L'agrégation de l'α-synucléine (α-syn) est au coeur du processus pathologique observé dans la maladie de Parkinson ou l'atrophie multi systèmatisée. La β-synucléine (β-syn) ressemble à l'α-syn mais pourrait avoir un rôle neuroprotecteur en inhibant l'agrégation de l'α- syn. Le but de cette thèse était de mettre en place et de tester chez la souris une stratégie thérapeutique visant à inhiber l'agrégation de l'α-syn en faisant exprimer la β-syn humaine via des vecteurs viraux adéno-associés (AAV). Nous avons d'abord caractérisé un modèle de synucléinopathie, la souris transgénique M83. Ces souris expriment l'α-syn humaine mutée en A53T, et développent une pathologie sévère associée à l'agrégation de l'α-syn. Nos résultats confirment le fait que l'agrégation de l'α-syn peut se propager à partir de l'injection périphérique de forme agrégée de la protéine, vers le système nerveux central. De plus, ils montrent que l'accumulation de l'α-syn pathologique chez la souris M83 malade dépend de l'inoculum utilisé pour accélérer leur pathologie et du niveau d'expression de l'α-syn mutée en A53T chez ces souris. Les essais de thérapie génique réalisés dans ce modèle M83 suggèrent que, quelle que soit la stratégie d'injection du vecteur AAV utilisée, la β-syn n'a pas eu d'effet protecteur détecté contre l'agrégation de l'α-syn. Une expression durable de la protéine β-syn humaine chez les souris M83 malades inoculées avec le vecteur AAV véhiculant le gène de la β-syn a pourtant été confirmée. Cependant, la β-syn pourrait s'être agrégée dans nos conditions expérimentales, comme cela a été précédemment décrit, ce qui pourrait peut-être expliquer l'absence d'effet protecteur détecté / The aggregation of α-synuclein (α-syn) is central in the pathological process observed in Parkinson’s disease or multiple system atrophy. Β synuclein (β-syn) shares some similarities with α-syn but may have a neuroprotective effect by inhibiting the aggregation of α-syn. The goal of this thesis was to develop and to test a therapeutical strategy potentially able to inhibit the aggregation of α-syn by expressing human β-syn using adeno-associated vectors (AAV). First, we characterized a model of synucleinopathy, the M83 transgenic mouse. These mice express the human A53T mutated α-syn and develop a severe disease associated with the aggregation of α-syn. Our results confirm the ability of the aggregation of α-syn to spread through the central nervous system following a peripheral injection of aggregates of α-syn. Furthermore, they show that the accumulation of pathological α-syn in sick M83 mice depends on the inoculum used to accelerate their disease and the expression level of human A53T mutated α-syn in these mice. Gene therapy trials realized in the M83 model suggest that, regardless the strategy used to inject AAV vector, β syn did not have a protective effect against the aggregation of α-syn. A lasting expression of the human β-syn protein was however detected in sick M83 mice injected with AAV vector carrying human β-syn gene. Nevertheless, β-syn could have aggregated in our specific experimental conditions, as this has already been described, which might explain the absence of protective effect detected

Les bactéries ajustent constamment leur composition moléculaire pour répondre à deschangements environnementaux. Nous nous intéressons aux systèmes de régulation métabolique et génique permettant une telle adaptation, notamment dans le contexte de la diauxie chez Escherichia coli lors de la transition de croissance sur une source de carbone riche, le glucose, à une source plus pauvre, l’acétate. Afin de modéliser de tels réseaux métaboliques, nous utilisons un formalisme cinétique approché appelé linlog et abordons les problèmes ren- contrés lors de l’estimation de paramètres. Ainsi, nous proposons une méthode d’estimationde paramètres à partir de jeux de données incomplets basée sur l’algorithme EM (“Expec- tation Maximization”) et l’appliquons au modèle linlog du métabolisme central du carbone. Nous proposons également une méthode d’analyse d’identifiabilité et de réduction de modèles non identifiables que nous appliquons ensuite sur des jeux de données simulés ou obtenus expérimentalement. Par ailleurs, nous mesurons des profils temporels