Le développement de nouvelles techniques a accéléré l'exploration structurale et fonctionnelle des génomes des conifères et contribué à l’étude de leur physiologie et leur adaptation aux conditions environnementales. Cette thèse s’intéresse à l’évolution des gènes chez les conifères et (i) fait le point sur les facteurs génomiques qui ont influencé la structure des gènes et (ii) analyse une grande famille de gènes impliqués dans la tolérance à la sécheresse, les déhydrines. Notre étude de la structure génique s’est fait à partir de diverses séquences de l’épinette blanche (Picea glauca [Moench] Voss) provenant de clones BAC, de l'assemblage du génome et de l’espace génique obtenu à partir de la technologie de «sequence capture». Par le biais d’analyses comparatives, nous avons observé que les conifères présentent plus de séquences introniques par gène que la plupart des plantes à fleurs (angiospermes) et que la longueur moyenne des introns n'était pas directement corrélée à la taille du génome. Nous avons constaté que les éléments répétitifs qui sont responsables de la très grande taille des génomes des conifères affectent également l'évolution des exons et des introns. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons entrepris la première analyse exhaustive de la famille des gènes des déhydrines chez les conifères. Les analyses phylogénétiques ont indiqué l'apparition d'une série de duplications de gènes dont une duplication qui a provoqué l'expansion de la famille génique spécifiquement au sein du genre Picea. L’analyse démontre que les déhydrines ont une structure modulaire et présentent chez les conifères des agencements variés de différents motifs d'acides aminés. Ces structures sont particulièrement diverses chez l'épinette et sont associées à différents patrons d'expression en réponse à la sècheresse. Dans l’ensemble, nos résultats suggèrent que l'évolution de la structure génique est dynamique chez les conifères alors que l'évolution des chromosomes est largement reconnue comme étant lente chez ceux-ci. Ils indiquent aussi que l'expansion et la diversification des familles de gènes liés à l'adaptation, comme les déhydrines, pourraient conférer de la plasticité phénotypique permettant de répondre aux changements environnementaux au cours du long cycle de vie qui est typique de plusieurs conifères. / Technical advances have accelerated the structural and functional exploration of conifer genomes and opened up new approaches to study their physiology and adaptation to environmental conditions. This thesis focuses on the evolution of conifer genes and explores (i) the genomic factors that have impacted the evolution of gene structure and (ii) the evolution of a large gene family involved in drought tolerance, the dehydrins. The analysis of gene structure was based on white spruce (Picea glauca [Moench] Voss) sequence data from BAC clones, the genome assembly and the gene space obtained from sequence capture. Through comparative analyses, we found that conifers presented more intronic sequence per gene than most flowering plants (angiosperms) and that the average intron length was not directly correlated to genome size. We found that repetitive elements, which are responsible for the very large size of conifer genomes, also affect the evolution of exons and introns. In the second part of the thesis, we undertook the first exhaustive analysis of the dehydrin gene family in conifers. The phylogenetic analyses indicated the occurrence of a series of gene duplications in conifers and a major lineage duplication, which caused the expansion of the dehydrin family in the genus Picea. Conifer dehydrins have an array of modular amino acid structures, and in spruce, these structures are particularly diverse and are associated with different expression patterns in response to dehydration stress. Taken together, our findings suggest that the evolution of gene structure is dynamic in conifers, which contrast with a widely accepted slow rate of chromosome evolution. They further indicate that the expansion and diversification of adaptation-related genes, like the dehydrins in spruce, may confer the phenotypic plasticity to respond to the environmental changes during their long life span.

