Orientador: Everson Alves Miranda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-14T10:04:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Robic_Goran_D.pdf: 5874566 bytes, checksum: 5a69e6daebf342bd09772a2c02c0c766 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A técnica de eletrocoagulação tem sido usada basicamente em tratamento de água potável e águas residuais. Neste trabalho propusemos o uso desta técnica na recuperação e purificação (RPB) de proteínas recombinantes produzidas em plantas geneticamente modificadas. O desafio principal da RPB de uso de plantas como biorreatores é a presença de clorofila e polifenóis nos seus extratos, que causam precipitação e desnaturação das proteínas de interesse, além de danificarem membranas e géis de separação. Portanto, a remoção destes compostos é essencial. No presente trabalho estudou-se a aplicação de eletrocoagulação para clarificar extratos de folhas de Nicotiana benthamiana transgênica removendo a clorofila e polifenóis, sem remover a proteína recombinante sGFP (proteína verde fluorescente sintética). Primeiramente foi necessário desenvolver um método de determinação e quantificação de sGFP baseado na fluorescência intrínseca desta proteína. Os problemas com a fluorescência de fundo presente nos extratos de folhas de N. benthamiana e o aumento de intensidade da fluorescência da sGFP nestes extratos - provavelmente o resultado de dimerização de moléculas de sGFP promovida por composto(s) do extrato - por nós observados, tinham que ser resolvidos. Diluição de 20 vezes dos extratos contendo sGFP com solução de uréia 6 mol/L em fosfato de sódio 50 mmol/L pH 7,00 eliminou completamente estas duas interferências. Os estudos da eletrocoagulação foram iniciados desenvolvendo-se dois modelos de remoção de compostos biológicos de soluções aquosas por esta técnica. Os modelos desenvolvidos são baseados na formação de complexos entre o composto e o gel de hidróxido de alumínio ou a partição do composto entre a fase aquosa e fase do gel de hidróxido de alumínio. Análises teóricas e experimentais revelaram que os parâmetros relevantes na remoção destes compostos são a corrente utilizada - que afeta a taxa de formação de hidróxido de alumínio - e o pH da eletrocoagulação - que afeta a carga tanto do gel formado como dos compostos a serem removidos. Gel de hidróxido de alumínio produzido a pH 8,0 apresentou alta eficiência em remover clorofila e polifenóis dos extratos de folhas de N. benthamiana não-transgênica, ao passo que somente uma pequena porção de proteínas nativas foi removida. Portanto, o gel de hidróxido de alumínio produzido nesta condição foi adicionado a extratos de N. benthamiana transgênica contendo sGFP. A remoção de 99,7% clorofila, de 88,5% dos polifenóis e de 38,4% de proteína total do extrato foi observada sem remoção da sGFP (fator de purificação de 1,6). Portanto, a eletrocoagulação pode também ser usada como técnica de pré-purificação de proteínas recombinantes e ao mesmo tempo como método de clarificação de extratos de folhas. / Abstract: Electrocoagulation is a technique that has been basically applied to water and wastewater treatment. We propose here the extension of this relatively cheap technique to the field of downstream processing (DSP) of plant-derived proteins, in which plants are used as a bioreactor for recombinant protein production. The main problem in the DSP of this plant-based technology is the presence of chlorophyll and phenolic compounds in plant extracts, which tend to precipitate and denature the proteins besides damaging separation membranes and gels. Therefore their removal from the extracts is essential. In the present work we studied the application of a electrocoagulation based technique as a prepurification technique to clarify transgenic Nicotiana benthamiana leaf extracts by removing chlorophyll and phenolic compounds without removing the recombinant protein sGFP (synthetic green fluorescent protein). First, a method for fluorescence-based quantification of sGFP had to be developed. The background fluorescence of plant extracts and the increased level of sGFP fluorescence in N. benthamiana leaves extracts - probably the result of dimerization of sGFP molecules promoted by interaction with some component(s) of tobacco extract - observed by us had to be overcome. Diluting the tobacco extract spiked with sGFP by 20 times with 6 mol/L urea solution in 50 mmol/L sodium phosphate buffer pH 7.00 completely eliminated the two mentioned interferences. The electrocoagulation studies started with the development of simple timedependent models for electrocoagulation of biological compounds from solutions. These models are based on