d’expression de gènes impliqués dans le contrôle de la diauxie et mettons en évidence, à l’aide de modèles cinétiques développés dans ces travaux, l’importance de la contribution de l’état physiologique de la cellule dans la régulation génique. En se confrontant aux défis méthodologiques rencontrés lors du développement de modèles de réseaux métabolique et génique, cette thèse contribue aux efforts futurs portant sur l’intégration de ces deux types de réseaux dans des modèles quantitatifs. / Bacteria manage to constantly adapt their molecular composition to respond to environmentalchanges. We focus on systems of both metabolic and gene regulation that enablesuch type of adaptation, notably in the context of diauxic growth of Escherichia coli, when itshifts from glucose to acetate as a carbon source. To model a metabolic network, we use anapproximate kinetic formalism called linlog and address methodological issues encounteredwhen performing parameter estimation. We propose a maximum-likelihood method basedon Expectation Maximization for parameter estimation from incomplete datasets. We then apply it to the linlog model of central carbon metabolism. We also propose a method foridentifiability analysis and reduction of nonidentifiable models that we then apply to bothsimulated and experimental datasets. Moreover, we monitored gene expression patterns for agene network involved in the control of diauxie and highlight, by means of kinetic models developedin this study, the role of the global physiological state of the cell in regulation of geneexpression. By addressing methodological challenges encountered with models of metabolicand gene networks, this thesis contributes to future efforts integrating both types of networksinto quantitative models

L'expression des gènes est finement régulée dans la cellule et soumise à de multiples contrôles-qualité. Cette régulation intervient à différents niveaux, de façon à garantir une synthèse efficace des produits fonctionnels de l'expression génique, et pour assurer une adaptation à un changement environnemental. Notamment, les régulations transcriptionnelles sont cruciales pour contrôler la cinétique et le niveau d'expression des gènes. La transcription pervasive est une transcription généralisée non-codante et instable qui fut révélée chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Bien que son potentiel régulateur ait été démontré de façon ponctuelle, la question de sa fonctionnalité globale restait ouverte. Lors de ma thèse, j'ai pu montrer l'existence de phénomènes multiples d'interférence transcriptionnelle liés à la transcription pervasive, pour co-réguler un ensemble de gènes entre la phase exponentielle et la quiescence. En effet, la transcription non-codante en antisens des gènes concernés conduit à leur répression, dans des conditions où ils ne doivent pas être exprimés. Le mécanisme de répression fait intervenir des modifications de la chromatine. La levure bourgeonnante, dépourvue de la machinerie d'ARN interférence, présente donc un système fin de régulation de l'expression génique utilisant la transcription pervasive. / In the cell, gene expression is finely tuned and is submitted to different quality-controls. Gene are regulated at different expression levels in order to guarantee a proper synthesis of functional products, and to ensure an optimal adaptation to environmental changes. In particular, transcriptional regulations are critical for gene expression level and kinetics.Pervasive transcription, defined as a generalized non-coding and unstable transcription, was discovered in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Although its regulatory potential was punctually shown, the question of its global functionality still remained. During my PhD, I could show the existence of numerous transcriptional interference mechanisms involved in the co-regulation of a group of genes between exponential phase and quiescence. Indeed, non-coding transcription in antisense to genes promoter leads to its repression in conditions where they have to be switched off. The repression mechanism is allowed by chromatin modifications.Hence, budding yeast that lacks RNA interference machinery has developed a fine regulation system using pervasive transcription.