Les récents progrès en génomique ont conforté la complexité de l’origine des algues; d’un point de vue de la phylogénie des hôtes de l’endosymbiose, les algues forment un groupe évolutif polyphylétique. Les algues vertes forment deux embranchements majeurs : les Streptophyta et les Chlorophyta. Les chlorophytes comprennent la majorité des algues vertes connues et se regroupent en quatre classes. La première, les Prasinophyceae, occupe la position la plus basale, tandis que l’ordre d’embranchement des trois autres classes (Ulvophyceae, Trebouxiophyceae et Chlorophyceae) demeure encore incertain. Pour clarifier les relations évolutives chez les Clorophyceae, huit génomes chloroplastiques appartenant à la lignée des Chlamydomonadales, lignée majeure des Chlorophyceae, ont été séquencés et analysés. Des études phylogénétiques ont confirmé les classifications préétablies et de nouveaux clades se sont vus formés. Les génomes de ces algues chlorophycéennes ont révélé une architecture conservée avec un certain nombre de caractères spécifiques à la classe des Chlamydomonadales. L’analyse de leurs caractères moléculaires a révélé des génomes marqués par la réduction ou le réarrangement de leur répertoire génomique comparativement aux génomes chloroplastiques des algues vertes plus ancestrales. / Recent advances in genome sequencing and analysis have reinforced the complexity of the origin of the green algae. From the point of view of a host endosymbiotic phylogeny, green algae form a polyphyletic evolutionary group. Green algae form two major branches : the Streptophyta and Chlorophyta. Chlorophytes include the majority of green algae known and they are grouped into four classes. The first, that of Prasinophyceae, occupies the most basal position, while the branching order of the other three classes (Ulvophyceae, Trebouxiophycea and Chlorophyceae) remain uncertain. To clarify the evolutionary relationships amongst Chlorophyceae, eight chloroplast genomes belonging to the lineage of Chlamydomonadales, a major clade of Chlorophyceae were sequenced and analyzed. Phylogenetic studies have confirmed the pre-established classifications and new clades were seen to be formed. The genomes of these chlorophyll algae were revealed to be conserved with a number of specific architectural characters of the Chlamydomonadales class. Analysis of their molecular characteristics revealed a genome marked by the reduction or rearrangement of their genomic repertory compared to chloroplast genomes of the ancestral green algae.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Un enjeu actuel en biotechnologie est d'obtenir des plantes haploïdes doublées par la technique de la culture de microspores isolées (CMI). Pourtant, la CMI génère parfois une proportion importante de plantes albinos, laquelle peut atteindre 100 % chez certains cultivars. Des travaux antérieurs ont indiqué que des remaniements du génome chloroplastique seraient à l'origine de cet albinisme. Afin de mieux comprendre ce processus menant à l'albinisme, nous avons entrepris d'étudier l'intégrité du génome chloroplastique au sein de microspores d'orge et de plantes albinos via une approche de séquençage à grande échelle. L'ADN total extrait de microspores à un stade précoce de la CMI, d'une feuille de la plante-mère (témoin), et de feuilles albinos, a été séquencé et les séquences chloroplastiques ont été analysées. Ceci nous a permis de documenter pour la première fois une diminution de l'ADN chloroplastique chez les microspores. De plus une étude de variations structurales a démontré un abaissement généralisé de la quantité de génomes chloroplastiques chez les microspores. Enfin, d'importants remaniements du génome chloroplastique ont été observés chez les plantes albinos, révélant une forte abondance de génomes chloroplastiques altérés de forme linéaire.

Brevibacterium aurantiacum est l'un des principaux micro-organismes utilisés dans la production de fromages à croûte lavée dans le monde. L’utilisation de cette bactérie est dû à sa richesse métabolique, car elle produit des composés soufrés volatils, des pigments caroténoïdes et des enzymes lipolytiques et protéolytiques, qui sont nécessaires à la maturation d’une variété de fromages. Des souches de cette espèce bactérienne sont inoculées à la surface de fromages au cours de l'affinage et sont sensibles à des infections virales. Les bactériophages (phages), virus qui infectent les bactéries, sont omniprésents dans divers écosystèmes. Dans l'industrie laitière, ils sont reconnus pour perturber les procédés de production lors de l'infection de ferments lactiques, mais leur implication sur des fromages présentant des défauts de couleur et de saveur reste à démontrer. Ces anomalies de maturation de fromages à croûte lavée ont conduit à cette thèse. Le premier objectif de cette thèse de doctorat consistait à analyser le génome de la souche industrielle B. aurantiacum SMQ-1335 et qui est aussi sensible à des phages. Le deuxième objectif de la thèse visait à étudier les phages virulents infectant cette souche. D’ailleurs, cette étude rapporte la première description et caractérisation de phages infectant cette espèce bactérienne. Malgré la similitude entre ces phages, des répétitions en tandem d'ADN ont été identifiées dans des génomes viraux et une analyse approfondie a montré que ces segments d'ADN sont répandus parmi les phages. Le troisième objectif visait à étudier l'interaction phage-hôte via l’analyse du génome de souches mutantes insensibles aux phages. En étudiant ces souches mutantes, des gènes potentiellement nécessaires pour l'infection phagique ont été identifiés. Enfin, le quatrième et dernier objectif visait à évaluer l'impact des phages de B. aurantiacum dans la production de fromages à croûte lavée et ce, à l'aide des caillé modèles. À noter que le reclassement de la souche SMQ-1335, avant identifiée auparavant comme