Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2014-12-02T11:21:04Z : No. of bitstreams: 1 000774036_20150224.pdf: 478460 bytes, checksum: 5c3bcdef535ae0c31c4b7881e50abd76 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:34Z: 000774036_20150224.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:10Z : No. of bitstreams: 1 000774036.pdf: 3030358 bytes, checksum: 222bd63dbd7f35d80957befc6fb96c7e (MD5) / Fungos endofíticos são microrganismos que colonizam assintomaticamente o interior de plantas, sendo encontrados em órgãos vegetais como as folhas, caule, frutos, sementes e raízes, podendo habitar a planta por toda vida, e são transmitidos, em alguns casos, para futuras gerações através da semente do hospedeiro. Estes exibem interações ecológicas especificas em seu habitat que tem sido pouco exploradas como estratégia para a descoberta de novos produtos naturais bioativos. Entre as varias modificações de meios de cultivo para estimular rotas biossintéticas silenciosas e aumentar a produção metabólica, a técnica OSMAC (One Strain Many Compounds) foi empregada neste trabalho. Colletotrichum gloeosporioides isolado de Eugenia jambolana foi cultivado em dois meios de cultivo sólidos (arroz e milho) e cinco líquidos (Czapek, Malte, Nutrient, PDB e YM), na presença e ausência de rede de polietileno como suporte sólido, objetivando avaliar a variação na produção de metabólitos secundários. Com a variação dos meios de cultivo, foi possível observar grande variação metabólica em todos os meios, o que foi constatado pelas analises por RMN de 1H e CLAE/DAD. Para o cultivo em extrato de malte na presença do suporte sólido (rede de polietileno) foi observado um aumento de massa de aproximadamente 275% no cultivo. Os extratos EjC(05)Arroz, EjC(05)YmSR, EjC(05)MaltSR e EjC(05)MaltCR, mostraram potencial antitumoral contra as linhagens OVCAR (carcinoma de ovário), HCT-116 (cólon humano) e SF-295 (glioblastoma humano). Avaliação de todos os extratos brutos permitiu selecionar o extrato EjC(05)MaltCR para a desreplicação das substâncias produzida, sendo possível identificar as dicetopiperazinas Ciclo Prolina-Valina e Ciclo Prolina-Leucina/Isoleucina. / Endophytic fungi are microorganisms that asymptomatically colonize the interior of plants, being found in plant organs such as leaves, stems, fruits, seeds and roots, the plant may dwell for a lifetime, and are transmitted in some cases, for future generations through seed host. These exhibit specific ecological interactions in its habitat that has been little explored as a strategy for the discovery of new bioactive natural products. Among the various modifications of culture media to stimulate and increase silent biosynthetic pathways and metabolic production, OSMAC (One Strain Many Compounds) technique was used in this work. Colletotrichum gloeosporioides isolated from Eugenia jambolana was grown in two different kind of media: two nutrient solids (rice and maize) and five nutrient liquids (Czapek, Malte, Nutrient, PDB and YM) in the presence and absence of polyethylene as a solid support network, to evaluate the variation in the production of secondery metabolites. With the change of the culture media, we observed high metabolic variation in all media, which was corroborated by analysis by 1H NMR and HPLC-DAD. For cultivation in malt extract in the presence of the solid support network (polyethylene) was observed a mass increase of approximately 275% in cultivation. The extracts EjC(05)Arroz, EjC(05)YmSR, EjC(05)MaltSR and EjC(05)MaltCR showed antitumor potential against OVCAR (ovarian carcinoma), HCT -116 (human colon) strains and SF- 295 (human glioblastoma). Evaluation of all crude extracts allowed select the EjC(05)MaltCR for dereplication of substances produced, making it possible to identify the diketopiperazines Cycle Proline-Valine and Cycle Proline-Leucine/Isoleucine.

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-09-05Bitstream added on 2014-12-02T11:21:37Z : No. of bitstreams: 1 000800061.pdf: 1547565 bytes, checksum: 2df2d2d64d204de432cc47eb081a5653 (MD5) / A murcha de fusário, causada pelo fungo de solo Fusarium oxysporum f.sp. lactucae é uma das doenças mais severas que ataca m a cultura da alface em todo o mundo. Em 2011, foram encontrados em uma plantação de alface n os município s de Capão Bonito e Campin as n o estado de São Paulo, sintomas característicos do ataque do patógeno. Plantas sintomáticas foram coletadas para identificação do patógeno. O s exame s em microscóp io óptico revel aram a presença de macroconídios falcados de coloração hialina, microconídi os hialinos unicelulares e testes de patogenicidade revelaram a presença de Fusarium oxysporum f.sp. lactucae . Efetuou - se o re - isolamento do patógeno, completa ndo - se assim o Postulado de Koch . No total, for am encontrados 4 isolados patogê nicos atacando pla ntas de alface. A partir do s isolados identificados , fo ram caracterizada s as variações patogênicas através de diferenciadoras de raça. Para esta finalidade foram utilizadas Patriot ( suscetível às raças 1, 2 e 3 ), Costa Rica ( resistente à raça 1 ; suscetível às raças 2 e 3 ), Summer Green ( suscetível às raças 1 e 3 ; resistente à raça 2 ) e Banchu Red Fire ( suscetível às raças 1 e 3, resistente à raça 2 ) . Os resultados obtidos identificaram a ocorrência da raça 3 de Folac. Este é o primeiro relato de ocorrência desta raça no Brasil . A partir do isolado selecionado como sendo o mais agressivo , e caracterizado como pertencente a raça 3 , r ealizou - se a triagem de genótipos de alface, afim de identificar fontes de resistência