Les encéphalopathies spongiformes transmissibles sont des maladies neurodégénératives caractérisées par une vacuolisation intense et une perte neuronale associées à l’accumulation d’une protéine prion pathologique : la PrPSc. A cause de la longue période d’incubation silencieuse de ces maladies, les individus souffrant d’une maladie à prions peuvent exposer des patients qui recevraient leur sang ou un de leurs organes à un risque de contamination iatrogène. De plus, lorsque le diagnostic survient, les dommages cérébraux sont souvent massifs, et l’issue toujours fatale. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, et l’ensemble des stratégies testées a échoué.L’alternative développée par le laboratoire est celle de la thérapie cellulaire couplée à la thérapie génique, en utilisant des cellules souches embryonnaires (ES) délivrant des molécules anti-prions. Concernant le choix des molécules anti-prions, nous avons choisi les mutants PrP-DN. Notre hypothèse repose sur des études montrant qu’une lysine au codon 219 de la PrP chez l’Homme ou une arginine au codon 171 de la PrP ovine, protègent du développement d’une ESST. L’étude de ces mutants, en cellules infectées ou dans des souris transgéniques, a permis de montrer que les PrP mutées n’étaient pas converties en PrPSc et qu’elles exerçaient un effet protecteur dit « dominant négatif » sur la conversion de la PrPC sauvage en PrPSc.Un des projets du laboratoire avait donc pour objectif d’utiliser les cellules souches exprimant les mutants PrP-DN pour développer une stratégie de thérapie génique et cellulaire des maladies à prions : l’hypothèse étant que les cellules greffées pourraient non seulement réparer le tissu lésé mais que ce dernier serait également protégé de l’infection par les prions.Une première approche de thérapie génique et cellulaire avait été initiée au laboratoire et montrait des résultats plutôt encourageants. En effet, la greffe de cellules souches neurales murines exprimant des PrP-DN et produites à partir de cellules souches embryonnaires murines, conduisait, pour une partie des souris, à un allongement du temps d’incubation de la maladie, ainsi qu’à une diminution de l’astrogliose et de la vacuolisation.Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse a été de valider l’approche thérapeutique en montrant que les cellules greffées délivraient des mutants PrP-DN capables d’inhiber la réplication du prion. Nous avons opté pour un modèle de culture organotypique infectée par des prions murins. En plus de répondre aux exigences éthiques de la directive 2010/63/UE, ce modèle offre l’avantage de pouvoir réaliser plus d’essais, des cinétiques d’accumulation de PrPSc et de visualiser le devenir des cellules greffées. Enfin, opter pour cette stratégie permettait de transposer dans un modèle humanisé des travaux précédemment réalisés et ayant montré des résultats encourageants. Pour cela, il a été nécessaire de mettre en place un modèle prion ex vivo de culture organotypique de tranches de cerveau, dans lequel il était possible de réaliser des greffes et permettant d’évaluer l’effet inhibiteur des mutant-PrP-DN sur la réplication du prion. Par ailleurs, notre groupe fait partie, avec d’autres groupes travaillant avec des cellules souches mésenchymateuses, de l’équipe « Biologie des cellules souches et médecine régénératrice », il nous est apparu pertinent d’évaluer l’effet des MSC sur la pathologie prions dans des modèles prions en culture organotypique et en particulier d’évaluer l’impact de greffes de MSC concomitantes aux greffes de NSC-PrP-DN. En effet, ces cellules sont décrites comme pouvant induire un microenvironnement neuroprotecteur en limitant la prolifération des cellules de la microglie et des astrocytes, et peuvent favoriser la différenciation des NSC. Enfin notre dernier objectif visait à transposer les outils murins vers des outils « humains » en produisant des NSC humaines issues d’ES et exprimant une PrP humaine portant les mutations DN. / Transmissible spongiform encephalopathies are neurodegenerative diseases characterized by a strong vacuolization, a neuronal lost and deposits of prion pathologic protein: PrPSc. This PrPSc accumulation is the result of the conformational conversion of the host encoded endogenous PrPC protein. Although the incidence of these diseases in humans remains low (about one to two cases per million inhabitants per year), these diseases remain a public health problem. Indeed, because of their long and silent incubation period, patients with prion disease may expose people through blood transfusion or organ transplantation with a risk of iatrogenic contamination. In addition, when the diagnosis occurs, brain damage is often massive, and the outcome is always fatal and rapidly occurs. Until now, there is no treatment that could be proposed to patients.The alternative developed by our laboratory for several years, is a strategy of cell therapy coupled with gene therapy. The general objective is to use pluripotent embryonic stem cells (ESC) and graft them as a “medicine” not only to orchestrate a functional recovery of the damaged zones and protect the grafted cells from prion propagation but also to deliver anti-prion molecules.For the anti-prion molecules, we have chosen dominant negative PrP mutants (PrP-DN). Our choice is based on studies showing that a lysine at codon 219 of the human PrP or an arginine at codon 171 of the ovine PrP protect against the development of a TSE. Study of these mutants in infected cells or in transgenic mice showed that the mutated PrPC were not converted into PrPSc. Moreover, they exibit a so-called "dominant negative" protective effect on the conformational conversion of their wild-type PrPC counterparts. A first approach of gene and cell therapy was initiated in the laboratory and has shown