Brevibacterium linens, est décrit en annexe de cette thèse. Malgré des décennies d'études sur les phages laitiers, les phages de B. aurantiacum étaient encore inconnus. Mes travaux auront permis le développement d’un protocole reproductible pour isoler ces phages. Ces travaux ont également apporté de nouvelles connaissances sur les interactions phage-hôte et de leur impact dans les fromages affinés en surface. / Brevibacterium aurantiacum is one of the key players in the production of washed rind cheeses produced worldwide. The importance of this bacterium to the dairy industry is due to its metabolic richness, as it produces volatile sulfur compounds, carotenoid pigments, and lipolytic and proteolytic enzymes, which play roles in the maturation of washed rind cheeses .As strains of this species are regularly inoculated on the cheese surface during ripening, there is a significant risk of viral attacks. Bacteriophage (phages), viruses that infect bacteria, are ubiquitous in the cheese environment. In the dairy industry, virulent phages have long been known to disrupt cheese processes by infecting lactic acid bacteria. The recent observations of color and flavor defects in washed rind cheeses suggested that phages may also infect strains of B. aurantiacum. These observations led to this thesis.The first objective of this PhD dissertation was to study the genomics of B. aurantiacum SMQ-1335, an industrial strain used in the production of washed rind cheeses. The second objective of the thesis was to study the diversity and biology of virulent phages infecting this industrial strain. This study was the first report of phages infecting B. aurantiacum. Despite the low diversity of the isolated B. aurantiacum phages, DNA tandem repeats were found in an intragenic region of the viral genomes and extended analysis showed that these DNA segments are widespread among phages. The third objective was to investigate phage-host interactions through the genome analyses of bacteriophage insensitive mutants, which were selected by challenging SMQ-1335 with phage AGM1. Host genes likely necessary for phage infection were identified and may explain why some of these mutants are phage-resistant. Finally, the fourth objective of this thesis evaluated the impact of virulent phages on the production of washed rind cheeses using model curds. Of note, the reclassification of the strain SMQ-1335, long believed to be Brevibacterium linens, is described in the annex of the thesis. Despite decades of studies on dairy phages, B. aurantiacum phages were still unknown. Here, a reproducible protocol to isolate these phages was developed, which may allow the isolation of new phages. This work also led to increased knowledge on phage-host interactions as well as on and their roles in surface-ripened cheeses.

Le large éventail d'applications du système CRISPR-Cas a conduit à des innovations biotechnologiques qui sont sur le point de transformer l'industrie pharmaceutique actuelle. Néanmoins, l'atteinte d'un haut niveau d'efficacité à un gène cible reste encore aujourd'hui un défi pour l'édition du génome. Ceci est dû principalement à la capacité encore limitée de modifier tous les sites du génome humain, tout comme le faible taux de recombinaison homologue obtenu chez les cellules de mammifères. Ainsi, l'optimisation des processus de modification génique s'avère indispensable pour favoriser les diverses utilisations de l'édition du génome. Dans cette thèse, il a été question de (i) développer une méthode d'enrichissement de cellules génétiquement modifiées et (ii) augmenter la polyvalence de l'édition du génome en augmentant la plage de ciblage du système CRISPR-Cas9 dans le génome humain. L'objectif de la première partie de cette thèse visait à étudier la fonctionnalité du gène ATP1A1, codant pour la pompe sodium/potassium (Na⁺/K⁺ ATPase), comme marqueur endogène de l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons modifié la sensibilité de cette pompe pour l'ouabaïne en insérant des mutations dominantes dans le locus ATP1A1, ce qui a permis de générer des cellules résistantes à l'ouabaïne. La capacité de multiplexage du système CRISPR-Cas permet de co-cibler simultanément ATP1A1 et le locus d'intérêt, où il est possible d'enrichir des évènements de réparation par NHEJ ou par RH dans les deux locus à la suite de l'ajout d'ouabaïne. Ainsi, nous avons démontré que cette approche peut être appliquée non seulement aux lignées cellulaires, mais aussi aux cellules primaires ce qui permet d'envisager une possible utilisation pour le développement thérapeutique ex vivo. Dans le deuxième objectif de cette thèse, il était question d'optimiser le système CRISPR1-Cas9 de Streptococcus thermophilus dans le but d'élargir le répertoire de nucléases pour l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons optimisé l'expression de l'ARN guide et nous avons caractérisé diverses variantes de St1Cas9 permettant de cibler des régions riches en A/T. Autant sous forme de nucléase que d'éditeur de base, l'application de nos variantes de St1Cas9 in vitro a permis d'obtenir des hauts taux d'édition du génome humain. Ainsi, la taille de St1Cas9 est idéale pour sa vectorisation avec son ARN guide dans un seul vecteur adéno-associés (AAV). Dans ce sens, nous avons démontré que l'administration du vecteur AAV-St1Cas9 permet de sauver la létalité et les anomalies métaboliques dans un modèle murin de tyrosinémie héréditaire de type I. En tout, ces travaux illustrent des outils permettant d'augmenter le rendement d'édition et l'ouverture de nouvelles régions géniques pouvant être ciblées à l'intérieur du génome humain à l'aide du système CRISPR-Cas9. Ainsi, nous avons démontré la fonctionnalité des outils développés au cours de ce projet de thèse pour diverses applications ex vivo et in vivo, permettant ainsi d'élargir le potentiel thérapeutique de l'édition du génome.

