L'utilisation du logiciel Miropeat pour comparer les séquences chromosomiquences d'Encephalitozoon cuniculi révèle la présence de séquences homologues aux différentes extrémités. Cette structure en mosaïque des extrémités a été confirmée par une approche PCR. Le plus intéressant est la présence de gènes dans ces régions. La comparaison des séquences codantes révèle 4 familles de gènes : inter AE , InterB, interC, interD. Nous avons choisi d'investir la famille interB, une famille homogène, avec très peu de gènes incomplets comparée aux trois autres familles. Après la validation de la présence des gènes interB chez les espèces du genre Encephalitozoon, ces gènes ont été retrouvés chez deux autres genres de microsporidies pouvant parasiter l'homme (Brachiola algerae et Vittaforma corneae). Par contre, ces gènes sont absents chez 5 autres genres de microsporidies, dont 2 parasites stricts d'insectes et 3 parasites stricts de poissons. L'expression de ces gènes a été abordée chez l'espèce E. cuniculi. Les gènes interB sont transcrits, et des protèines interB existent également.

La conversion par les thymidylate synthases du désoxyuridine 5'-monophosphate (dUMP) en désoxythymidine 5'-monophosphate (dTMP) est une des étapes clés de la biosynthèse des désoxyribonucléotides pyrimidiques. Chez les procaryotes (bactéries et archées), il existe deux familles de thymidylate synthases non homologues : ThyA et ThyX. La distribution phylogénétique quasi-exclusive des deux familles est complexe et ne suit pas les relations phylogéniques entre les organismes. Les protéines de ces deux familles ne présentent aucune similarité de séquence, de structure et leurs mécanismes et efficacités catalytiques diffèrent. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de montrer que l'activité de ThyX est essentielle à la survie de la bactérie Rhodobacter capsulatus en absence de thymidine exogène. A partir des résultats de tests de complémentation génétique et de la modélisation mathématique du métabolisme des folates nous avons pu mettre en évidence que seulement une faible activité dihydrofolate réductase était nécessaire à la survie des organismes utilisant ThyX. D'autre part, j'ai pu montrer par des approches génétiques et par l'étude statistique de plus de 400 génomes procaryotes que les organismes utilisant ThyX ont une réplication et un taux de croissance lents, et possèdent majoritairement un petit génome. Je propose un modèle dans lequel la faible activité catalytique de ThyX limite la réplication de l'ADN e! t par conséquent l'expansion du génome. Enfin, j'ai étudié le métabolisme des pyrimidines chez la bactérie pathogène humaine, Helicobacter pylori. J'ai pu en particulier mettre en évidence qu'en absence de voie de récupération de l'uracile, cette bactérie est capable de métaboliser un analogue toxique le 5-fluorouracile (5FU), utilisé comme anticancéreux. J'ai par ailleurs montré que l'orotate phosphoribosyltransférase de H. pylori était capable de restaurer l'auxotrophie pour l'uracile d'une souche d'Escherichia coli indiquant que cette enzyme pourrait être responsable de la sensibilité de H. pylori au 5FU. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis une meilleure compréhension des conséquences physiologiques de l'utilisation de la thymidylate synthase ThyX. Ils ont notamment permis d'expliquer la distribution apparemment sporadique des deux familles de thymidylate synthases dans le monde procaryote.

Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), l'agent causal de bactériose vasculaire du riz (BLB), injecte des protéines de liaison à l'ADN, appelées Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) dans les cellules hôtes afin de moduler l'expression de gènes cibles. Certains TALEs agissent comme des facteurs de virulence majeurs, indispensables à la mise en place du BLB et ciblent des gènes de sensibilité du riz. Les TALEs majeurs de Xoo ciblent universellement les gènes de sensibilité de la famille SWEET. Il existe dans la nature un polymorphisme des séquences ADN des gènes SWEET reconnues par les TALEs qui confère une résistance à la maladie. L’utilisation de la technologie TALEN a permis d'introduire artificiellement ce type de mutation dans le promoteur du gène de sensibilité SWEET14 le rendant insensible aux TALEs et conférant une résistance à certaines souches de Xoo asiatiques. La caractérisation des populations de Xoo africaines montrent qu'elles sont distinctes de celles d’Asie. L’objectif du projet de thèse était de créer à l'aide des technologies d'édition des génomes des sources de résistances efficaces contre un large panel de Xoo maliennes.Dans une première partie, l'édition des boites ADN de SWEET14 ciblées par des TALEs majeurs de souches africaines a effectivement permis d'obtenir des résistances