Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-21Bitstream added on 2014-06-13T18:56:50Z : No. of bitstreams: 1 carvalho_ics_me_sjc.pdf: 668962 bytes, checksum: 9fcef8d37972e56096faee53f7658608 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O álcool atua no organismo podendo trazer várias doenças, entretanto sua ação no tecido ósseo ainda apresenta resultados controversos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do consumo crônico de álcool a 20% em osteoblastos obtidos da calvária de ratos recém-nascidos. Foram utilizadas 18 ratas prenhas, tratadas durante a gestação e divididas em grupos conforme a dieta: álcool a 20%, grupo isocalórico, e controle. Aos três dias de vida, os recém-nascidos foram eutanasiados para remoção da calvária e isolamento das células por meio de digestão enzimática sequencial, sendo estas cultivadas por períodos de até 14 dias. Foram realizados testes para avaliar o efeito do álcool na adesão, proliferação e viabilidade celular, no conteúdo de proteína total, na atividade da fosfatase alcalina e nas formações nodulares de matriz mineralizada. Os resultados mostraram que em geral, a adesão celular não foi influenciada pelo consumo crônico de álcool, já que não foi demonstrada diferença estatística entre os grupos. Contudo, o grupo álcool apresentou aumento significativo na proliferação, exceto no período de 1 dia, e nas formações nodulares. Com relação a viabilidade celular, apenas no período de 3 dias houve aumento significativo de células no grupo álcool. Os valores representativos de proteína total variaram dependendo do período estudado, sendo maior no grupo controle com 7 dias, porém aos 14 dias houve maior média nos grupos isocalórico e álcool. Quanto à fosfatase alcalina observamos aumento de sua atividade nos grupos álcool e isocalórico em todos os períodos. Concluímos que nesta metodologia, o álcool não apresentou efeito deletério para os osteoblastos, talvez pelo curto tempo de administração / The alcohol affects the organism and may cause various diseases, even though its effects on bone metabolism are still controversial. The purpose of this paper was to evaluate the effects of alcohol 20% chronic consumption in osteoblasts obtained from the calvaria of newborn mice. The alcohol was administrated to pregnant mice throughout the entire pregnancy. For that purpose, 18 mice were used, divided in groups according to the diet: 6 receiving alcohol 20%, 6 belonging to the isocaloric group and 6 receiving water and ration at will. At three days of life, the newborns were euthanized so as to remove the calvaria and start the cell culture procedures. The osteoblastic lineage cells were isolated by sequential enzymatic digestion and the osteoblasts were cultivated for periods of 14 days or less. Tests were performed on the culture slides to evaluate the effect of alcohol based on adhesion, proliferation and cellular viability on total protein content, alkaline phosphatase activity and nodule formation of mineralized matrix. The results have shown that the alcohol group presented significant increase in proliferation, except for the period of one day, and in nodule formation. A significant increase in the alcohol group concerning cellular viability was only observed in the period of 3 days and there was no statistic difference in adhesion. The total protein content was higher in the control group in 7 days, and the average higher in the isocaloric and alcohol groups in 14 days, according to the periods of time studied. An increase in the activity of the alkaline phosphatase was observed in the isocaloric and alcohol groups in all periods of evaluation. By this methodology, we have concluded that the alcohol has not presented any deleterious effect on osteoblasts, possibly due to the short period of administration

Orientador:João Martins Pizauro Junior / Banca: Douglas Emydio de Faria / Banca: Luiz Hnerinque Souza Guimarães / Banca: Marcos Tulio Oliveira / Banca: Saulo Santesso Garrido / Banca: João Martins Pizauro Junior / Resumo:A Discondroplasia Tibial é atribuída a uma assíncronia no processo de ossificação endocondral, levando a um acúmulo de cartilagem não calcificada e avascularizada onde deveria ser formado osso trabecular. É necessária uma atuação sincronizada das enzimas, ectoenzima fosfodiesterase nucleotídeo pirofosfatase (PC-1), fosfatase alcalina e fosfatase ácida durante o processo de calcificação biológica, pois elas atuam como reguladoras das concentrações de pirofosfato, que, quando elevadas, podem inibir a calcificação e levar ao desenvolvimento da discondroplásia tibial. As aves foram separadas em normais e portadoras de discondroplásia, sacrificadas, as tíbias foram retiradas, congeladas e estocadas a -70ºC. Posteriormente os discos de crescimento foram homogeneizados, receberam diferentes tratamentos para se ter as enzimas purificadas, então foram aliquotados, congelados e estocados a -70ºC para futuras análises enzimáticas e dosagem de proteína. Não houve diferença entre a atividade especifica da PC-1 extraída de aves normais, quando comparada aquela obtida de aves portadoras de lesão, já a atividade especifica da fosfatase alcalina foi diminuída nas aves portadoras de discondroplásia tibial em relação as aves normais, sugerindo que a discondroplásia pode ser atribuída a um aumento na concentração de pirofosfato, o qual pode dificultar a mineralização se ligando diretamente aos cristais de hidroxiapatita e impedindo o seu crescimento, e também pela não produção do fosfato inorgânico. A fosfatase ácida, apresentou redução na atividade nas aves doentes, quando comparadas as aves normais, sugerindo que o disco de crescimento tem as suas funções de remodelação afetadas. Nossos resultados sugerem que a disfunção tibial discondroplasia pode ser atribuída a diminuição das atividades da fosfatase alcalina, o que gera o aumento da concentração pirofosfato... / Abstract:The tibial dyschondroplasia is attributed to an asynchrony in the endochondral ossification process, leading to an accumulation of non-calcified and non-vascularized cartilage in the place where the trabecular bone should be formed. A synchronized action of ectoenzyme nucleotide phosphodiesterase pyrophosphatase (PC-1), alkaline phosphatase and acid phosphatase is required in the biological calcification process, because they act in the regulation of pyrophosphate concentrations, which in high concentrations is an inhibitor of calcification and may lead to the development of tibial dyschondroplasia. The birds were divided into normal and dyschondroplasic, sacrificed, then the tibiae were removed, frozen in liquid nitrogen and stored at -70 °C. Afterwards, the growth plates were homogenized, submitted to different treatments to make each enzyme extract and then were aliquoted, frozen and stored at -70 °C for posterior enzyme assays and protein dosage. There was no difference between the specific activity of PC-1 extracted from normal birds compared to that obtained from dyschondroplasic birds, on the other hand the specific activity of alkaline phosphatase was lower in birds with tibial dyschondroplasia, when compared with healthy birds, suggesting that dyschondroplasia may be attributed to an increase in the concentration of pyrophosphate, which may cause prejudice to mineralization by binding directly to the hydroxyapatite crystals and preventing their growth and also because there is no production of inorganic phosphate. The acid phosphatase activity decreased in dyschondroplasic birds when compared to the normal ones, suggesting that the growth plate has its remodeling functions affected. Our results suggest that the tibial dyschondroplasia can be attributed to the decrease in alkaline phosphatase activity, which leads to an increase in inorganic pyrophosphate concentration, inhibiting... / Doutor