para uso em programas de melhoramento . No total de 63 genótipos testados apenas Onondaga, Itha ca, Sudenvil e JP - 11 apresentara m - se como resistente a raça 3 de Fusarium oxysporum f.sp. lactucae / The fusarium wilt, caused b y the soil fungus Fusarium oxysporum f.sp. soil lactucae is one of the most severe diseases that attack lettuce crop worldwide. In 2011, were found in a pla nting lettuce in Capão Bonito and Campinas in São Paulo, symptoms characteristic of this pathogen. S ymptomatic plants were collected for pathogen identification. The optical microscope examinations revealed the presence of hyaline staining falcate macroconidia, microconidia unicellular hyaline and pathogenicity tests revealed the presence of Fusarium oxy sporum f.sp. lactucae. We performed the re - isolation of the pathogen, there by supplementing the Koch's postulate. For this purpose were used: Patriot(susceptible to races 1, 2 and 3), Costa Rica (susceptible to races 2 and 3, resistant to race 1); Summer Green (susceptible to races 1 and 3; resistant to race 2) and Banchu Red Fire (susceptible to races 1 and 3, resistant to race 2). The results show the occurrence of race 3 of Folac. This is the first report of the case in Brazil. From the isolated select ed as being the 3 most aggressive, and characterized as belonging to race 3 was held screening of lettuce genotypes in order to identify sources of resistance for use in breeding programs. From of 63 genotypes tested only Onondaga, Ithaca, Sudenvil and JP - 11 were identified as resistant to race 3 of Fusarium oxysporum f.sp. lactucae

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, Programa de Pós-Graduação em Fitopatologia, 2018. / Submitted by Robson Amaral (robsonamaral@bce.unb.br) on 2018-05-09T21:31:32Z No. of bitstreams: 1 2018_AlineSuelendaSilva.pdf: 2028975 bytes, checksum: 83ed9830ce39fc10a92e668c1a9e81ae (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-06-07T12:07:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_AlineSuelendaSilva.pdf: 2028975 bytes, checksum: 83ed9830ce39fc10a92e668c1a9e81ae (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-07T12:07:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_AlineSuelendaSilva.pdf: 2028975 bytes, checksum: 83ed9830ce39fc10a92e668c1a9e81ae (MD5) Previous issue date: 2018-06-07 / Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Universidade de Brasília (UnB). / Os fungos cercosporoides são comumente associados a lesões foliares em várias espécies de plantas. Atualmente, existem mais de 2000 espécies, a maioria das quais é conhecida em um único hospedeiro. Este grupo de fungos é o mais representativo no Cerrado brasileiro, mas até agora a maioria das espécies foram descritas exclusivamente por meio de características morfológicas. A inclusão de dados moleculares na taxonomia de fungos cercosporoides revelou que o grupo é polifilético e demonstrou a necessidade de comparação de sequências para a identificação precisa das espécies. Portanto, este trabalho tem como objetivo epitipificar os espécimes de fungos cercosporoides associados às plantas do Cerrado e entender sua relação filogenética. Para identificação precisa, isolados foram obtidos a partir de lesões foliares em Piper aduncum (Piperaceae), Solanum sp. (Solanceae), Palicourea rigida (Rubiaceae), Smilax japecanga (Smilacaceae), Cybistax antisyphilitica, Handroanthus ochraeus, Handroanthus heptaphyllus, Handroanthus serratifolius, Tabebuia aurea, (Bignoniaceae), Passiflora setacea (Passifloraceae), Mauritia flexuosa (Arecaceae) e Vellozia squamata (Velloziaceae). Após a confirmação da identidade por comparações morfológicas, o DNA genômico foi extraído utilizando o kit Wizard® Genomic DNA Purification. As sequências de nucleotídeos da região do DNA ribossomal foram obtidas e comparadas com sequências de espécimes tipo e espécies disponíveis no GenBank. No total, 28 isolados foram obtidos de 12 plantas hospedeiras pertencentes a oito famílias botânicas. Os isolados obtidos pertencem à Mycosphaerellaceae e são agrupados em seis clados distintos. Este estudo confirma o relato de Pseudocercospora piperis associado à Piper aduncume Pseudocercopora rigidae associada à Palicourea rigida, com alto suporte filogenético. Os epitipos de Cercospora tabebuiae-impetiginosae, Passalora tabebuiae, Pseudocercospora passiflorae-setaceae, P. cybistacis, P. tabebuiae-caraibae e P. tabebuiae-ochraeae associadas a Handroanthus heptaphyllus, Handroanthus serratifolius, Passiflora setacea, Cybistax antisyphilitica, Tabebuia aurea e Handroanthus ochraceus, respectivamente, foram designados pela primeira vez e três prováveis espéciesnovas, sendo duas Pseudocercospora associadas à Solanum sp. e Mauritia flexuosa, respectivamente e Pseudocercosporella associada à Vellozia squamata, serão propostas seguindo as normas do Código Internacional de Nomenclatura para algas, fungos e plantas. Os espécimes examinados neste estudo representam uma pequena fração de fungos cercosporoides relatados no Cerrado e demonstram a necessidade de recoletar esses organismos para entender sua relação filogenética. / Cercosporoid fungi are commonly associated with leaf lesions in numerous plant species. Currently, there are over 2000 species, most of which are known in a single host. Although this group of fungi is the most representative in the Brazilian Cerrado, the majority of species have been described exclusively by morphological characteristics. The inclusion of molecular data in the taxonomy of cercosporoid fungi revealed that the group is polyphyletic and demonstrated the need for sequence