contre les souches utilisant le TALE TalF (initialement appelé Tal5) mais pas contre celles utilisant TalC. La caractérisation du répertoire de TALEs des souches maliennes par des approches fonctionnelles (sensibilité des lignées éditées, expression de SWEET14 et autres gènes cibles de TALEs) et in silico (séquençage du génome de 8 souches) à révélé une diversité fonctionnelle de ces répertoires et la présence simultanée quasi systématique de versions actives et redondantes de TalF et TalC. La caractérisation de la sensibilité de variétés de riz locales aux souches de Xoo maliennes a montré que ces dernières possèdent un large spectre de virulence et qu'à une exception près, toutes les variétés testées sont sensibles au BLB. L'édition en multiplex par la technique CRISPR/Cas9 des boites TalF et TalC a aboli l'induction de SWEET14 en réponse à une souche malienne. Cependant, les lignées correspondantes sont restées sensibles à cette souche. Dans la dernière partie, pour expliquer ce résultat, nous avons postulé l'existence d'au moins un gène de sensibilité, cible de TalC et redondant avec SWEET14. Une approche bioinformatique a permis d'identifier un locus dont plusieurs caractéristiques en faisaient un candidat intéressant. Ce locus, nommé ATAC (pour Alternative TalC Target) est composé de deux gènes, ATAC1 et ATAC2 induits de façon bidirectionnelle par TalC. Nous avons montré qu'ATAC2, qui code pour un facteur de transcription bHLH atypique potentiellement impliqué dans l’élongation cellulaire et l'immunité chez le riz, se comporte comme un locus de sensibilité lorsqu'il est induit par des TALE artificiels dans un système gain de fonction. Nous avons édité simultanément le promoteur SWEET14 et le locus ATAC. Ces éditions devraient empêcher la reconnaissance du promoteur SWEET14 et du locus ATAC par TalC et TalF afin de conférer une résistance large au BLB au Mali. / Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo), the causal agent of bacterial leaf blight of rice (BLB), injects DNA binding proteins called Transcription Activator-Like Effectors (TALEs) into host cells to manipulate plant genes expression. Some TALEs behave as major virulence factors essential for BLB to occur by binding directly to target DNA boxes of rice susceptibility genes and inducing their expression. Xoo major TALEs universally target susceptibility genes of the SWEET family. In nature, polymorphism in the DNA sequence of SWEET genes recognized by TALEs confers resistance to BLB. Using the TALEN technology, this type of mutations has been artificially introduced in the promoter of the SWEET14 susceptibility gene to make it TALE-unresponsive and confer resistance to some Asian Xoo. The characterizations of Malian Xoo populations show that they are distinct from the Asian ones. The PhD project aimed to create broad tailored BLB resistance against Malian Xoo using genome editing technologies.First, editing SWEET14 DNA boxes targeted by major TALEs of African strains indeed yielded resistance against strains relying on TalF (initially named Tal5) but not against those relying on TalC. The characterization of Malian strains TALE repertoires using functional (edited lines susceptibility assays, SWEET14 and other TALE target expression studies) and in silico (genome sequencing of 8 strains) approaches uncovered functional diversity in these repertoires and, the almost systematic, simultaneous presence of active and redundant versions of TalF and TalC. In susceptibility assays of local rice varieties, Malian Xoo strains exhibited a broad virulence spectrum and, with one exception, all tested varieties were susceptible to BLB. Multiplex editing of TalF and TalC target boxes with the CRISPR/Cas9 technology abolished SWEET14 induction in response to a Malian strain. However the corresponding rice lines remained susceptible to this strain. Finally, to explain these results, we postulated the existence of, at least, a TalC target susceptibility gene redundant with SWEET14. Bioinformatics analysis identified a rice locus with several features electing it as a high priority candidate. This locus named ATAC (Alternative TalC Target) is composed of two genes, ATAC1 and ATAC2, bidirectionally upregulated by TalC. We further showed that ATAC2 which is predicted to code for an atypical bHLH transcription factor potentially involved in rice cell elongation and immunity, behaves as a susceptibility gene upon artificial TALEs-mediated induction in a gain of function assay. We used the CRISPR/Cas9 system to simultaneously edit the SWEET14 promoter and the ATAC locus. These mutations should prevent the recognition of the SWEET14 promoter and the ATAC locus by TalC and TalF, compromise their transcriptional induction and ultimately provide broad BLB resistance in Mali.

