Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-13T16:23:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1336183 bytes, checksum: 62633b2b82bbf0a977cd8b2fa27bd3f1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-13T16:23:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1336183 bytes, checksum: 62633b2b82bbf0a977cd8b2fa27bd3f1 (MD5) Previous issue date: 2014-11-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O controle biológico é uma das possíveis aplicações biotecnológicas de enzimas fúngicas. Este tipo de controle se destaca por ser uma alternativa “limpa”, sem o uso de produtos químicos que possam gerar possíveis resíduos. Nesse contexto, fungos nematófagos produzem enzimas extracelulares envolvidas em diversas etapas da infecção, como liberação de nutrientes para o crescimento do microrganismo, penetração da cutícula pela degradação proteica e digestão do tecido hospedeiro. O mecanismo molecular da ação patogênica de fungos contra nematoides não é completamente conhecido. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo otimizar a produção, purificar e caracterizar enzimas extracelulares produzidas por fungos nematófagos, bem como avaliar sua capacidade nematicida. Micélios obtidos da transferência de discos de cultura de três isolados de fungos nematófagos (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) e Pochonia chlamydosporia (VC4)) mantidos em corn-meal-ágar 2% (CMA 2%) e transferidos para frascos contendo meio de cultura que teve sua composição otimizada para a produção de protease e quitinase. Em seguida, as enzimas foram purificadas e caracterizadas em relação ao pH e temperatura. Por fim, foi demonstrada a atividade nematicida dos extratos brutos e das enzimas purificadas sobre larvas de nematoides. Duas varíaveis (pH e tempo de incubação), apresentaram um efeito significativo (p<0,05) sobre a produção de protease do fungo nematófago Monacrosporium sinense (SF53). Além disso, este fungo produziu três diferentes proteases (Ms1, Ms2 e Ms3) com atividade nematicida sobre larvas de Panagrellus redivivus, sugerindo que essas proteases sejam produzidas como um complexo enzimático eficaz na destruição de larvas de primeiro estágio de Angiostrongylus vasorum. Em relação a M. thaumasium (NF34), foi observada atividade nematicida (p<0.01) de seus conídios e de seu extrato bruto proteolítico em coproculturas sobre larvas de primeiro estádio de A. vasorum. Os efeitos das variáveis (quitina, quitina coloidal, glicose, nitrato de sódio (NaNO 3 ), umidade) sobre a produção xiide quitinase em fermentação no estado sólido pelos isolados de Monacrosporium NF34 e SF53 foram analisados usando o planejamento estatístico Plackett-Burman. Para o isolado NF34, nos níveis avaliados, a presença de quitina e NaNO 3 nos meios de cultura foram significativas (p<0,05) para a produção de quitinase. Por outro lado, para o isolado SF53, nos níveis avaliados, apenas a presença de glicose foi significativa (p<0,05) para a produção de quitinase. Em relação a influência do pH na atividade enzimática, para M. thaumasium (NF34), o valor de pH com maior atividade obtida foi 5.5. Entretanto, para M. sinense (SF53), a maior atividade foi observada em pH 8. Além disso, observou-se que o isolado NF34 produziu duas quitinases distintas com a atividade nematicida sobre larvas de P. redivivus. Por fim, a atividade ovicida do fungo nematófago Pochonia chlamydosporia (VC4) e de suas proteases e quitinases foi avaliada sobre ovos de Dioctophyma renale. Houve diferença significativa (p <0,01) na destruição de ovos em relação ao grupo de controle, não se verificando diferença estatisticamente significativa (p> 0,01) entre as concentrações de P. chlamydosporia na destruição de ovos. No entanto, houve uma tendência de aumento da mortalidade com o aumento da concentração de P. chlamydosporia. As proteases e quitinases do isolado VC4, causaram uma redução de percentagem significativa (p <0,01) no número de ovos viáveis de