encouraging results. Indeed, the graft of murine neural stem cells (NSC) derived from murine embryonic stem cells and expressing anti-prion molecules, has allowed, for some of the mice, to an increase the incubation time of the diseaseas well as to a decrease of astrogliosis and vacuolization.In this context, the first objective of my thesis was to validate the therapeutic approach by showing that the grafted cells were able to inhibit prion replication trough the dominant negative effect of the PrP-DN. To address this point, we have chosen to use an organotypic culture model infected with murine prions (22L strain). In addition to fill the ethical requirements under the European Directive 2010/63 and the 3Rs, organotypic culture models offer the advantage to perform and repeat experiments, kinetic tests, and PrPres analysis. This model also allows to visualize the fate of the grafted cells. Finally, by choosing this strategy, it will be possible to transpose into a humanized model the work previously performed on mouse organotypic cultures.To achieve this task, it was necessary to establish an ex vivo prion model of organotypic culture brain slices, in which it was possible to perform grafts and to evaluate the inhibitory effect of PrP-DN mutants on the prion replication.In addition, as our group is included in the team "Stem cell biology and regenerative medicine" (led by Pr Jorgensen) in which several stem cells are studied (liver stem cells and mesenchymal stem cells (MSC)) and because MSC have been shown to provide protective effects when grafted in the brain of mice with neurological diseases, it was therefore relevant to evaluate the effect of MSC on prion pathology in our prion models and in particular to evaluate the impact of concomitant MSC grafts on NSC-PrP-DN.In a last step, our goal was to transpose the mouse tools (NSC from ES and expressing the PrP-DN mutants) to "human" tools by producing human NSCs derived from human ESC and expressing human PrP-DN, and to characterized the resulted cells.

L'holoprosencéphalie (HPE) est une maladie rare due à une anomalie du développement précoce du prosencéphale. Les gènes impliqués appartiennent à des voies de signalisation cruciales pour le développement embryonnaire telles que les Nodal, Shh et Fgf. Des mutations de ces gènes n'expliquent que 30% des cas d'HPE. Différentes stratégies ont été mises en œuvre pour déterminer de nouveaux gènes responsables de l'HPE. Récemment, des délétions du gène DLL1, un ligand du récepteur Notch ont été identifiées chez des patients HPE. L'objectif de mon travail de thèse était de tester l'hypothèse d'un rôle de la voie Notch au cours du développement précoce du prosencéphale. Dans ce but, une inhibition de la voie Notch a été réalisée en utilisant une culture ex ovo d'embryon de poulet. Grâce à cela, j'ai pu identifier une activité de la voie Notch au niveau de l'hypothalamus présomptif, une structure ventrale du cerveau antérieur. Une approche transcriptomique a ensuite permis d'identifier les dérégulations survenant lors de l'inhibition pharmacologique de la voie Notch. Les expressions des cibles trancriptionnelles de la voie Notch telles que Hes5, Hey1, Ascl1 ou Nhlh1 m'ont permis de suggérer un modèle d'action par inhibition latérale lors de la neurogénèse de l'hypothalamus en développement. Les données transcriptomiques générées m'ont permis d'identifier de nouveaux gènes marqueurs de l'hypothalamus dont l'expression est sous l'influence de la voie Notch. Nos résultats suggèrent que ces gènes appartiennent à une boucle de régulation comprenant la voie Notch et des facteurs de neurogénèse tels que les gènes proneuraux. Mon travail a également permis de montrer que l'expression du gène majeur de l'HPE, le gène Shh, requérait une activité de la voie Notch précisément au niveau de l'hypothalamus. En conclusion, mes résultats montrent que la voie Notch contribue au développement précoce du cerveau. Ce constat ajoute un autre niveau de complexité à l'apparition de l'HPE et apporte de nouveaux arguments en faveur d'un modèle « multi-hit » pour cette pathologie. / Holoprosencephaly (HPE) is a rare disease corresponding to a failure of early prosencephalon development. Genes involved in HPE, belong to crucial signalling pathways for embryonic development as Nodal, Shh and Fgf. Mutations in these genes could explain only 30% of HPE cases. Different strategies were used to identify new genes in HPE. Recently, deletions of DLL1, a ligand of Notch receptor, have been identified in HPE patients. The aim of my thesis was to test hypothesis that Notch pathway has a role during the early prosencephalon development. First, I performed a pharmacological inhibition of Notch pathway in embryos that were cultured ex ovo. Thus, I could identify Notch activity at the level of primordium hypothalamus, a ventral structure of prosencephalon. Then, transcriptomic analyses were performed to identify deregulations occurring during Notch inhibition. Expressions of well known transcriptional targets of Notch pathway, Hes5, Hey1, Ascl1 and Nhlh1, indicated that Notch pathway might act by lateral inhibition in the neurogenesis of developing hypothalamus. From transcriptomic data, we identified novel markers of developing hypothalamus that will be regulated by Notch pathway. Our results suggest that these novel genes could be involved in the regulatory loop associating with Notch pathway and proneural genes. Then, I demonstrated that Notch activity is required to maintain Shh expression, a major gene involved in HPE, particularly in the hypothalamus. To conclude, adding the Notch pathway in the signalling pathway network involved in prosencephalon development, we provide other complexity level in the HPE appearance. Thus, these results support the hypothesis of a « multi-hit » model of HPE.