Orientador: Frab Norberto Boscolo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-26T02:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lourenco_RobertoMartins_D.pdf: 2249820 bytes, checksum: bd8f4a607ea61642bb145975a109046e (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: Neste trabalho tivemos por finalidade pesquisar o efeito de baixas doses de radiação de elétrons na atividade das fosfoesterases no tecido de granulação, grupo enzimático este que tem um papel preponderante na nova formação do tecido. Para tanto, os animais sofreram um procedimento cirúrgico, sendo efetuada a inserção subcutânea do disco de esponja de PVC, possuindo 8 mm.de diâmetro por 4 mm. de espessura a uma distância de 3cm da incisão. Esse procedimento foi repetido em 84 animais, os quais foram divididos em dois grupos experimentais, sendo um irradiado, outro controle, contendo, cada grupo, 42 animais. Por sua vez, cada grupo teve seus animais distribuídos segundo 7 tempos de evolução do tecido de granulação: 5, 7, 10, 14, 17,20 e 24 dias, sendo cada tempo composto de 6 animais. Para a irradiação foi utilizado um acelerador linear, com um feixe de elétrons com energia de 6 MeV, a uma distância de 100 em. (fonte até esponja) com dose simples de 1,0 Gy a 1 em. de profundidade. A irradiação foi realizada 3 dias após a implantação da esponja sendo os seus corpos protegidos por 4 mm de chumbo com uma abertura permitindo a exposição da área correspondente a 5 mm de diâmetro maior do que o diâmetro da esponja. Decorrido o tempo proposto para o estudo, foram removidos os tecidos formados e mediu-se a atividade específica de 3 enzimas: - A Adenosina Trifosfatase (ATPase), nos tecidos irradiados, mostrou, quando comparada ao controle, menor atividade, aos 17 dias após a irradiação. - A Fosfatase Alcalina apresentou, aos 11, dias uma maior atividade no grupo irradiado, decaindo dos 14 aos 21, dias porém não significante quando comparada ao grupo controle. - A 5'Nucleotídeo Fosfodiesterase apresentou maior atividade nos animais irradiados dos 2 aos 11 dias, sendo que, aos 2 dias, houve diferença significante em relação ao grupo controle de mesmo tempo. Aos 14 dias houve queda de atividade estatisticamente significante em relação ao grupo não irradiado, seguida de novo aumento de atividade dos 17 aos 21 dias nos animais do grupo irradiado, com diferença estatisticamente significante aos 21 dias, quando comparada ao grupo controle / Abstract: This work had the purpose to seek the effect of low doses of electron radiation on the activity of phosphoesterases in granulation tissue, as this enzymatic group has a major role in the new tissue formation. With that purpose, the animais underwent surgical procedure, receiving a subcutaneous insertion of a disc of PVC foam, averaging 8 milimeters diameter and 4 milimeters thick, at a distance of 3 centimeters away from the incision. This procedure was repeated on eighty-four animais, which were divided into two experimental groups, the irradiated group and the contrai group, each one with forty-two animais. In their tum, the groups had their animal distributed into seven development times for the granulation tissue: five, 7, 10, 14, 17, 20, and 24 days, performing groups of six animais. A linear accelerator was used for irradiation, with a 6 MeV energy electron beam, at a distance of 100 centimeters frem the source to foam, and with a simple dose of 1.0 Gy , 1 centimeter deep. Irradiation was performed three days afier surgical procedure, with the body protected by a lead cover, four milimeters thick, with an aperture allowing an exposition of five milimeters surrounding the foam diameter. Afier the proposed times, the formed tissues were removed and the specific ativity of three enzymes was measured: - The Adenosine Triphosphatase (ATPase) showed a decreased activity, when compared to control, seventeen days afier irradiation. - The Alkaline Phosphatase showed, at eleven days, an increased activity in the irradiated group, decreasing at fourteen and twenty-one days but not significant when compared to the control group. - The 5'Nucleotide Phosphodiesterase showed an increased activity in the irrradiated animais frem two to eleven days, with significant difference from the control groups. At fourteen days a decreasing activity occurred, statistically significant, when compared to the non-irradiated group, followed by a new increasing from seventeen to twenty-one days in the animais belonging to the irradiated group with statistically significant difference at twenty-Oone days, when compared to the control grou / Doutorado / Doutor em Radiologia Odontológica

Made available in DSpace on 2014-06-12T23:03:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8816_1.pdf: 1068492 bytes, checksum: 75506251a75134f7871049031b69f94e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / São crescentes as evidências de interação entre o sistema nervoso e o metabolismo ósseo. Estudos recentes evidenciam receptores glutamatérgicos, dopaminérgicos e serotoninérgicos nas células ósseas. No entanto ainda não está bem documentado o papel da serotonina no osso. No presente estudo, foi investigado o papel da serotonina sobre o crescimento e desenvolvimento do tecido ósseo em ratos. Foram utilizados 60 ratos machos Wistar com idades de 30 e 90 dias. Para cada idade, os animais foram divididos em dois grupos: tratado e salina. Ao grupo tratado foi administrada fluoxetina, um potente inibidor seletivo da recaptação da serotonina ISRS, em dose de 10mg/Kg p.c. (10 l/g p.c., s.c). Ao grupo salina foi administrada solução salina a 0,9% (10 l/g). Os tratamentos foram realizados diariamente nos primeiros 21 dias pós-natais dos animais. Nas idades de 30 e de 90 dias, foram coletados para análise o fêmur e o sangue dos animais. O peso corporal (S= 88,38 ± 5,9; F= 81,34*), o peso relativo do fêmur (S= 3,42 ± 0,3 ; F=3,21 ± 0,22*) e o comprimento do fêmur (S= 21,97 ± 0,62, F= 21,27± 0,78*) apresentaram redução nos animais tratados com fluoxetina aos 30 dias de vida (*p<0.05). Os níveis séricos da fosfatase alcalina (S= 74 ± 11.9; F= 100.4± 12.3*) apresentaram-se maiores nos animais tratados aos 30 dias de idade. Aos 90 dias de idade não houve diferenças para estes parâmetros entre os grupos. A densidade do fêmur e seu ângulo colo-diáfise não apresentaram diferenças entre os grupos ou idades. A redução do peso relativo e comprimento femorais entre os animais jovens tratados com ISRS sugere um efeito precoce do ISRS sobre o metabolismo ósseo. Já o aumento na atividade da fosfatase alcalina precocemente sugere que houve incremento da atividade osteoblástica em resposta à agressão farmacológica no período de aleitamento. Sendo assim, a influência da serotonina sobre o metabolismo ósseo parece ser evidente em idade precoce tendo em vista que houve recuperação dos parâmetros estudados entre os animais adultos tratados com ISRS