D. renale, em relação ao controle, com os seguintes valores de redução: 27,8% (proteases), 29,4% (quitinases) e 43,4% (proteases + quitinases). Mais estudos devem ser conduzidos no sentido de otimizar as condições de produção de enzima e aplicação destas no combate de nematoides. / Biological control is one of the possible biotechnological applications of fungal enzymes. This type of control is known for being a "clean" alternative, without the use of chemicals that may generate residues. In this context, nematophagous fungi produce extracellular enzymes that are involved in various stages of infection, such as release of nutrients for microorganism growth, cuticle penetration through protein degradation and digestion of host tissue. However, the detailed molecular mechanism of pathogenic action of fungi against nematodes is not complete known. Thus, the present study aimed to optimize production, purify and characterize extracellular enzymes produced by nematophagous fungi and evaluate their nematicidal ability. Mycelia were collected through the transfer of culture dishes of three isolates (Monacrosporium thaumasium (NF34), M. sinense (SF53) and Pochonia chlamydosporia (VC4)) of nematophagous fungi kept in 2% corn-meal-agar (2% CMA) and transferred to vials containing culture medium that had the composition optimized for the production of protease and chitinase. Then, the enzymes were purified and characterized with respect to pH and temperature. Finally, the nematicidal activity of crude extracts and purified enzymes on nematodes larvae was demonstrated. Two variables (pH and incubation time) showed a significant effect (p <0.05) on the production of protease from nematophagous fungus Monacrosporium sinense (SF53). Moreover, this fungi produced three different proteases (Ms1, Ms2 and MS3) with nematicidal activity against Panagrellus redivivus larvae. It is also suggested that these proteases are produced in an enzymatic complex that was effective in the destruction of first-stage larvae of Angiostrongylus vasorum. Regarding M. thaumasium (NF34), it was observed nematicidal activity (p <0.01) of its conidia and crude extract in proteolytic coprocultures on first stage larvae of A. vasorum. The effect of the variables (chitin, colloidal chitin, glucose, sodium nitrate (NaNO 3 ), moisture) on chitinase production in solid state fermentation by Monacrosporium isolates SF53 and NF34 were analyzed using Plackett- xivBurman statistical design. For the isolate NF34, at the evaluated levels, the presence of chitin and NaNO 3 in culture medium was significant (p <0.05) for the production of chitinase. On the other hand, for isolate SF53, at the evaluated levels, only the presence of glucose was significant (p <0.05) for chitinase production. Regarding the influence of pH on enzyme activity, for M. thaumasium (NF34) the pH value with the highest activity was 5.5. However, for M. sinense (SF53), the highest activity was observed at pH 8. Furthermore, it was observed that the isolate NF34 produced two different chitinases with nematicidal activity against larvae of P. redivivus. Finally, the ovicidal activity of the nematophagous fungus Pochonia chlamydosporia (VC4) and its proteases and chitinases was evaluated on Dioctophyma renale eggs. There was a significant difference (p <0.01) in the destruction of eggs in relation to the control group. Moreover, there was no difference (p> 0.01) between the concentrations of P. chlamydosporia in the destruction of eggs. However, there was a trend for increased mortality with increasing its concentration. Proteases and chitinases of isolate VC4 have caused a significant percentage reduction (p <0.01) in the number of viable eggs of D. renale, compared to control, with the following values of reduction: 27.8% (proteases), 29 4% (chitinase) and 43.4% (proteases + chitinases). More studies should be conducted to optimize enzyme production conditions and the application of these on nematodes.