MTM1 et MTMR2 sont 2 phosphatases de phosphoinositides appartenant à la famille des myotubularines, conservée pendant l’évolution. Bien qu’étant très similaires, des mutations dans MTM1 entraînent la sévère myopathie XLCNM alors que les mutations dans MTMR2 entraînent la neuropathie CMT4B. On ne comprend pas encore les bases moléculaires de cette spécificité de tissu, et il n’existe aucun traitement spécifique pour ces maladies. J’ai tout d’abord caractérisé l’activité des 2 isoformes endogènes de MTMR2, nommés MTMR2-L et MTMR2-S. J’ai démontré que la différence fonctionnelle entre MTM1 et MTMR2 s’explique principalement par l’extension N-terminale de MTMR2, et que l’isoforme MTMR2-S dépourvu de cette extension entraîne les mêmes phénotypes que MTM1. Ensuite, grâce à l’injection d’AAV dans les souris Mtm1 KO, j’ai démontré que l’expression exogène des isoformes de MTMR2, et surtout de MTMR2-S, améliore grandement l’atrophie musculaire, la force musculaire et les marqueurs histologiques de ces souris myopathiques. Ces résultats révèlent une première base moléculaire expliquant les spécificités fonctionnelles de MTM1 et MTMR2, et montrent que MTMR2 est une cible thérapeutique potentielle pour la myopathie XLCNM. / MTM1 and MTMR2 are 2 phosphatases of phosphoinositides that belong to the myotubularin family conserved through evolution. Despite their high level of similarity, mutations in MTM1 lead to the severe XLCNM myopathy while mutations in MTMR2 lead to the CMT4B neuropathy. The molecular bases for the surprising tissue-specific functions of these ubiquitously expressed proteins was unclear. Moreover, there is no specific therapy for these diseases.I first characterized the activity of the two naturally occurring isoforms of MTMR2, that we named MTMR2-L (long) and MTMR2-S (short). I found that the functional differences between MTM1 and MTMR2 reside mostly in the N-terminal extension of MTMR2-L, and that the endogenous MTMR2-S isoform lacking this N-terminal extension behaves similarly as MTM1. Then, using the myopathic Mtm1 KO mouse and AAV-mediated expression, I showed that exogenous expression of MTMR2 isoforms, and specifically of MTMR2-S, strongly improved the muscle atrophy, muscle force and the histological hallmarks of the myopathic mice. These data reveal a first molecular basis for the functional specificities of MTM1 and MTMR2, and highlight MTMR2 as a therapeutic target for XLCNM myopathy.