Orientador : Alcides Guimarães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-07-16T23:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luciano_Eliete_M.pdf: 1966182 bytes, checksum: b63d7e671e62b52fdfb57346be95ca24 (MD5) Previous issue date: 1984 / Resumo: Este trabalho teve como objetivo, verificar os possiveis efeitos do princípio ativo das glândulas salivares, Parotin sobre a gênese e desenvolvimento dos tecidos de reparo em ratos diabéticos e a atividade da fosfatase alcalina durante esses processos. Para isso, foram utilizados 38 ratos adultos Jovens, distribuÍdos em 4 grupos...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Thís work had the purpose to study the.effects of Parotin administratíon upon sponge induced granulation tissue in diabetic rats and alkaline phosphatase activity during these processo This expe.rimental study was 'carried out by uSlng 38 young adult rats. The animaIs were divided into four groups , as follows:...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Biologia e Patologia Buco-Dental

A organização da membrana biológica em microdomínios tem um papel chave em vários processos celulares semelhante a receptores protéicos e a transdução de sinal. A existência de microdomínios, também denominados de rafts tem sido explicada pela separação das membranas lipídicas em duas fases: liquida cristalina (L) e fase liquida ordenada (Lo) rica em colesterol e esfingolipídeos. Assim, o enfoque deste projeto foi correlacionar mecanismos de controle da atividade da fosfatase alcalina (TNAP) com a organização intermolecular e o estado de fase de alguns lipídios que compõem as vesículas da matrix. Foi estudada a modulação da atividade da enzima e sua inserção à sistemas de lipossomos constituídos com diferentes composições lipídicas (Dipalmitoilfosfatidilcolina, Colesterol, Esfingomielina e Gangliosídeo) como um mecanismo de regulação e transdução entre enzimas que não compartilham intermediários metabólicos comuns. Isto é, verificar como mudanças de organização molecular, induzida por colesterol e/ou outros lipídios, podem modular a atividade de enzimas regulando a produção de mensageiros lipídicos secundários e/ou processos de fusão e recombinação topológica da bicamada lipídica, modulando concomitantemente a atividade da fosfatase alcalina. Com tal propósito, a TNAP foi reconstituída em lipossomos constituídos de DPPC e lipossomos mistos formando sistemas binários DPPC:Chol, DPPC:SM e DPPC:GM1 com razões molares de (9:1); sistemas terciários DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 e DPPC:SM:GM1 com razões molares de (8:1:1) e por fim sistemas quaternários constituídos de DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). Estes sistemas foram propostos com o intuito de mimetizarmos os lipid rafts existentes nas membranas biológicas, porém utilizando lipídios que já foram identificados e quantificados nas vesículas da matrix. Foram avaliados os efeitos da composição lipídica dos lipossomos na inserção da enzima aos sistemas vesiculares. Além disso, foram realizados estudos biofísicos de calorimetria analisando como os parâmetros termodinâmicos são afetados com as diferentes composições lipídicas e pela presença da enzima ancorada aos sistemas. A reconstituição da enzima a lipossomos constituídos de DPPC proporcionou uma incorporação em torno de 80% da atividade enzimática. Estudos termodinâmicos dos proteolipossomos formados evidenciaram uma queda significativa nos valores de variação de entalpia em relação aos sistemas de lipossomos (de 7,63 a 1,88 kcal.mol-1). Lipossomos binários constituídos de DPPC:Chol em concentrações crescentes (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 razão molar) foram estudados tanto pelos parâmetros biofísicos como pela habilidade de inserção da enzima a tais sistemas. Foi observado um significativo decréscimo nos valores de variação entalpia com o aumento da proporção de colesterol no lipossomo. Além disso, a presença do colesterol proporcionou uma redução na inserção da atividade catalítica em até 42%, quando utilizada a composição lipídica de 9:5 DPPC:Chol. Dos sistemas binários formados com razões molares 9:1, o que apresentou maior porcentagem de reconstituição da TNAP foi o sistemas DPPC:Chol, apresentando em torno de 62% de incorporação da enzima. Os sistemas terciários apresentaram ao redor de 30% de incorporação da atividade catalítica e o sistema quaternário em torno de 25%. Além dos ensaios de atividade enzimática, a incorporação da enzima aos sistemas vesiculares também pôde ser comprovada pelas mudanças nos parâmetros termodinâmicas detectados por DSC. Nos estudos de calorimetria de todos os sistemas de proteolipossomos formados, foram observadas significativas diminuições nos valores de variação de entalpia quando comparados aos sistemas de lipossomos correspondentes. Deste modo, os resultados aqui apresentados fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão do comportamento da atividade da fosfatase alcalina na presença de diferentes composições lipídicas dos microdomínios existente membrana, quanto para o entendimento dos processos de regulação da enzima durante o processo de biomineralização. / The organization of the biological membrane in microdomains has a key roll in many cellular processes similar to proteic receptors and signal transduction. The existence of microdomains, also called rafts, has been explained by the lipid membrane separation in two phases: crystalline phase (L) and ordinate liquid phase (Lo), rich in cholesterol and sphingolipids. The focus of this Project was to correlate activity control mechanisms of the alkaline phosphatase (TNAP) with the intermolecular organization and the phase stat of some lipids that comprise the matrix vesicles. The enzyme activity modulation and its insertion into liposomes systems, constituted by different lipid compositions (DPPC, Chol, SM e GM1) as a regulation and transduction mechanism between enzymes that do not share common intermediary metabolites, was studied. That is, to verify how molecular organization changes, induced by cholesterol and/or other lipids, can modulate the enzyme activity regulating the production of secondary lipid messengers and/or fusion processes and topological recombination of the lipidic bilayer, concomitantly modeling the alkaline phosphatase