Orientador: Silvana Giuliatti / Banca: Ana Lilia Alzate Marin / Banca: Gabriella Souza Cintra / Resumo: A citricultura brasileira representa um importante segmento econômico na pauta de produtos agrícolas, não só por seu expressivo valor de produção, como por sua importância na geração de empregos diretos e indiretos. No mundo, o Brasil destaca-se como maior produtor de citros, e exportador de suco concentrado de laranja. Entretanto, a citricultura ressente-se de problemas complexos, de natureza diversa, com particular destaque para o de ordem fitossanitária. Dentre esses problemas destaca-se a Mancha Preta dos Citros (MPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa. A doença deprecia os frutos para o mercado in natura e restringe a possibilidade de exportação. Além disso, provoca a queda prematura dos frutos e eleva o custo de produção devido à necessidade de controle. O presente trabalho teve o objetivo de estabelecer relações filogenéticas entre Citrus spp. e Guignardia spp., entender a origem evolutiva do patossistema Citrus - G. citricarpa, bem como avaliar a ocorrência de G. citricarpa como patógeno em momentos distintos na história evolutiva de Citrus. Os dados filogenéticos foram gerados utilizando-se marcadores moleculares do tipo AFLP e sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2, em ambos os gêneros. As análises filogenéticas foram realizadas no programa PAUP* v.4.0b10. Os resultados das análises filogenéticas utilizando AFLP foram mais informativos que aqueles gerados com base no sequenciamento da região ITS1-5.8S-ITS2, tanto para Citrus quanto para Guignardia. As análises de AFLP permitem concluir que G. citricarpa e G. mangiferae, isoladas de C. medica, apresentam maior distância filogenética em relação aos isolados das outras espécies cítricas. A evolução do patossistema Citrus/Guignardia não pôde ser estabelecida, de forma geral, por meio da associação das filogenias... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Brazilian citriculture represents an important economic sector in the agenda of agricultural products, not only for its impressive production value, for its importance in generating direct and indirect jobs. In the world, Brazil stands out as the largest citrus producer and exporter of concentrated orange juice. However, the citriculture suffers from complex problems of diverse nature, with particular emphasis on plant health. Among these problems highlight the Black Spot of Citrus (BSC), caused by the fungus Guignardia citricarpa. The disease depreciates the fruit for the fresh market and restricts the ability to export. Furthermore, causes the fall premature fruit and raises the cost of production due to need for control. This study aimed to establish phylogenetic relationships between Citrus and Guignardia, understanding the evolutionary origin of pathosystem Citrus - G. citricarpa, and to evaluate the occurrence of G. citricarpa pathogen at different period in evolutionary history of Citrus. The phylogenetic data were generate for both genera using AFLP molecular markers and ITS1-5.8S-ITS2 sequencing . Phylogenetic analysis were performed in the PAUP * v.4.0b10 program. The phylogenetic analysis using AFLP were more informative than ITS1-5.8S-ITS2 sequencing in both genera Citrus and Guignardia. The AFLP analysis conclude that G. citricarpa and G. mangiferae isolated from C. medica presents a larger phylogenetic distance if compared to the other citrus spp. strains. The evolution of the pathosystem Citrus/Guignardia could not be established, in general, through the association of phylogenies generated for Citrus spp. and Guignardia spp. except in the particular case of bo isolated from C. medica, which follow a pattern of associations in pathogen/endophyte / Mestre

Orientador: Angela Regina Araujo / Banca: Sandra Imaculada Maintinguer / Banca: Ana Helena Januário / Resumo: Fungos endofíticos são microrganismos que colonizam assintomaticamente o interior de plantas, sendo encontrados em órgãos vegetais como as folhas, caule, frutos, sementes e raízes, podendo habitar a planta por toda vida, e são transmitidos, em alguns casos, para futuras gerações através da semente do hospedeiro. Estes exibem interações ecológicas especificas em seu habitat que tem sido pouco exploradas como estratégia para a descoberta de novos produtos naturais bioativos. Entre as varias modificações de meios de cultivo para estimular rotas biossintéticas silenciosas e aumentar a produção metabólica, a técnica OSMAC (One Strain Many Compounds) foi empregada neste trabalho. Colletotrichum gloeosporioides isolado de Eugenia jambolana foi cultivado em dois meios de cultivo sólidos (arroz e milho) e cinco líquidos (Czapek, Malte, Nutrient, PDB e YM), na presença e ausência de rede de polietileno como suporte sólido, objetivando avaliar a variação na produção de metabólitos secundários. Com a variação dos meios de cultivo, foi possível observar grande variação metabólica em todos os meios, o que foi constatado pelas analises por RMN de 1H e CLAE/DAD. Para o cultivo em extrato de malte na presença do suporte sólido (rede de polietileno) foi observado um aumento de massa de aproximadamente 275% no cultivo. Os extratos EjC(05)Arroz, EjC(05)YmSR, EjC(05)MaltSR e EjC(05)MaltCR, mostraram potencial antitumoral contra as linhagens OVCAR (carcinoma de ovário), HCT-116 (cólon humano) e SF-295 (glioblastoma humano). Avaliação de todos os extratos brutos permitiu selecionar o extrato EjC(05)MaltCR para a desreplicação das substâncias produzida, sendo possível identificar as dicetopiperazinas Ciclo Prolina-Valina e Ciclo Prolina-Leucina/Isoleucina. / Abstract: Endophytic fungi are microorganisms that asymptomatically colonize the interior of plants, being found in plant organs such as leaves, stems, fruits, seeds and roots, the plant may dwell for a lifetime, and are transmitted in some cases, for future generations through seed host. These exhibit specific ecological interactions in its habitat that has been little explored as a strategy for the discovery of new bioactive natural products. Among the various modifications of culture media to stimulate and increase silent biosynthetic pathways and metabolic production, OSMAC (One Strain Many Compounds) technique was used