de dois íntrons na seqüência parcial do gene atp (53 e 65 pb), enquanto que na seqüência parcial do gene aat foram identificados três íntrons (52, 52 e 46 pb). Todos os íntrons analisados possuem a seqüência padrão 5 GT 3 AG no sítio de processamento, variando os nucleotídeos adjacentes. A análise filogenética, utilizando as seqüências parciais de aminoácidos deduzidas dos genes atp e aat, permitiu a separação correta dos grupos, corroborando a classificação do fungo Hydnangium sp. como pertencente à mesma família de Laccaria bicolor.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1109551 bytes, checksum: 5f0d13927b00626f1a0d15b78536b7bc (MD5) Previous issue date: 2009-07-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / This is the first study of genetic diversity of the Archaea community associated to coffee fruits (Coffea arabica L.). It was performed in cherry coffee fruits of cultivars Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho and Catucaí Vermelho in different altitudes. The archaeal diversity during natural drying of depulped grains in cement covered yard was also studied. The addition of proteases during the coffee fruits metagenomic DNA extraction cell lysis step provided better recovery of DNA from Archaea. Comparing different hypervariable regions of 16S rDNA by DGGE (Denaturing Gradiente Gel Electrophoresis), the highest diversity resolution was obtained with the V3 region, for the cultivar Catucaí Vermelho at an altitude of 936m. The Archaea endophytic community analysis in four C. arabica cultivars revealed varied genotypic profiles among the samples. Three samples that showed distinct DGGE profiles were chosen for 16S rDNAs libraries construction. Sequencing of 63 clones revealed 12 OTUs and the prevalence of sequences related to Euryarchaeota phylum, mainly the halophylic genera Halobacterium, Halococcus, and Haloferax. Sequences with high identity with Methanobrevibacter, with the thermophilic Thermoplasma, and sequences related to uncultivated Archaea from marine environment were also found in the Euryarchaeota phylum. Of the four sequences belonging to the Crenarchaeota phylum, three phylogenetically clustered with uncultivated archaea from soil, and one with sequences from a marine environment. Rarefaction curve analysis and the estimated Coberture pointed out that the libraries constructed were large enough to cover the most of Archaea diversity in cherry coffee. The archaeal diversity study during natural drying revealed higher increase in OTUs number beginning at the seventh day up to the last day. Cluster analysis of DGGE fingerprints distinguished the population of the first days of drying from those in the last ones. The absence of physiological studies of uncultivable Archaea, especially in mesophilic environments, limits the knowledge of metabolism of these microorganisms and the determination of endophytes role in coffee fruits. Although, metagenomic studies of microbial community associated to coffee fruits will help to identify archaeal genes and establish relations among the presence of certain microorganisms and precursors of those compounds that make up the aroma and the flavor in the final quality of the beverage. / Este é o primeiro estudo de diversidade genética da comunidade de Archaea associada a frutos de café (Coffea arabica L.). Ele foi realizado em amostras de frutos no estádio cereja das cultivares Bourbon Amarelo, Bourbon Vermelho, Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho e Catucaí Vermelho, em diferentes altitudes. A diversidade de arqueas presentes durante a secagem natural de grãos despolpados em terreiro revestido com cimento também foi estudada. A adição de proteases durante a etapa de lise celular para extração de DNA metagenômico de frutos de café propiciou melhor recuperação de DNA de Archaea. A maior resolução da diversidade na comparação de diferentes regiões hipervariáveis do rDNA 16S por DGGE foi obtida quando se utilizou a região V3 para a amostra da cultivar Catucaí Vermelho em altitude de 936m. A análise da comunidade endofítica de Archaea em quatro cultivares de C. arabica revelou um variado perfil genotípico entre as amostras. Três amostras que apresentaram perfis de DGGE distintos entre si foram escolhidas para construção de bibliotecas de rDNAs 16S. O sequenciamento de 63 clones revelou a existência de 12 UTOs e a prevalência de sequências relacionadas ao filo Euryarchaeota, principalmente de