activity. TNAP was then reconstituted in liposomes constituted by DPPC and mixed liposomes forming binary systems DPPC:Chol , DPPC:SM , DPPC: Chol:GM1 with (9:1) molar rates; tertiary systems DPPC:Chol:SM, DPPC:Chol:GM1 and DPPC:SM:GM1 with (8:1:1) molar rates and finally quaternary system constituted by DPPC:Chol:SM:GM1 (7:1:1:1). These systems were proposed aiming the mimetization of lipid rafts existent in biological membranes, but using lipids that had already been identified and quantified in the matrix vesicles. The effects of liposome lipid composition in the enzyme insertion to the vesicular systems were assayed. Besides that, calorimetry biophysical studies were done analyzing how the thermodynamic parameters are affected by the different lipid compositions e by the presence of the systems anchored enzyme. The enzyme reconstruction to the DPPC constituted liposomes has provided an incorporation of around 80% of the enzyme activity. Thermodynamic studies of the proteoliposomes formed have shown a significant decrease in the H values in relation to the liposomes systems (from 7.63 to 1.88 kcal.mol-1). Binary liposomes constituted of DPPC:Chol in increasing concentrations (9:1, 9:2, 9:3, 7:3, 9:4 e 9:5 molar ratio) were studied by the biophysical parameters as well as by the insertion ability of the enzyme into those systems. A significant decrease in the enthalpy values with the increase of the cholesterol proportion in the liposome was observed. Besides that, the presence of cholesterol has allowed a reduction in the insertion of the catalytic activity in up to 42% when the lipid composition 9:5 DPPPC:Chol was used. Among the binary systems formed with molar ratios of 9:1, the one which showed the highest percentage of TNAP reconstitution was the DPPC:Chol system, with around 62% enzyme incorporation. The tertiary systems had around 30% incorporation of the catalytic activity, and the quaternary system around 25%. Besides the enzymatic activity assays, the enzyme incorporation to the vesicular systems can also be verified by the thermodynamic parameters change detected by DSC. In the calorimetry studies of all the proteoliposomes formed, significant decreases in the enthalpy values were observed when compared to the corresponding liposomes systems. Thereby, the results presented here provide new information that can contribute to understand the alkaline phosphatase behavior in the presence of different microdomain lipid compositions existent in the membrane, as well as understanding the regulation processes of the enzyme during the biomineralization process.

Os osteoblastos são responsáveis pelo início do processo de biomineralização óssea mediada pela liberação de vesículas da matriz (MVs). As MVs surgem por brotamento das superfícies laterais dos osteoblastos e são secretadas para a matriz. A membrana das MVs possuem níveis elevados de Fosfatase Alcalina (TNAP), entre outra enzimas/proteínas, bem como de Chol, em comparação com a membrana plasmática. O objetivo deste estudo foi a construção de proteolipossomos constituídos por Dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) ou Dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), com Colesterol (Chol) em diferentes proporções para a caracterização cinética da TNAP, utilizando os substratos ATP, PPi e ADP, a fim de se obter um sistema que mimetize as MVs. O aumento da concentração de Chol dificultou a incorporação da TNAP aos sistemas constituídos com DPPC, e facilitou a sua incorporação aos constituídos por DOPC. A presença do Chol em todos os sistemas miméticos preparados afetou os parâmetros cinéticos de hidrólise da TNAP para todos os substratos estudados. Entretanto, independentemente da presença do Chol, a hidrólise do PPi apresentou sempre uma maior eficiência (maior kcat/K0.5), sugerindo que este substrato provavelmente possa ser hidrolisado preferencialmente. O tratamento com 2 mM de ciclodextrina (bmCD), resultou na remoção de apenas 70% do Chol de proteolipossomos constituídos por DPPC:Chol 36% mol. Estudos de calorimetria diferencial (DSC) revelaram que a bmCD fica ligada ao sistemas vesiculares causando interferência para os demais ensaios. Quando 36% mol de colestenona (Achol), um análogo de Chol, foi empregado na construção dos proteolipossomos de DPPC, foram encontrados comportamentos cinéticos distintos para a TNAP. O ATP foi hidrolisado com uma Vmáx menor que a os sistemas constituídos por DPPC:Chol 36% e maior do que para sistemas de DOPC:Chol 36% mol. Os valores de K0.5 foram menores para DPPC:Achol 36 % mol em comparação aos sistemas análogos. Com relação a hidrolise do PPi, os parâmetros cinéticos foram similares, em relação aos sistemas estudados contendo DPPC:Chol ou DOPC:Chol. Por fim, foi avaliada a capacidade de propagação de nódulos de mineralização pelos sistemas vesiculares contendo DPPC, DPPC:Chol e DPPC:Achol (com e sem TNAP incorporada), utilizando o ATP como substrato. A mineralização foi cerda de 16 vezes mais eficiente na presença de protelipossomos que continham tanto Chol ou colestenona, do que para o sistema somente constituído por DPPC (cerca de 4 vezes), quando comparados com os respectivos sistemas de lipossomos (na ausência de enzima). Diante destas diferenças apresentadas, tanto no comportamento cinético, quanto na capacidade de mineralização, pode-se suger que o microambiente lipídico tem um importante papel das MVs. Uma explicação que pode ser sugerida é que fatores termodinâmicos como: a diminuição da entalpia de transição; perda de pré-transição; presença de cargas superficiais; presença de diferentes substratos; bem como, orientações das ligações de hidrogênio com a molécula de água na superfície dos proteolipossomos, podem acarretar em modificações conformacionais na TNAP. A relevância dos resultados apresentados pode contribuir no entendimento da função dos lipídios e de suas interações com as proteínas presentes na MVs no processo de biomineralização. / Osteoblasts are responsible for initiating the bone biomineralization process mediated by the release of matrix vesicles (MVs). The MVs arise by budding from the membrane of the osteoblasts and are secreted into the matrix. The MVs membrane has high levels of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP), among other enzymes/proteins, as well as cholesterol, compared with the plasma membrane. The objective of this study was to build proteoliposomes constituted by Dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) or dioleoylphosphatidylcholine (DOPC), with cholesterol (Chol) in different molar ratios for the kinetic characterization of TNAP, using the substrates ATP, ADP and PPi, in order to obtain systems that mimic the MVs. The increase in the cholesterol concentration hampered the incorporation of TNAP into the DPPC systems, but favored its incorporation into the DOPC liposomes. The presence of cholesterol in all prepared mimetic systems affected the kinetic parameters of hydrolysis for all substrates studied. Regardless of the presence of