in this work. Colletotrichum gloeosporioides isolated from Eugenia jambolana was grown in two different kind of media: two nutrient solids (rice and maize) and five nutrient liquids (Czapek, Malte, Nutrient, PDB and YM) in the presence and absence of polyethylene as a solid support network, to evaluate the variation in the production of secondery metabolites. With the change of the culture media, we observed high metabolic variation in all media, which was corroborated by analysis by 1H NMR and HPLC-DAD. For cultivation in malt extract in the presence of the solid support network (polyethylene) was observed a mass increase of approximately 275% in cultivation. The extracts EjC(05)Arroz, EjC(05)YmSR, EjC(05)MaltSR and EjC(05)MaltCR showed antitumor potential against OVCAR (ovarian carcinoma), HCT -116 (human colon) strains and SF- 295 (human glioblastoma). Evaluation of all crude extracts allowed select the EjC(05)MaltCR for dereplication of substances produced, making it possible to identify the diketopiperazines Cycle Proline-Valine and Cycle Proline-Leucine/Isoleucine. / Mestre

Orientador: Marcelo Pinto Marcelli / Resumo: Hypotrachyna foi descrito por Vainio em 1890 como Parmelia subgênero Parmelia seção Hypotrachyna, que dividiu nos subgrupos Irregularis, Cychlocheila e Sublinearis. Hale e Kurokawa, em 1964, entenderam que o subgrupo Sublinearis representava muito bem a seção e elegeram Parmelia brasiliana como tipo do subgênero Hypotrachyna, que dez anos depois Hale elevou a gênero. Hoje estima-se que o gênero seja um dos maiores dentro da família Parmeliaceae com cerca de 270 espécies. Estudos filogenéticos recentes comprovaram que esse gênero é polifilético e necessita de uma melhor compreensão. Hypotrachyna é um gênero com centro de dispersão nas américas, onde está o maior número de espécies endêmicas. Em toda a história da liquenologia brasileira não se deu especial atenção às espécies saxícolas de fungos liquenizados pela dificuldade de coleta e transporte. O objetivo do trabalho foi estudar a taxonomia do gênero Hypotrachyna no Brasil, com ênfase nas espécies saxícolas do sudeste brasileiro. Para tanto foram realizadas expedições a localidades da Serra da Mantiqueira, Serra do Caraça e arredores para obtenção de material, que foi estudado de acordo com o protocolo desenvolvido pelo GEL, que sofreu várias atualizações e aprimoramentos decorrentes do desenvolvimento desta tese. Como resultado foram criados os gêneros Hypotrachynella, Lyngenella, Martiana e Vainia, todos segregados de Hypotrachyna s.l., e descobertas 27 espécies novas, sendo que dez pertencem a Hypotrachyna s.l. (H. corrugata, H. etii, H. fracta, H. iarae, H. martiana, H. nashii, H. palui, H. protentoides, H. serrana, e H. vexillina); cinco estão em Hypotrachynella, que compreende espécies com ácidos girofórico e lecanórico (H. caapora, H. marcellii, H. mogiana, H. oreadica, e H. puiggarii); duas em Lyngenella, com espécies produzindo ácido livídico (L. damazioi e L. subsipmanii); cinco em Martiana, de espécies com ácidos evérnico e... / Abstract: Not available / Doutor

Os oceanos constituem 71% da superfície da Terra e muitos microrganismos que provém deste ambiente podem secretar enzimas de alto interesse biotecnológico. As enzimas produzidas por microrganismos marinhos podem ser mais estáveis, devido à alta complexidade deste ambiente. Por este motivo, objetivou-se isolar e identificar os fungos presentes no sedimento marinho e verificar a atividade enzimática da amilase, celulase, lípase e protease dos mesmos em diferentes temperaturas (15°C, 20°C, 25°C e 30°C). As amostras de sedimento foram coletadas com auxilio de seringas estéreis à 10 metros de profundidade, e transportadas até o laboratório em caixas isotérmicas. Após o crescimento, fragmentos de micélio foram repicados no centro de placa de petri para isolamento das amostras. Diferentes substratos foram utilizados para avaliar a atividade da amilase, celulase, lipase e protease dos isolados. A capacidade de hidrolisar os substratos foi verificada em diferentes temperaturas (15°C, 20°C, 25°C e 30°C). Foram isoladas 22 cepas fúngicas, de 14 diferentes espécies, pertencentes a nove gêneros, dentre eles Helicosporium, Helicomyces, Paecilomyces, Phoma, Chaetomium, Geotrichum, duas espécies de Cladosporium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Penicillium chrysogenum e Penicillium aurantiogriseum. O maior índice de positividade enzimática ocorreu na temperatura de 25°C, na qual 71% dos isolados hidrolisaram o substrato lipídico, seguido de protease com 50%, celulase 43% e amilase 36%. Todos os isolados produziram no mínimo um tipo de enzima, nas temperaturas testadas, ficando evidente a que o ambiente marinho é para descoberta de novas enzimas. / Oceans constitute 71% of the Earth's surface, and many microorganisms from this environment may secrete enzymes of high biotechnological interest. Enzymes produced by marine microorganisms might be more stable due to the great complexity of this environment. Therefore, we aimed at isolating and identifying the fungi present in marine sediment and at verifying the corresponding enzymatic activities of amylase, cellulase, lipase, and protease. Sediment samples were collected with sterile syringes at a depth of 10 meters and transported to the laboratory in cool boxes. After their growth, mycelial fragments were sub-cultured and inoculated in the center of Petri dishes for isolating the samples. Different substrates were used to evaluate the activity of amylase, cellulase, lipase and protease. The ability to hydrolyse the substrates was observed at different temperatures (15°C, 20°C, 25°C e 30°C).Twenty-two fungal strains were isolated from 14 different species belonging to nine genera, including Helicosporium, Helicomyces, Paecilomyces, Phoma, Chaetomium, Geotrichum, two different types of Cladosporium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp., Penicillium chrysogenum, and Penicillium aurantiogriseum. The highest enzymatic production rate was found for lipase, produced by 71% of the isolated fungi, followed by protease (50%), cellulase (43%), and amylase (36%). All isolates produced at least one type of enzyme, evidencing that the sea is a environment for discovering new enzymes.