arqueas halofílicas dos gêneros Halobacterium, Halococcus e Haloferax. Ainda no filo Euryachaeota, foram identificadas sequências com alta identidade com Methanobrevibacter, com a hipertermófila Thermoplasma e com sequências relacionadas à arqueas não cultiváveis de ambiente marinho. Das quatro sequências pertencentes ao filo Crenarchaeota, três agruparam filogeneticamente com sequências de arqueas não cultiváveis do solo, e uma com sequências de ambiente marinho. A análise das curvas de rarefação e o cálculo das coberturasmostraram que as bibliotecas construídas foram grandes o suficiente para cobrir a maior parte da diversidade de Archaea presentes em frutos de café cereja. No estudo da diversidade de Archaea durante a seca natural observou-se um aumento do número de UTOs a partir do sétimo dia,permanecendo até o último dia do processo. A análise de agrupamento dos perfis distinguiu as populações presentes nos dias finais de secagem. A ausência de estudos fisiológicos de arqueas não cultiváveis, especialmente de ambientes mesófilos, limita o conhecimento do metabolismo destes micro-organismos e a determinação do papel das endofíticas dos frutos de café. Contudo, estudos metagenômicos da comunidade microbiana associada a frutos de café ajudarão a identificar genes de Archaea e a estabelecer relações entre a presença de determinados micro- organismos e de compostos precursores daqueles que compõe o aroma e sabor na qualidade final da bebida.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 482532 bytes, checksum: 1c1dce279e9ef945c0bd479992a99516 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The hemibiothrophic basidiomycete Moniliophthora perniciosa, the causal agent of witche's broom disease in cocoa (Theobroma cacao), presents different transposable elements in its genome. A transposable element of Class II belonging to the super-family PIF/Harbinger, named Boto, had been partially characterized in previous studies. The element Boto, as well as other elements PIF/Harbinger, presents two ORFs (ORF 1 and ORF 2). OFR 2 codifies the transposase while ORF 1 codifies one protein which function is unknown. The aim of this work was to prove the Boto element activity and characterize the ORF 1. For assure the activity of the transposable element Boto in the genome of M pernicious was carried out the evaluation of the integration profile in isolates resultants of sexual cycle. Three of such isolates showed variation in the copy number of transposable element Boto, proving Boto activity. Furthermore, PCR reactions were carried out for detection of insertion sites of this element in different isolates. Among the 28 isolates used in this experiment, 14 showed amplification products with expected size. The products of amplification of two isolates, randomly chosen, were cloned and sequenced. The analysis of the obtained sequences showed that in both isolated sequenced the element Boto did not transpose for the insertion site analyzed in the M. perniciosa genome. It proves the activity of this element in the genome of M. perciciosa, because, in the isolated used as reference for this study, the Boto element was inserted in that position. In the in silico analysis of the ORF 1 sequence, the presence of two possible introns was verified, one containing 55 pb and another 48 pb. This sequence codifies a protein of 422 amino acids residues. To demonstrate the presence of the two introns, experiments of RT-PCR were carried out using two oligonucleotides groups. Amplified products obtained, when cDNA was used as template of PCR reaction, were cloned and sequenced, being confirmed the position and the size of the two predicted introns. Analysis of RT-PCR also showed that this ORF is expressed even in normal conditions of cultivation of the fungi, what is important for activity of this element, since other studies showed that the expression of this ORF is fundamental to the transposition of elements PIF/Harbinger. The results of this work showed that Boto is active in the M. perniciosa genome and it can have an important role as generating agent of genetic variability in this phytopathogen. It is worth to emphasize that this is the first description of an element of the superfamily PIF/Harbinger that presents two introns in ORF 1. / O basidiomiceto hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao) apresenta diferentes elementos transponíveis em seu genoma. Um elemento transponível da Classe II pertencente