A produção de massa celular de Candida parapsilosis var, Intermedia e das leveduras naturais provenientes da"goga"(mel de cacau), safra/87, foram obtidas em meio Sabouraud líquido. O crescimento das células foi interrompido com 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas consecutivas de fermentação, sendo realizados posteriormente, testes para avaliar a produção, por parte das leveduras, de um fator capaz de inibir o crescimento de P. capsici. As células foram separadas do meio fermentado por centrifugação, sendo depois rompidas com material abrasivo, sob resfriamento, separando-se a fração subcelular dos seus restos celulares. Todas as fraç6es obtidas (meio fermentado, restos celulares e fração subcelular) foram esterilizadas por autoclavagem. Os testes de inibição do crescimento de P. capsici foram conduzidos em placas de Petri contendo meio BDA, onde foram adicionadas diferentes concentraç6es do meio fermentado, de células rompidas e de fração subcelular, res- pectivamente. Estas placas foram inoculadas com P. capsici, observando-se seu crescimento durante 5 (cinco) dias consecutivos em temperatura ambiente. Os resultados obtidos mostraram que houve a produção de um fator inibidor do crescimento de P. capsici, no meio fermentado de Candida parapsilosis var, Intermedia mais acentuado até cerca de 48 horas de fermentação. Mesmo após esse período, a produção do fator de inibição se manteve ligeiramente crescente até 144 horas de fermentação nas concentrações estudadas de 1:10 e 1:5. Já para as leveduras naturais da"goga"de cacau, o fator de inibição, produzido no meio com concentração 1:10 manteve-se ligeiramente crescente de 6 a 120 horas, aumentando vigorosamente até 100% após 144 horas, o que pode ser verificado mesmo em concentrações menores como 1:20. O fator de inibição do crescimento de P. capsici, sendo produzido no interior das células no curso da fermentação, foi liberado para o meio fermentado, como pode ser demonstrado nos experimentos com frações subcelulares e restos celulares, cuja inibição foi considerada insignificante em relação ao meio fermentado / In order to reduce the"dark gray rottenness"of the cacao-tree fruits, caused by P. capsici, experiments were carried out to promote the biological control of this fungus. Its growth was accomplished in potato-dextrose-agar (PDA), showing a rapid sporulation. The production of Candida parapsilosis var, Intermedia cell mass and natural yeasts from"goga"Cacao- honey), harvest/87, were obtained in liquid Sabouraud medium. The cells growth was interrupted with 6, 12, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 consecutive hours of fermentation; posterior tests were made to evaluate the production of an inhibition factor, by yeasts, suitable to inhibit the P. capsici, growth. The cells were separated from the fermentated medium by centrifugation, and then, they were broken with abrasive material, by cooling; the subcell fraction was separated from its cell rests. All the fractions obtained (fermentated medium, cell rests, and subcell fraction) were sterilized by autoclaving. The inhibition tests of the P. capsici, growth were conducted on Petri plates, containing PDA medium, adding different concentrations of the fermentated medium, broken cells and subcell fractions, respectively. These plates were inoculated with P. capsici, its growth was observed during five consecutive days at room temperature. The obtained results showed that there was production of a P. capsici, growth inhibitor factor Candida parapsilosis var, Intermediafermentated medium, until almost 48 hours of fermentation. Thus, after this period, the production of the inhibition factor maintained light increase until 144 hours of fermentation, at the 1:10 and 1:5 concentrations. Otherwise, the inhibition factor produced by cacao"goga"natural yeasts, in a medium with the concentration 1 :10, maintained a light increase from 6 through 12Q hours, augmenting strongly till 100%, after 144 hours, the same could be observed in concentrations smaller than 1:20. The P. capsici, growth inhibition factor produced inside the cells during the fermentation, was released to the fermentated medium, as could be demonstrated in the experiments with subcell fractions and cell rests, whose inhibition was considered insignificant in relation to the fermentated medium