comparison for accurate identification of species. Therefore, the objective this work was to epitypify specimens of cercosporoid fungi associated to Cerrado plants and to understand their phylogenetic relationships. For precise identification, isolates were obtained from leaf lesions on Piper aduncum (Piperaceae), Solanum sp. (Solanceae), Palicourea rigida (Rubiaceae), Smilax japecanga (Smilacaceae), Cybistax antisyphilitica, Handroanthus ochraeus, Handroanthus heptaphyllus, Handroanthus serratifolius, Tabebuia aurea, (Bignoniaceae), Passiflora setacea (Passifloraceae), Mauritia flexuosa (Arecaceae) and Vellozia squamata (Velloziaceae). After confirmation of identity by morphological comparisons, genomic DNA was extracted using the Wizard® Genomic DNA Purification kit. Nucleotide sequences from the ribosomal DNA region were obtained and compared to sequences of type specimens and species available from GenBank. In total, 28 isolates were obtained from 12 host plants belonging to eight botanical families. The isolates obtained belong to the Mycosphaerellaceae and are grouped into six distinct clades. This study confirms the report of Pseudocercospora piperis associated with Piper aduncum and Pseudocercopora rigidae associated to Palicourea rigida, with high phylogenetic support. The epitypes of Cercospora tabebuiae-impetiginosae, Passalora tabebuiae, Pseudocercospora passiflorae-setaceae, P. cybistacis, P. tabebuiae-caraibae, and P. tabebuiae-ochraceae associated with Handroanthus heptaphyllus, Handroanthus serratifolius, Passiflora setacea, Cybistax antisyphilitica, Tabebuia aurea and Handroanthus ochraceus, respectively, were designated for the first time and three probable new species, two Pseudocercospora associated with Solanum sp. and Mauritia flexuosa, respectively and a Pseudocercosporella associated with Vellozia squamata, will be proposed following the International Code of Nomenclature for algae, fungi and plants. The specimens examined in this study represent a small fraction of the fungi reported in the Cerrado and demonstrate the need to carry out re-inventory of cercosporoid fungi to understand their phylogenetic relationship.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Ciência da Computação, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-07-29T15:56:28Z No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / Approved for entry into archive by Leandro Silva Borges(leandroborges@bce.unb.br) on 2013-08-06T20:48:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-06T20:48:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_PauloAntonioAlvarez.pdf: 2479176 bytes, checksum: 131c372971163154ba6bf20da667bbce (MD5) / O Paracoccidioides lutzii é o agente causador da Paracoccidioidomicose (PCM), uma doença endêmica em áreas rurais da América Latina que afeta cerca de 10 milhões de indivíduos. Neste trabalho realizamos a primeira reconstrução in silico em larga escala da rede metabólica desse fungo, com o objetivo de integrar e disponibilizar mais informações sobre a biologia molecular de P. lutzii.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Gabriela Lima (gabrieladaduch@gmail.com) on 2017-10-30T16:15:01Z No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-12T14:08:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_AdrielleVelosoCaixeta.pdf: 10460144 bytes, checksum: fd3c3fd66f6bfe53c45f00c2e5d79086 (MD5) Previous issue date: 2017-11-12 / A criptococose é uma doença com mais de 223 mil novos casos por ano, acarretando a morte de aproximadamente 181 mil pessoas, principalmente indivíduos HIV positivos. Cryptococcus neoformans e C. gattii são as principais espécies causadora da meningoencefalite criptocócica, dentre outras complicações. Os tratamentos utilizados atualmente são antifúngicos como anfotericina B, flucitosina e fluconazol. Contudo, essas drogas possuem limitações como toxicidade, custo e o surgimento de resistência em algumas linhagens. Dessa forma, terapias alternativas como uso de citocinas e anticorpos monoclonais vem sendo criados no intuito de desenvolver novas ferrramentas para o tratamento e diagnóstico desta doença. Alguns estudos mostram que mAbs (IgGs) contra glicuronoxilomanana (GXM) da cápsula de C. neoformans podem proteger contra a infecção em camundongos, mas que variantes isotípicas IgG3 podem na verdade agravar a doença, diminuindo assim a sobrevida desses animais. Além disso, já foi descrito que diferenças na região constante de IgGs com paratopos idênticos podem levar a alterações no padrão de ligação ao antígeno, o que contrasta com a definição já consolidada de que a região variável é a única responsável pela afinidade ao antígeno. O mecanismo molecular da diversidade de ligação aos antígenos da cápsula de C. neoformans por esses anticorpos de diferentes isotipos ainda é desconhecido e seu estudo possui grande importância, já que parece promover alteração na resposta imunitária, tendo assim um grande potencial para terapia da doença. No intuito de produzir variantes de anticorpos recombinantes para elucidar quais regiões são responsáveis pela mudança no padrão de ligação à cápsula de C. neoformans, foram desenvolvidos, construídos e sintetizados quatorze vetores que codificam híbridos entre isotipos IgG1 e IgG3, sendo 7 derivados do anticorpo 2H1 (um hibridoma secretor de IgG contra GXM) e sete dos anticorpos 3E5 (outro hibridoma secretor de anticorpo contra GXM). Sua produção foi realizada por meio de expressão heteróloga em células CHO DHFR-/- e HEK 293F. Por fim, foram realizados ensaios de imunofluorescência indireta para observar seu padrão de ligação à