à superfamília PIF/Harbinger, denominado Boto, foi parcialmente caracterizado em estudos anteriores. O elemento Boto, assim como os demais elementos PIF/Harbinger, apresenta duas ORFs (Open Reading Frame), uma que codifica a transposase e outra, denominada ORF 1, cuja seqüência de aminoácidos deduzida representa uma proteína de função é desconhecida. Este trabalho foi conduzido com o objetivo de comprovar a atividade de Boto e caracterizar a ORF 1. Para a confirmação da atividade do elemento transponível Boto no genoma de M. perniciosa realizou-se a avaliação do perfil de integração em isolados resultantes do ciclo sexual, isto é, obtidos a partir da germinação de basidiósporos. Três isolados apresentaram variação no número de cópias, demonstrando a atividade de Boto. Foi realizado PCR para detecção dos sítios de inserção deste elemento em diferentes isolados. Dentre os 28 isolados utilizados no experimento, 14 apresentaram produtos de amplificação com o tamanho esperado. Os produtos de amplificação de dois isolados, escolhidos aleatoriamente, foram clonados e seqüenciados. Na análise das seqüências obtidas, verificou-se que, em ambos os isolados sequenciados, o elemento Boto provavelmente não sofreu transposição para os sítios analisados no genoma de M. perniciosa. Isto comprova a atividade deste elemento, pois, no isolado usado como referência para este estudo, o elemento Boto estava inserido naquela posição. Na análise da seqüência da ORF 1, verificou-se a presença de dois possíveis íntrons, um contendo 55 pb e outro de 48 pb. Esta seqüência codifica uma proteína de 422 resíduos de aminoácidos. Para comprovar a presença dos íntrons, experimentos de RT-PCR foram realizados com a utilização de dois conjuntos de oligonucleotídeos. Os amplificados obtidos, quando cDNA foi utilizado como molde da reação de PCR, foram clonados e sequenciados, sendo confirmada a posição e o tamanho dos dois íntrons preditos. Análise de RT-PCR mostrou que esta ORF é expressa mesmo em condições normais de cultivo do fungo, o que é importante para atividade deste elemento, visto que outros estudos mostram que a expressão desta ORF é fundamental à transposição de elementos PIF/Harbinger. Os resultados deste trabalho mostram que Boto é ativo no genoma de M. perniciosa e pode ter um importante papel como agente gerador de variabilidade genética neste fitopatógeno. Vale ressaltar que esta é a primeira descrição de um elemento da superfamília PIF/Harbinger que apresenta dois íntrons na ORF 1.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 577759 bytes, checksum: 8b7270200348b4cbbdc4f40d5e821098 (MD5) Previous issue date: 2010-08-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work aimed to study the diversity of endophytic bacteria associated to Coffea arabica L. fruit during their development. Seven monthly collections were conducted, following coffee fruit development in homogeneous stand of Catuai Vermelho coffee cultivar plantation. Each sample was processed according to protocol aiming to obtain total DNA from the endophytic bacterial community, associated to each stage of fruit development. The strategy of rDNA16S amplification through the Nested-PCR technique and DGGE discrimination were applied. The total population of endophytic bacteria and the phylos Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria (alpha, beta and gamma classes) were investigated. The analysis of each gel, representing the evolution of a population along time, was carried out using the program Bionumerics®. The existence of endophytic bacteria associated to coffee fruit since the first month of their development was confirmed, by using the universal primer for Eubacteria. Based on the similarity between the distribution pattern of the OTUs on the rays representing the two final months of fruit development, it was inferred that the populations tend to stabilize. Less similarity between the endophytic populations, present in the different phases of fruit development, was confirmed in the phylo Firmicutes, while the beta-Proteobacteria displayed greater similarity among the different phases of fruit development. Amplification of the rDNA by Nested PCR and DGGE discrimination were found to be adequate to distinguish the alteration dynamics among the phylo populations and the bacterial classes studied. / Neste trabalho foi estudada a diversidade de bactérias endofíticas associadas a frutos de Coffea arabica L. durante o seu