either stoichiometric complex formation between aluminium hydroxide gel and the compound or the partition of the compound between the aqueous and the aluminium hydroxide gel phase. Theoretical and experimental analysis demonstrated that a relevant parameters in the process of electrocoagulation of biological materials are the current applied - since it affects the rate of aluminium hydroxide formation - and the pH of electrocoagulation - since it affects the charges of the aluminium hydroxide gel formed and the components to be removed. Aluminium hydroxide gel produced at pH 8.0 demonstrated a high efficiency of clorophyll and phenolic compounds removal from non-transgenic N. benthamiana leafs extracts, while removing only relative small portion of the native proteins. Therefore, the aluminum hydroxide gel produced at this pH was added to transgenic N. benthamiana leaf extracts containing recombinant sGFP. Removal of 99.7% of chlorophyll and 88.5% of phenolic compounds were observed. Also at this conditions 38.4% of total protein was removed, which resulted in a purification factor of 1.6 with 100% of the sGFP recovered. Therefore the method proposed could also be used as a strategy of pre-purification of recombinant proteins besides at the same time clarifying the tobacco leaf extracts. / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

A saliva humana possui diversas enzimas que apresentam atividades específicas e algumas delas podem estar envolvidas no processo inflamatório que acometem os implantes dentários. A arginase é uma enzima hidrolítica que utiliza a L-arginina como substrato para formação da L-ornitina e uréia. Acredita-se que um aumento na produção de arginase possa levar à uma redução na produção de óxido nítrico, consequentemente aumentando a suscetibilidade à infecção bacteriana. Considerando a hipótese de que o número de implantes nos indivíduos e o fumo possam alterar a produção de arginase e que o mesmo é considerado um fator de risco para o sucesso da terapia com implantes, o presente estudo objetivou avaliar o efeito de ambas as variáveis sobre a atividade da arginase salivar (AS) em pacientes portadores de implantes dentários. Amostras de saliva de 102 indivíduos foram coletadas: 26 não-fumantes e sem implantes dentais (A), 28 pacientes com até 4 implantes dentais e não-fumantes (B), 29 pacientes com cinco ou mais implantes dentais e não-fumantes (C), dez fumantes com implantes (D) e nove fumantes sem implantes (E). Os níveis de AS foram expressos em U/mg proteína e determinados por espectrofotometria através da mensuração da L-ornitina e da proteína salivar. Houve um aumento significativo dos níveis de AS no grupo D (64.26) em relação aos grupos A (10.72, p=0), B (10.66, p=0), C (11.21, p=0) e E (13.66, p=0). Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos A, B, C e E (p>0,05). Dentro dos limites do presente estudo, pode-se concluir que a atividade da arginase salivar encontra-se elevada em indivíduos fumantes portadores de implante dentário, sugerindo um possível mecanismo pelo qual o fumo pode levar ao insucesso desta terapia reabilitadora. / Human saliva possesses many enzymes with activity and some of them might be involved in the inflammatory process of dental implants. Arginase is a hydrolytic enzyme that catalyses L- arginine into ornithine and urea. Its known that a high production of arginase can decreased the production of nitric oxide, consequently leading to bacterial infection susceptibility. To regard the hypothesis of number of implants and smoking might change the production of arginase and considering that smoking is a risk factor of implant therapy, the aim of this study was to evaluate the effect of both on the activity of arginase in saliva of subjects with dental implants. Saliva of 102 subjects were collected: 26 non-smoking and without dental implants (A), 28 with 4 dental implants or less and non-smoking (B), 29 with five dental implants or more and non-smoking (C), ten smokers with implants (D) and nine smokers and without dental implants (E). The arginase levels were expressed in U/mg and analyzed by spectophotometry and it was determined by measuring the Lornitine formation from L-arginine. The result showed that the mean values of arginase in group D (64.26) were statistically different among groups A (10.72, p=0), B (10.66, p=0), C (11.21, p=0) e D (13.66, p=0). There was no statistically difference among groups A, B, C and E (p>0,05). By the limits of the present study, it can be concluded that arginase activity shown higher in subjects smokers with dental implants, suggesting a possible mechanism that smoke may lead to unsuccess of this rehabilitation therapy.