cápsula de C. neoformans. Neste foi observado que os anticorpos recombinantes 2H1 produzidos são funcionais e que as alterações realizadas em 2H1 CH1, geraram padrões de ligação de puntiforme (IgG3) e anular (IgG1), como esperado. Porém, quando a dobradiça do anticorpo 2H1 IgG3 foi substituída pela dobradiça de IgG1, o padrão de ligação à cápsula parece mudar de puntiforme para anular. Quando o inverso é feito, substituindo em um anticorpo IgG1 a dobradiça de IgG3, o padrão continua anular. Estes resultados indicam que a dobradiça é uma região necessária, mas não suficiente para determinar o padrão de ligação de um anticorpo à cápsula do fungo. / Cryptococcosis is a disease with more than 223 thousand new cases per year, resulting in the death of approximately 181 thousand people, mainly HIV positive individuals. Cryptococcus neoformans and C. gattii are the main species responsible for cryptococcal meningoencephalitis, among other complications. The treatments currently used for this desease involves the antifungals amphotericin B, flucytosine and fluconazole. However, these drugs have limitations such as toxicity, cost and the emergence of resistance in some strains. Thus, alternative therapies such as the use of cytokines and monoclonal antibodies have been created in order to develop new tools for the treatment and diagnosis of this disease. Some studies show that mAbs (IgGs) against C. neoformans capsule glucuronoxylomannan (GXM) may protect against infection in mice, but that IgG3 isotypic variants may actually enhance the disease, thereby decreasing the survival of these animals. In addition, it has been described that differences in the constant region of IgGs with identical paratopes may lead to changes in the antigen binding pattern, which contrasts with the already established definition that the variable region is the only one responsible for the antigen affinity. The molecular mechanism of C. neoformans capsule antigen-binding diversity by these antibodies of different isotypes is still unknown and its study is of great importance, since it seems to affect the immune response and thus have therapeutic potential. In order to produce recombinant antibody variants to elucidate which regions are responsible for the change in C. neoformans capsule binding pattern, fourteen vectors encoding hybrids between IgG1 and IgG3 isotypes were developed, constructed and synthesized, 7 of which were derived from 2H1 antibody (IgG secreting hybridoma against GXM) and seven of the 3E5 antibodies (another GXM antibody secreting hybridoma). The antibodies were produced by heterologous expression in CHO DHFR -/- and HEK 293F cells. Finally, indirect immunofluorescence assays were performed to observe their binding patterns to the C. neoformans capsule. We observed that the 2H1 recombinant antibodies are functional and that the changes made in 2H1 CH1 have generated punctate (IgG3) and annular (IgG1) binding patterns, as expected. However, when we replaced the hinge of the 2H1 IgG3 antibody with its IgG1 counterpart, the capsule binding pattern appeared to change from punctate to annular. When the reverse is done by substituting the hinge in an IgG1 antibody for its IgG3 counterpart, the pattern remained annular. These results indicate that the hinge is necessary but not sufficient to determine the pattern by which an antibody binds to the C. neoformans capsule.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-11-22T17:06:56Z No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-01-15T19:37:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) / Made available in DSpace on 2018-01-15T19:37:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamilleSilvaFlorencio.pdf: 9849805 bytes, checksum: fe60311acbba40d8dc063c8ef218e4ea (MD5) Previous issue date: 2018-01-15 / Fonsecaea pedrosoi, um fungo filamentoso pigmentado devido à produção de melanina, é o principal agente etiológico da Cromoblastomicose (CBM), uma doença com distribuição mundial, mas predominante em países tropicais e subtropicais. A biobalística é uma técnica amplamente utilizada para a direta entrega de material genético em células e tecidos intactos, pelo bombardeamento de partículas. Outro método bem estabelecido numa variedade de fungos é a transformação mediada por Agrobacterium, que consiste na transferência de um T-DNA da bactéria para a célulaalvo. Em F. pedrosoi não há relatos de protocolos estabelecidos para transformação genética, por isso a utilização de qualquer método requer otimização dos parâmetros. Neste estudo, foi utilizada a cepa CBS 271.37de F. pedrosoi para otimizar o bombardeamento de partículas, e transformação mediada por Agrobacterium. Além disto foram construídos vetores contendo marca de resistência à Higromicina B, Nourseotricina e Neomicina. O plasmídeo gGFP contendo o gene da proteína fluorescente GFP, também foi inserido por biobalística em F. pedrosoi para gerar transformantes verde fluorescentes que podem servir como linhagens repórter. Os transformantes obtidos a partir dos vetores contendo as marcas de resistência aos antibióticos foram avaliados quanto à estabilidade mitótica e a presença dos genes de resistência, confirmada por PCR. As condições testadas para biobalística, a distância das partículas às células alvo (6 e 9 cm) e o tempo de recuperação das células em meio não seletivo (24 e 48h), não apresentaram diferença significativa após análises estatísticas. Apesar disto, foi possível observar que um disparo de seis centímetros de distância e um tempo de incubação em meio não seletivo por 24 horas para recuperação das células