Para melhor compreender o papel dos micro-organismos nas doenças da cavidade bucal, é necessário inicialmente avaliar a diversidade microbiana naturalmente existente em indivíduos saudáveis, além de sua distribuição espacial na cavidade bucal. Muitos estudos são conduzidos elucidando o papel do biofilme e das bactérias na saúde bucal, porém poucas pesquisas focaram na atuação das leveduras. Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a diversidade e distribuição de leveduras do gênero Candida na microbiota bucal de indivíduos saudáveis. Foram coletadas amostras da boca pacientes adultos saudáveis. Foram obtidas amostras de 9 diferentes habitats da boca: bochechas direita e esquerda, assoalho da boca, palato, língua dorsal, língua ventral, dente molar, vestíbulo labial e saliva. Foram avaliados 100 pacientes com uma média de 28 dentes. Quarenta e nove indivíduos apresentaram leveduras na sua microbiota bucal. Candida albicans foi o micro-organismo mais prevalente (49%), seguido de Candida krusei, Candida parapsilosis, Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii), Candida glabrata, Candida tropicalis e Candida dubliniensis. A associação das leveduras encontradas e os habitats bucais sugeriu que comunidades leveduriformes podem distinguir-se entre os diferentes tecidos da cavidade bucal. A língua (dorsal e ventral) apresentou colonização específica, caracterizada pelas espécies C. tropicalis e C. dubliniensis. De forma semelhante, a microbiota dos habitats revestidos por mucosa foi análoga. A microbiota da língua e dos tecidos duros assemelhou-se entre si em menor intensidade. Estes resultados introduzem a dimensão espacial desta diversidade microbiana que vem sendo estudada, complementando as informações obtidas nos estudos do microbioma humano. / To better understand the role of microorganisms in the diseases of the oral cavity, first it is necessary to evaluate the natural microbial diversity in healthy individuals, as well as their spatial distribution in the oral cavity. Many studies are conducted elucidating the role of biofilms and bacteria in oral health, but few research has focused on the yeast’s performance. In this sense, the objective of this study was to evaluate the diversity and distribution of Candida species in the oral microbiota of healthy individuals. Samples were colleted from the mouth of healthy adults. Samples of 9 different mouth habitats were obtained: right and left cheeks, floor of the mouth, palate, dorsal tongue, ventral tongue, molar tooth, labial vestibule and saliva. We evaluated 100 patients with an average of 28 teeth. Forty-nine subjects had yeasts in their oral microbiota. Candida albicans was the most prevalent microorganism (49%), followed by Candida krusei, Candida parapsilosis, Meyerozyma guilliermondii (C. guilliermondii), Candida glabrata, Candida tropicalis and Candida dubliniensis. The association found between the yeasts and oral habitats suggested that communities can be distinguished by the different tissues of the oral cavity. The tongue (dorsal and ventral) presented specific colonization, characterized by the species C. tropicalis, and C. dubliniensis. Similarly, the microbiota of the mucous habitats was similar. The microbiota of the tongue and hard tissue resembled each other in a lesser degree. These results introduce the spatial dimension of the microbial diversity that has been studied, complementing the information obtained in the human microbiome research.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-08-14T11:27:23Z No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-14T11:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_ClaudiaPatriciaBravoChaucanes_Parcial.pdf: 2199963 bytes, checksum: 32f34de0fb4306a0e65e2ee1e766bf95 (MD5) / As infecções fúngicas invasivas configuram um problema grave de saúde pública, especialmente em pacientes imunocomprometidos. Mais de 90% de todas as mortes relacionadas com fungos procedem de espécies que pertencem aos gêneros: Cryptococcus, Candida, Aspergillus e Pneumocystis. A Criptococose é causada pelo fungo encapsulado Cryptococcus neoformans, que causa doença pulmonar e pode-se espalhar amplamente no cérebro e pele; afeta cerca de um milhão de pessoas anualmente e mata cerca de 650.000. A virulência desse fungo é mediada por vários fatores, como a presença de uma cápsula polissacarídica anti-fagocítica e a indução de enzimas antioxidantes tais como peroxidases e catalases. Estes mecanismos antioxidantes de defesa se mostram importantes, não só para a resistência às espécies reativas, mas também para a sobrevivência em hospedeiros mamíferos. Estas enzimas antioxidantes, importantes para a virulência, podem servir como alvos excelentes para a terapia antifúngica. O gene TRR1 é essencial em C. neoformans e, codifica para a enzima citoplasmática tioredoxina redutase. Esta proteína tem um papel importante na manutenção redox da célula e é parte do complexo chamado sistema tioredoxina, no qual participam a tioredoxina (Trx), tioredoxina redutase (Trr) e NADPH, protegendo as células contra o estresse oxidativo e nitrosativo. Algumas drogas estão disponíveis para o tratamento de infecções fúngicas sistêmicas ou superficiais, contudo, existe apenas um número limitado de agentes antifúngicos eficazes (anfotericina B e o fluconazol para tratar a criptococose), muitos deles com efeitos secundários tóxicos e indesejáveis. Além disso, a resistência aos antifúngicos representa uma limitação nas atuais terapias utilizadas, demonstrando uma necessidade urgente de uma nova geração de agentes antifúngicos. No presente trabalho, a expressão heteróloga, purificação e caracterização enzimática de Trr1 e seu substrato Trx1 do fungo patogênico C. neoformans foram realizados. Os genes TRR1 e TRX1 de C. neoformans (H99) foram expressos em Escherichia coli via estratégia recombinante. Os fragmentos gênicos foram obtidos por meio da montagem de genes sintéticos inseridos no vetor pET21a para a produção como proteínas de fusão na forma solúvel. Os produtos expressos foram purificados por cromatografia de afinidade em coluna de