Die Übertragung der amphiphilen Grundbausteine der Liposome in die Welt der Polymere führte zu Blockcopolymeren, welche sogenannte Polymersome bilden können. Die synthetische Herkunft der Polymere ermöglicht es, eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Funktionalitäten einzubringen. Anwendungen von Polymersomen werden vor allem als Wirkstoffträgersystem oder im Bereich der synthetischen Biologie als Nanoreaktoren oder künstliche Zellorganellen ausgemacht. In vielen Fällen wird dabei eine Schaltbarkeit oder Responsivität der Vesikel gegenüber äußerer Stimuli benötigt. Als nächste Stufe der Komplexizität können die responsiven, »smarten« Polymersome innerhalb ihrer Membran quervernetzt werden, wodurch es möglich wird, den Durchmesser und die Membranpermeabilität der Vesikel reversibel hin- und herzuschalten. Diese Arbeit baut dabei auf pH-responsiven Polymersomen auf, welche durch photochemische Reaktionen vernetzt werden. Dabei soll zunächst der Frage nachgegangen werden, an welchem pH Wert genau der Übergang von kollabierten zu gequollenen Vesikeln erfolgt und wie sich dieser »kritischer pH« (pH*) verändern und einstellen lässt. Neben der Herstellung von maßgeschneiderten Polymersomen ist aber auch die detaillierte Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften unabdingbar, wofür die Titration mit Fluoreszenz-Sonden eingesetzt wurde. Darüber hinaus wurden Enzyme in die Vesikel eingekapselt wobei die neuartige Methode der post-Verkapselung untersucht wurde.

Ce manuscrit porte sur la synthèse et les applications d'une nouvelle série de composés hétéroaromatiques : les 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones. La première partie de ce manuscrit présente la préparation de ces squelettes via une réaction d'O-arylation intramoléculaire. La seconde partie du manuscrit repose sur la réactivité de ces entités chimiques et de leur utilisation en tant qu'intermédiaires de synthèse. La fonctionnalisation des 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones, via des réactions de couplage pallado-catalysées, a permis d'obtenir des systèmes polyfonctionnalisés plus complexes. Les pyrido-oxazinones ont également été transformées, en une étape, en divers petits hétérocycles d'intérêt : les 1,3,5-triazines, les 1,2,4-triazoles et les 1,2,4-oxadiazoles. La dernière partie du manuscrit est consacrée à l'utilisation des molécules synthétisées comme potentielles sondes fluorescentes pour la détection de protéines oxydées. / This work focused on the synthesis and applications of a novel series of heteroaromaticcompounds: the 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones. The first part of this thesis presents thepreparation of these pyrido-oxazinones via an intramolecular O-arylation reaction. The secondpart of this work relies on the reactivity of these chemical entities and their use as buildingblocks. The functionalization of the 4H-pyrido[e][1,3]oxazin-4-ones has been studied viacross-coupling reactions to obtain more elaborated structures. The pyrido-oxazinones werealso converted, in one step, into other diverse small molecules of interest: 1,3,5-triazines,1,2,4-triazoles and 1,2,4-oxadiazoles. The last part of this thesis was devoted to the use of theobtained heterocycles as potential fluorescent probes for the detection of carbonylatedproteins.