Les génomes bactériens contiennent de nombreuses séquences répétées qui ont un rôle majeur dans la plasticité et l'évolution des génomes. Parmi elles, les séquences REP sont de courtes séquences d'ADN, trouvées en grand nombre dans des régions intergéniques de plusieurs espèces bactériennes. Ces séquences ont la particularité de présenter des structures en tige boucle précédées par un tétranucléotide conservé. Elles peuvent exister seules mais sont majoritairement groupées dans des clusters consécutifs appelés BIME. De nombreux rôles ont été attribués aux REP/BIME dans la physiologie de la cellule : elles sont notamment impliquées dans la régulation de l'expression des gènes et elles constituent des sites de fixation pour plusieurs protéines de l'hôte. Toutefois, leur origine et le mécanisme de leur dissémination dans les génomes ne sont pas connus. Récemment, un gène codant une protéine (TnpAREP) apparentée aux transposases de la famille des séquences d'insertions IS200/IS605 a été identifiée en association avec des REP/BIME au sein de structures appelées REPtron. Il a été alors proposé que les REP/BIME pourraient être des éléments transposables non-autonomes mobilisables par la protéine TnpAREP. Cette protéine fait partie de la superfamille des enzymes HuH comprenant des Relaxases, des protéines Rep des phages/plasmides à réplication en cercle roulant et certaines transposases. Elles utilisent le motif HuH (Histidine - résidu hydrophobe - Histidine) pour coordonner des cofacteurs métalliques ainsi que des résidus tyrosines pour leur activité catalytique. Comme pour les transposases HuH de la famille IS200/IS605, TnpAREP reconnait spécifiquement des substrats ADN simple brin. Elle est active in vitro sur des séquences structurées contenant des REP/BIME sous forme simple brin et celle-ci clive au niveau d'un dinucléotide spécifique. Des données cristallographiques suggèrent que TnpAREP serait monomérique, contrairement aux transposases d'IS200/IS605 qui sont des dimères obligatoires. Cela pose de nombreuses questions sur le site catalytique de l'enzyme ainsi que sur le mécanisme de prolifération des REP/BIME dans les génomes bactériens, d'autant plus qu'aucune activité de TnpAREP n'a été décrite in vivo. Mes premiers résultats portent sur la caractérisation du site catalytique de TnpAREP d'E. coli et ont permis d'exclure la possibilité d'un site catalytique hybride comme dans le cas des protéines Rep de certains plasmides. J'ai pu mettre en évidence une activité in vivo de TnpAREP : son expression sous contrôle d'un promoteur inductible à un effet toxique et induit la réponse SOS chez E. coli. J'ai également développé un test pour cartographier des sites de clivage de TnpAREP in vivo et montré que l'enzyme est capable de cliver les deux brins des plasmides et de l'ADN chromosomique. De plus, une excision d'un BIME a pu être observée dans ces conditions. J'ai aussi construit des souches bactériennes permettant d'étudier l'évolution expérimentale des REP/BIME in vivo dont les résultats sont en cours d'analyse. Enfin, nous avons élargi notre étude à un sous-groupe de TnpAREP associées à un autre type de REP/BIME. Cette analyse comparative nous a permis non seulement de généraliser des propriétés observées avec TnpAREP d'E. coli, mais aussi de révéler des caractéristiques spécifiques de ce sous-groupe. / In spite of their compact size, bacterial genomes carry many repetitive sequences, often important for genome function and evolution. Among them, REPs are short DNA found at high copy number in intergenic regions in many bacterial species. These sequences can form stem-loop structures preceded by a conserved tetranucleotide. They can exist as individual units but also as complex consecutive clusters called BIMEs. REP/BIMEs are known to interact with different proteins and several important roles have been attributed to these sequences in cell physiology. However, their origin and dissemination mechanisms are poorly understood. Recently, a first example of prokaryotic domesticated transposases (TnpAREP) was found associated with REP/BIME sequences in structure called REPtron. REP/BIMEs might represent a special type of non-autonomous transposable element mobilizable by TnpAREP. TnpAREP is member of the HuH enzymes superfamily including Relaxases, Rep proteins of RCR plasmids/ss phages and some transposases. These transposases are fundamentally different from classical transposases. They use HuH motif (Histidine-hydrophobe-Histidine) to coordinate metal cofactor and tyrosine residues (Y) as nucleophile for catalysis. TnpAREP shares certain similarities to Y1 HuH transposases encoded by the IS200/IS605 family which processes only ssDNA substrates. Analysis of E. coli TnpAREP activity in vitro also shown the strict requirement of structured single stranded REP/BIME DNA substrates. Cleavage in vitro occurs at a specific dinucleotide. In contrast to Y1 HuH transposases which are obligatory dimers, E. coli TnpAREP is a monomer as shown by structural studies. Furthermore, TnpAREP activities have never been described in vivo. This raises questions about its catalytic sites and also the way by which it promotes REP/BIME proliferation within their host genomes. The first objective of my PhD was to characterize the TnpAREP catalytic site. My results exclude the possibility of a second catalytic site as observed for REP protein of some plasmid families. Here I show that in vivo, expression of TnpAREP under control of an inducible external promoter is toxic to E. coli cells and induces SOS response, the effect depending on catalytic activity of the protein. I have developed an assay to map TnpAREP cleavage sites in vivo and show that it can cleave both DNA strands on plasmid and bacterial chromosome. In these conditions, an excision of BIME could be observed. I also constructed bacterial strains to perform REP/BIME experimental evolution, results are under analysis. Finally, we are extending our analysis to a subgroup of TnpAREP that are associated with another type of REP/BIME. This comparative analysis not only permitted to generalize some properties observed with E. coli TnpAREP but also revealed some interesting distinct characteristics of this subgroup.