níquel e detecção por western-blot e foi possível identificar uma banda de ̴ 39 kDa e outra de ̴ 12 kDa, correspondentes às proteínas recombinantes Trr1 e Trx1. A análise de atividade enzimática da proteína Trr1 recombinante foi realizada por ensaios de cinética enzimática. Os parâmetros cinéticos Vmáx e Km foram determinados variando a concentração de Trx1 de 0.25 μM até 15 μM. Como resultado a velocidade de reação foi aumentando gradualmente à medida que a concentração xiv de substrato crescia, mostrando assim a capacidade da Trr1 em reduzir Trx1. Este trabalho possibilitou a produção das proteínas recombinantes com atividades biológicas esperadas, proporcionando quantidades necessárias para a realização de estudos estruturais tridimensionais (3D). Como resultado preliminar foi identificado o crescimento dos cristais para a proteína recombinante Trx1 de C. neoformans, em presencia do agente precipitante sulfato de amônio 2 M pelo método de difusão de vapor em gota sentada. A partir do refinamento das condições será possível encontrar uma solução ideal para a difração dos cristais de cada proteína. Diante dos resultados obtidos pelo nosso grupo, na proposta maior do projeto principal: “Pós-genoma de fungos patogênicos humanos visando o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas”, este trabalho encontra-se inserido nesta linha de pesquisa para a obtenção de novas moléculas candidatas que inibam a atividade da proteína tioredoxina redutase, especificamente na viabilidade do fungo patogênico C. neoformans. Embora estas moléculas tenham sido selecionadas por varredura virtual de quimiotecas, uma metodologia in silico, os resultados in vitro feitos previamente em nosso grupo já apontaram o potencial destas moléculas como antifúngicos para o gênero Paracoccidioides spp. Em parceria com pesquisadores da França foi predita a estrutura da proteína Trr1 de C. neoformans por modelagem molecular por homologia. A partir da varredura virtual de quimiotecas foram selecionadas 4 moléculas inibitórias do banco Life Chemicals que interagem com os modelos de Trr1 obtidos para C. neoformans (Anexo). Os testes in vitro para validar tais inibidores potenciais estão sendo realizados em nosso laboratório, com intuito de desenvolver novas drogas para o tratamento de infecções fúngicas de relevância mundial, e gerar informações básicas da estrutura e função desta proteína. / Invasive fungal infections constitute a major public health problem, especially in immunocompromised patients. Over 90% of all deaths related to fungi come from species belonging to the genera Cryptococcus, Candida, Aspergillus and Pneumocystis. Cryptococcosis is caused by Cryptococcus neoformans, an encapsulated fungus that causes lung disease and can spread widely in the brain and skin, affects about one million people each year and kills about 650,000. The virulence of this fungus is mediated by several factors such as the presence of an anti-phagocytic polysaccharide capsule, and the induction of antioxidant enzymes such as peroxidases and catalases. These antioxidant defense mechanisms have been shown to be important not only for resistance to reactive species but also for survival in the mammalian host. These antioxidant enzymes important for virulence may serve as excellent targets for antifungal therapy. The TRR1 gene is essential and encodes the cytoplasmic thioredoxin reductase enzyme. This protein has a role in maintaining the redox balance of the cell and forms part of a complex called thioredoxin system, which contains thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (Trr) and NADPH, protecting cells against oxidative and nitrosative stress. Some drugs to treat systemic and superficial fungal infections are available; however, there is only a limited number of effective antifungal agents (amphotericin B and fluconazole to treat cryptococcosis) many of them are toxic and present undesirable secondary effects. Furthermore, drug resistance is a limitation on current therapy used, demonstrating an urgent need for a new generation of antifungal agents. In this study, heterologous expression, purification and enzymatic characterization of Trr1 and its substrate Trx1 of the fungal pathogen C. neoformans were performed. The TRX1 and TRR1 genes of C. neoformans (H99) were expressed in Escherichia coli using recombinant strategy. The gene fragments were obtained by assembling synthetic genes and these were inserted into pET21a vector for production as fusion proteins in soluble form. The expressed products were purified by affinity chromatography on nickel column and detected by western blot. It was possible to identify a band of ̴ 39 kDa and another of ̴ 12 kDa corresponding recombinant proteins Trr1 and Trx1. The enzymatic activity of the recombinant protein Trr1 was confirmed by assays of enzyme kinetics. The kinetic parameters Km and Vmáx were determined by varying the Trx1 concentration of 0.25 μM to 15 μM. As a result the reaction rate was gradually increased as the substrate concentration, showing the ability of Trr1 to reduce Trx1. In conclusion, this work shows a viable system for the production of recombinant proteins providing amount necessary to perform three-dimensional structural studies (3D). As a preliminary result crystal xvi growth for recombinant protein, Trx1 of C. neoformans was identified in the presence of sulfate 2M as the precipitant agent. From the refinement of the conditions will be possible to find an ideal solution for diffraction of crystals of each protein. Considering the results obtained by our group, most of the main project proposal: "Post-genome of human pathogenic fungi aiming the development of new antifungal drugs," this work is inserted in this line of research for obtaining new candidate molecules that inhibit the activity of thioredoxin reductase protein, specifically on the viability of the pathogenic fungus C. neoformans. Although these molecules have been selected for virtual screening library, a methodology in silico, in vitro results previously made in our group have pointed out the potential of these molecules as antifungal in the Paracoccidioides genus. In collaboration with researchers from France, the structure of the protein Trr1 of C. neoformans was predicted by molecular homology modeling. From the virtual screening library, four inhibitory molecules that interact with the Trr1 models obtained for C. neoformans were selected from Life Chemicals database (Appendix). Currently in vitro tests to validate these potential inhibitors are being carried out in our laboratory, aiming at developing new drugs for the treatment of fungal infections of global significance, and generating basic information on the structure and function of this protein.