Essa pesquisa objetivou avaliar métodos para estimar o vigor das sementes de fumo (Nicotiana tabacum L.) variedade Virgínia, cultivar CSC 439, nuas e peletizadas representadas por cinco lotes de sementes. Essas sementes foram submetidas aos seguintes testes de vigor: condutividade elétrica (0,5; 0,8; e 1,0 g e 2,5; 4,0 e 5,0 g de sementes nuas e peletizadas, respectivamente, hidratadas por 2, 4, 6, 8 e 24h em 25 mL de água destilada à 25 °C), envelhecimento acelerado (41 °C e 43 °C por 12 e 24h) com água (100% UR) e com solução salina de NaCl saturada (76% UR) e deterioração controlada (graus de umidade de 20% e 24% para sementes nuas e 8% e 12% para peletizadas, a 40 °C e 43 °C por 24 e 48h). As avaliações foram realizadas aos 7, aos 10 e aos 16 DAS (dias após a semeadura). Adicionalmente foi determinado o grau de umidade e realizados os testes de germinação, de primeira contagem de germinação e, a emergência da plântula e a velocidade de emergência da plântula. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado com quatro repetições. Os dados foram submetidos separadamente à análise de variância e a comparação das médias pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Todas as análises foram repetidas uma vez. Conclui-se que o teste de condutividade elétrica não é eficiente para ordenar os lotes de semente de fumo, nuas e peletizadas, em diferentes níveis de vigor. Para o teste de envelhecimento acelerado as condições mais adequadas são 41 ºC por 12 horas de exposição com avaliação aos 7 dias após a semeadura, utilizando água (100% UR) para as sementes nuas e solução salina de NaCl (76% UR) para as sementes peletizadas. Para o teste de deterioração controlada, as combinações mais adequadas para as sementes nuas são 24% de água, exposição a 43 °C por 24h e avaliação aos 7 dias após a semeadura e para as sementes peletizadas 8 % de água a 43 °C por 48h e avaliação aos 16 dias. / The objective of this research was to evaluate methods for estimating the physiological quality of tobacco seeds (Nicotiana tabacum L.) \'Virginia variety, CSC 439\' cultivar. For this, five original seeds lots and five coated seed lots were used. The seed vigor were evaluated by electrical conductivity test (0.5, 0.8, and 1.0 g and 2.5, 4.0 and 5.0 g of original and coated seeds, respectively, hydrated for 2, 4, 6, 8 and 24 hours in 25 mL of distilled water at 25 ° C), accelerated aging test (41 ° C and 43 ° C for 12 and 24 hours) with water and saturated salt solution (NaCl) and controlled deterioration test (moisture content 20% and 24% for original seeds and 8% and 12% for coated seeds at 40 ° C and 43 ° C for 24 and 48). The evaluations were performed at 7, 10 and 16 DAS (days after sowing). Additionally, it was determined the seed the moisture content, germination test, first counting, seedling emergence and speed of seedling emergence. The experimental design was a completely randomized and the means were compared by Tukey test (5%). In conclusion, the electrical conductivity test is not efficient to sort lots of original and coated tobacco seeds in different levels of vigor. On the accelerated aging test the most adequate conditions are observed at 41 ºC for 12 hours of exposition and evaluations performed at 7 days after sowing, by using water (100% HR) for the original seeds and NaCl saturated salt solution (76% HR) for coated seeds. On the controlled deterioration test for the tobacco seeds the most adequated conditions are observed with the combinations of 24% of moisture content for the original seeds at 43 °C for 24 hours on evaluations performed at 7 days after sowing and 8% moisture content at 43 °C for 48 hours of exposition for coated seeds.

Considerando-se que o tabagismo afeta a maioria dos sistemas do corpo humano, que os estudos concentram-se mais sobre os efeitos deletérios do tabaco em doenças cujos órgãos vitais são afetados e que seu impacto na formação e na consolidação óssea ainda não está estabelecido, a proposta neste estudo foi avaliar os efeitos da exposição à fumaça de cigarro no mecanismo de consolidação e remodelamento da matriz óssea e relacioná-los ao processo inflamatório desencadeado por fratura em modelo desenvolvido em camundongos. Para isso, camundongos C57BL6 machos foram distribuídos em quatro grupos: C (n=29) expostos ao ar ambiente; F (n=23) expostos ao ar ambiente e submetidos à osteotomia da tíbia direita; CS (n=29) expostos à fumaça de cigarro; FCS (n=23) expostos à fumaça de cigarro e submetidos à osteotomia da tíbia direita. Nossos dados indicaram diminuição do volume trabecular, da mineralização, MS/BS% (p < 0,05), e da formação óssea, MAR (p=0,0004), bem como aumento de osteoclastos, Oc.S/BS% (p=0,0361), e de reabsorção óssea, ES/BS% (p=0,0114), no grupo CS, quando comparado ao grupo C. Identificamos uma elevação significativa de IL-6 nos grupos CS e FCS (p < 0,001) na comparação com os grupos C e F (p < 0,05). Observamos diminuição de VEGF nos grupos CS e FCS, quando comparados com os grupos C e F (p=0,01). O índice de IGF demonstrou-se diminuído nos grupos CS e FCS, quando comparados com os grupos C e S (p < 0,05). A matriz fibrilar apresentou um intenso remodelamento, caracterizado pelo aumento da expressão de Colágeno V na avaliação por imuno-histoquímica nos grupos CS, F e FCS, comparados com C (p < 0,05), e da expressão dos genes COL5A1 (p < 0,0001) e COL5A2 nos grupos F e FCS (p < 