desenvolvimento. Foram realizadas sete coletas mensais, acompanhando o desenvolvimento dos frutos em cafeeiros de um talhão homogêneo de lavoura do cultivar Catuaí Vermelho. Cada amostra foi processada seguindo protocolo para obter o DNA total da comunidade bacteriana endofítica, associada a cada estádio de desenvolvimento do fruto. Foi empregada a estratégia de amplificação do rDNA16S pela técnica de Nested-PCR e discriminação em DGGE. A população total de bactérias endofíticas e os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria (classes alfa, beta e gama) foram investigados. A análise de cada gel, representando a evolução de uma população ao longo do tempo, foi realizada empregando o programa Bionumerics®. Demonstrou-se a existência de populações de bactérias endofíticas associadas aos frutos de café desde o primeiro mês de seu desenvolvimento, com emprego do primer universal para Eubacteria. Pela maior similaridade entre o padrão de distribuição das UTOs nas raias que representam os dois meses finais de desenvolvimento dos frutos inferiu-se que as populações tendem para a estabilização. A menor similaridade entre as populações endofíticas, presentes nas diferentes fases de desenvolvimento dos frutos, foi constatada no filo Firmicutes, enquanto as beta- Proteobacteria exibiram maior similaridade entre as diferentes fases de desenvolvimento dos frutos. A amplificação do rDNA por Nested PCR e discriminação em DGGE mostrou-se adequada para a distinção da dinâmica de alterações nas populações entre os filos e as classes de bactérias estudadas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 649442 bytes, checksum: 480c7019b7f152a1aa0ec2308fbde07e (MD5) Previous issue date: 2006-03-14 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Epidendrum secundum and Zygopetalum mackaii, native from State Park of Serra do Brigadeiro, Minas Gerais State, Brazil, were studied to characterize the structure of mycorrhizae and associated mycorrhizal fungi. From August/2004 to July/2005, roots were collected from four different areas. A total of 28 isolates were obtained, all belonging to genus Epulorhiza, which were separated in three groups according their morphological and cultural characteristics. In both orchid species, mycorrhizae were tolipophagic, and colonizing all extension of the root system, presenting intact and degraded pelotons. Root colonization occurs mainly through root hairs and sometimes via epidermic cells, while cortex colonization occurs, mainly, via passage cells of the exodermis. Cortex colonization occurs by cell-to cell, and pelotons occupy all cellular space. Peloton degradation starts by hypha deformation, followed by a uniform reduction of peloton volume. Colonization intensity was higher in the dry season. The species growing on rocks showed higher colonization frequency and higher mycotrophic activity. This is the first report on the mycorrhizal association of Z. mackaii. Isolated fungi in this study show high potential to be used in commercial propagation of this orchid species. / Epidendrum secundum e Zygopetalum mackaii, nativas do Parque Estadual Serra do Brigadeiro (MG), foram estudadas com objetivo de caracterizar a associação micorrízica e os fungos micorrízicos associado a estas plantas. Durante o período de agosto/2004 a julho/2005, foram realizadas coletas do sistema radicular dessas espécies crescendo em quatro áreas com características distintas. Obtiveram-se o total de 28 isolados fúngicos, todos pertencentes ao gênero Epulorhiza, os quais foram divididos em três grupos, de acordo com as características culturais e morfológicas. A micorriza encontrada foi o tolipofágico, sendo observado pelotons intactos e degradados em toda a extensão do sistema radicular das espécies estudadas. A infecção da raiz ocorre via pêlo radicular ou células epidérmicas, enquanto a colonização do córtex é, principalmente, via célula de passagem da exoderme. A colonização no córtex ocorre via célula-célula, sendo todo o espaço celular ocupado pela estrutura fúngica, os pelotons. O estádio de degradação inicia-se pela deformação do peloton, seguida da redução uniforme de seu volume. A intensidade de colonização foi maior nos períodos de seca. As espécies crescidas diretamente sobre rochas apresentaram maior freqüência de colonização e maior atividade micotrófica. Este é o primeiro relato sobre o isolamento e caracterização de fungos micorrízicos em Z. mackaii. Os fungos isolados neste trabalho apresentam um grande potencial para serem utilizados na propagação comercial destas orquídeas.