Les protéines possédant un domaine RING (REALLY INTERESTING NEW GENE) avec une activité E3 ligase sont largement présentes chez les plantes, jouent des rôles importants dans la régulation de plusieurs processus par la reconnaissance d’une protéine cible pour l’ubiquitination. Auparavant, il a été montré que l'expression de PtaRHE1, codant une protéine contenant un domaine RING-H2 avec une activité E3 ligase, est associée à la mise en place de la croissance secondaire chez le peuplier. Dans le cadre de cette thèse, nous avons démontré que PtaRHE1 est mono-ubiquitiné in vitro en présence de l’E2 du peuplier PtaUbC5a. Par hydridation in situ et Western blot, nous montrons que PtaRHRE1 et la protéine correspondante sont exprimés dans les tissus vasculaires de la tige, c'est-à-dire le phloème, le cambium et le xylème. Par comparaison avec les plantes de type sauvage, la sous-expression de PtaRHE1 suite à l’expression d’un microARN (i) a donné lieu à une modification dans la morphologie des fibres secondaire de phloème avec une plus forte densité cellulaire et des paroi de fibres plus mince, (ii) à une modification de la qualité de lignine avec moins d’unité S au niveau des tissus de l’écorce, ces résultats suggèrent un rôle de PtaRHE1 dans la formation et / ou la maturation des fibres. La sur-expression de PtaRHE1 chez les peupliers engendre un phénotype pléiotropique caractérisé par l’enroulement des feuilles et une inhibition du développement racinaire. L’expression du gène codant pour le facteur de transcription WRKY23 est positivement corrélée à celui de PtaRHE1 dans le xylème de la tige des lignées sur-exprimant ou sous-exprimant PtaRHE1. Sur base d’un modèle, nous suggérons un rôle pour le couple PtaRHE1/PtaWRKY23 dans le développement des tissus vasculaires. De plus, nous avons montré que l'expression de PtaRHE1 et l'accumulation de la protéine correspondante sont modulées par l'humidité de l’air et du sol ainsi que par l'acide abscissique. Les informations présentées dans ce travail indiquent un rôle de PtaRHE1 au cours de développement de la plante ainsi que pendant la réponse au stress biotique et abiotique / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les génomes sont affectés par des régimes de sélection conflictuels. Ceci est particulièrement bien illustré par le concept de barrière semi-perméable au flux génique, issu de la littérature des zones hybrides. Certains gènes contribuent à empêcher le mélange entre lignées génétiques différenciées, soit parce qu'ils participent à l'adaptation aux conditions environnementales locales, soit parce qu'ils sont incompatibles avec les gènes d'autres lignées. D'autres parties du génome sont soit neutres, soit soumises à une sélection qui tend à homogénéiser les différentes lignées entre elles. Dans la première partie de cette thèse, des modèles d'évolution de l'isolement reproductif sont présentés pour expliquer les patrons d'isolements observés dans les expériences d'hybridation au laboratoire. Par modélisation classique d'incompatibilités génétiques de type Dobzhansky-Muller, il est montré que l'asymétrie et la complexité des incompatibilités sont imparfaitement expliquées par un filtre évolutif, c.a.d. une vitesse d'accumulation différente entre types d'incompatibilité. Une approche complémentaire de modélisation quantitative à l'aide d'une extension du modèle géométrique de Fisher a permis de préciser quelles conditions de divergence entre lignées isolées conduisaient à un effet fortement délétère des mutations dans les génotypes hybrides. L'importance relative du niveau d'épistasie moyen, de la distribution des effets des mutations et des modalités de l'adaptation de chaque lignée est discutée. La seconde partie de cette thèse profite des avancées techniques de la génomique pour étudier l'histoire de la spéciation et de l'adaptation dans un complexe d'espèces non-modèles, les moules du genre Mytilus. Une méthode statistique d'inférence de scénarios de spéciation est présentée. Les résultats montrent que les moules Européennes ont connu une histoire complexe de divergence stricte suivie d'une période de connectivité périodique. En accord avec le concept de barrière semi-perméable au flux génique, il est montré que les taux d'introgression sont hétérogènes le long du génome. Ensuite, des scans génomiques de la différenciation ont été menés entre paires de populations du complexe d'espèces. L'analyse de la variation génétique et des généalogies d'allèles sur une échelle chromosomique localisée a permis de reconstituer l'histoire évolutive de plus de 1000 régions du génome des moules. Cette analyse a révélé qu'une cause majeure, mais insoupçonnée, de la différenciation génétique intraspécifique est l'introgression différentielle d'allèles étrangers. Globalement, cette thèse montre non seulement le rôle majeur de la biogéographie de la spéciation, c.a.d. des patrons temporels et spatiaux du flux de gènes, dans notre compréhension de la biodiversité actuelle, mais aussi sa surprenante complexité et l'étendue de ses conséquences sur l'évolution des génomes. / Genomes are affected by conflicting selective regimes. This is particularly well illustrated by the concept of semi-permeable barriers to gene flow, as found in the hybrid zones literature. Some genes contribute to the prevention of mixing between differentiated genetic lineages, either because they are involved in adaptation to local environmental conditions, or because they are incompatible with alleles from other genetic