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Eduardo da Silva Martins / Resumo: Xilanases são enzimas que agem na despolimerização da cadeia de xilana, principal componente da hemicelulose. Elas possuem diversas aplicações industriais tais como, na indústria de alimentos, do papel e de bioenergia. Neste contexto, há destaque para a produção de xilo-oligossacarídeos (XOS), que são considerados prebióticos. Estes possibilitam que probióticos sejam capazes de modular positivamente a microbiota intestinal, causando benefícios ao indivíduo hospedeiro. Nesse sentido, a busca de xilanases microbianas destaca-se como uma estratégia sustentável para a produção de prebióticos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi purificar e caracterizar uma xilanase do fungo Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 e aplicar esta e duas xilanases recombinantes GH11 do referido fungo para obtenção de XOS. A enzima nativa purificada, com massa molecular estimada em 27 kDa, apresentou atividade máxima em pH 4,5 e 65 °C, e manteve média maior que 90% de sua atividade residual quando exposta a temperaturas entre 30 e 60 °C por 1 hora. Essa enzima pode ser caracterizada como uma endoxilanase pertencente à família GH11. Foram produzidos XOS do bagaço pré-tratado com ozonólise seguida de extração alcalina, xilana extraída do bagaço in natura e xilana beechwood. Os produtos da hidrólise enzimática dos diferentes substratos foram identificados por eletroforese capilar e/ou HPAE-PAD, sendo que o hidrolisado de xilana beechwood pela xilanase nativa purificada, após 12 horas de hidrólise,... / Abstract: Xylanases are enzymes that act in depolymerization of the xylan chain, the main component of hemicellulose. They have various industrial applications such as, food, paper and bioenergy industries. In this context, highlight the production of xylooligosaccharides (XOS), which are considered prebiotics. The XOS can be used with probiotic microorganisms to be able to positively modulate an intestinal microbiota, presenting benefits to the individual host. In this sense, a search for microbial xylanases stands out as a sustainable strategy for a production of prebiotics. Therefore, the objective of this work was to purify and characterize an xylanase of the fungus Myceliophthora heterothallica F.2.1.4 and to apply two recombinant enzymes of the same fungus to produce XOS. The enzyme, with the molecular weight estimated at 27 kDa, is at the maximum temperature of 4.5 and 65 °C, and continues more than 90% of its residual activity when exposed to temperatures between 30 and 60 °C for 1 hour. The purified native enzyme is presented as an endoxylanase for the GH11 family. XOS was produced from pretreated bagasse with ozonolysis followed by alkaline extraction, xylan extracted from the bagasse in natura and beeechwood xylan. The products of the enzymatic hydrolysis of the different substrates were identified by capillary electrophoresis and/or HPAE-PAD, being that the beechwood Xylan hydrolysate by xylanase purified native, after 12 hours of hydrolysis, showed 234.2 mg/g of xylan. Evaluated enzymes have potential for applications in the production of xylooligosaccharides for use as prebiotics / Mestre

Orientador: Lara Durães Sette / Banca: André Rodrigues / Banca: Rafaella Costa Bonugli Santos / Resumo: As coleções de culturas de micro-organismos apresentam importante contribuição para a preservação, manutenção e disponibilização de material microbiológico para uso acadêmico e em pesquisa. A Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP) tem como missão dar suporte ao conhecimento da biodiversidade microbiana, bem como ao desenvolvimento científico e tecnológico, apoiando projetos de relevância. A CRM-UNESP possui um acervo associado de fungos filamentosos e leveduras de ambientes incomuns e/ou extremos. Neste contexto, o presente estudo tem como objetivo reorganizar o acervo de fungos marinhos da costa brasileira, marinhos e terrestres da Antártica e prospectar as enzimas xilanase e L-asparaginase. Para tanto, cerca de 696 fungos marinhos oriundos da costa brasileira e 185 fungos isolados de ambientes antárticos foram avaliados quanto à viabilidade e pureza, fotografados e preservados por dois métodos distintos: criopreservação e Castellani. Destes, 71% dos isolados foram considerados puros e viáveis e submetidos às triagens quantitavas e qualitativas para enzima xilanase e L-asparaginase. Na triagem qualitativa (meio sólido) 112 fungos produtores de xilanase foram isolados de ambiente marinho da costa brasileira e 19 de ambiente antártico. Estes foram submetidos à triagem quantitativa (meio liquído), na qual, o fungo LAMAI 31 identificado como Aspergillus tubingensis apresentou o melhor resultado de produção enzimática (49,41 U/mL). Para a enzima L-asparaginase além dos 622 isolados, 17 fungos