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Molecular, Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, 2012. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-10-14T12:22:10Z No. of bitstreams: 1 2012_JackelineLeitePereira.pdf: 3652289 bytes, checksum: 11e3d00bc97f96db1c6ae48254de4373 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-15T14:19:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JackelineLeitePereira.pdf: 3652289 bytes, checksum: 11e3d00bc97f96db1c6ae48254de4373 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-15T14:19:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JackelineLeitePereira.pdf: 3652289 bytes, checksum: 11e3d00bc97f96db1c6ae48254de4373 (MD5) / Este estudo teve como objetivo analisar a interação entre o fungo Trichoderma harzianum ALL-42 isolado de solo do Cerrado e Phaseolus vulgaris, na presença ou ausência dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani e Fusarium solani. Foram avaliadas as capacidades de T. harzianum de promover o crescimento, bem como de modular a resposta de defesa e alterar o padrão de expressão de proteínas na planta hospedeira, P. vulgaris. Os feijoeiros cultivados na presença deste isolado mostraram um aumento significativo de 14,29% no tamanho, 17,72% na área foliar e 36,31% no volume radicular, quando comparados às plantas controle. Análises da produção de enzimas relacionadas à resposta de defesa vegetal em folhas em raízes das plantas mostraram que os valores mais significativos de atividade de quitinases em folhas e raizes de feijoeiro, foram detectadas para as plantas cuja interação envolvia o fungo micoparasita T. harzianum e um dos fungos fitopatogênicos, R. solani ou F. solani. Para β 1,3 glucanases, os valores de atividade mais significativos foram detectados em folhas, após 7 dias de cultivo na presença do fungo fitopatogênico R. solani e em raízes, após 14 dias, nesta mesma condição. Valores aumentados da atividade de peroxidases foram detectados nas folhas de plantas cultivadas por 14 dias na presença do isolado de Trichoderma e do fungo fitopatogênico R. solani. Em raízes o aumento nesta atividade foi detectado nas plantas cultivadas apenas na presença do isolado de Trichoderma. A presença do isolado de Trichoderma e dos fungos fitopatogênicos alterou o padrão de expressão dos genes CHT1, GLU, POD6 e LOX1 codificadores de proteínas de defesa, principalmente após 14 e 21 dias de crescimento. Além disto, a presença destes fungos alterou o padrão de expressão de proteínas em folhas e raízes de feijoeiro. Dos ―spots‖ diferencialmente expressos, 80 foram selecionados para identificação por espectrometria de massas utilizando ―Peptide Mass Fingerprint‖, sendo que 29 dos identificados foram retirados de mapas proteômicos de raízes, e 19 de mapas proteômicos de folhas. As proteínas identificadas em suas maioria tem papel na resposta de defesa de plantas, a exemplo da glutationa S – transferase, Cinamoil CoA redutase, serina-treonina quinase, chalcona isomerase, peroxirredoxina, proteínas da família PR-1, e no metabolismo de carboidratos, como, subunidades da Rubisco, anidrase carbônica e gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase. Estes resultados sugerem que o isolado de T. harzianum ALL-42 é capaz de promover mudanças no metabolismo da planta, e desencadear ou potencializar a resposta de defesa em feijoeiro comum, quando R. solani e F. solani estão presentes. __________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The aim of this study was to analyze the interaction between the fungus Trichoderma harzianum ALL-42, which was isolated from the soil of the ―Cerrado‖ biome, and Phaseolus vulgaris in the presence or absence of the phytopathogenic fungi Rhizoctonia solani and Fusarium solani. The growth-promoting capacities of T. harzianum were evaluated, as well as its ability to modulate the defense response and alter the protein expression pattern in the host plant P. vulgaris. Bean plants cultivated in the presence of this isolate showed a significant increase of 14.29% in size, 17.72% in leaf area, and 36.31% in root volume when compared with control plants. Analysis of enzyme production related to the plant defense response in the leaves and roots of the plants showed that the most significant values for kinase activity in the leaves and roots of bean plants were detected for those in which there was an interaction between the microparasitic fungus T. harzianum and one of the phytopathogenic fungi R. solani or F. solani. The most significant values for β-1,3-glucanase activity were detected in the leaves after 7 days of cultivation in the presence of the phytopathogenic fungus R. solani and in the roots after 14 days under the same conditions. Increased values were detected for peroxidase activity in the leaves of plants cultivated for 14 days in the presence of the isolate of Trichoderma and the phytopathogenic fungus R. solani. In the roots, an increase in this activity was detected in plants cultivated only in the presence of the isolate of Trichoderma. The presence of the isolate of Trichoderma and the phytopathogenic fungi altered the expression pattern of the genes CHT1, GLU, POD6, and LOX1 that code for defense proteins, particularly after 14 and 21 days of growth. Furthermore, the presence of these fungi altered the protein expression pattern in the roots and leaves of bean plants. Of the differentially expressed spots, 80 were selected for identification by mass spectrometry using peptide mass fingerprinting. Of those identified, 29 were taken from proteomic maps of the roots and 19 from proteomic maps of the leaves. The majority of the identified proteins play a role in the defense response of the plants, e.g., glutathione S-transferase, cinnamoyl-CoA-reductase, serine-threonine kinase, chalcone isomerase, peroxiredoxin, and proteins of the PR-1 family, and in the metabolism of carbohydrates, such as subunits of Rubisco, carbonic anhydrase, and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. These results suggest that the ALL-42 isolate of T. harzianum is capable of promoting changes in the metabolism of the plant and triggering or potentiating the defense response in the common bean plant when R. solani and F. solani are present.