Les éléments transposables jouent un rôle majeur dans l’évolution des génomes eucaryotes. La connaissance de la distribution des éléments transposables entre différentes espèces au sein d’un même taxon est une condition essentielle pour étudier leur dynamique et mieux comprendre leur rôle dans l'évolution des espèces. Compte tenu de leur abondance, de leur diversité spécifique et de milieu de vie, les crustacés sont un excellent modèle pour étudier la génomique comparative des rétrotransposons. C’est notamment chez les Galathées qu’a été défini le clade GalEa des éléments de la superfamille des Copia. Nous avons étudié la distribution de deux superfamilles de rétrotransposons à LTR bien connus: les Gypsy et les Copia, au sein des crustacés. En combinant des PCRs avec amorces dégénérées et des analyses in silico, nous avons identifié 35 familles de rétrotransposons Copia et 46 familles de rétrotransposons Gypsy dans respectivement 15 et 18 espèces de crustacés (principalement des malacostracés : crabes, crevettes, krill...). Ces éléments présentent une distribution et une diversité différentes au sein des crustacés. Les éléments Gypsy apparaissent relativement fréquents et diversifiés dans toutes les espèces. A l’inverse, les éléments Copia semblent rares, donc difficilement détectables, et sont largement dominés par les éléments du clade GalEa. Ces résultats suggèrent deux stratégies différentes de dynamique pour les rétrotransposons Gypsy (théorie de la Reine Rouge) et les rétrotransposons GalEa (‘domino days spreading’ branching process). De plus, les éléments GalEa présentent un grand succès évolutif en étant largement distribués dans de nombreuses branches de métazoaires. Ils sont aussi présents chez quelques algues rouges et nous en avons également détecté chez des Fungi. Profitant des nombreuses données génomiques disponibles, nous avons donc étudié la distribution des éléments GalEa de Fungi, dans le but de comparer celle-ci aux résultats obtenus chez les crustacés. En fait, ils n’apparaissent qu’au sein d’un grand embranchement d’ascomycètes, les Pezizomycotina, et ils forment un groupe monophylétique au sein des GalEa. Enfin, chez les Fungi, les éléments GalEa ne sont pas majoritaire parmi les rétrotransposons Copia. Nous avons donc initié une nouvelle étude chez les mollusques, afin de définir si les résultats obtenus chez les crustacés sont une caractéristique des éléments GalEa, des malacostracés ou des métazoaires. / Transposable elements play a major role in the evolution of eukaryotic genomes. Knowing the distribution of transposable elements between different species within the same taxon is essential to study their dynamics and to better understand their role in the evolution of species. Given their abundance, species diversity and living environment, crustaceans are an excellent model for studying comparative genomics of retrotransposons. It is notably in the squat lobsters that the GalEa clade of Superfamily Copia was defined. We studied the distribution of two well-known LTR retrotransposons superfamilies: Gypsy and Copia, in crustaceans. By combining PCRs with degenerate primers and in silico analysis, we identified 35 families of Copia retrotransposons and 46 families of Gypsy retrotransposons in 15 and 18 species of crustaceans (mainly Malacostraca: crabs, shrimp, krill ...). These elements have different distribution and diversity in crustaceans. Gypsy elements appear relatively commonly and diverse in all species. Conversely, the Copia elements seem rare, and consequently more difficult to detect, and are largely dominated by the elements of the clade GalEa. These results suggest two different dynamic strategies for retrotransposons Gypsy (the Red Queen theory) and retrotransposons GalEa (‘domino days spreading’ branching process). In addition, GalEa elements present a great evolutionary success being widely distributed in many branches of metazoans. They are also present in certain red algae and we have also detected them in Fungi. Taking advantage of the large amount of available genomic data, we have studied the distribution of GalEa elements of Fungi, in order to compare it with the results obtained in crustaceans. In fact, they appear only in a large phylum of Ascomycetes, in Pezizomycotina, and they form a monophyletic group within the GalEa. Finally, in the Fungi, the GalEa elements are not majority among Copia retrotransposons. We have therefore initiated a new study in molluscs, to define if the results obtained in crustaceans are a feature of GalEa elements, Malacostraca or metazoans.

Les glucides sont très rependus dans la nature et sont impliqués dans une multitude de phénomènes biologiques. Sous forme de saccharides et de glycoconjugués, ils constituent une partie substantielle de la biomasse produite sur terre et représentent une source potentielle d’énergie renouvelable de première importance. La diversité des glucides complexes est créée et contrôlée par un panel d’activités enzymatiques qui interviennent dans leur assemblage, dégradation et modification. L’étude structurale et fonctionnelle des enzymes actives sur les glucides (CAZymes) est à la base de multiples efforts de recherche appliquée en biotechnologie. L’industrie recherche actuellement des enzymes avec des activités et des spécificités encore plus performantes. L’activité de recherche de ces nouvelles enzymes est grandement facilitée par l’accumulation de séquences biologiques dans les bases de données, provenant notamment des études génomiques.Mon sujet de recherche s’inscrit dans un objectif de développement d’outils pour la classification et l’identification de nouvelles enzymes impliqués dans la conversion de la biomasse. Tous ces travaux sont en lien direct avec la mise en place d’une nouvelle infrastructure de la base de données CAZy et l’analyse de données génomiques, métagénomiques et biochimiques. La refonte complète de la structure de la base de données préexistantes et de son interface a été ainsi réalisée. Cet effort a été validé par l’analyse des familles de polysaccharide lyases et la création de sous-familles, dont l’homogénéité fonctionnelle a été révélée. De plus, la détection systématique de protéines modulaires portant des modules d’adhésion aux composants de la paroi végétale a permis l’identification de nouvelles protéines potentiellement impliquées dans la dégradation de la biomasse végétale. Enfin, j’ai implémenté des approches automatisées capables d’analyser de grands volumes de données (méta)génomiques pour en extraire le contenu en CAZymes. / Carbohydrates are widely distributed in nature, where they are involved in a multitude of important biological events. Saccharides and glycoconjugates constitute the main component of the biomass produced on earth, therefore they represent a plentiful source of renewable energy. The diversity of complex carbohydrates is created and controlled by a panel of enzyme activities involved in their assembly, degradation and modification. The structural and functional study of Carbohydrate Active enZymes on (CAZymes) has been the basis for many applied research efforts in biotechnology. For exemple, the biotechnology industry is currently searching enzymes with enhanced activities and specificities. The identification of new enzymes is potentially facilitated by the large-scale accumulation of gene sequences, particularly from current genomic studies.This thesis aimed at developing tools for the classification and identification of new enzymes involved in biomass degradation. To this end, a new structure of the CAZy database was developed and applied to mining genomic, metagenomic and biochemical data. A complete reorganisation of the structure of the existing database and its interface has been achieved. In this effort the analysis of all known families of polysaccharide lyases has been validated and subfamilies were created, which revealed functional homogeneity. In addition, the systematic identification of modular proteins containing plant cell wallbinding modules allowed the identification of new proteins potentially targeting plant biomass. Finally, I show that it is indeed possible to analyze large volumes of (meta)genomic data by automated methods in order to understand their CAZyme contents.