filamentosos adicionais foram analisados na triagem qualitativa, totalizando 510 de origem marinha da costa brasileira e 129 de origem Antártica. Dentre estes, 407 fungos foram positivos para L-asparaginase em meio sólido e foram submetidos à triagem em meio liquido. A L-asparaginase foi produzida na faixa de 0,02 a 1,65 U/mL por 103 isolados. Delineamentos experimentais foram aplicados aos isolados que... / Abstract: Microbial culture collections have an important contribution to the preservation, maintenance, and availability of the microbial material for academic and research pourpose. The mission of the Central of Microbial Resources of the UNESP (CRM-UNESP) is to provide support for the knowledge of the microbial biodiversity, as well as for the scientific and technological development, supporting relevant projects. CRM-UNESP has an associated collection of filamentous fungi and yeast from uncommon and/or extreme environments. In this context, the present study aims to reorganize the marine-derived fungal collection from brasilian coast and the marine and terrestrial collection from Antarctica and to prospect the enzymes xylanase and L-asparaginase. For that end, about 696 marine fungi originating from brasilian coast and 185 isolated from antarctic environments had their viability and purity assessed and were photographed and preserved by two different methods: criopreservation and Castellani. Among them, 71% isolated were considered pure and viable and were submitted to the quantitative and qualitative screening for the production of xylanase and L-asparaginase. In the qualitative quantitative screening (solid medium) 112 filamentous fungi able to produce xilanases were isolated from marine environment (brasilian coast) and 19 from the antartic environment. These isolates were submitted to quantitative screening (liquid medium), in which, the fungus LAMAI 31 indentified as Aspergillus tubingensis presented the best result of enzymatic production (49.41 U/mL). For L-asparaginase besides the 622 isolates, 17 additional filamentous fungi were analysed, being 510 originated from the brasilian marine coast and 129 from Antarctica. Among them, 407 fungi were positive for L-asparaginase in solid medium and were submitted to the screening in liquid medium. L-asparaginase was produced in a range of 0.02 to 1.65 U/mL by 103 isolated. Experimental designs ... / Mestre

Com o objetivo de verificar o fenômeno da parameiose em Metarhizium anisopliae, mutantes das linhagens E6, E9 e RJ, com duas marcas auxotróficas e uma marca morfológica, foram utilizados para a realização de cruzamentos via fusão de protoplastos. Através da análise genética dos produtos de fusão detectou-se a ocorrência de recombinantes auxotróficos, com evidências de recombinação mitótica, não recuperando - se o diplóide. Este fato demonstra a alta instabilidade da fase diplóide e comprova a ocorrência de parameiose nesta espécie. Prováveis aneuplóides foram isolados, os que poderiam ter sido originados pelo desarranjo cromossômico dos diplóides em processo de haploidização. Por outro lado, descreveu-se o método de produção de protoplastos de conídios. A obtenção dos mesmos, abre a possibilidade de sua utilização em futuros estudos de transformação genética, uma vez que estes protoplastos são mais adequados para essa finalidade. / Aiming to study parameiosis in Metarhizium anisopriae, mutants of the strains E6 , E9 and RJ, with two auxotrophic marks and a morphological one, were crossed by protoplast fusion. Through the genetical analysis of the fusion products it was detected auxotrophic mutants, evidencing mitotic recombination and the diploid was not recovered. This fact shows the high instability of the diploid phase and confirms the occurrence of parameiosis in this species. Some supposed to be aneuploids were isolated ant it might, be possible they were originated by cromossomic disarrengements during haploidization. A protoplasting method from conidia was described as well. It might be used in future genetic transformation experiments since this kind of protoplasts suit better the process

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, &#946;-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade &#946;-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e &#946;-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, &#914;glucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of &#914;glucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of &#914;glucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and &#914;g1ucosidase-protease production, as well.