cholesterol, PPi hydrolysis always showed greater catalytic efficiency (kcat/K0.5), suggesting a preferential hydrolysis of this substrate. Treatment with 2 mM cyclodextrin (BMCD) resulted in removal of 70% of the cholesterol from the proteoliposome constituted of DPPC:Cholesterol 36% (molar ratio). Differential scanning calorimetry (DSC) studies showed that BMCD was bound to the vesicular systems interfering with the other assays. When 36% of cholestenone (Achol), an analogue of cholesterol, was employed in the construction of DPPC proteoliposomes, a different kinetic behavior was observed for TNAP. The Vmax for ATP hydrolysis was lower compared with the systems constituted of DPPC:Chol 36% and higher than that obtained for the DOPC:Chol 36% system. The values of K0.5 were lower for DPPC:Achol 36% compared to the similar systems. With respect to the hydrolysis of PPi, the kinetic parameters were similar for the systems constituted of DPPC:Chol and DOPC:Chol. Finally, we evaluated the ability of the vesicular systems containing DPPC, DPPC:Chol and DPPC:Achol (with and without TNAP incorporated) to propagate mineralization nodules, using ATP as substrate. The mineralization was about 16 times more efficient in the presence of proteoliposomes containing Chol or Achol than for the system constituted of DPPC only (about 4 times more efficient) compared with the corresponding liposome (in the absence of enzyme). Given the differences observed for both the kinetic behavior and the mineralization ability of the different systems, we suggest that the lipid microenvironment plays an important role in MVs function. A possible explanation for these differences is that thermodynamic factors such as the decrease in the enthalpy of transition and the loss of pre-transition, as well as the presence of surface charges, the presence of different substrates, and the orientation of hydrogen bonds with the water molecule on the surface of the proteoliposomes, may cause conformational changes in TNAP molecule. These relevant results can contribute for the understanding of the role of lipids and their interactions with proteins present in MVs in the biomineralization process.

Dentre os diversos processos de formação de mineral em organismos vivos, a formação do tecido ósseo é um exemplo particular, uma vez que fosfatos de cálcio, na forma de hidroxiapatita, são produzidos em meio a fibrilas de colágeno na matriz extracelular de células osteogênicas; processo este regulado por um complexo enzimático. A fosfatase alcalina tecido não-específico (TNAP) desempenha um papel fundamental na histogênese óssea, responsável principalmente pela produção de fosfato inorgânico necessário para a formação dos minerais. Diversas abordagens experimentais permitem a reconstituição desta enzima em sistemas miméticos de membrana celular, dentre os quais, os filmes Langmuir-Blodgett (LB), que possibilitam a formação de materiais com propriedades osteoindutoras. No presente estudo, foi investigada a imobilização desta enzima em filmes LB sobre suportes de Ti. O ácido dimiristoil fosfatídico foi o fosfolipídeo utilizado na confecção dos filmes LB, obtendo um regime de deposição linear de massa em função do número de camadas depositadas em subfases de CaCl2. A TNAP foi imobilizada nos filmes através de duas metodologias: a partir da adsorção física da enzima aos filmes LB pré-transferidos a um suporte sólido, ou ainda por meio da construção do filme a partir de uma monocamada mista de DMPA/Ca2+/TNAP. Em ambas as metodologias adotadas, foi obtida uma diminuição drástica da atividade fosfohidrolítica da forma imobilizada da enzima, em relação à sua atividade obtida em meio homogêneo. Ao expor suportes de Ti modificados com os filmes LB em uma solução contendo íons Ca2+ e ATP como fonte de fosfato inorgânico, foi observada a formação de uma maior quantidade de mineral para as amostras contendo a TNAP imobilizada; atribuída a uma maior supersaturação local de íons fosfato devido a maior hidrólise de ATP na presença da enzima, demonstrando a capacidade desta em conferir à superfície modificada uma maior capacidade na indução de formação de mineral. Após este ensaio de mineralização in vitro, foi obtida uma maior hidrofilicidade das superfícies recobertas com os filmes LB na presença da TNAP, tornando estas superfícies modificadas mais bioativas. A presença dos filmes LB mistos de lipídeo/TNAP nas superfícies permitiram a adesão, proliferação e recobrimento homogêneo de células osteogênicas, que posteriormente promoveram o extravasamento de fibrilas proteicas e a formação de nódulos de mineralização. Estes resultados são importantes na confecção de materiais que acelerem o processo de osteoindução. / Among all the processes of mineral formation in living organisms, the osseous tissue formation is a particular example, since that calcium phosphates as hydroxyapatite are produced among collagen fibrils at the extracellular matrix of osteogenic cells, being this process regulated by an enzymatic complex. The tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) plays a central role on the osseous histogenesis, responsible mainly for the inorganic phosphate production necessary for mineral formation. Various experimental approaches allows this enzyme reconstitution in cellular membrane mimetic systems, among which, the Langmuir-Blodgett films (LB), that allows the formation of materials with osteoinductive properties. With that in mind, the immobilization of that enzyme in titanium supports modified with LB films was investigated. The dimyristoyl phosphatidic acid was the phospholipid used in the LB film construction, obtaining a linear deposition-layer numbers relation in CaCl2 subphases. The TNAP was immobilized at the films through two main methodologies: from the physical adsorption of the enzyme to the LB film pre-constructed on a solid support, or through the film construction from the mixed DMPA/Ca2+/TNAP monolayer. At both the adopted methodologies, it was obtained a diminishment at the phosphohidrolytic activity of the immobilized enzyme, comparing to its activity at homogeneous media. Exposing the Ti supports with the LB films in a solution containing Ca2+ ions and ATP as a phosphate source, it was observed a higeher mineral formation to the samples containing the immobilized TNAP, possibly due to a higher phosphate ions supersaturation from the higher ATP hydrolysis at the presence of the enzyme, demonstrating the capacity of the TNAP in promoting a higher mineral formation induction to the modified surface. After this in vitro mineralization assay, it was obtained surfaces more hydrophilic at presence of the LB films containing TNAP, making those modified surfaces more bioactive. The mixed LB films presence at the surfaces allowed the adhesion, proliferation and homogeneous covering of osteogenic cells, that posteriorly promoted the production of proteic fibrils and mineralization nodules. Those results are important in order to construct materials more osteointegrative.