Le Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) est une molécule à fort impact écologique couramment produite par le phytoplancton marin, mais très rarement chez les plantes à fleurs: seulement chez quelques genres (dont Spartina chez les Poacées). Bien que les étapes enzymatiques impliquées dans la voie de biosynthèse du DMSP soient connues chez les spartines, son origine ainsi que les gènes impliqués restent encore à découvrir chez les plantes. Cette étude s’est fixée pour objectif de contribuer à élucider les mécanismes à l’origine de cette fonction chez les spartines. Cette question a été appréhendée à travers différentes approches : biochimique, métabolomique, transcriptomique, génomique comparative et phylogénétique. Les résultats ont montré que la capacité à synthétiser le DMSP a une origine unique au sein du genre Spartina et se serait mise en place il y a 3-10 millions d’années. Cette capacité est intervenue chez l’ancêtre d’un des deux principaux clades (hexaploïde) de spartines, puis a été héritée chez toutes les espèces dérivant de ce clade (hexaploïdes à dodécaploïdes). Les espèces de l’autre clade (tétraploïde) et leurs descendants (quel que soit leur niveau de ploïdie) n’accumulent pas de DMSP. En utilisant les génomes séquencés des espèces de Poacées ainsi que les ressources génomiques et transcriptomiques disponibles chez les spartines, les gènes candidats intervenant dans les 4 étapes de la voie de biosynthèse proposée dans la littérature ont été explorés. L’identification des gènes intervenant dans les deux étapes intermédiaires, supposées spécifiques de la capacité de synthèse du DMSP représente un véritable défi dans la mesure où seules des activités enzymatiques putatives ont été proposées à ce jour (sans connaissance des enzymes spécifiques ni de leur séquence protéique). Nous avons pu identifier une série de gènes candidats pour chacune des deux fonctions concernées (décarboxylase et amine oxydase), comparer leur niveau de transcription entre les espèces DMSP+ et DMSP-, et prédire leur localisation cellulaire. De plus, des analyses d’activités enzymatiques ont permis de formuler de nouvelles hypothèses et pistes de recherches sur l’émergence de cette nouvelle voie de biosynthèse chez les spartines. / Dimethylsulfoniopropionate (DMSP) is an ecologically important molecule produced by most marine phytoplankton species, but very rarely by flowering plants: only in a few genera (including Spartina in Poaceae). Despite the different enzymatic steps involved in DMSP biosynthesis are well known, the origin of the function and the genes encoding the different enzymes are yet to be discovered. To explore the evolutionary mechanisms involved in the DMSP accumulation in Spartina, we used various approaches, including biochemical analyses, metabolomics, transcriptomics, comparative genomics and phylogenetics. Notably, we demonstrate that the ability to synthesize DMSP evolved once in the Spartina genus, sometimes 3-10 million years ago. This functional innovation occurred following the emergence of the hexaploid clade, and was inherited by all Spartina species deriving from this hexaploid ancestor. Spartina species belonging to the tetraploid clade and their deriving species do not accumulate DMSP (whatever their ploidy level). Using Poaceae sequenced genomes as well as Spartina genomic and transcriptomic resources obtained in our laboratory, candidate genes involved in the four different enzymatic steps of the DMSP biosynthesis pathway were searched. Identifying genes involved in the intermediate (2nd and 3rd) steps that are specific to this pathway was particularly challenging as only putative enzymatic activities have been proposed so far (corresponding protein sequences and genes are unknown). A set of candidate genes potentially involved in these two steps (with decarboxylase and amine oxydase activities) were identified and their transcription levels were compared among DMSP producing (DMSP+) and non-producing (DMSP-) Spartina species. Their putative cellular localization was also predicted. Moreover, enzymatic activity assays open new hypotheses and research perspectives regarding this enigmatic biosynthesis pathway in Spartina.