Culturas monozoospóricas de Phytophthora, num total de dezesseis, originárias do Estado de São Paulo, foram estudadas quanto as suas características morfológicas, culturais, moleculares e sensibilidade ao fungicida metalaxyl. Todos os isolados foram identificados como P. parasitica pelas suas características morfológicas, culturais e fisiológicas. Houve diferenças estatísticas entre os isolados quanto a suas dimensões no comprimento (c), largura (l) e relação c/l dos esporângios em meio cenoura-dextrose, incubados a 25ºC; assim como na capacidade de produção de clamidósporos no mesmo meio. Todos os isolados foram sensíveis ao metalaxul, todos crescendo na concentração de 1 ppm, a maioria na concentração de 10 ppm e alguns isolados a 100 ppm, apesar que no último caso ao redor do disco que continha micélio do patógeno. O qual vem a demonstrar que há genótipos com alguma tolerância ao produto no Estado de São Paulo. Essa tolerância teve uma distribuição independente do local de isolamento e a análise molecular com a técnica de RAPD não foi suficientemente sensível par detectar grupos com similaridade genética com essa característica. A técnica de RAPD conseguiu distinguir os isolados, mas observou-se uma baixa diversidade genética entre eles, apesar de terem sido isolados em diferentes pontos do Estado. Mesmo assim houve diferenças entre isolados provindos da mesma cultura original / not available

Com o objetivo de desenvolver a quantificação das hifas externas e da sua atividade aos 30, 60 e 90 dias após o plantio (DAP), foram conduzidos dois experimentos em casa de vegetação utilizando-se Zea Mays inoculado e não inoculado com Glomus etunicatume doses crescentes de fosforo (0, 25, 50 e 75 mg de P/kg de solo). O micélio extramatrical foi extraído do solo através da técnica da membrana de filtração e quantificado pela técnica da grade de filtração. A proporção de hifas ativas foi determinada pelo método de coloração enzimática por Iodonitrotetrazólio (INT). Tanto a técnica de extração quanto o método de coloração por INT não apresentaram resultados promissores quando utilizados em solos argilosos. As limitações da quantificação da atividade e do método de extração de hifas externas de fungos micorrízicos vesículo-arbusculares através da técnica da membrana de filtração e do método de coloração enzimático por INT são discutidas. Observou-se que aos 30 e 60 DAP houve um aumento do micélio externo total e uma atividade com a elevação das doses de P aplicadas ao solo / not available

No presente trabalho estudou-se a caracterização morfológica, a esporulação, e a patogenicidade dos fungos Alternaria solani e Alternaria alternata obtidos a partir de lesões foliares de tomateiro, pimentão, berinjela, batata, jiló e fumo; também se avaliou a sua sensibilidade à fungicidas. Para a caracterização morfológica utilizou-se como parâmetros, a mensuração do comprimento e largura do corpo e o comprimento do bico dos conídios. Os resultados obtidos, apesar de variabilidade observada estão de acordo com as caracterizações morfológicas dessas espécies, em literaturas citadas·Para esporulação estudou-se a influência da luz negra (N.U.V.) e escuro, idade do micélio (margem e interno) e a adição suplementar de água ou não no meio de esporulação. O melhor índice de esporulação de A. solani foi obtida com discos de micélio retirados da margem da colônia e incubados em luz negra (N.U.V.) e sem adição suplementar de água, enquanto que para A. alternata somente a luz negra foi suficiente para propiciar ótima esporulação. No estudo de inoculações cruzadas com os isolados de A. solani e A. alternata em tomateiro, pimentão e berinjela, verificou-se que todos os isolados foram patogênicos, exceto o isolado de A. solani de berinjela que não mostrou patogenicidade a pimentão. Entretanto, quando inoculado em sementes de tomate somente o isolado de A. solani de tomateiro foi patogênico no período de pós emergência das plântulas. Os isolados de A. alternata não demonstraram serem patogênicos em pré e pós emergência das plântulas. Porém, quando inoculados em frutos semi-maduros de tomateiro, os isolados de A. alternata