Cette étude a consisté en le développement et l’évaluation de nouvelles molécules pour la radiochimiothérapie concomitante. Ce travail a abouti à la conception de nouveaux agents chimiothérapeutiques duaux basés sur la combinaison covalente de deux radiosensibilisateurs: un inhibiteur de la PARP d’une part, et un alkylant de l’ADN (complexe de platine ou témozolomide) d’autre part. Les évaluations biologiques ont permis de mettre en évidence l’intérêt d’une molécule duale inhibiteur de la PARP/platine. Parallèlement à ce projet, le développement d’outils moléculaires pour l’étude d’inhibiteurs de la PARP a été entrepris. Ainsi, plusieurs sondes d’affinité ont été conçues pour une étude d’inhibiteurs de la PARP par protéomique chimique. Ce travail a permis de valider la spécificité d’une sonde d’affinité pour la PARP1 et la PARP2. Finalement, des molécules fluorescentes inhibitrices de la PARP ont été développées dans l’objectif d’un criblage d’inhibiteurs de PARP3 par anisotropie de fluorescence. / The main topic of this work was the development and biological evaluation of dual molecules for concomitant chemoradiotherapy. To this end, new dual chemotherapeutic agents were designed by linking covalently two radiosensitizers: a PARP inhibitor and an alkylating agent (platinum complex or temozolomide). This study led to an efficient PARP inhibitor/platinum dual molecule. A complementary approach was to develop affinity probes to study PARP inhibitors by a chemical proteomic method. This study permitted to validate the selectivity of an affinity probe for PARP1 and PARP2. Finally, fluorescent PARP inhibitor probes were synthesised and evaluated for a PARP3 screening by fluorescence anisotropy.

La méthylation de l'ADN est une des marques épigénétiques majeures qui intervient dans la régulation de processus physiologiques importants. Par ailleurs, elle a été reconnue comme une cible majeure pour lutter contre le cancer car son dysfonctionnement est impliqué dans le développement de pathologies comme les cancers. Une meilleure compréhension de ce mécanisme permettrait aux chimistes médicinaux de développer de nouveaux inhibiteurs plus spécifiques. Actuellement, un grand nombre d'hypothèse ont été avancées concernant la méthylation de l'ADN et méritent d'être confirmées ou clarifiées. Dans ce contexte, nous avons décidé de développer de nouveaux analogues nucléosidiques fluorescents et ratiométriques présentant un motif 3-hydroxychromones, afin d'étudier la dynamique et le mécanisme de méthylation de la cytosine impliquant UHRF1 et DNMT1. Nous avons tout d'abord décidé de nous focaliser sur la première étape du mécanisme, la reconnaissance du duplexe hémi-méthylé par le domaine SRA de UHRF1. Deux stratégies de marquage de l'ADN ont ainsi été explorées. La première a consisté à remplacer une base azotée naturelle par le fluorophore, afin de sonder l'intérieur du duplexe. Ce biocapteur a ainsi pu être utilisé afin de détecter l'approche du domaine SRA de UHRF1 ainsi que le basculement de la cytosine méthylée dans son site de reconnaissance. La deuxième approche repose sur la modification d'une nucléobase naturelle sur laquelle la sonde ratiométrique est attachée à l'aide d'un bras espaceur insaturé rigide, lui permettant ainsi de sonder les interactions au niveau du grand sillon de l'ADN. / DNA methylation is one the major epigenetic modification and plays an important role in the regulation of major processes. DNA methylation was recently recognized as one of the major target to inhibit and to fight cancer. A deeper insight of the DNA methylation mechanism should help medicinal chemists in the design and research of more specific inhibitors of DNA methylation. Currently, miscellaneous hypotheses are advanced about DNA methylation mechanism and deserve to be confirmed or clarified. In this context, we decided to develop new ratiometric fluorescent nucleoside analogs, incorporating 3-hydroxychromone moiety, to study the dynamics and mechanism of cytosine methylation involving UHRF1 and DNMT1. We firts decided to focus on the first step of the mechanism, the recognition of the hemi-methylated duplex by the SRA domain of UHRF1. Two diferent strategies of labeling DNA were explored. In the firts one, a natural nucleobase was substituted by the fluorescent dye in order to probe inside the duplex. This biosensor allows to detect and monitor the binding of the SRA domain and flipping of the 5-methylcytosine from the duplex into its recognizing site. The second approach is based on a modification of a natural nucleobase on which, through a rigid unsaturated linker, the ratiometric probe was incorporated in order to sense the interaction in the major groove.

In the beginning of this thesis is a short introduction into plasmid DNA which is in the form of a vector used in molecular biology. Plasmids can be used in the form of fluorescent probes to measure changes in membrane potential. Into their structure is added a dye called fluorophore. As an important representative of this thesis is a fluorescent probe ASAP1 which contains green fluorescent protein whose response to the membrane potential change is the decrease in the intensity of emitted light. The aim of this thesis was to make chemical transfection of this plasmid into the HEK293 cell line and carry out its characterization. In the work is also described the design of a method for the analysis of the time course of changes in fluorescence depending on the cell membrane depolarisation. In the end of this thesis is also desribed realized experiment including the discussion of aquired results.