foi o que proporcionou um maior número de transformantes (37 transformantesµg DNA para o plasmídeo construído neste trabalho, e 45 transformantesµg DNA para o plasmídeo pAN7.1). Nos experimentos com Agrobacterium a proporção de co-cultivo bactéria: fungo de 10:1 108 com tempo de incubação por 72 horas é o que proporciona maior número de transformantes (209 transformantes para plasmídeo pAD1625). Foram selecionados aleatoriamente transformantes resistentes a Higromicina B obtidos por ambas as técnicas para estimar o número de integrações de hph no genoma por Southern blot. Os dados mostraram que a utilização de biobalística para a transformação genética de F.pedrosoi é eficaz, bem como aquela mediada por Agrobacterium. Esta é a primeira vez que uma cepa de Fonsecaea foi geneticamente transformada e estes resultados abrem novas vias para melhor compreender a patobiologia do fungo usando estudos de função gênica. / Fonsecaea pedrosoi, a pigmented filamentous fungus due to the production of melanin, is the main etiological agent of Chromoblastomycosis (CBM), a disease with a worldwide distribution, but predominant in tropical and subtropical countries. Biolistics is a widely used technique for the direct delivery of genetic material to intact cells and tissues by the bombardment of particles. Another well-established method in a variety of fungi is Agrobacterium-mediated transformation, which involves the transfer of a TDNA from the bacterium to the target cell. There are no reports for F. pedrosoi of established protocols for genetic transformation, and then the use of any method requires the optimization of physical and biological parameters. In this study, F. pedrosoi strain CBS 271.37 was used to optimize particle bombardment, and Agrobacterium-mediated transformation. In addition, vectors containing resistance to HygRomycin B, Nourseotricina and Neomycin were constructed. The gGFP plasmid containing the GFP fluorescent protein gene was also inserted by biolistics in F. pedrosoi to generate fluorescent green transformants that can serve as reporter strains. Transformants obtained after plasmids bombardment were evaluated for mitotic stability and the insertion of resistance genes was confirmed by PCR. The conditions tested for biolistics, distance of the particles to the target cells (6 and 9 cm) and time of recovery of the cells in nonselective medium (24 and 48h), did not present significant difference after statistical analyzes. In spite of this, it was possible to observe that six centimeters of distance and an incubation time of 24 hours in non-selective medium for recovery of the cells were the conditions that provided the highest number of transformants (37 transformants μg DNA for the plasmid constructed in this work, and 45 transformants μg DNA for plasmid pAN7.1). In the experiments with Agrobacterium the use of a bacterial: fungus co-culture ratio of 10: 1  108 for 72 hours provided the largest number of transformants (209 transformants for plasmid pAD1625). HygRomycin B resistant transformants were random selected from both methods to estimate the number of integrations of hph into the genome by the Southern blot. The data showed that the use of biolistics for the genetic transformation of conidia of F.pedrosoi is effective, as well as that mediated by Agrobacterium. This is the first time that a Fonsecaea strain has been genetically modified and these results open new avenues to better understand fungal pathobiology using gene function studies.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-08-01T12:51:42Z No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-08-02T19:47:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T19:47:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) 2016_IsaqueMedeirosSiqueira.pdf: 6983724 bytes, checksum: 423c96221b6277cb355c442ef8e76cfe (MD5) / A cromoblastomicose (CBM) é uma micose subcutânea, crônica, de distribuição cosmopolita, causada por vários fungos demáceos, pigmentados e dimórficos. Pacientes com a doença ainda são tidos como desafio terapêutico, principalmente devido à sua natureza recalcitrante. Tendo em vista a persistência do fungo no tecido e a cronicidade das lesões, a ativação do sistema imunológico do hospedeiro apresenta grande relevância nessa micose. Após infecção com diferentes formas do fungo Fonsecaea pedrosoi (conídios, hifas e células muriformes) isoladamente foi observado manifestações distintas da CBM murina experimental de modo que infecção com células muriformes promoveu o estabelecimento de doença mais duradoura em comparação à infecção com as demais formas do fungo. Ademais, foi visto que a presença de hifas e, principalmente, de células muriformes na lesão, mas não de conídios, está relacionada com alta produção de citocinas pro-inflamatórias durante o estabelecimento da CBM experimental. Sequenciamento de alto desempenho do RNA (RNA-seq) de macrófagos recém-migrados para o peritônio em co-cultivo com conídios ou células muriformes do fungo mostraram que a interação com células muriformes, mas não com conídios, acarreta em intensa regulação positiva de genes relacionados com a resposta inflamatória do hospedeiro repercutindo em alta produção de citocinas pró-inflamatórias, de modo que o estabelecimento de inflamação exacerbada foi correlacionado com a persistência do fungo na lesão. Mecanismos efetores e a expressão de genes importantes na ativação da resposta imune adaptativa estão inibidos na interação com as formas do fungo. Análise das subpopulações de linfócitos T no linfonodo drenante e no sítio de infecção no curso da CBM