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-03-04T12:17:39Z No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-06T14:00:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_LuanaCastroOliveira.pdf: 2841384 bytes, checksum: 0632b4b2ba99fc494aa9ce5971604fd2 (MD5) / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica humana mais comum na América Latina. O local de contato inicial entre o fungo P. brasiliensis e o hospedeiro é o epitélio respiratório. A resistência do hospedeiro à PCM está associada à ativação de células fagocíticas ao longo da infecção. Os antifúngicos atualmente utilizados no combate à PCM apresentam desvantagens como a alta incidência de efeitos colaterais e o aumento de casos de resistência. A epigenética refere-se a modificações nos padrões de expressão gênica herdáveis ao longo de sucessivas divisões celulares ou de sucessivas gerações de um indivíduo, e que não envolvem mudanças na sequência de nucleotídeos do DNA. As principais marcas epigenéticas envolvem a metilação de citosinas em ilhas CpG no DNA e as modificações pós-traducionais de histonas. Drogas como a 5-aza-2’-deoxi-citidina (5-AZA, inibidor de DNA metiltransferases), tricostatina A (TSA) e butirato de sódio (BS, inibidores de histona desacetilases) vêm sendo empregadas para modular estados epigenéticos. Em fungos patogênicos como C. albicans e C. neoformans, a administração de moduladores epigenéticos levou a uma diminuição no crescimento e viabilidade das leveduras. No presente estudo, avaliamos os efeitos biológicos de 5-AZA, TSA e BS sobre leveduras de P. brasiliensis e sobre uma linhagem de macrófagos murinos. As mais altas concentrações de drogas que não interferiram no crescimento celular foram definidas como BS 1 mM, TSA 20 nM e 5-AZA 1 µM, para macrófagos J774, e BS 10 mM, TSA 1,5 µM e 5-AZA 2 µM para leveduras de P. brasiliensis. 5-AZA provocou um aumento do índice de internalização das leveduras pelas células J774 com 2h e 6h de infecção, enquanto BS provocou aumento em 2h e TSA não afetou esse índice. A análise do acúmulo de mensageiros de genes relacionados à resposta imune revelou uma diminuição dos níveis de transcritos de MyD88 em macrófagos tratados com BS, ao passo que 5-AZA elevou os níveis de transcritos desse adaptador. O acúmulo de transcritos NF-κB diminuiu quando os macrófagos foram infectados e tratados com 5-AZA e BS, enquanto TSA não teve efeito. O mensageiro de TNF-α, em macrófagos infectados tratados com 5-AZA, também teve aumento significativo de acúmulo, o que não aconteceu no tratamento com TSA ou BS. Os níveis do transcrito de IL-6 foram afetados apenas pela administração de TSA, que elevou o acúmulo dos mensageiros dessa interleucina. Nas culturas infectadas e tratadas com TSA observou-se uma diminuição do nível de TNF-α secretado, enquanto o tratamento com BS provocou um aumento dessa citocina no sobrenadante. Nossos dados indicam que alterações epigenéticas possam participar da regulação da resposta de fagócitos quando em contato com células fúngicas, e que mais de uma via de sinalização pode estar relacionada a essa resposta. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiologic agent of Paracoccidioidomycosis (PCM), the most prevalent deep mycosis in Latin America. The first contact between the fungus and the host is the respiratory epithelium. The host resistance to PCM is related to the activation of phagocytic cells during the course of the infection. The antifungals used against PCM show many disadvantages, as high incidence of side effects and increasing fungal resistance. The term epigenetic refers to modifications in the genetic expression patterns, heritable through cell divisions or individuals generations, which do not implicate in changes in the sequence of nucleotides of the DNA. The main epigenetic marks are the cytosine methylation in DNA CpG islands and histones post-translational modifications. Drugs such as 5-aza-2’-deoxy-cytidine (5-AZA, methyltransferase inhibitor), trichostatin A (TSA) and sodium butyrate (SB, histone desacetylase inhibitors) have been used to modulate epigenetic states. In pathogenic fungi such as C. albicans and C. neoformans, the use of epigenetic modulators led to a lower growth rate and yeasts viability. In the present work we evaluated the biological effects of 5-AZA, TSA and SB on P. brasiliensis yeast cells and on a lineage of murine macrophages. The highest drug concentrations that did not affect cell growth were SB 1 mM, TSA 20 nM and 5-AZA 1 µM, to the macrophages, and SB 10 mM, TSA 1,5 µM and 5-AZA 2 µM, to P. brasiliensis yeast cells. 5-AZA induced a higher internalization yeasts index by the macrophages within 2h and 4h of infection, while SB had the same effect with 2h of infection and TSA did not affect this index. The transcripts accumulation analysis of genes related to the immune response showed a down modulation of the MyD88 transcript levels in macrophages treated with SB, whilst 5-AZA up regulated the transcript levels of this gene. The NF-κB transcript level was lower when macrophages were infected and treated with 5-AZA and SB, while TSA did not show any effect. TNF-α transcripts accumulation was also upregulated in macrophages infected and treated with 5-AZA, what was not observed with TSA or SB. IL-6 transcripts level was only affected by the TSA administration, which upregulated it. In cultures infected and treated with TSA, there was a lower level of secreted TNF-α, while SB had the opposite effect, increasing this cytokine in the supernatant. Our data indicate that epigenetic modifications can participate in the regulation of the phagocytes response to fungal cells and that alternative signaling pathway can be related to this answer.