Die Übertragung der amphiphilen Grundbausteine der Liposome in die Welt der Polymere führte zu Blockcopolymeren, welche sogenannte Polymersome bilden können. Die synthetische Herkunft der Polymere ermöglicht es, eine Vielzahl von verschiedenen chemischen Funktionalitäten einzubringen. Anwendungen von Polymersomen werden vor allem als Wirkstoffträgersystem oder im Bereich der synthetischen Biologie als Nanoreaktoren oder künstliche Zellorganellen ausgemacht. In vielen Fällen wird dabei eine Schaltbarkeit oder Responsivität der Vesikel gegenüber äußerer Stimuli benötigt. Als nächste Stufe der Komplexizität können die responsiven, »smarten« Polymersome innerhalb ihrer Membran quervernetzt werden, wodurch es möglich wird, den Durchmesser und die Membranpermeabilität der Vesikel reversibel hin- und herzuschalten. Diese Arbeit baut dabei auf pH-responsiven Polymersomen auf, welche durch photochemische Reaktionen vernetzt werden. Dabei soll zunächst der Frage nachgegangen werden, an welchem pH Wert genau der Übergang von kollabierten zu gequollenen Vesikeln erfolgt und wie sich dieser »kritischer pH« (pH*) verändern und einstellen lässt. Neben der Herstellung von maßgeschneiderten Polymersomen ist aber auch die detaillierte Charakterisierung ihrer Membraneigenschaften unabdingbar, wofür die Titration mit Fluoreszenz-Sonden eingesetzt wurde. Darüber hinaus wurden Enzyme in die Vesikel eingekapselt wobei die neuartige Methode der post-Verkapselung untersucht wurde.

One of the main reasons for the treatment failure of infections caused by pathogenic microorganisms is the overexpressing of efflux membrane proteins, which actively remove drugs from cells, leading to a phenomenon called multidrug resistance MDR. In this work, we focused on the functional characterization of the MDR pump Pdr5p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We have verified that diS-C3(3) fluorescence method can be used to determine the binding sites where the substrates bind in the binding pocket of the pump ScPdr5p. We focused on the study of the ScPdr5p binding pocket using triazole derivatives: ravuconazole, voriconazole and fluconazole. Using disc diffusion assay, we showed that all three studied triazoles are substrates of the pump ScPdr5p. We have found that these structural analogs have a significantly different effect on the inhibition of the potentiometric fluorescent probe diS-C3(3) transport by the pump ScPdr5p, and also that ravuconazole and voriconazole compete with each other for transport by the pump ScPdr5p. We have used a fluorescent approach to study the binding of azoles to the binding pocket of pump ScPdr5p using benchmark substrates, that bind selectively to only one binding site in the binding pocket of the pump ScPdr5p, and we have supported the hypothesis that ravuconazole...