de tomateiro, batata, berinjela e pimentão foram mais patogênicos do que os de jiló e fumo. Quanto a fungitoxicidade de 10 fungicidas em diferentes concentrações a um isolado de A. solani e a outro de A. alternata de tomateiro observou-se que o captafol, propiconazol e acetato de trifenil estanho a 100 ppm inibiram totalmente o crescimento micelial de A. alternata, enquanto que para A. solani somente o acetato de trifenil estanho a 100 ppm foi eficiente. / Morphological characteristics, sporulation and pathogenicity of A. solani and A. alternate were estudied. Isolates were obtained from tomato, sweet-pepper, eggplant, potato,"jiló"(Solanum gilo Raddi) and tobacco fungicidal sensibility of these isolates to various fungicidas was also evaluated. For morphological characterization, length and width of the conidium body and length of the conidium beak were measured. The results obtained confirmed the morphological variation between the two species of Altenaria,/i> studied. Influence of NUV, light and darkness, mycelium age and the addition of supplementary water to the medium was studied in relation to sporulation of both species of Alternaria. The best sporulation index for A. solani was obtained with mycelium discs removed from the colony margins, incubation under NUV light conditions and without the addition of supplementary water. For A. alternate only NUV light was enough to induce optimum sporulation. Cross inoculations tests with the various isolates of A. solani and A. alternate which were tested against tomato, pepper and eggplant, showed that all isolates were pathogenic to all hosts, with the exception of the A. solani isolate obtained from eggplant which was not pathogenic to pepper. Seed inoculations 'of tomato with A. solani was positive only for the tomato isolate, during the period of post-emergence of the seedlings. Isolates of A. alternate were not pathogenic to seedlings in pre and post-emergence. However, isolates of A. alternate,/i> from tomato, potato, eggplant and sweet-pepper were most pathogenic, whereas the"jiló"and tobacco isolates were the less agressive ones, when inoculated in semi-matured tomato fruits. With respect to the fungitoxicity of 10 fungicides, at different concentrations, against the isolates of A. solani and A. alternate from tomato, it was found that 100 ppm captafol, propiconazole and phenyltin acetate totally inhibited the mycelial growth of A. alternate, whereas for A. solani only 100 ppm phenyltin acetate was effective.

O presente trabalho foi realizado com a finalidade de estudar aspectos biológicos básicos do fungo celulolítico Humicola sp. Assim, através da auxanografia, determinou-se que biotina e tiamina eram necessárias ao meio mínimo, para o desenvolvimento de culturas transferidas por inoculação de ponto; contudo, raramente ocorreu germinação nesse meio, quando suspensões de esporos foram semeadas. Devido ao crescimento não individualizado em meio completo, cinco redutores de crescimento foram ensaiados, optando-se pela utilização de citrato de sódio 0,700%, o qual possibilitou redução de 70,1% no diâmetro da colônia, sem prejuízo da sobrevivência. Para indução de mutação foram utilizados: ácido nitroso, etil metano sulfonato, luz ultra-violeta e radiação gama, sendo estabelecidas as curvas de sobrevivência de esporos desse fungo, quando submetidos a esses mutagênicos. Foram então isolados três mutantes auxotróficos e 27 mutantes morfológicos, que posteriormente foram caracterizados. Observações citológicas de núcleos em 250 esporos da linhagem selvagem indicaram que a classe mais freqüente, constituía de 12 núcleos por esporo, evidenciando o estado multinuclear dos conídios desse·fungo. Isso pode permitir a ocorrência de heterocariose, e ser responsável, pelo menos em parte, pela variabilidade observada. As curvas de distribuição do numero de núcleos por esporo dos mutantes morfológicos, apresentaram máximos para as classes 6, 12, 18 e 24 núcleos, sendo que a linhagem mor10 apresentou pico em 3, podendo ser esse o numero básico de núcleos em esporos dessa espécie. Estudo do comportamento cromossomal durante a divisão nuclear