O fenômeno da bio- e quimiluminescência tem atraído o interesse da comunidade científica nas últimas décadas não só pelo seu inerente interesse acadêmico, mas também devido as incontáveis aplicações analíticas que dele têm surgido. A maior parte do trabalho acadêmico que tem sido desenvolvido está relacionado ao estudo do mecanismo de geração de estados excitados e a eficiência de desativação radiativa. Por outro lado, do ponto de vista das aplicações tecnológicas, as metodologias para análise de enzimas, drogas e metabólitos, aplicadas à imunologia, microbiologia, medicina forense, etc., que se baseiam em quimiluminescência, estão entre as mais utilizadas em procedimentos de rotina em laboratórios. O desenvolvimento de substratos e, conseqüentemente, novas técnicas quimiluminescentes tem se tornado cada vez mais importante devido a alta sensibilidade desses ensaios, tipicamente equivalente ou melhor do que aqueles que utilizam rótulos radioativos. Esta tese apresenta o desenvolvimento de novas metodologias quimiluminescentes para a determinação de atividade enzimática. O princípio químico é a geração de peróxidos cíclicos instáveis, conhecidos como 1,2-dioxetanos, após a hidrólise de substratos específicos, catalisada pela enzima objeto de estudo. Anéis dioxetânicos são conhecidos pela sua propriedade de gerar produtos em estados eletronicamente excitados quando decompostos. A emissão de luz pode ser relacionada à atividade enzimática. Foi desenvolvido o substrato (fosfato dissódico de 2-metil-1-propenila, NA-MPP) (I)), capaz de produzir o composto 2-metil-1-propen-1-ol quando hidrolisado via a ação catalítica das enzimas fosfatase alcalina (ALP) ou fosfatase ácida (ACP). Este enol é oxidado, sob ação catalítica da enzima peroxidase de raiz forte (HRP), gerando acetona em estado excitado triplete. A emissão de luz direta ou sensibilizada da acetona excitada pode ser correlacionada a atividade enzimatica da ALP ou ACP. A determinação da atividade dessas enzimas livres ou ligadas em anticorpos (conjugados ALP-IgG) tem grande aplicação em tecnologias de diagnóstico, seja como um marcador de diversas doenças, seja como uma sonda em ensaios imuno-enzimáticos (EIA). A sensibilidade alcançada com este substrato foi de 10-15 mols de ALP, 0,0027 unid. de ACP e diluições de até 300.000 de um conjugado (ALP-IgG) por ensaio. Também foi possível correlacionar a atividade de ALP à velocidade de consumo do oxigênio dissolvido no meio de reação, que é uma característica dessa oxidação. Partindo do mesmo princípio delineado no parágrafo anterior, desenvolveu-se um composto para determinação de proteases. Para isso, o composto N-etil-N-(2-metil-1-propenil)benzenamida (II) foi preparado, pois a clivagem de sua ligação amídica geraria uma enamina, que também pode ser oxidada pela ação catalítica da HRP. No entanto, nossos estudos mostraram que este composto não é reconhecido como substrato das proteases. Tomando como base a bem conhecida característica de gerar uma fraca emissão de luz quando derivados indólicos são oxidados por agentes oxidantes clássicos, como KMnO4, K2S2O4, etc., foi estudado o potencial quimiluminescente de alguns derivados indólicos quando submetidos ao sistema HRP/H2O2/O2. Como era esperado, detectou-se quimiluminescência de baixa intensidade para a maioria dos derivados indólicos. Também neste caso a clivagem do anel indólico, via um intermediário dioxetânico, parece ser a responsável pela emissão observada na maioria dos compostos testados. Além disso, a oxidação do composto 2-metilindol (III) mostrou uma eficiência de quimiluminescência com cerca de 3 ordens de grandeza maior que os demais derivados. Verificou-se que o comportamento diferenciado desse composto estava relacionado à exclusiva formação de um composto secundário. A estrutura desse composto foi parcialmente atribuída ao 2,2\'-dimetil-2,2\'-diindoxil. Então, utilizando o 2-metilindol como substrato, desenvolveu-se uma metodologia analítica para determinação de HRP livre ou ligada em anticorpos (conjugados HRP-IgG). Assim como no caso da enzima ALP, conjugados do tipo HRP-IgG são largamente utilizados em EIA. Também com base nas características quimiluminescentes de \'alfa\'-hidroperóxi-cetonas quando submetidas a um forte meio alcalino, desenvolveu-se um potencial substrato para análise de esterases. A hidrólise catalisada por esterase de 2-peracetoxiadamantano-2-carboxialdeído (IV) geraria um \'alfa\'-hidroperóxi-aldeído, que por um ataque nucleofílico intramolecular, levaria a um intermediário dioxetânico. Este composto mostrou-se instável, gerando quimiluminescência mesmo na ausência da enzima. Este fato inviabilizou o seu uso como planejado. / The bio- and chemiluminescent phenomena have attracted the scientists attention in the last decades not only because its inherent academic interests, but also due the uncounted analytical applications that it has originated. Most of the academic work was devoted to the study of the mechanism responsible for the generation of the excited states and the efficiency of radiative deactivation. On the other hand, the technological developments pointed to methodologies for enzyme, drug, and metabolite determination applied to immunological, microbiology, forensic science, etc., based on chemiluminescence, which are already among the most applied techniques in routine laboratory procedures. The development of chemiluminescent substrates has become increasingly important due to their high sensitivity, typically equivalent to or better than assays using radioactive labels. This thesis reports the development of new chemiluminescent methodologies for enzymatic activity determination. The chemical basis is the generation of unstable cyclic peroxides, called 1,2-dioxetanes, upon hydrolysis of specific substrates catalyzed by the target enzyme. Dioxetanes rings are known by their properties to generate electronically excited products upon decomposition. The light emission can be related to enzymatic activity. It was developed a substrate (dissodium 2-methyl-1-propenyl phosphate) (Na-MPP) (I) able to produce 2-methyl-1-propen-1-ol when catalytically hydrolyzed by alkaline (ALP) or acid (ACP) phosphatases