Les répétitions en tandem sont constituées de successions de motifs d'ADN. Ces structures sont présentes dans tous les organismes, procaryotes comme eucaryotes et, même si leur rôle biologique est encore peu compris, elles ont des applications dans de nombreux domaines. Tout d'abord, chez les bactéries, les répétitions en tandem polymorphes, dont le nombre d'unités varie, se révèlent un outil puissant pour l'identification de souches à des fins épidémiologiques. Par ailleurs, certaines répétitions en tandem humaines ont la propriété de muter à des fréquences élevées : les minisatellites hypermutables sont les éléments les plus instables du génome humain. Ils peuvent être utilisés comme biomarqueurs d'exposition à des agents potentiellement mutagènes tels que les radiations ionisantes. D'un point de vue plus fondamental, ils sont également un modèle d'étude des mécanismes d'instabilité des génomes. Dans cette thèse, nous mettons à profit les données issues du séquençage afin d'identifier des répétitions en tandem polymorphes. Nous avons tout d'abord élaboré une base de données des répétitions en tandem accessible sur le web (http://minisatellites.u-psud.fr), qui fournit un accès aux répétitions en tandem de génomes entiers. Ensuite, dans le but de sélectionner les répétitions en tandem polymorphes, plusieurs stratégies ont été mises en oeuvre. D'une part, chez les bactéries pour lesquelles les séquences de plusieurs souches étaient disponibles, nous avons créé un utilitaire de comparaison de souches, afin d'identifier des marqueurs polymorphes utilisables en épidémiologie. D'autre part, une étude menée sur les minisatellites humains a permis de définir des critères prédictifs du polymorphisme à partir de la séquence d'un seul allèle de minisatellite, et a en outre mis en évidence un nouveau minisatellite hypermutable situé dans une séquence codante putative. Les critères prédictifs ont également été appliqués à l'identification de minisatellites codants potentiellement polymorphes dans le génome humain.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le paludisme, ou malaria, est une maladie infectieuse qui touche plus de 350 millions d'êtres humains et qui tue chaque année 2,5 millions de personnes à travers le monde. Les parasites responsables de la malaria sont des apicomplexes du genre Plasmodium, essentiellement P. falciparum. Le génome de P. falciparum, est séquencé depuis octobre 2002, et présente un des taux les plus faibles de gènes annotés, avec ~60 % de gènes sans fonction attribuée. Il est difficile, voire impossible, d'identifier dans le génome de P. falciparumi, certains gènes, responsables de fonctions mesurées biochimiquement chez le parasite, par similarité avec des séquences homologues caractérisées dans d'autres organismes. Cette difficulté rencontrée lors des recherches automatiques d'homologie est une limite à tout projet exploratoire du génome malarial fondé sur la phylogénie moléculaire. En particulier, l'inventaire des séquences héritées de l'algue ancestrale, qui a réalisé l'endosymbiose secondaire qui caractérise le phylum des Apicomplexa (sous génome d'origine algale dans lequel il est possible de rechercher des cibles pour des médicaments herbicides), peut être rendu incomplet. Les caractéristiques atypiques du génome et du protéome de Plasmodium, résumées sous le terme de biais compositionnel (en particulier un pourcentage en adénosine+thymidine supérieur à 80%), ont été soupçonnées d'être un cas limite pour les outils d'analyse de séquence existants. L'objet de cette thèse a donc été d'examiner l'influence possible de ce type de biais sur les méthodologies de comparaisons de séquences et de façon plus approfondie sur leurs statistiques.<br />Nous avons proposé des développements théoriques nouveaux, associés à la statistique de la Z-value introduite par Lipman et Pearson pour évaluer la significativité d'un score d'alignement de deux séquences protéiques: (1) le théorème TULIP permettant de déduire un majorant de la probabilité d'un score d'alignement de séquences (i.e. la P-value) par la valeur 1/Z-value2 et (2) la déduction des propriétés remarquables de la distribution des Z-values à partir de quelques hypothèses sur l'évolution des protéines dans le contexte de la théorie de la fiabilité des systèmes. Ces développements théoriques ont permis certaines avancées sur le plan pratique de l'identification de séquences homologues initialement non détectées par le théorème de Karlin-Altschul et d'étayer la relation entre les scores d'alignements et l'information mutuelle, au sens de la théorie de l'information.