0,0001). Identificamos também diminuição significativa de Colágeno I nos grupos CS, F e FCS, comparados com C (p < 0,001), e da expressão dos genes COL1A1 no grupo CS (p=0,008) e COL1A2 nos grupos CS, F e FCS (p=0,005). Nosso estudo mostra que a exposição à fumaça de cigarro altera a composição das fibras de colágeno pertencentes à matriz fibrilar óssea, retarda a mineralização e modifica a interação entre os diferentes tipos de colágeno, importantes no desempenho funcional do osso / Introduction: The impact of cigarette smoke on bone metabolism is not yet fully understood. This study aimed to verify the effects of cigarette smoke exposure in bone healing in an experimental tibial fracture model, evaluating the mineralization process, bone cellular differentiation/function and collagen types deposition. Materials and Methods: C57BL/6 male mice were assigned into four groups: C(n=29): exposure to room air; F(n=23): exposure to room air and right tibia osteotomy; CS(n=29): exposure to cigarette smoke; FCS(n=23): exposure to cigarette smoke and right tibia osteotomy. Results: Histomorphometry of Bone Mineral Matrix revealed that cigarette smoke exposure significantly reduced thickness of bone trabeculae, associated with a decrease in mineralizing surface and in rate of mineral apposition, which was reflected in lower bone formation rate and consequently in a longer time for mineralization. Both resorption surface and osteoclastic surface were higher in the CS group, evidencing the increase of the resorptive action of cigarette smoke. Histomorphometry of Bone Fibrillar Matrix: Type I collagen demonstrated a decrease in CS and FCS compared to C (p < 0.01); Type V collagen demonstrated an increase in CS, FC and FSC compared to C (p < 0.0001). The cytokines expression evaluation demonstrated that only CS exposure has already induced a VEGF and IGF decrease with a concomitant increase in IL-6 and these changes were intensified under fracture conditions. COL1A1 gene expression was reduced in the CS and FCS groups, similar result was observed in COL1A2 evaluation. COL5A1 gene expression, showed an increase in CS and Fracture groups while the COL5A2 gene expression increase was detected only in Fracture groups. Conclusion: Cigarette smoke exposure alters bone matrix composition and worsens bone mineralization, leading to bone fragility by increasing collagen V synthesis and deposition and impairing collagen I fibril forming and assembling

O objetivo do presente trabalho foi comparar fumantes e não fumantes com periodontite crônica com relação a presença e quantidade de patógenos periodontais, através da reação em cadeia da polimerase em tempo real. Quarenta fumantes e quarenta não fumantes, pareados por idade, sexo e profundidade clínica de sondagem dos sítios de coleta microbiológica, foram incluídos no estudo. Foi realizado exame periodontal completo, e coletado um pool de biofilme subgengival dos sítios mais profundos de cada quadrante, em cada sujeito de pesquisa. Para confirmar os dados sobre tabagismo, os sujeitos foram submetidos à avaliação das concentrações de monóxido de carbono expirado, através de um monoxímetro. A presença e quantificação de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia e Treponema denticola foi determinada pela reação em cadeia da polimerase em tempo real. Fumantes apresentaram maior média de profundidade clínica de sondagem (p = 0,001) e nível clinico de inserção (p = 0,006), e menos sítios com sangramento à sondagem (p = 0,001) do que os não fumantes. Foi observada associação entre fumo e presença de A. actinomycetemcomitans (p < 0,001). Contagens médias de A. actinomycetemcomitans (p < 0,001), P. gingivalis (p = 0,042) e T. forsythia (p < 0,001) foram significantemente maiores nos fumantes. Os resultados permitiram concluir que o fumo altera a composição da microbiota subgengival em indivíduos com periodontite crônica, com diferenças na presença e quantidade dos patógenos periodontais investigados. / The aim of the present investigation is to compare smokers and nonsmokers with chronic periodontitis, regarding the presence and quantity of periodontal pathogens, using real-time polymerase chain reaction. Forty current smokers and forty never-smokers, matched for age, sex and sampling sites mean probing depth, were included in this investigation. A full-mouth periodontal examination was performed, and a pooled subgingival plaque sample was collected from the deepest site, in each quadrant, of each subject. To confirm smoking status, subjects had their expired air carbon monoxide concentrations measured with the help of a carbon monoxide monitor. The presence and quantification of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia and Treponema denticola were determined by real-time polymerase chain reaction. Smokers presented greater overall mean probing depth (p = 0,001) and mean clinical attachment level (p = 0,006), and fewer bleeding on probing sites (p = 0,001). An association was observed between smoking status and presence of A. actinomycetemcomitans (p < 0.001). Counts of A. actinomycetemcomitans (p < 0,001), P. gingivalis (p = 0,042) and T. forsythia (p< 0,001) were significantly higher in smokers. We concluded that smoking changes the composition of the subgingival microbiota in chronic periodontitis patients, with differences in the presence and quantification of investigated periodontopathogens.