murina experimental por citometria de fluxo mostraram polarização de linfócitos T com perfil regulatório no linfonodo poplíteo ao passo que no coxim plantar foi observada a predominância de Th17 nos estágios iniciais da doença, sendo sucedida por uma polarização Th1 nos estágios mais tardios, relacionados com a remissão da doença. Ensaios in vivo de neutralização de IL-17A e IFN-γ obstaram o processo de eliminação do fungo no curso da doença. De modo semelhante, animais dectina-2 KO, os quais apresentaram redução na população de Th17 no curso da doença, mostrou redução da carga fúngica prejudicada nos primeiros 15 dias de infecção sem, contudo, afetar a resolução da doença. Por fim, depleção in vivo de células CD25+, a qual leva à redução de células Treg presentes no linfodo drenante, repercutiu em maior redução da carga fúngica nos primeiros 15 dias de infecção, todavia se opos ao processo de remissão da doença observada no modelo experimental murino. Assim, de modo geral, o presente trabalho traz novos elementos na compreensão da imunopatologia da doença, de forma que trabalhos futuros envolvendo a imunomodulação da resposta do hospedeiro para aquela mais efetiva pode representar uma estratégia promissora no tratamento, não só da CBM, como das demais micoses. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chromoblastomycosis (CBM) is a chronic worldwide subcutaneous mycosis, caused by several dimorphic, pigmented dematiaceous fungi. Patients with the disease are still considered as therapeutic challenge, mainly because of its recalcitrant nature. Due to fungal persistence in the tissue and lesions chronicity, the immune system activation in the host is highly relevant in this mycosis. After infection with different Fonsecaea pedrosoi fungal forms alone (conidia, hyphae and muriform cells), it was observed distinct manifestations of experimental murine CBM so that infection with muriformes cells promoted the establishment of longer lasting disease compared to infection with other fungal forms. Moreover, the presence of hyphae and especially muriformes cells in skin lesions, but no conidia, is related with high production of pro-inflammatory cytokines during the establishment of experimental CBM. High throughput RNA sequencing (RNA-seq) of Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages co-cultivated with conidia or muriformes fungal cells showed that the interaction with muriformes cells, but not with conidia, results in strong upregulation of genes related to inflammatory response leading to a high production of proinflammatory cytokines, while exacerbated inflammation was correlated with the persistence of the fungus on the lesion. Effector mechanisms and the expression of genes important to adaptive immune response activation are inhibited in the interaction with the fungal cells. Analysis of T lymphocyte subpopulations in draining lymph node and in the site of infection during the course of experimental CBM by flow cytometry showed polarization of T lymphocytes with regulatory status in the popliteal lymph node while in the footpad was observed predominance of Th17 in the early stages of disease, being succeeded by Th1 popularization in the later stages, which is associated with disease remission. In vivo analysis with IL-17A and IFN-γ neutralization hindered fungal cell elimination in the course of the disease. Similarly, dectin-2 KO animals, Th17 contraction in the course of the disease showed fungal burden impairment in the first 15 days of infection, but did not affected the disease resolution. Finally, in vivo depletion of CD25+ cells, which leads to reduction of Treg cells in the draining lymph node, reflected in greater reduction in fungal burden in the first 15 days of infection, however it opposes to disease remission observed in the experimental CBM. Thus, in general, this study brings new elements in the understanding of the immunopathology of CBM, so that future work involving immunomodulation of the host response to a more effective pattern can represent a promising strategy for the treatment, not only of CBM, but to other mycoses as well.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-16T19:54:22Z No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-09-30T22:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-30T22:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_CristianaMouraAndrade.pdf: 1562427 bytes, checksum: c6b3855c58847246d1e9597518b95126 (MD5) / Sclerotinia sclerotiorum é um fungo necrotrófico, que causa uma doença devastadora denominada mofo branco, responsável por infectar mais de 450 espécies de plantas por todo o mundo. Sendo muito difícil seu controle por fungicidas. Desta forma, o uso de plantas hospedeiras com níveis adequados de resistência é a melhor alternativa para o manejo da doença. Entretanto, devido à natureza da doença, programas de melhoramento tem tido sucesso limitado. Uma alternativa para o desenvolvimento de resistência a um fungo necrotrófico é o uso da estratégia de HIGS (Silenciamento Gênico Induzido pelo Hospedeiro), que envolve a expressão de construções no hospedeiro, gerando dsRNA dirigidos para silenciar genes do patógeno. O alvo escolhido foi o gene que codifica para quitina sintase (chs), que determina a síntese de quitina, um polissacarídeo que é componente estrutural crucial na parede celular de diversos fungos. Plantas de fumo foram transformadas com uma construção do tipo intron-hairpin para silenciamento do gene chs do fungo. Cinco linhagens de plantas transformadas demonstraram uma redução na severidade da doença 72 horas após a