enzymes. This enol is oxidized, upon horseradish peroxidase (HRP) action, yielding acetone in triplet excited state. The direct or sensitized light emission of the excited acetone can be correlated to enzymatic activity of ALP or ACP. The activity of this enzyme, free or bound to antibody (ALP conjugates), is widely used in diagnostic technologies, either as a direct marker of several diseases or as an enzymatic probe in enzyme immunoassays (EIA). The sensibility reached with this substrate was 10-15 mols to ALP, 0,0027 u/mL to ACP and dilutions up to 300.000 of ALP-IgG per assay. Since the HRP system consumes dissolved oxygen during the oxidation of the enol, ALP quantification may be performed by following the oxygen uptake rate. By applying the same principle above delineated, it was synthesized a compound for proteases activity determination. Thus, the compound N-ethyl-N-(2-methylpropen-1-yl)benzenamide (II) was prepared, since its hydrolysis would lead to an enamine , which is known to be oxidized via HRP with light emission. However, our studies showed that II is not recognized as a substrate by proteases. Owning to the well known weak emission elicited when indole derivatives are oxidized by classical oxidants like KMnO4, K2S2O4, etc., it was studied the chemiluminescent potential when indoles are submitted to the HRP/H2O2/O2 oxidant system. Indeed, weak chemiluminescence was detected for almost all derivatives. Likewise, the oxidation of 2,3-bond of indoles, through a dioxetane intermediate leading to an open-ring product, seems responsible for this emission. Furthermore, the oxidation of 2-methylindole (III) showed a chemiluminescence efficiency about 3 orders of magnitude higher. It was observed that the high chemiluminescent yield was related to exclusive formation of a secundary product. Its structure was partially attributed to 2,2\'-dimethyl-2,2\'-diindoxil. Thus, using 2-methylindole as substrate was possible to develop an analytical procedure to quantify HRP activity, free or bound to antibodies (conjugates HRP-IgG). In EIA the enzymes HRP and ALP are the most important labels. From the also known chemiluminescent characteristics of \'alpha\'-hidroperoxy-ketones, when submitted to strong alkaline medium, it was developed a potential substrate to esterases. The esterase catalyzed hydrolysis of 2-acetylperoxiadamantane-2-carboxaldeyde (IV) would generate an \'alpha\'-hidroperoxy-aldeyde which, by an intramolecular nucleofilic attack, would lead to a dioxetane intermediate. This compound showed to be unstable and it generated chemiluminescence in the absence of the enzyme. This fact impaired its use as planned.

A fosfatase alcalina é uma fosfomonohidrolase inespecífica, capaz de hidrolisar monoésteres de fosfato, pirofosfato, diésteres de fosfato, bem como catalisar reações de transfosforilação, e é denominada \"alcalina\" por sua habilidade de efetuar estas reações mais eficientemente em pH acima do neutro (pH 8-11). O objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia para a obtenção de uma fração de membrana rica em fosfatase alcalina a partir de culturas de células osteoblásticas, provenientes de medula óssea de rato, sem a utilização de solventes orgânicos, colagenase ou outras proteases. O procedimento padronizado é simples e reprodutível, com a vantagem da considerável redução do tempo necessário para se obter esta fração de membrana, o que contribui para um menor efeito desnaturante sobre a enzima. A fosfatase alcalina é inserida à membrana plasmática por uma âncora GPI e foi solubilizada tanto com polidocanol (1%, p/v) quanto com PIPLC (0,2 U/mL), hidrolisando diversos substratos (PNFF, ATP, PPi, ADP, ?-glicerofosfato, glicose-1-fosfato, glicose-6-fosfato e frutose-6-fosfato) e sendo inibida por inibidores clássicos deste grupo de enzimas (levanisol, teofilina, ZnCl2, vanadato, fosfato e arsenato). Os efeitos de lipossomos constituídos por DPPC, DPPC:DPPS (9:1 e 8:2, razão molar) e DPPC:DODAB (9:1 e 8:2, razão molar) na habilidade tanto de inserção da enzima nos sistemas vesiculares, bem como de modulação da atividade da enzima reconstituída, também foram avaliados. A reconstituição da fosfatase alcalina nos lipossomos mistos constituídos de DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) e DPPC:DODAB (8:2) proporcionou máxima incorporação da atividade PNFFase da enzima (cerca de 90%, 75% e 90%, respectivamente) após 4 horas, 5 horas e 40 minutos, respectivamente, de incubação dos diversos lipossomos com a proteína. No entanto, utilizando lipossomos de DPPC:DODAB (9:1), apenas cerca de 50% da atividade PNFFase da enzima foi incorporada aos sistemas mesmo após 5 horas de incubação. Para os lipossomos com carga positiva, uma maior proporção de DODAB nos sistemas de DPPC favoreceu a inserção da fosfatase alcalina aos sistemas após um curto período de incubação. Para os lipossomos com carga negativa, as diferentes proporções de DPPS utilizadas não exerceram grande influência tanto na velocidade de incorporação quanto na quantidade de enzima incorporada aos sistemas. Para todos os sistemas utilizados, o processo de incorporação é tempo dependente. A eletroforese dos proteolipossomos de DPPC revelou a presença de uma única banda protéica bem intensa, com massa molecular ao redor de 60 kDa (quando desnaturada), que apresentou atividade de fosfomonohidrolase em condição não-desnaturante, com massa molecular de 120 kDa. Assim, com esta estratégia, foi possível obter proteolipossomos ricos em fosfatase alcalina devido à inserção preferencial da âncora de GPI às bicamadas lipídicas, em detrimento das outras proteínas que não interagem favoravelmente com os sistemas vesiculares, comprovando que a metodologia de reconstituição padronizada pode ser usada eficientemente na obtenção de sistemas de proteolipossomos sem a necessidade de uma etapa de purificação prévia da enzima solubilizada, de modo a se obter um máximo de incorporação da enzima às vesículas com mínima perda em atividade. A reconstituição da enzima empregando-se células ghost resseladas foi obtida incubando-se volumes iguais de enzima (23 ?g/mL) e células ghost (0,22 mg/mL), por 2 horas, a 25ºC, com cerca de 40% da atividade