A exemplo do que ocorre em animais, peptídeos hormonais em plantas desempenham papéis importantes no crescimento, desenvolvimento e defesa. RALF é um peptídeo hormonal ubíquo em plantas que foi primeiramente isolado de folhas de tabaco. Embora não se saiba exatamente sua função, as informações até agora existentes apontam para um envolvimento com aspectos básicos da biologia celular, provavelmente alongamento celular. Peptídeos RALF em Arabidopsis são encontrados em uma família multigênica de 37 membros. Plantas transgênicas superexpressando o AtRALF1 sob o controle do forte promotor constitutivo 35S, mostram um fenótipo semi-anão e inibição do crescimento das raízes. Um fenótipo semelhante também foi observado quando o AtRALF23 foi superexpresso. O AtRALF23, ao contrário do AtRALF1, tem sua expressão inibida por brassinosteróides. Esses fatos sugerem que diferentes peptídeos hormonais RALF, apesar de convergirem para a mesma função, apresentam uma relação individualizada com outros hormônios. O objetivo desse trabalho foi contribuir para a determinação da função dos peptídeos RALF em plantas e para o esclarecimento da inter-relação existente entre eles e os demais hormônios vegetais. Para tal, selecionou-se as isoformas AtRALF1 e AtRALF34 com base em semelhança/dessemelhança estrutural e padrão de expressão. Plantas silenciadas e com altos níveis de expressão para ambos os genes foram obtidas e avaliadas. A construção gênica AtRALF1-GFP foi inserida em Arabidopsis sob o controle do promotor 35S e foi observada fluorescência no retículo endoplasmático, complexo de Golgi e apoplasto. Genes anteriormente reportados como induzidos em plantas 35S:AtRALF1 foram validados e utilizados em experimentos com o AtRALF1 e o brassinolide. O conjunto dos resultados sugere um efeito antagônico do peptídeo AtRALF1 com relação ao efeito do brassinolide no alongamento de hipocótilos e raízes. Plantas com altos níveis de AtRALF1 são resistentes a aplicação exógena de brassinolide, não exibindo as respostas características do hormônio esteróide. O antagonismo entre os dois hormônios também foi sugerido pela análise da expressão de genes que são induzidos por AtRALF1 e brassinolide. / Like in animals, plant peptide hormones play important roles in growth, development and defense. RALF is a peptide hormone ubiquitous in plants that was first isolated from tobacco leaves. Although its function has not been established, the information gathered so far suggest its involvement with basic aspects of cellular biology, probably cellular elongation. RALF peptides in Arabidopsis are found in a multigene family of 37 members. Transgenic plants overexpressing AtRALF1 under the control of the strong constitutive promoter 35S, show a semi-dwarf phenotype and root growth inhibition. A similar phenotype was also observed when AtRALF23 was overexpressed. AtRALF23, as opposed to AtRALF1, is inhibited by brassinosteroids. These facts suggest that different RALF peptide hormones, despite the convergence to the same function, show a unique relationship with other hormones. The goal of this work was to contribute to the determination of the function of RALF peptides in plants and to clarify the inter-relationship between RALF and the other plant hormones. With that in mind, the isoforms AtRALF1 and AtRALF34 were selected based on primary structure similarity/dissimilarity and pattern of gene expression. Plants with high levels of expression or silenced for both genes were obtained and evaluated. The gene construct AtRALF1-GFP was introduced in Arabidopsis under the control of the 35S promoter and fluorescence was observed in the endoplasmic reticulum, Golgi apparatus and apoplast. Genes previously reported as induced in 35S:AtRALF1 plants were validated and used in AtRALF1 peptide and brassinolide experiments. Taken together our results suggest an antagonistic effect of the peptide AtRALF1 regarding the elongation effect of brassinolide in hypocotyls and roots. Plants with high levels of AtRALF1 are resistant to exogenously applied brassinolide, and do not show typical responses to the steroid hormone. The antagonism between the two hormones was also suggested by the gene expression analysis of the AtRALF1 and brassinolide inducible genes.