lineages. Other parts of the genome are either neutral, or subjected to selection which tends to homogenize the genetic lineages. In the first part of this thesis, models of the evolution of reproductive isolation are presented to explain the isolation patterns observed in experimental hybridizing crosses between incipient species. Using standard models of Dobzhansky-Muller genetic incompatibilities, it is shown that the asymmetry and complexity of incompatibilities are not well explained by there being an “evolutionary sieve”, i.e. a different rate of accumulation between incompatibilities. A complementary approach to quantitative modeling (an extension of Fisher's Geometric Model) then clarifies which conditions of divergence between allopatric lines led to highly deleterious effects in hybrid genotypes. The relative importance of mean levels of fitness epistasis, the distribution of mutation sizes, and the way lineages adapt to new environmental conditions is discussed. The second part of this thesis takes advantage of technical advances in genomics to study the history of speciation and adaptation in a non-model species complex, Mytilus mussels. A statistical method of inferring speciation scenarios is presented. Results show that European mussels experienced a complex history of strict divergence followed by a period of periodic connectivity. In agreement with the concept of semi-permeable barriers to gene flow, it is shown that introgression rates are heterogeneous along the genome. Next, genome scans of differentiation were conducted between pairs of populations of the species complex. The analysis of genetic variation and allele genealogies on a small chromosomal scale allowed to reconstruct the evolutionary history of more than 1000 genomic regions. This analysis reveals that a major cause of intraspecific differentiation is the differential introgression of foreign alleles. Overall, this thesis shows not only that biogeography of speciation, i.e. the temporal and spatial patterns of gene flow, play a major role in our understanding of existing biodiversity, but also its amazing complexity and extent of its impact on genome evolution.

Legionella pneumophila, responsable de la maladie du légionnaire, est une bactérie aquatique parasitant les amibes, mais aussi les macrophages alvéolaires humains. Legionella alterne entre une forme infectieuse non réplicative et une forme réplicative intracellulaire, qui n'exprime pas les facteurs de virulence. Ce cycle de vie biphasique est gouverné par un système de régulation complexe permettant son adaptation dans différents hôtes. Le but de mon projet de thèse était d'étudier un des facteurs clés dans la régulation des ARNm, le régulateur post-transcriptionnel global Hfq. L'expression de Hfq est régulée au cours du cycle infectieux chez L. pneumophila: Hfq est peu exprimée en phase réplicative, mais fortement exprimée lors de la phase de transmission, ce qui suggère un rôle dans la transition entre ces deux phases. J'ai identifié un petit ARN (sRNA) que j'ai nommé Anti-hfq puisqu'il est transcrit dans l'orientation antisens à Hfq et chevauche sa région 5' non traduite (UTR). Mes recherches ont mis en évidence un mécanisme sophistiqué par lequel Anti-hfq régule l'expression de Hfq: Anti-hfq interagit avec l'ARNm du gène hfq par sa région complémentaire et ainsi contrôle la stabilité de la protéine. De plus, j'ai montré que la protéine Hfq auto-réprime sa propre traduction en facilitant l'interaction entre Anti-hfq et son propre ARNm. Finalement, Hfq régule son propre renouvellement par le recrutement de la RNase III. De plus, des tests de réplication intracellulaire ont montré que Hfq et Anti-hfq sont nécessaires pour la multiplication intracellulaire de L. pneumophila, ce qui a mis en évidence un rôle important de Hfq et Anti-hfq dans la virulence de cette bactérie. / Legionella pneumophila, the causative agent of the pneumonia-like Legionnaires’ disease, is commonly found in aquatic habitats worldwide where it multiplies within protozoa. To adapt between intra- and extracellular environments, L. pneumophila evolved a biphasic lifecycle wherein it alternates between an infectious and non replicative form and an intracellular form, which does not express the virulent phenotypes. This biphasic life cycle is governed by a complex regulatory network that comprises transcriptional and post-transcriptional regulatory elements, enabling the bacteria to adapt in diverse hosts. During my Ph.D., I focused my attention of the post-transcriptional regulator Hfq, a hexameric, RNA-binding protein and chaperon of small RNAs (sRNA). The expression of this fascinated protein is life cycle regulated: poorly expressed during the replicative phase of growth, whereas significantly upregulated upon entry into the transmissive phase of growth. Moreover, my research research lead to the identification of a sRNA transcribed antisense to the hfq gene overlapping its 5’UTR region. This antisense RNA, named Anti-hfq, was found to regulate hfq expression by base-pairing complementarity, describing a sophisticated mechanism of regulation. In addition, the Hfq protein controls its own translation by facilitating the interaction between Anti-hfq and its own mRNA. Thus, Hfq regulates its turnover, recruiting the endoribonuclease RNaseIII. Furthermore, infection assays revealed that Hfq and Anti-hfq are necessary for efficient replication of L. pneumophila in amoeba revealing an important role of both in bacterial virulence.