demonstrou que a mitose é similar a de outros fungos filamentosos. O número de cromossomos, observados no final da metáfase, não pode ser determinado, com segurança, mas sugeriu-se estar entre 6 e 8. Em culturas de Humicola sp foi freqüentemente observada anastomose de hifas, possibilitando a ocorrência de heterocariose e/ou heteroplasmose e, indicando que o ciclo parassexual pode ocorrer nessa espécie. A interação entre vários pares de mutantes morfológicos produziu conídios pigmentados semelhantes aos da linhagem selvagem, indicando a ocorrência de algum tipo de sintrofismo ou complementação morfológica. A linhagem selvagem e alguns mutantes morfológicos apresentaram variabilidade quanto à morfologia e produção de celulases. Assim, após várias tentativas de estabilização da linhagem selvagem e de alguns mutantes morfológicos, foram determinadas as atividades exoglucanase, endoglucanase, &#946;-glicosidase, amilase e protease neutra dos mesmos. A atividade &#946;-glicosidase do mutante mor13 foi superior à do selvagem e mor21 destacou-se como melhor produtor de amilase, apesar do selvagem ter demonstrado boa produção das referidas enzimas. Coeficiente de correlação altamente significativo foi verificado entre as atividades exoglucanase-endoglucanase, sugerindo que as mesmas devem ser correguladas nesse microorganismo. Correlações significativas foram verificadas, também entre exoglucanase - protease, endoglucanase - protease e &#946;-glicosidase - protease. / This research was carried out aiming to study some biological aspects of Humicola sp., a cellulolytic fungus. Through the auxanographical assay, it was determined that biotin and thiamine are essential for the growth of this fungus. It rarely occured germination in minimal medium, when spore suspensions were plated. Since the colonies were not grown in complete medium independently, five growth reducers were tested. Sodium citrate at the concentration of 0.700% reduced in 70.1% of the colony size, however did not affect the fungus survival. Nitrous acid, sulfonethylmethane, ultra-violet light and gamma ray were used to induce mutation. The survival ratio of this fungus was observed. From these treatments, three auxotrophic and 27 morphological mutants were isolated and characterized. From the cytological observation, multinuclear conditions were observed in the spore ce11s and myce1ium both wild and mutant strains. It might be possible the occurrence of heterokaryosis and probably it is·responsible for part of the variability. Observations of the nuclei in 250 spores of wild strains showed that the most frequent class included 12 nuclei per spore. Classes with 6, 12, 18 and 24 nuclei per spore were observed in morphological mutants. Three nuclei as the most frequent class was observed in the mutant strain mor10. It suggested that the basic number of nuclei in this fungus is three. The chromosomal behaviour showed a typical mitosis similar to other filamentous fungi. The chromosome number observed at the end of metaphase could not properly determined, however it might be between 6 and 8. In general, Humicola sp. showed anastomosis and it allows the occurrence of heterokaryosis and/or heteroplasmosis. It suggests that the parasexual cycle can occur in this fungus. The association of two morphological mutants produced pigmented spores suggesting some kind of synthrophism or morphological complementation. The wild strain and some morphological mutants showed wide variability concerning to morphology and cellulase production. Five enzyme systems: exoglucanase, endoglucanase, &#914;glucosidase, amylase and neutral protease activities were analysed in wild and selected mutants. Besides the suitable production of &#914;glucosidase and amylase by the wild strain, the mutant mor13 was better producer of &#914;glucosidase and mor21 for amylase. Highly significant level of correlation was observed between exoglucanase and endoglucanase activities showing co-regulation of these enzymes in this fungus. Significant level of correlations were obtained to exog1ucanase-protease, endoglucanase-protease and &#914;g1ucosidase-protease production, as well.