inoculação, variando de 55,5% a 86,7% quando comparadas a linhagens não transgênicas. A área da lesão não mostrou extensivo progresso com o passar do tempo (até 120h) em linhagens transgênicas. Resistência à doença e silenciamento do gene chs do fungo teve uma correlação positiva com a presença de siRNAs detectáveis em linhagens transgênicas. Demonstrou-se que genes endógenos do fungo necrotrófico muito agressivo, S. sclerotiorum pode ser silenciado induzido pelo hospedeiro. HIGS do gene da síntese de quitina de fungo pode gerar plantas tolerantes à mofo branco. Do ponto de vista biotecnológico, nossos resultados abrem novas perspectivas para o desenvolvimento de plantas transgênicas resistentes a fungos necrotróficos patogênicos. / Sclerotinia sclerotiorum is a necrotrophic fungus, which causes a devastating disease called white mold, infecting more than 450 plant species worldwide. Its control with fungicides is difficult. Thus, the use of adequate levels of host-plant resistance is the best alternative for disease management. However, due to the nature of the disease, breeding programs have had limited success. A potential alternative to developing necrotrophic fungal resistance is the use of the host-induced gene silencing (HIGS) methods, which involves host expression of dsRNAgenerating constructs directed against genes in the pathogen. We chose as a target the gene coding for chitin synthase (chs) that is involved in the synthesis of chitin, the polysaccharide that is a crucial structural component of the cell walls of many fungi. Tobacco plants were transformed with an interfering intron-hairpin construct for silencing the chs fungal gene. Five transgenic lines showed a reduction in disease severity 72 h after inoculation ranging from 55.5% to 86.7% compared with the non-transgenic lines. The lesion area did not show extensive progress over this time (up to 120h). Disease resistance and silencing of the chs fungal gene was positively correlated with the presence of detectable siRNA in the transgenic lines. It was demonstrated that endogenous genes from the very aggressive necrotrophic fungus S. sclerotiorum can be silenced induced by the host. HIGS of the fungal chitin synthase gene can generate white mold-tolerant plants. From a biotechnological perspective, our results open new prospects for the development of transgenic plants resistant to necrotrophic fungal pathogens.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, Programa de Pós-Graduação em Nutrição Humana, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-03-09T18:30:40Z No. of bitstreams: 1 2015_AliceMariaCardosoBarreto.pdf: 11466051 bytes, checksum: 5a7bc63a10160ddaa32afc10ee97070c (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-26T19:43:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_AliceMariaCardosoBarreto.pdf: 11466051 bytes, checksum: 5a7bc63a10160ddaa32afc10ee97070c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-26T19:43:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_AliceMariaCardosoBarreto.pdf: 11466051 bytes, checksum: 5a7bc63a10160ddaa32afc10ee97070c (MD5) / A Cucurbita ficifolia Bouché, conhecida no Brasil por abóbora-gila, vem sendo estudada por suas propriedades anti-hiperglicemiantes para uso como coadjuvante no tratamento do diabetes mellitus (DM). O objetivo deste estudo foi a caracterização física, química e microbiológica da casca, polpa e semente deste fruto e a determinação dos parâmetros de controle de qualidade para elaboração de fitoterápicos. As abóboras-gila foram colhidas aos 60, 70 e 80 dias após a antese (DAA). Os frutos foram sanitizados e a polpa, a casca e as sementes foram separadas e trituradas. Foram armazenados individualmente em embalagens de polietileno de baixa densidade (PEBD) e congelados a -18 ºC. O material foi liofilizado e moído para a realização das análises granulométricas, cinzas totais, cinzas insolúveis em ácido, teor de umidade, contagem de microrganismos mesófilos e fungos, Escherichia coli, Salmonella e Staphylococcus aureus. As amostras de casca e sementes foram classificadas como pó grosso, já que mais de 40% passaram pelo tamis de 75 m (número 200). Os maiores teores médios de umidade foram encontrados na polpa (3,5%) da abóbora-gila, diferindo da casca (1,2%) e da semente (1,1%). As cinzas totais não diferiram durante as épocas de colheita para a casca (2,7%) e para as sementes (2,6%); a polpa do fruto apresentou o maior valor (3,7%) aos 60 DAA. As cinzas insolúveis em ácido não apresentaram diferença significativa durante as épocas de colheita para nenhuma das partes da abóbora-gila analisadas; os valores médios para a casca, polpa e sementes foram de 0,52, 0,55 e 1,02%, respectivamente. As contagens de microrganismos mesófilos não diferiram entre a polpa (1,7 log UFC g-1) e a semente (1,2 log UFC g-1), já a casca apresentou 2,7 log UFC g-1. Todas as partes do fruto apresentaram semelhança quanto à contagem de fungos, 2,8 log UFC g-1 para a casca, 2,2 log UFC g-1 para a polpa e 2,4 log UFC g-1 para a semente. Não foram detectados Escherichia coli, Salmonella e Staphylococcus aureus. Os parâmetros de controle de qualidade estabelecidos podem ser utilizados como referência em futuros estudos relacionados à elaboração de fitoterápicos a partir de abóbora-gila como matéria-prima. / Cucurbita ficifolia Bouché has been studied for its anti-hyperglycemic properties for use as an adjunct in the treatment of diabetes mellitus (DM). This study aimed at the physical, chemical and microbiological characterization of skin, flesh and seeds of this fruit, as well as the determination