Este projeto objetivou desenvolver um marcador molecular ligado ao gene de resistência a Tobacco mosaic virus (TMV), em vista da necessidade de aprimorar os métodos de melhoramento de plantas para atender crescentes demandas de produtividade. O outro objetivo deste trabalho foi a avaliação de uma população segregante F2 e de retrocruzamento (RC1F1) a Meloidogyne incognita raça 3, oriunda do cruzamento das cultivares comerciais Coker 176 (C176) e Coker 371 Gold (C371G). Para o desenvolvimento do marcador ligado ao gene de resistência a TMV, o gene N, foram desenvolvidos iniciadores específicos para regiões conservadas (TIR, NBS e LRR) deste gene com base em sua seqüência. Estes iniciadores foram utilizados para amplificar um marcador cuja ligação ao referido gene foi confirmada em 200 indivíduos de população segregante F2 oriunda do cruzamento entre uma linhagem resistente (Coker176) e outra suscetível ao vírus (Kentucky326). A proporção entre o número de plantas resistentes e suscetíveis (154:46) não diferiu estatisticamente daquela esperada no caso de segregação de um gene dominante de resistência, que seria de 3:1. Os resultados indicaram que o marcador e o gene estão proximamente ligados segundo taxa de recombinação, que foi de 1%. Na avaliação da hereditariedade a M.incognita utilizou-se 141 indivíduos da população segregante F2 oriunda do cruzamento entre uma linhagem resistente (Coker176) e suscetível (Coker 371G) e 138 indivíduos de RC1F1 ([C176 X C371G] X C371G). Os resultados obtidos entre a proporção entre o número de plantas resistentes e suscetíveis da população F2 (102:39) e da RC1F1 (67:71) não diferiu estatisticamente daquela esperada no caso de segregação de um gene dominante de resistência. / The aim of this study is to develop a molecular marker linked to the resistant gene to Tobacco mosaic virus (TMV) considering the necessity to improve plant breeding to meet growing demands of productivity. The other goal of this study is to evaluate the mode of inheritance of an F2 segregating population and backcross (BCF1) population of Meloidogyne incognita race 3 originated from cross breeding between commercial cultivars Coker 176 and Coker 371 Gold. For the development of the marker linked to the TMV resistant gene, the N gene, specific primers of this gene were developed for conserved regions (TIR, NBS and LRR) based on their sequence. These primers were used to amplify a marker whose connection with the aforementioned gene was confirmed in 200 individuals in a segregating F2 population originated from the cross breeding between a resistant cultivar (Coker176) and another cultivar which is susceptible to the virus (Kentucky326). The proportion between the number of resistant and susceptible plants (154:46) did not statistically differ from the one expected in the segregation of one dominant resistance, which would be a 3:1 segregation ratio. The results indicated that the marker and the gene are narrowly linked according to recombination ratio 1%. In the heredity evaluation of resistance to M.incognita 141 plants of the segregating F2 population originated from the cross breeding of a resistant (Coker176) and susceptible cultivar (Coker 371G) and 138 plants of backcross BC1F1 ([C176 X C371G) X C3371G) were used. The outcome of the proportion between the number of resistant and susceptible plants of segregating F2 (102:39) and BC1F1 population (67:71) were not statistically different from the ones expected for a monogenic dominant resistance.