L’émergence du génotypage à haut débit et le développement de méthodes statistiques reliant le génotype au phénotype ont donné lieu à des approches pangénomiques, c’est-à-dire à l’échelle du génome entier, exploitables en sélection des plantes. Ces approches ont d’abord permis d’examiner l'association entre génotype et phénotype via des analyses d'association pangénomique (GWAS en anglais) afin d’identifier des loci de caractères quantitatifs (« quantitative trait loci », QTL) utiles en sélection assistée par marqueurs (SAM). Plus récemment, ces approches ont été explorées pour la prédiction génomique, laquelle vise, d’une part, à identifier les croisements les plus prometteurs (la sélection des croisements), et d’autre part, à identifier les individus les plus prometteurs au sein d’une descendance (la sélection génomique). Dans les deux cas, ces prédictions reposent sur un modèle statistique reliant le génotype et le phénotype au sein d’une population de référence. Ces approches pangénomiques offrent un grand potentiel, mais sont encore émergentes et de nombreuses questions se posent encore chez l’orge. Notre étude s’intéresse à certaines de ces interrogations et elle est divisée en quatre volets de recherche. Les approches pangénomiques nécessitent un nombre important de marqueurs moléculaires de type SNP (« single nucleotide polymorphism »). Ainsi dans le premier volet nous avons optimisé le protocole de génotypage par séquençage. Ce volet détaille tout le processus, de la préparation des librairies de séquençage jusqu’à la production d’un catalogue de SNP de haute qualité. À titre d’illustration, nous avons généré un catalogue de 30 000 SNP ayant une distribution chromosomique intéressante et une grande exactitude des génotypes. Dans le deuxième volet, en utilisant les données phénotypiques et génotypiques d’une population d’amélioration, nous avons comparé l’efficacité de trois approches GWAS (Uni-SNP, Multi-SNP et Haplotypique) pour détecter des QTL pour des caractères agronomiques importants. Les approches Multi-SNP et Haplotypique ont identifié plus de QTL que l’approche Uni-SNP. Le chevauchement entre les approches était limité, chaque approche découvrant un sous-ensemble différent de QTL. / Dans le cadre du troisième volet, nous avons étudié l’impact de trois facteurs sur la justesse de la sélection génomique : (1) la performance de différents modèles statistiques (incluant ou non l’épistasie), (2) le nombre de marqueurs employés ainsi que (3) leur localisation (génique/nongénique). Le modèle qui intègre les effets additifs et épistatiques a montré les meilleures performances même si les différences entre les modèles étaient modestes. Jusqu’à 2K SNP, la justesse de la sélection génomique est restée comparable à celle basée sur le catalogue entier (35K), mais une diminution significative été observée à 500 SNP. Dans la plupart des cas, l’utilisation de SNP présents dans les régions géniques, voire codantes, n’a pas apporté une amélioration significative. Enfin, dans le quatrième volet, nous avons exploré la sélection génomique et la sélection des croisements. En premier lieu, nous avons constitué une population de référence pour bâtir un modèle de sélection génomique et prédire les performances de 350 descendants développés dans un programme d’amélioration. A partir des prédictions, 35 lignées ont été sélectionnées et testées au champ afin d’examiner la corrélation entre les performances prédites et observées. Les corrélations étaient satisfaisantes pour la résistance à la fusariose et le rendement. Ensuite, sur la base de ce modèle, nous avons prédit la moyenne (μ) ela variance génétique (Vg) de chacune des descendances simulées issues de tous les croisements possibles (30 000). La validation de ces prédictions a été réalisée rétrospectivement sur un sous-ensemble de croisements précédemment réalisés, en examinant leur persistance dans le processus de sélection. Tel qu’attendu les croisements les plus persistants (>F9) ont présenté des μ supérieures, mais des Vg modérées. Même si la résistance à la fusariose et le rendement sont corrélés défavorablement, nous avons pu identifier des croisements (650) où cette corrélation était rompue. Parmi ces croisements, certains (40) auraient un réel potentiel avec des performances égales ou supérieures à des lignées témoins performantes. Au terme de ce projet, nous avons démontré l'efficacité d'une procédure GWAS combinant des approches uni- et multi-locus à disséquer des caractères complexes et à détecter des QTL clés utilisables en SAM. Nous avons aussi démontré que la prédiction génomique peut être optimisée et efficacement intégrée en sélection génétique chez l’orge à six rangs pour identifier les meilleurs descendants, mais surtout pour identifier des croisements prometteurs. / Finally, in the fourth part, we explored genomic selection and genomic mating in a breeding program. First, we established a training population to build a genomic selection model and to predict the performance of 350 progeny developed in a breeding program. Based on these predictions, 35 lines were selected and tested in the field to examine the correlation between predicted and observed performances. The correlations were satisfactory for Fusarium head blight (FHB) resistance and yield. Then, based on this model, we predicted the mean (μ) and the genetic variance (VG) of each simulated progeny from all possible crosses (n = 30,000) between lines of the training population. The validation of these predictions was carried out retrospectively on a subset of previously performed crosses by examining their persistence in the selection process. As expected, the most persistent crosses (> F9) displayed high μ but moderate VG. Although resistance to FHB and yield are unfavorably correlated, we could identify crosses (650) where this correlation was weakened. Among these crosses, some (40) are predicted to offer equal or better performance than current checks. Through this project, we demonstrated the efficiency of a GWAS procedure combining single- and multi-locus approaches to dissect complex characters and to detect key QTLs that can be used in MAS. We also demonstrated