Les stratégies d'ingénierie du génome par recombinaison homologue basées sur la technologie CRISPR/Cas-9 ont été largement utilisées pour modifier la séquence de gènes chez C. elegans. Cependant, l'efficacité de sélection des animaux modifiés nécessite d'être améliorée. Nous avons développé un nouveau marqueur, le gène miniSOG, qui permet la contre-sélection des animaux non modifiés et que nous avons intégré dans une cassette de double sélection. Les animaux contenant la cassette HySOG sont d'abord sélectionnés pour leur résistance à un antibiotique, l'hygromycine B. HySOG est ensuite excisée et les modifications sont insérées au locus cible. Les souches recombinantes résistent à une exposition à la lumière bleue, qui tue les vers exprimant le gène miniSOG. Nous montrons que la méganucléase I-SceI peut être utilisée pour exciser HySOG et pour introduire des modifications dans la lignée germinale avec la même efficacité que la technologie CRISPR/Cas-9.Des technologies d'ingénierie du génome ont été utilisées pour étiqueter la sous-unité des GABAAR UNC-49 et pour analyser le rôle de MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC et NLG-1/neurologine sur l'agrégation synaptique des GABAAR à la jonction neuromusculaire GABAergique. Nous montrons que MADD-4, une protéine de la matrice extracellulaire sécrétée par les motoneurones, est un nouveau ligand de NLG-1 et de UNC-40 et constitue un organisateur synaptique antérograde des synapses GABAergiques. D'abord, l'isoforme courte de MADD-4, MADD-4B, lie directement NLG-1 et assure sa localisation à la membrane post-synaptique. Ensuite, MADD-4B lie, recrute et active probablement le récepteur UNC-40, qui renforce l'interaction des GABAAR avec NLG-1. / CRISPR/Cas-9-based techniques have been widely used to engineer any gene in C. elegans by homologous recombination. However, the selective efficacy of engineered animals needs to be expanded. We have developed miniSOG as a counter-selection marker in a dual selection strategy. Animals containing the dual selection cassette HySOG are firstly selected by the resistance to the antibiotic hygromycin B. HySOG is then excised and customized gene modifications are inserted into target sites. Recombinant strains are selected based on the resistance to blue light exposure, which otherwise kills miniSOG expressing worms. We demonstrate that meganuclease I-SceI can be used to excise HySOG and to introduce gene modifications in C. elegans germline as efficiently as CRISPR/Cas-9. Genome-engineering techniques have been used to tag the GABAAR subunit UNC-49 with RFP and to analyze the role of MADD-4/Punctin, UNC-40/DCC and NLG-1/neuroligin on GABAARs clustering at GABAergic NMJs. We showed that MADD-4/Punctin, an extracellular matrix protein secreted by GABAergic neurons, is a new ligand of NLG-1/neuroligin and of UNC-40/DCC and functions as a central anterograde organizer of GABAergic synapses. First, the short isoform of MADD-4, MADD-4B directly binds NLG-1/neuroligin and localizes it in the post-synaptic membrane of GABAergic synapses. Second, MADD-4B binds, recruits and likely activates the netrin receptor UNC-40/DCC, which in turn promotes the interaction of GABAAR with NLG-1/neuroligin and its localization at the synapse.