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) destaca-se como um grave problema de saúde no mundo. O enfisema pulmonar, dentro do espectro das DPOC, caracteriza-se pelo alargamento dos espaços aéreos distais resultante da destruição do parênquima pulmonar. O tabagismo é considerado o principal fator relacionado ao surgimento da patologia. Considerando a escassez de aparelhos comercializados para exposição à fumaça de cigarro, bem como o elevado custo dos existentes, o presente projeto propôs um modelo experimental de enfisema por exposição à fumaça utilizando um novo aparato. Foram realizadas avaliações morfométricas e funcionais nos pulmões de ratos expostos à fumaça ou ao ar ambiente. Além disso, o peso dos animais foi aferido semanalmente. Os resultados indicaram alargamento dos espaços aéreos pulmonares, além de redução do ganho de peso nos animais expostos. Não houve diferenças funcionais entre os grupos controle e experimental. O trabalho objetivou o desenvolvimento de um aparato eficiente e menos custoso para estudos relacionados ao enfisema pulmonar. / The Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) stands out as a serious health problem in the world. The pulmonary emphysema, in the spectrum of COPD, has as main feature the enlargement of the airspaces distal resulting from destruction of lung parenchyma. Smoking is considered the main factor related to the development of pathology. Considering the lack of machines marketed for exposure to cigarette smoke, as well as the high cost of devices available, the currently project has proposed a experimental model of pulmonary emphysema induced by the use of a new apparatus. Were performed morphometric and functional measurements in the lung of rats exposed to cigarette smoke or clean air. Further, the animal weight was measured weekly. The results indicated enlargement of the pulmonary airspaces, as well as reduction of weight gain in animals exposed. There were no functional differences between control and experimental groups. The current study aimed to the development of an efficient and less costly apparatus for experimental studies related to the pulmonary emphysema.

O complexo coletor de luz (LHC) do fotossistema II (PSII) é o principal complexo de proteínas associado a pigmentos situado na membrana dos tilacóides de cloroplastos em plantas. O LHCII funciona como uma antena de transferência de energia para a captura e direcionamento da energia luminosa do PSII para o PSI. A ação coordenada dos dois fotossistemas com o direcionamento do fluxo de elétrons gera a quebra da molécula de água, através da membrana do tilacóide, produzindo força assimilatória ATP e NADPH. A energia química produzida na fotossíntese é de suma importância para a assimilação de carbono, biossíntese de aminoácidos e metabólicos secundários. Portanto, este é um importante gene para estudos em biotecnologia. Linhagens transgênicas de tabaco (TR-1 e TR-2) as quais expressam constitutivamente o transgene Lhcb1*2 de ervilha obtidas por Labate e colaboradores (2004) foram utilizadas nesse trabalho. Estas plantas apresentaram diversos efeitos pleiotrópicos relacionados à anatomia, morfologia, bioquímica e fisiologia. Uma proteína pode não atuar isoladamente, mas freqüentemente interagindo com outras proteínas, influenciando diversos processos metabólicos. O perfil de proteômica dessas linhagens transformantes, em relação à planta selvagem (WT) foi investigado. As proteínas totais foram extraídas de folhas de plantas de três meses crescidas em câmaras de crescimento, então separadas por 2D-PAGE. As proteínas diferencialmente expressas foram identificadas por LC-MS/MS. Os resultados mostram que 244 spots apresentaram alterações significativas na expressão nas duas linhagens transgênicas em relação à WT. 122 spots são expressos exclusivamente nas linhagens transformantes, e 24 spots somente na selvagem. Muitas proteínas como ATP synthase e ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase foram mais expressas nas linhagens transgênicas, mas a glutamine synthetase, uma importante proteína na reciclagem de nitrogênio nos cloroplastos, teve sua expressão diminuída. Para analisar as alterações na expressãode genes relacionados ao ritmo circadiano entre outros, como a conformação do PSII, cotilédones de plântulas estioladas foram submetidas à luz e amostras coletadas depois de 0, 3, 6, 12 e 24 horas. O nível de transcritos foram analisados por PCR quantitativo. A diferenciação de plastídio à cloroplasto maduro foi analisado por microscopia eletrônica de transmissão, para se entender as diferenças entre os genótipos em estudo no desenvolvimento vegetal. A expressão constitutiva do gene Lhcb1*2 de ervilha em plantas transgênicas de tabaco acarretou a indução e repressão de várias proteínas e genes em distintos passos de vias metabólicas, estabilizando a homeostase celular, exercendo uma influência significativa no desenvolvimento vegetal e produção de biomassa. / The light harvesting complex (LHC) of photosystem II (PSII) is the major ensemble of pigmet-biding proteins situated in the thylakoid membranes of the chloroplast in plants. The LHCbII functions as an energy-transferring antenna for capturing and delivering light energy to the photosystems PSII and PSI. The coordinated actions of the two photosystems in turn drive the flow of electrons, generated by the splitting of water, through the thylakoid membranes to produce the assimilatory force ATP and NADPH. The