<br />En construisant un espace de configuration des protéines homologues, permettant une expression du théorème TULIP et ayant une cohérence avec la théorie synthétique de l'évolution, nous avons déduit une méthode de reconstruction de phylogénies de séquences protéiques à l'aide des Z-values. Les phylogénies moléculaires reconstruites par cette méthode sont concordantes avec celles obtenues à partir d'alignements multiples et permettent par ailleurs de résoudre certaines incohérences rapportées avec les méthodes de reconstruction phylogéniques classiques.<br />En prenant en compte le modèle statistique que nous avons élaboré, nous avons entrepris une première analyse de l'évolution du biais en acides aminés chez Plasmodium corrélativement à l'évolution du biais en acides nucléiques dans le génome malarial et en fonction de la divergence évolutive, établie en prenant le génome non biaisé d'Arabidopsis thaliana comme référence. Nous avons observé que le biais des séquences malariales était corrélé au pourcentage de divergence avec leurs homologues végétaux. Nos analyses suggèrent de plus que le biais est vraisemblablement la conséquence d'une évolution au niveau nucléique. Nous avons examiné la possibilité de construire une famille de matrices tenant compte de cette dissymétrie dans le cas de la comparaison de Plasmodium et d'Arabidopsis. Ces matrices appelées DirAtPf, possèdent (1) une sensibilité théorique et (2) une spécificité supérieure aux familles de matrices existantes.<br />Les perspectives des travaux présentés dans ce mémoire incluent une progression de l'annotation automatique de Plasmodium falciparum et la mise en place d'une procédure statistiquement robuste et phylogénétiquement consistante pour caractériser le sous-génome algal du parasite malarial.

Longtemps considéré comme une structure stable hautement optimisée, le génome des procaryotes nous apparaît, au regard de récentes découvertes, comme extrêmement changeant au cours du temps. Chez certaines bactéries, les gènes acquis récemment d'espèces distantes par transmission horizontale sont estimés à plus de 15 % du génome et les phylogénies construites à partir de différents gènes présentent fréquemment des incongruences importantes. De ce point de vue, la cohérence interne des génomes et la durabilité des interactions entre gènes au cours des temps évolutifs sont mises en question. Certains auteurs proposent que les transferts horizontaux se produisent à une fréquence telle que le concept même d'histoire des espèces ne s'applique pas aux procaryotes. Cependant, il a été suggéré que certaines catégories de gènes pouvaient être plus ou moins sensibles au transfert. Nous avons testé cette hypothèse au moyen de méthodes phylogénétiques et tenté de reconstruire une phylogénie des procaryotes en utilisant les génomes complets. Les résultats suggèrent que certains gènes conservent une information congruente sur l'histoire des bactéries et que la combinaison de ces informations peut permettre de reconstruire une phylogénie des bactéries. La nature des gènes détectés comme ayant été acquis récemment pose également problème. En effet, plusieurs auteurs ont remarqué que ces gènes avaient tendance à être enrichis en nucléotides A et T en comparaison du reste du génome. Nous avons analysé la structuration en nucléotides de nombreux génomes complets et montré que certaines caractéristiques intrinsèques aux génomes pourraient, dans certains cas, conduire à une surestimation de la quantité de gènes acquis par transferts horizontaux. Si d'un point de vue qualitatif, l'importance des transferts horizontaux dans l'évolution des procaryotes a été amplement démontrée, nous pensons qu'elle a été surestimée du point de vue quantitatif du fait de problèmes méthodologiques. Détectés par une méthode phylogénétique, les gènes récemment acquis montrent des caractéristiques qui les rapprochent de séquences parasites (phages notamment) ou non fonctionnelles, suggérant que certaines catégories de gènes pourraient être « spécialisées » dans le transfert horizontal.