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Departamento de Nutrição, 2007. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-10-21T19:19:31Z No. of bitstreams: 1 dissert_Vanessa Cunha Taveira.pdf: 4302270 bytes, checksum: 63c4dd8d31f740d852cb47de58a9a1bc (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-11-10T12:21:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissert_Vanessa Cunha Taveira.pdf: 4302270 bytes, checksum: 63c4dd8d31f740d852cb47de58a9a1bc (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T12:21:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissert_Vanessa Cunha Taveira.pdf: 4302270 bytes, checksum: 63c4dd8d31f740d852cb47de58a9a1bc (MD5) Previous issue date: 2007 / INTRODUÇÃO: O câncer é considerado a segunda principal causa de morte em vários países do mundo apesar dos avanços da terapêutica. Em países Orientais cogumelos comestíveis especialmente os da família Agaricaceae fazem parte da medicina tradicional e são extensamente utilizados no tratamento do câncer devido às suas propriedades nutricionais que atuam na melhora das alterações metabólicas constantemente presentes em pacientes portadores de tumores malignos e também devido às suas propriedades farmacológicas que atuam principalmente no aumento da resposta imunológica. OBJETIVOS: Avaliar os efeitos farmacológicos e nutricionais do fungo Agaricus sylvaticus (Agaricaceae) em animais inoculados com tumor sólido de Walker 256. MATERIAIS E MÉTODOS: Foram utilizados 120 ratos machos adultos separados em 6 grupos, sendo 2 grupos controle não inoculados com tumor de Walker: Grupo I – tratado com solução placebo por gavagem a cada 12 horas por 12 dias e Grupo II- tratado com solução de A. sylvaticus por gavagem a cada 12 horas por 12 dias. Quatro grupos foram inoculados com tumor de Walker e tratados da seguinte forma: Grupo III – tratado com solução placebo por gavagem a cada 12 horas por 12 dias; Grupo IIIS – tratado com solução placebo por gavagem a cada 12 horas até o dia do óbito para avaliação do tempo de sobrevida; Grupo IV tratado com solução de A. sylvaticus a cada 12 horas por 12 dias e Grupo IVS – tratado com solução A. sylvaticus a cada 12 horas até a data do óbito. Para a análise das variáveis estudadas, foram realizadas avaliações clínicas, hemograma completo, exame bioquímico, medição dos tumores, necropsia e avaliação do tempo de sobrevida. RESULTADOS: Todos os animais inoculados com tumor apresentaram anemia normocítica, alteração das taxas de creatinina, uréia, triglicerídeos, glicose e proteína C reativa, perda de peso, sinais clínicos e mudança de comportamento característico de dor, sofrimento e desconforto. Os animais inoculados com tumor tratados com A. sylvaticus apresentaram valores de hematócrito e hemoglobina mais próximos dos valores de referência comparados aos animais inoculados com tumor tratados com placebo (p < 0,05) indicando uma melhora do quadro anêmico. Os exames bioquímicos mostraram que as taxas de uréia, triglicerídeos e proteína C reativa foram mais próximas do normal nos animais inoculados com tumor tratados com A. sylvaticus comparados aos animais inoculados com tumor tratados com placebo (p < 0,05). Na avaliação clínica os animais com tumor tratados com o fungo apresentaram menor incidência de sinais característicos de dor e sofrimento comparados aos tratados com placebo (p < 0,01). O volume tumoral também foi menor no grupo tratado com cogumelo comparado ao grupo não tratado (p < 0,05). Não foi observado aumento da sobrevida dos animais tratados com A. sylvaticus (p > 0,05). Os animais controle tratados com A. sylvaticus não apresentaram alterações hematológicas, bioquímicas ou clínicas, comparados aos animais controle tratados com placebo o que indica que este fungo apresenta boa tolerabilidade. CONCLUSÃO: Estes resultados sugerem que o fungo A. sylvaticus pode ser utilizado como adjuvante no tratamento do câncer atuando na melhora do quadro clínico. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / INTRODUCTION: Cancer is the second cause of death in a great number of countries despite therapeutic advances. In Oriental countries such as Japan and China, edible mushrooms, specially the ones belonging to Agaricaceae family are ingredients of traditional medicine and are widely used as adjuvants in the treatment of cancer due to its nutritional properties that improve metabolic alterations and also to its pharmacological properties that increase the immunological response. AIM: The aim of the present study was to evaluate the pharmacological and nutritional properties of the mushroom Agaricus sylvaticus (Agaricaceae) in animals inoculated with Walker 256 tumor. MATERIALS AND METHODS: 120 male Wistar rats, adults were separated in 6 groups. Two control groups: Group I- treated with placebo solution by gavage every 12 hours for 12 days and Group II- treated with A. sylvaticus solution by gavage every 12 hours for 12 days. Four groups of animals were inoculated with Walker 256 tumor and separated as following: Group III – treated with placebo solution by gavage every 12 hours for 12 days; Group IIIS – treated with placebo solution by gavage every 12 hours until the day of death to evaluate animal's surviving time; Grupo IV- treated with A. sylvaticus solution by gavage every 12 hours for 12 days and Group IV- treated with A. sylvaticus solution by gavage every 12 hours until the day of death. RESULTS: The control animals treated with A. sylvaticus presented no alterations in clinical, hematological and biochemical analyses compared to control animals treated with placebo indicating that this fungus is well tolerated. The animals inoculated with tumor presented normocitic anemia, alteration