of the quality control parameters for phytotherapy use. The fruits were harvested at 60, 70 and 80 days after anthesis (DAA). They were sanitized and skin, flesh and seeds were separated and crushed. Afterwards, they were packed individually in low density polyethylene bags (LDPE) and frozen at -18 ºC. The material was lyophilized and ground to carry out the grain size analysis, total ash, acid insoluble ash, moisture content, mesophilic and fungi count, Escherichia coli, Salmonella and Staphylococcus aureus. Samples of skin and seeds were classified as thick, since more than 40% were retained on sieves of 75 uM (#200). The highest moisture content was found for the flesh (3.5%), differing from the skin (1.2%) and seed (1.1%). The total ash of skin (2.7%) and seed (2.6%) did not differ during the harvest time, and the fruit flesh had the highest value (3.7%) at 60 DAA. Acid insoluble ash showed no significant difference during harvest times for the fruit parts; mean values for skin, flesh and seed were 0.52, 0.55 and 1.02%, respectively. Mesophilic counts did not differ between flesh (1.7 log CFU g-1) and the seed (1.2 log CFU g-1); the skin showed 2.7 log CFU g-1. All parts of the fruit showed similarity in fungi count, 2.8 log CFU g-1 for skin, 2.2 log CFU g-1 for flesh and 2.4 log CFU g-1 for seed. No Escherichia coli, Salmonella e S. aureus were detected. The established quality control parameters can be used as reference for future studies related to preparation of herbal medicines from Cucurbita ficifolia Bouché as raw material.

Orientador: Carlos Renato Corso / Banca: Adauto Ivo Milanez / Banca: Aurora Mariana Garcia de França Souza / Banca: Dejanira de Franceschi de Angelis / Banca: Antonio Sérgio Spanó Seixas / Resumo: O solo do pólo cerâmico de Santa Gertrudes tem sido poluído há décadas por diversos elementos, como Pb, Zn e outros. Foram realizadas quatro coletas de solo (duas durante a época chuvosa e duas na seca), em cinco locais, entre novembro de 2002 a junho de 2003; mediram-se temperaturas, pH, teores de Pb, Zn e umidade. Os fungos foram isolados através do método de Warcup, modificado, com a utilização de meios de extrato de malte agar (MEA) a 2%, adicionados com doses crescentes de nitrato de Zn e de Pb, sendo as colônias purificadas e identificadas. Foram obtidos 70 táxons de fungos anamorfos com 70% de similaridade entre as micotas obtidas com os dois metais. Foram isolados 43 taxons dos meios de cultura com Pb, havendo predominância de isolamentos nos teores mais elevados (500 a 1000 mg Pb/dm3). Foram obtidos 63 táxons nos meios com Zn, com teores de 200 a 500 mg /dm3. Predominaram espécies de Trichoderma, Penicillium e outras usualmente associadas a substratos em decomposição. Estabelecida a diversidade dos fungos, estudou-se a tolerância do Aspergillus terreus e do Paecilomyces lilacinus a nitratos de Pb e Zn. Foi usado o meio Czapek, com a adição de 250; 500; 750 e 1000 mg de Pb por dm3 e 1.000; 2.000; 3.000; 4.000; 6.000; 8.000 e 10.000 mg de Zn por dm3 .Com os dados obtidos, foi possível cálcular o teor do metal que inibe 50% e 100% do crescimento da biomassa EC 50 e/ou EC100 .Para o A. terreus foram encontrados: EC 50 Pb= 489,05 mg/dm3 ; EC 100 Pb = 1.049,08 mg/dm3 ; EC50 Zn = 81,26 mg/dm3 ; EC100 Zn= 6.360,98 mg/dm3 . Para o P. lilacinus foram encontrados: EC 50 Pb = 1.147,89 mg/dm3; EC 100 Pb = 2.389,45 mg/dm3 ; EC 50 Zn= 8.323,75 mg/dm3; EC 100 Zn= 15.995,36 mg/dm3 . Em relação à sensibilidade a Pb e a Zn, o A. terreus apresentou sensibilidades maiores do que o P. lilacinus. Constatou-se também, que a sensibilidade do A . terreus a Zn foi maior do que ao Pb / Abstract: The soil of the ceramic pole, has been polluted since decades by several elements, mainly lead and zinc. Four soil sample collections were conducted (2 during the rainy and 2 in the dry season) at 5 sites, between november 2002 and june 2003, measuring the temperature, pH and the content of Pb, Zn and moisture in the soil. The fungi were obtained by the modified Warcup's soil plate method, using malt extract agar (2%), added of increasing dosis of Zn and Pb salts.The colonies were purified and identified .Seventy anamorphs were obtained, with 70% of similarity between the mycotas isolated from the culture media added with the metals. Fourty three taxa were isolated from the culture media with Pb, with predominance of isolations in higher Pb concentrations (500 to 1000 mg Pb per dm3). 63 taxa were obtained in the media with Zn, mainly in the concentrations between 200 and 500 mg Zn per dm3. Species of Trichoderma, Penicillium and several fungi usually found in decomposing plant debris prevailed. After determining the diversity of fungi in the ceramic pole, Aspergillus terreus and Paecilomyces lilacinus were submitted to tests of tolerance to Pb and Zn. A modified medium Czapek was used amended with 250; 500; 750 and 1000 mg of Pb per dm3 and 1000; 2000; 3000; 4000; 6000; 8000 and 10000 for Paecilomyces lilacinus mg of Zn per dm3 . Afterwards it was possible to calculate the effective concentrations inhibiting growth by 50% and 100% values ( EC50 and EC100 ). Values obtained for A terreus: EC 50 Pb = 489,05 mg/dm3 ; EC 100 Pb= 1.049,08 mg/dm3 ; EC 50 Zn= 81,26 mg/dm3; EC 100 Zn= 6.360,98 mg/dm3 .Values obtained for P. lilacinus; EC 50 Pb = 1.147,89 mg/dm3 ; EC 100 Pb = 2.389,45 mg/dm3 ; EC 50 Zn = 8.323,79 mg/dm3 ; EC 100 Zn = 15.995,36 mg/dm3 . With regards to the sensitivity to lead and zinc, A. terreus showed greater sensitivity than P. lilacinus. A greater sensitivity of A. terreus for zinc than lead was recorded / Doutor