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - Capa_Abstract.pdf: 84206 bytes, checksum: fde95bad13eae98fb18c23bd5a1f8e62 (MD5) Previous issue date: 2011-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Silage is a sort of conserved fodder obtained through the fermentation of forage by lactic bacteria, which convert the soluble carbohydrates in lactic acid. This acid is responsible for reducing the pH of the ensiled mass, inhibiting the growth of deteriorating and pathogenic microorganisms, with no interference in the nutritional features of the ensiled culture. In addition to the lactic acid, the lactic bacteria may produce other antimicrobial compounds, such as the bacteriocins. In the present study, it was isolated 256 cultures of lactic bacteria from Estilosantes Campo Grande, in varied periods of fermentation. Among the 256 isolates obtained, 83% (214) displayed antagonist activity against the indicator microorganism. Among these, only 10% were capable of growing in basal medium. An analysis of the genetic diversity of 20 isolates was done by BOX-PCR. Eight isolates of lactic bacteria which presented high antagonist activity and elevated growth rate were selected and their fermenting profile in 49 carbohydrates sources allowed the identification of theses isolates, such as Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. The analysis of the 16S rDNA showed the same identification. The crude extract of the antimicrobial substance similar to bacteriocin (Blis) of three isolates inhibited the growth of the indicator microorganism, and the antagonist activity was also observed after pH neutralization (pH 7,0) with NaOH. The antagonist activity of the Blis crude extract was lost after the treatment with proteolytic enzymes. These three lactic acid bacteria isolates presented a broad spectrum of antagonist activity, inhibiting several species of different microorganisms. The antimicrobial feature of these isolates observed in this in this work, associated with other growth and fermentation physiological parameters shows that the lactic bacteria cultures isolated in silage from Estilosantes Campo Grande are potential candidates to be evaluated as inoculants in legume silage. / A silagem é uma forma de forragem conservada obtida por meio da fermentação da forrageira pelas bactérias lácticas, que convertem os carboidratos solúveis em ácido láctico. Este ácido é responsável por reduzir o pH da massa ensilada, inibindo o crescimento de micro-organismos deterioradores e patogênicos, sem interferir com as características nutricionais da cultura ensilada. Além do ácido láctico, as bactérias lácticas podem produzir outros compostos antimicrobianos, como as bacteriocinas. Neste estudo, foram isoladas 256 culturas de bactérias lácticas da silagem de Estilosantes Campo Grande, em diferentes períodos de fermentação. Dos 256 isolados de bactérias lácticas obtidos, 83% (214) demonstraram atividade antagonista contra o micro-organismo indicador. Dentre estes, apenas 10% foram capazes de crescer em meio basal. Análise da diversidade genética de 20 isolados foi realizada por BOX-PCR. Oito isolados de bactérias lácticas que apresentaram alta atividade antagonista e elevada velocidade de crescimento foram selecionados e o perfil de fermentação de 49 carboidratos permitiu a identificação desses isolados como Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici e Lactobacillus plantarum. A análise do gene 16S rDNA mostrou a mesma identificação. O extrato bruto da substância antimicrobiana semelhante a bacteriocina (Blis) de três isolados de bactérias lácticas inibiu o crescimento do micro-organismo indicador, e a atividade antagonista do extrato também foi observada após a neutralização do pH (pH 7,0) com NaOH. A atividade antagonista do extrato bruto da Blis foi perdida após o tratamento com enzimas proteolíticas. Estes tres isolados de bactérias lácticas demonstraram amplo espectro de atividade antagonista, inibindo várias espécies de micro-organismos diferentes. A característica antimicrobiana destes isolados observada neste trabalho, associada com outros parâmetros fisiológicos de crescimento e fermentação faz com que as culturas de bactérias lácticas isoladas de silagem de Estilosantes Campo Grande sejam candidatos potenciais para serem avaliados como inoculantes em silagens de leguminosas.