in creatinine, urea, triglicerides, glucose and C reactive protein rates, weight loss, clinical signs and behavioural changes that are characteristics of pain and suffering. Cancer animals treated with A. sylvaticus presented hematocrit and hemoglobin rates nearer the normal values when compared to animals treated with placebo ( p < 0,05), indicating an improvement of anemic state. The biochemical exams showed an improvement of urea, triglicerides and C reactive protein rates in the animals treated with A. sylvaticus, compared to animals treated with placebo ( p < 0,05). In clinical evaluation the animals treated with the fungus presented less incidence of characteristic signs of pain and suffering compared to the ones treated with placebo ( p < 0,01). The tumoral volume was also smaller in the group treated with mushroom compared to the no treated group ( p < 0,05). It was not observed an improvement in surviving time in the animals treated with A. sylvaticus ( p > 0,05). CONCLUSION: These results suggest that the edible mushroom A. sylvaticus can be used as an adjuvant in cancer treatment to improve patient’s clinical state.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-11-03T16:49:34Z No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:31:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lorena da Silveira Derengowski.pdf: 1542481 bytes, checksum: cb6123102a20bb711c1f94f71d3a369d (MD5) Previous issue date: 2006 / O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. O mecanismo mais importante de defesa do hospedeiro contra infecções por P. brasiliensis é a resposta imunológica celular. Esse fungo é capaz de sobreviver e se replicar no interior de macrófagos murinos e humanos, revelando a existência de mecanismos que permitam a sobrevivência no ambiente inóspito do fagossomo da célula hospedeira. Em concordância com essa habilidade de P. brasiliensis em sobreviver nesse ambiente de carência nutricional, estresse oxidativo e baixo pH, análises do transcriptoma desse fungo revelam ortólogos a potenciais genes de virulência de outros microrganismos patogênicos. Nesse contexto, esse trabalho descreve a análise da expressão de potenciais genes de virulência de P. brasiliensis por RT-PCR. Visando a avaliar a expressão dos genes icl1 (isocitrato liase) e mls1 (malato sintase), que codificam as enzimas do ciclo do glioxalato, leveduras de P. brasiliensis foram crescidas em condições que potencialmente mimetizam às encontradas no interior do fagossomo, substituindo-se glicose por acetato como única fonte de carbono. Os resultados sugerem um significativo aumento na expressão de icl1 e mls1 quando do cultivo do fungo em meio contendo apenas acetato. A mesma análise foi feita para os genes ady2, que codifica uma permease de acetato, e icl2, que parece codificar outra isoforma da enzima isocitrato liase. Entretanto, os resultados indicam que os genes ady2 e icl2 de P. brasiliensis são regulados independentemente das fontes de carbono utilizadas nesse trabalho. Ainda, a expressão de ure1 (urease) foi analisada quando do cultivo de P. brasiliensis em pH ácido. Esses experimentos não mostraram uma regulação do gene ure1 desse fungo dependente de pH. Adicionalmente, esse trabalho descreve, pela primeira vez, experimentos de RT-PCR utilizando RNA extraído de leveduras de P. brasiliensis após 6 horas de co-cultura com macrófagos murinos. Os resultados mostram um aumento no nível de expressão dos genes icl1, mls1 e ady2, quando comparada à expressão por células crescidas em meio convencional. Essas observações indicam claramente que P. brasiliensis utiliza o ciclo do glioxalato como uma importante via metabólica alternativa para produção de energia, como observado para outros fungos. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The fungus Paracoccidioides brasiliensis is the ethiologic agent of paracoccidioidomycosis, the most prevalent systemic mycosis in Latin America. The most important mechanism of host defense against P. brasiliensis infection is cell-mediated immune response. This fungus is able to survive and replicate within the phagossome of murine and human macrophages, revealing that it have evolved mechanisms allowing its survival within the phagocytic cells, which are considered an inhospitable habitat. In agreement with the ability to survive in this nutritionally poor, oxidative stress and low pH environment, the analysis of P. brasiliensis transcriptome revealed several putative orthologs to virulence genes of other human facultative intracellular pathogenic microorganisms. In this context, this work describes the analysis of putative virulence genes expression by RT-PCR. In order to evaluate the expression of glyoxylate cycle genes, icl1 (isocitrate lyase) and mls1 (malate synthase), the yeast form of P. brasiliensis was grown in media mimicking the phagossome millieu, in which glucose was replaced by acetate as a sole carbon source. The results suggests a significantly increase in the icl1 and mls1 expression when this fungus was grown in media with acetate as the only carbon source. The same analyzis was performed for ady2 gene, that encode an acetate permease, and icl2 gene, that probably encodes another putative isoform of isocitrate lyase enzyme. However, the results indicate that ady2 and icl2 genes of P. brasiliensis are not regulated by these different carbon sources used in this work. On the other hand, the expression of ure1 (urease) was analyzed in this work when P. brasiliensis yeast cells were grown in acid pH, mimicking the phagossome environment. These experiments don’t show a pHdependent regulation by ure1 gene of this fungus. In addition, this work describes for the first time RT-PCR experiments using RNA extracted from yeast cells recovered from murine macrophages after 6 hours of co-culture. The results show the higher levels of icl1, mls1 and ady2 gene expression when compared to cells grown in conventional media. These observations clearly indicates that P. brasiliensis uses the glyoxylate cycle as an important alternative energetic metabolism pathway, as observed for other fungi.