that genomic prediction can be optimized and efficiently integrated in genetic improvement of six-row barley to identify the best progeny but also to identify promising crosses. / The emergence of high-throughput genotyping and the development of statistical methods linking genotype to phenotype have led to pangenomic approaches, performed on a genome-wide scale, exploitable in plant breeding. First, these approaches were used to examine the association between genotype and phenotype in genome-wide association studies (GWAS) in order to identify quantitative trait loci (QTLs) useful in marker-assisted selection (MAS). More recently, these approaches have been explored in genomic prediction which aims, on the one hand, to identify the most promising crosses (genomic mating), and on the other hand, to identify the most promising lines within a set of progeny (genomic selection). In both cases, these predictions are based on a statistical model linking genotype to phenotype in a training population. These genome-wide approaches offer great potential but are still emerging and many questions remain unanswered in barley. Our study focuses on some of these questions and is divided into four areas of research. Genome-wide approaches require a large number of single nucleotide polymorphism (SNP) markers. Thus, in the first part of this project, we optimized the protocol of genotyping by sequencing (GBS). This part details the entire process, from the preparation of GBS libraries until the production of a high-quality SNP catalog. As an illustration, we generated a catalog of 30,000 SNPs with a broad chromosome distribution and high genotype accuracy. In the second part, using phenotypic and genotypic data from a breeding population, we compared the effectiveness of three GWAS approaches (Single-SNP, Multi-SNP and Haplotype-based) to detect QTLs for important agronomic traits. The Multi-SNP and Haplotype-based approaches identified more QTLs than the Single-SNP approach. The overlap between the approaches was limited, as each approach uncovered a different subset of previously validated QTLs. In the third part we studied the impact of three factors on the accuracy of genomic selection: (1) the performance of different statistical models (including epistasis or not), (2) the number of SNP markers included in the model as well as (3) their localization (genic/non-genic regions). The model that incorporates both the additive and epistatic effects of SNPs showed the best performance even though the differences between the models were modest. With as few as 2K SNP, the accuracy of genomic selection remained comparable to that based on the entire catalog (35K), while a significant decrease in accuracy was observed at 500 SNPs. In most cases, the use of SNPs located in genic regions, even coding regions, did not provide a significant improvement.

L’androgenèse est une biotechnologie végétale utilisée pour fixer le bagage génétique des plantes en une seule génération. Elle repose sur la capacité d’un grain de pollen immature, la microspore, à restaurer sa totipotence cellulaire végétale et se dédifférencier puis s’engager dans la voie de l’embryogenèse. Or, on observe que la capacité de la microspore à s’engager dans l’embryogenèse est génétiquement variable. En dépit des nombreux avantages qu’elle présente, l’androgenèse entraîne souvent une conséquence indésirable, soit une distorsion de la ségrégation (DS) chez les populations issues de cette biotechnologie. Ma thèse porte sur l’étude (i) du transcriptome de la microspore en transition entre la voie de développement du grain de pollen et celle de l’androgenèse et (ii) de la DS pour déterminer quand la DS survient dans le processus et où elle affecte le génome. J’ai utilisé l’orge comme espèce modèle pour mon étude. L’analyse transcriptomique a été réalisée sur la microspore isolée de l’anthère à trois stades, soit avant (jour 0) et immédiatement après (jours 2 et 5) l'application d'un traitement de stress visant à induire la voie de l’androgenèse. Je me suis intéressé à deux catégories de gènes; soit les gènes exprimés exclusivement à un stade précis et les gènes exprimés différemment lors de l’initiation de l’androgenèse. J’ai pu identifier des gènes exprimés exclusivement dans la microspore au jour 0 (11), 2 (34) ou 5 (367). Au jour 5, j’ai constaté l’induction de nombreux gènes codant pour des FT et des gènes impliqués dans la synthèse ou la transduction du signal de nombreux régulateurs de croissance. L’analyse des gènes exprimés différemment m’a permis d’identifier certains processus métaboliques qui sont activés/réprimés lors du passage de la microspore du jour 0 au jour 2 et du jour 2 au jour 5. Les gènes exprimés exclusivement à un stade précis du développement pourraient servir de marqueurs moléculaires indicateurs de la performance en androgenèse pour optimiser les protocoles de culture. Ensuite, la DS a été étudiée par une approche de génotypage à l’échelle génomique. J’ai d’abord développé une méthodologie d’analyse génotypique novatrice, reproductible et précise pour étudier la fréquence allélique sur un échantillon en composite. Cette méthode m’a permis d’étudier la fréquence allélique chez 1) des échantillons de microspores (avant et après l’application d’un stress), 2) des embryons et 3) des plantes régénérées. J’ai montré que la DS survenait à la fois lors du développement des embryons et la régénération des plantes. Aucune DS n’a été observée chez les échantillons de microspores. Mes résultats montrent que la sélection engendrant la DS s’opère au cours de la culture in vitro. Toujours à l’aide de cette méthode de génotypage en composite, j’ai identifié et comparé la fréquence et l’étendue de la DS chez 12 populations de lignées haploïdes doublées (HD). Dans cette seule étude, un plus grand nombre de populations de lignées HD (12) ont été caractérisées que ce qui avait été fait dans la somme de toutes les études antérieures dans la littérature scientifique. Nous avons montré que les régions de distorsion de ségrégation différaient beaucoup quant à leur position, leur étendue et l’amplitude de la distorsion d’un croisement à