PNFFase da fosfatase alcalina incorporada às vesículas. Para verificar o efeito do microambiente da membrana sobre a atividade da enzima reconstituída, foram determinados os parâmetros cinéticos de hidrólise para diferentes substratos (ATP, PPi e PNFF). Para todos os substratos, uma única classe de sítios de hidrólise foi observada, com valores de K0,5 que variaram de 0,14 a 2,7 mM. Excesso de PPi e ATP no meio reacional inibiu as atividades PPase e ATPase da enzima reconstituída, respectivamente, em todos os sistemas estudados. A hidrólise de PPi apresentou efeitos cooperativos positivos para todos os sistemas, enquanto que para a hidrólise de ATP, uma pequena cooperatividade positiva foi observada apenas para os sistemas constituídos de DPPC e contendo DPPS em sua composição. Assim, a enzima não perdeu a habilidade de hidrolisar nenhum dos substratos quando reconstituída nos diferentes sistemas vesiculares, e todos os dados obtidos reforçam a hipótese de que a composição lipídica do microambiente onde a fosfatase alcalina se encontra exerce grande influência na modulação tanto da atividade da enzima quanto da interação da mesma com os sistemas vesiculares. Assim, os resultados obtidos fornecem novas informações que poderão contribuir tanto para a compreensão dos mecanismos de interação da fosfatase alcalina com a membrana, quanto para estudos da função da enzima durante o processo de biomineralização. / Alkaline phosphatase is a multifunctional enzyme, capable of hydrolyzing phosphate monoesters, pyrophosphate, phosphodiesters, as well as catalyzing transphosphorylation reactions, and it is named \"alkaline\" due to its ability to perform these reactions more efficiently in pH above the neutral (pH 8-11). The aim of this work was to standardize a methodology to obtain a membrane fraction rich in alkaline phosphatase from osteoblastic cells cultures, originated from rat bone marrow, without the use of organic solvents, collagenase or others proteases. The standardized procedure is simple and easy to reproduce, with the advantage of considerable reduction in the time needed to obtain this membrane fraction, which contributes to a smaller denaturing effect on the enzyme. Alkaline phosphatase is a membrane-bound enzyme attached to the cell membrane via a GPI anchor and was solubilized with both polidocanol (1%, w/v) and PIPLC (0,2 U/mL), hydrolyzing several substrates (PNPP, ATP, PPi, ADP, beta-glycerophosphate, glucose-1-phosphate, glucose-6-phosphate and fructose-6-phosphate) and being inhibited by some classical inhibitors of this group of enzymes (levamisole, theophylline, ZnCl2, vanadate, phosphate and arsenate). The effect of liposomes constituted by DPPC, DPPC:DPPS (9:1 and 8:2, molar ratio) and DPPC:DODAB (9:1 and 8:2, molar ratio) on the enzyme insertion ability in the vesicular systems and activity modulation of the reconstituted enzyme were also evaluated. The alkaline phosphatase reconstitution in the mixed liposomes constituted by DPPC:DPPS (9:1), DPPC:DPPS (8:2) and DPPC:DODAB (8:2) presented maximum incorporation of the PNPPase enzyme activity (about 90%, 75% and 90%, respectively) after 4 hours, 5 hours and 40 minutes, respectively, of incubation of the several liposomes with the protein. However, using DPPC:DODAB (9:1) liposomes, only about 50% of the PNPPase enzyme activity was incorporated in the systems, even after 5 hours of incubation. For positive charged liposomes, a higher proportion of DODAB in the DPPC systems favored the alkaline phosphatase insertion into it after a short period of incubation. For negative charged liposomes, the different proportions of DPPS used did not have a big influence in both, incorporation velocity and quantity of incorporated enzyme into the systems. For all the systems used, the incorporation process is time dependent. SDS-PAGE of the DPPC proteoliposomes revealed only a single protein band, with molecular mass of about 60 kDa (when denaturated), which presented phosphomonohydrolase activity under non-denaturing conditions, with molecular mass of about 120 kDa. Thus, using this strategy, it was possible to obtain proteoliposomes rich in alkaline phosphatase due to the preferential insertion of the GPI anchor in the lipid bilayers, since the other proteins do not interact favorably with the vesicular systems. This proves that the standardized methodology for reconstitution can be used efficiently to obtain proteoliposomes systems without prior purification of the solubilized enzyme, with its maximum incorporation in the vesicles and a minimum loss of activity. The reconstitution of the enzyme using resealed ghost cells was obtained by incubating equal volumes of enzyme (23 microg/mL) and ghost cells (0,22 mg/mL), for 2 hours, at 25ºC, with about 40% of the alkaline phosphatase PNPPase activity being incorporated into the vesicles. To verify the effect of the membrane microenvironment on the activity of the reconstituted enzyme, the kinetic parameters for the hydrolysis of different substrates (ATP, PPi and PNPP) were determined. For all the substrates, only one class of hydrolysis sites was observed, with K0,5 values that varied from 0,14 to 2,7 mM. Excess of PPi and ATP in the reaction medium inhibited the PPase and ATPase activities of the reconstituted enzyme, respectively, in all systems studied. PPi hydrolysis presented positive cooperative effects for all systems, while for ATP hydrolysis a small positive cooperativity was observed only for the systems constituted by DPPC and containing DPPS in its composition. Thus, the enzyme did not lose the ability to hydrolyse any of the studied substrates when reconstituted in the different vesicular systems and all the data obtained strengthen the hypothesis that the lipid composition of the microenvironment where the alkaline phosphatase is located plays a great influence on the modulation of both enzyme activity and enzyme interaction with the vesicular systems. Thus, the results obtained provide new information that could contribute to the comprehension of the interaction mechanisms of the alkaline phosphatase with the membrane, as well as to studies of the enzyme function during the biomineralization process.