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L'enveloppe cellulaire des bactéries à Gram négatif constitue la première ligne de défense contre les antibiotiques. Sous l’effet, d’une part, de la faible perméabilité de la membrane externe qui s'oppose à la pénétration des agents antibactériens, d’autre part des pompes d'efflux qui favorisent leur expulsion, elle empêche nombre de composés potentiellement actifs in vitro d'atteindre leur cible, limitant l’effet antibactérien. Un enjeu important pour restaurer l’activité de ces molécules est de trouver une stratégie pour en augmenter la concentration intracellulaire. L'objectif de cette thèse est de développer des métallodrogues comme nouvelle stratégie de vectorisation de drogues dans les cellules. Cette stratégie repose sur l’association d'une drogue active in vitro, et d’un ligand auxiliaire ayant des propriétés perméabilisantes ou inhibitrices de pompe d’efflux, dans un complexe qui jouera le rôle de chaperone. Les agents antibactériens utilisés sont des inhibiteurs (dérivés d’acides hydroxamiques) de peptide déformylase (PDF) et de méthionine aminopeptidase (MetAP) développés au laboratoire. Tout d’abord, une étude globale de la stratégie de vectorisation a été réalisée (i) étude de stabilité de métallodrogues modèles : en utilisant un acide hydroxamique fluorescent, nous avons montré que, seules, des métallodrogues à Co(III), à la différence de celles à Cu(II) et Fe(III), satisfaisaient aux conditions de stabilité compatibles avec les conditions de tests biologiques. (ii) Etude de la libération de la drogue : nous avons établi par une étude RMN 1H et UV-vis qu’en milieu tampon pH = 7,4, la libération de la drogue se faisait par échange de ligand avec un thiol exogène. Récemment, une nouvelle série d’inhibiteurs de PDF a été synthétisée au laboratoire. Elle est basée sur un squelette hétérocyclique à 5 chaînons fonctionnalisé par une chaîne en C4, puis via un espaceur monocarboné, à un acide hydroxamique. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec un oxadiazole (AT002 16 µg/ml sur E. coli en présence de perméabilisant PMBN). Au cours de cette thèse, pour améliorer la lipophilie, des groupements aromatiques ont été fixés sur cet hétérocycle. Les MICs sur la souche d’E. coli sauvage n’ont pas été améliorées mais en présence de PMBN, le dérivé présentant la meilleure activité est le composé AT015 (2 µg/ml sur E. coli en présence de PMBN) qui a donc été choisi pour concevoir des métallodrogues. La métallodrogue réunit autour d’un métal deux parties: (i) un ligand auxiliaire fonctionnalisé via un espaceur par un perméabilisant peptidique analogue de peptide antimicrobien ou par un modulateur de l’efflux (ii) un acide hydroxamique inhibiteur de PDF. Au cours de la SAR réalisée en faisant varier la drogue, le ligand auxiliaire et le métal, nous avons montré que les meilleures métallodrogues permettent d’améliorer l’activité de la drogue sur la souche d’E. coli sauvage d’un facteur 16. Un des ligands auxiliaires fonctionnalisé par un tétrapeptide présente, seul, une activité sur une souche d’E. aerogenes résistante aux fluoroquinolones. Sur ce cas, l’activité biologique a été reliée, par des expériences de mapping par fluorescence, à son accumulation intracellulaire, en utilisant un analogue fluorescent de ce composé. / The gram negative bacterias’ cell envelopes are the first line of defense against antibiotics. First thanks to the low permeability of the external membrane that prevents the penetration of the antibiotics, but also thanks to the efflux pumps that help expelling the antibiotics from the cell. These mechanisms prevent many compounds, potentially active in vitro, from reaching their targets, thus limiting the antimicrobial effect. To increase the molecules’ intracellular concentration is one of the means to restore their activity. This thesis’ objective is to develop metallodrugs as a new drug vectorization strategy in cells. We here associate an active drug in vitro and an auxiliary ligand with permeabilization or efflux pumps inhibition abilities in a complex playing the role of a chaperone. We used peptide deformylase (PDF) and methionine aminopeptidase (MetAP) inhibitors (derived from hydroxamic acids) developed at the laboratory as antimicrobial agents. I’ll begin with a global study of the vectorization strategy we’ve adopted (i) Stability study of the metallodrugs models: using a fluorescent hydroxamic acid, we showed that only Co(III) metallodrugs are in agreement with the stability conditions compatible with the biological tests, in opposition with the Cu(II) and Fe(III) ones. (ii) Drug release study: we showed in 1H NMR and UV-vis studies that in a buffer solution pH 7.4, a ligand exchange with an exogenous thiol is responsible for the drug release. Recently, a new series of PDF inhibitors was synthesized at the laboratory. It is composed of a 5 membered heterocyclic skeleton functionalized by a chain in C4 followed by an hydroxamic acid via a monocarbonated spacer. The best results were obtained with an oxadiazole (AT002 16 µg/ml with E. coli and PMBN as permeabilizing agent). During this thesis, to enhance lipophilicity, we attached aromatic groups on the heterocycle. CMIs on the E. coli strain have not been increased but the compounds displaying the best activity in presence of PMBN (AT015, 2 µg/ml with E. coli and PMBN) was chosen to conceive metallodrugs. The metallodrug is composed of a metal center and two other parts: (i) an auxiliary ligand functionalized via a spacer by a permeabilizing peptide, an antimicrobial peptide analogue, or by an efflux modulator. (ii) An hydroxamic acid PDF inhibitor. We showed that the best metallodrugs enhance the drug activity on the wild E.coli strain by a 16 factor, with the SAR we realized, changing the drug, the auxiliary ligand and the metal. One of the auxiliary ligands functionalized by a tetrapeptide show an activity on a fluoroquinolone-resistant E. aerogenes strain while alone. Utilizing a fluorescent analogous of this compound, we linked the biological activity to its intracellular accumulation with fluorescence mapping experiments.