l’autre. La connaissance de ces allèles permettrait de prédire le potentiel androgénique des génotypes dans un programme de sélection. Mes travaux de thèse élèvent à l’ère des «omics» la recherche chez la microspore d’orge dans le système de l’androgenèse. À une échelle sans précédent, mon étude transcriptomique explore et décrit les changements d’expression génique au cours de la transition développementale de la microspore. Mon étude génomique identifie quand s’exerce la sélection engendrant la distorsion de la ségrégation des allèles dans ce système et décrit quelles régions chromosomiques sont affectées par cette distorsion. À la lumière de mes résultats, dans le dernier chapitre, je propose certaines pistes de recherche pour poursuivre l’étude des mécanismes moléculaires dirigeant la transition développementale de la microspore en androgenèse et pour développer des outils de génotypage afin d’utiliser la DS comme un outil d’amélioration génétique. / Androgenesis is a plant biotechnology used to fix the genetic background of plants in a single generation. This is based on the ability of an immature pollen grain, the microspore, to restore its totipotency, to dedifferentiate and then to engage in the path of embryogenesis. However, it is observed that the ability of the microspore to engage in embryogenesis is genetically variable. Despite the many desirable attributes of androgenesis, an undesirable side - effect is the segregation distortion (SD) encountered in populations resulting from this biotechnology. My thesis focuses on (i) the study of the transcriptome of microspores undergoing a developmental transition from the pollen - grain pathway towards embryogenesis and (ii) to identify when SD arises in the process and in which genomic regions it occurs. I used barley as a model species for my studies. Transcriptomic analysis was performed on microspores isolated from anthers at three stages corresponding to the microspore before (day 0) and immediately after (days 2 and 5) the application of a stress treatment aimed at inducing embryogenesis. I was interested in two categories of genes: those expressed exclusively at a specific stage of microspore development and those that were differentially expressed during the initiation of androgenesis. I was able to identify genes expressed exclusively in the microspore on day 0 (11), 2 (34) or 5 (367). On day 5, I found the induction of many genes encoding transcription factors (T Fs) in addition to genes involved in the synthesis or signal transduction of many growth regulators. The analysis of differentially expressed genes allowed me to identify certain metabolic processes that were activated/repressed during microspore development from day 0 to 2 and from day 2 to 5. Genes expressed exclusively at a specific stage of development could serve as molecular markers indicative of the performance in androgenesis to optimize isolated microspore culture protocols. Then, SD was studied using a whole - genome genotyping approach. I first developed an innovative, reproducible and accurate genotypic analysis methodology to determine allelic frequency on pooled samples. This method was then used to estimate allelic frequencies in samples of microspores (before and after the application of stress), embryos and regenerated plants. I showed that SD arises during both the development of embryos and the regeneration of plants. No SD was observed in samples of microspores. My results show that the selective forces promoting SD act during in vitro culture. Still using the same genotyping method performed on pooled samples, I identified and compared the frequency and extent of SD in 12 populations of doubled haploid lines (DH). A greater number of DH (12) populations were characterized in my study alone than the sum of all previous studies in barley. I showed that segregation distortion regions greatly differ in their position, extent, and magnitude in different DH populations. Knowledge of these alleles would be useful to predict the androgenic potential of a genotype in a breeding program. My dissertation has allowed research into barley microspores, or more widely androgenesis, to enter into the “omics” era. On an unprecedented scale, my transcriptomic study explores and describes the gene expression changes that occur during the developmental transition that the microspore undergoes in the course of androgenesis. My genomic study identifies when the selection (producing SD) arises in this system and describes which chromosomal regions are affected by this distortion. In light of my findings, in the final chapter I propose some lines of research to further study the molecular mechanisms driving the developmental transition from microspores to embryos and to develop genotyping tools to use SD as a genetic improvement tool.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Le complexe MRN (MRE11-RAD50-NBS1) est essentiel au maintien de la stabilité du génome chez les eucaryotes supérieurs. Il a été démontré que la sous-unité MRE11 du complexe MRN, qui possède une activité nucléase nécessaire aux mécanismes de réparation des cassures double-brin (CDBs). est méthylée sur les arginines de façon asymétrique. Cette méthylation est effectuée par la protéine PRMT1 et survient sur les arginines du motif GAR (Glycine-Arginine Rich) de la protéine MRE11. Cet événement arrive apparemment avant l'incorporation de MRE11 dans le complexe MRN. Le motif GAR de MRE11 influence la relocalisation in vivo de MRN en réponse aux CDBs. en plus d'affecter la réponse de signalisation des CDBs. De plus, une analyse des mutants ponctuels sur les arginines du motif GAR de MRE11 montre que ces arginines normalement méthylées influencent l'activité nucléase de MRE11 in vitro. Finalement, nous montrons que le domaine GAR de MRE11 permet la liaison de la protéine SMN par son domaine tudor, in vivo et in vitro. Cette interaction suggère la participation de SMN au niveau de la réparation des CDBs, ce qui est supporté par la sensibilité aux CDBs des cellules mutantes pour le gène smnl. Nos résultats démontrent, pour la première fois, une implication possible de SMN dans la réparation de l'ADN.