chemical energy produced by photosynthesis is very important for the assimilation of carbon, amino acids biosynthesis, and secundary metabolism. Therefore it is an important gene for biotechnological studies. Transgenic tobacco lines (TR-1 and TR-2) which express the pea Lhcb1*2 transgene constitutively obtained by Labate et al. (2004) were used in this work. These plants presented pleiotropic effects related to anatomy, morphology, biochemistry and physiology. As a protein may not act by itself, but it is, frequently interacting with other proteins, influencing a lot of metabolic processes. The proteomic profile of these transgenic lines, in relation to the wild type (WT), was investigated. The total proteins extracted from leaves of three-month old plants grown in growth chambers were separated by 2DPAGE. The differentially expressed proteins were identified by LC-MS/MS. The results showed that 225 spots displayed significant changes in the expression of the two transgenic lines in relation to the WT. 122 spots were exclusively expressed in the transgenic lines, and 24 only in the wild type. Many proteins as ATP synthase and ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase are overexpressed in the transgenic lines, but the glutamine synthetase, an important protein tor nitrogen recycling in the chloroplasts, showed a reducted level of expression. In order to analyse the alterations of the expression of genes related to the circadian rhythm among others, involved in the conformation of the PSII, cotyledons from etiolated seedlings were thenexposed to light and samples collected after 0, 3, 6, 12 and 24 hours. The level of transcripts were analysed by RT/RT-PCR. The PSII conformation were analysed by transmition electron microscopy, with the aim of verifying the evolution of plastids into the chloroplasts which could be leading to changes in plant development. The overexpression of the pea Lhcb1*2 gene in transgenic tobacco plants, lead to the induction and suppression of several proteins and genes in key metabolic pathways, as a way to establish a cellular homeostasis, exerting a significant influence on plant development and biomass production.

Approximately 135,000 Brazilians die from smoking-related diseases every year (ERIKSEN et al., 2015). Due to the relevance of smoking as a public health problem, some states and municipalities implemented restrictive smoke-free environments from 2008 onwards. The national regulation became effective only in 2014. In this paper we explore the regional differences in the adoption of this policy to evaluate its impacts on cigarette consumption in Brazil. We propose a difference-in-differences approach to estimate the effects throughout the years on the smoking behavior of two age groups: adults and youths. We also estimate the impacts according to different levels of enforcement among states. We have built our panel using micro data from the National Health Research, collected by the Brazilian Bureau of Statistics (IBGE) in 2013. Our results indicate that smoking bans reduced daily cigarette consumption among young individuals in 7% on average, by reducing smoking initiation. This impact increases to 10% when considering higher enforced smoking bans and vanishes when the law is not enforced. In absolute values, it represents from 64 to 80 thousand less smokers among young individuals in the treated capitals. No impacts were found on smoking initiation and on smoking prevalence among adults, but high enforced smoking bans are related to 1.2% smoking cessation rate. Robustness tests show that the results are consistent. Our paper contributes to the literature providing evidences to developing countries on the effects of tobacco control policies / Aproximadamente 135.000 brasileiros morrem por doenças relacionadas ao tabagismo anualmente (ERIKSEN et al., 2015). Devido à relevância do tabagismo como um problema de saúde, alguns estados e municípios adotaram áreas totalmente livres de fumo a partir de 2008. A legislação nacional passou a vigorar apenas a partir de dezembro de 2014. Nesse estudo, exploramos a variação regional da adoção dessa política para avaliar seus impactos no consumo de cigarro no Brasil. Para tanto, adotamos uma abordagem de diferenças-em-diferenças para estimar os efeitos ao longo dos anos de introdução das leis no comportamento de fumantes em dois grupos etários: adultos e jovens. Os impactos também foram estimados considerando diferentes níveis de aplicação das leis entre os estados. Construímos um painel utilizando micro dados da Pesquisa Nacional da Saúde (PNS), coletada pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) em 2013. Os resultados indicam que a criação de áreas livres de fumo reduziu, na média, em 7% o consumo de cigarro entre jovens, e isso ocorreu através do desincentivo à iniciação ao tabagismo. Esse impacto aumenta para 10% quando consideramos leis efetivamente aplicadas e desaparecem quando a aplicação é baixa. Em valores absolutos, esse efeito representa de 64 mil a 80 mil menos fumantes entre jovens nas capitais tratadas. Não foram encontrados efeitos em iniciação ao tabagismo e em consumo de cigarro entre adultos, mas leis fortemente aplicadas estão relacionadas a uma taxa de cessação do fumo de 1,2%. Testes de robustez mostram que os resultados são consistentes. Esse estudo contribui para a literatura sobre os efeitos das políticas de controle do tabagismo ao apresentar evidências para países em desenvolvimento