De nombreux processus biologiques liés aux membranes cellulaires lipidiques sont encore très mal connus. La présence d'eau et d'ions à l'interface influence les propriétés structurelles et dynamiques de la bicouche lipidique. Les techniques de fluorescence sont très utiles pour étudier les membranes en raison de la grande sensibilité des sondes à leur environnement. Nous avons utilisé la technique de relaxation de solvant (SR) pour explorer l'hydratation et la mobilité de l'eau. Nous avons également réalisé des calculs quantiques (QM) et des dynamiques moléculaires (DM) pour étayer nos expériences. Les résultats SR montrent qu'un petit cation (Na+) est très attiré par la membrane et augmente sa rigidité à l'opposé des cations (NH4+, Cs+) plus gros. Les anions (CI04-, SCN-) s'adsorbent à l'interface plus facilement que Cl-. Ces anions changent la mobilité et l'hydratation des têtes polaires des lipides de la bicouche. Les études SR de la zone hydrophobe de la membrane montrent que les processus de relaxation sont ici très complexes. lis reflètent des processus rapides intramoléculaire (relaxation de torsion, transferts de charge) et des processus intermoléculaires lents. Les calculs QM ont permis de créer les champs de force de trois sondes fluorescentes (Prodan, Laurdan et C-laurdan). Les simulations DM ont permis de déterminer les positions des sondes dans une membrane DOPC. La modélisation reproduit correctement les résultats SR, en particulier les temps de relaxation : de l'ordre de la ps en solvant aqueux et de la ns dans la membrane. Les simulations MD sont complémentaires des méthodes SR et permettent de surveiller le comportement de molécules uniques. / Many biologically important processes and phcnomena in lipid membranes are still not fully understood. The presence of ions and water molœules has a significant influence on the structural and dynamical properties of lipid bilayers. Fluorescent techniques are versatile tools for studying the lipid membranes, because the fluorescence emission is strongly sensitive to dye environment. We have conducted fluorescent solvent relaxation (SR) experiments to explore the hydration and mobility properties in lipid membranes in the presence of different chaotropic ions. We have also carried out Quantum Mechanical (QM) calculations and Molecular Dynamics (MD) simulations for supporting the SR experiments. SR experiments show that small cation (Na+) is attracted to the membrane and increases rigidity ofbilayer, while larger cations (NH/, Cs+) should not. Large anions (CI04·, SCN') adsorl, at the membrane interface more easily than smaller ones (Cl') and significantly change tl!e mobility and hydration of the headgroup region oflipid bilayer. SR study ofhydrophobic part of the membrane show that SR processes are complex there and reflect botl!: faster, intramolecular (torsional relaxation or fonnation of charge transfer state) and slower, intermolecular (SR) relaxation processes. QM calculatiom were used to create force-field for three fluorescent dyes (Prodan, Laurdan and C-laurdan). MD simulations allow detennining position of the dye in the lipid membrane in the ground state and after excitation and reproduce correctly SR timescale- ps in water and ns in the membrane. MD simulations extend the capabilities of SR method and allow observing the behaviour of individual molecules.