Mycoplasma hyopneumoniae (MH) é uma das menores bactérias encontradas na natureza, apresentando genoma altamente reduzido e ausência de parede celular. Este organismo é o agente causador da pneumonia enzoótica suína, a qual apresenta distribuição mundial causando importantes perdas econômicas. Recentemente, várias espécies de Mycoplasma tiveram seus genomas completamente seqüenciados, incluindo três cepas de MH. Apesar da grande quantidade de dados gerados, pouco se sabe sobre as seqüências nucleotídicas que controlam o início da transcrição nestes microrganismos. Assim como em outras espécies deste gênero, M. hyopneumoniae não possui vários mecanismos que regulam a expressão gênica, incluindo o sistema de dois componentes e diversos fatores σ. Portanto, aparentemente, os sinais que promovem e regulam a transcrição, nestes organismos, devem diferir significativamente de outras bactérias. Além disso, o baixo conteúdo de GC e a falta de promotores experimentalmente caracterizados, também são fatores que dificultam o reconhecimento de seqüências controladoras. Para possibilitar a identificação das seqüências promotoras de MH in vitro, através da utilização da RNA polimerase holoenzima reconstituída, este trabalho tem como objetivo purificar o fator σ através da expressão heteróloga do gene rpoD de M. hyopneumoniae cepa 7448. Como esta CDS possui três códons de parada UGA – os quais codificam triptofano nos micoplasmas –, foi utilizado uma técnica baseada em PCR para introduzir as mutações (TGA→TGG) necessárias. A metodologia de mutagênese sítio-dirigida, empregada neste trabalho, apresentou eficiência relativamente boa na substituição dos nucleotídeos alvo. O gene íntegro e mutado foi subclonado no vetor pET23a-d(+) e expresso em Escherichia coli. De acordo com o fato de que os fatores σ exibem menor mobilidade em SDS-PAGE, a proteína expressa apresentou uma massa molecular aparente de 64 kDa, diferente dos 58 kDa deduzidos a partir da seqüência nucleotídica. Ainda, nas condições utilizadas, maior quantidade da proteína foi produzida de forma insolúvel. Para obtenção de um fator σ recombinante funcional, diferentes protocolos de expressão, solubilização e purificação serão testados. / Mycoplasma hyopneumoniae (MH) is one of the smallest bacteria found in nature, presenting a small genome and no cell wall. It is present in the majority of swine herds throughout the world, and is considered an important pathogen in the swine industry. Recently, many species of this genus had their genome completely sequenced, including three strains of MH. Nevertheless, very little is understood of the nucleotide sequences that control transcription initiation in these microorganisms. Like its relatives, M. hyopneumoniae lacks several major regulators of gene expression, including two component regulatory systems and multiple σ factors, thus it appears that the signals for promotion and regulation of transcription may differ significantly from other bacteria. In addition, the low GC content and the dearth of experimentally characterized promoters in this genus severely limit the recognition of the controlling sequences. To enable in vitro identification of the MH promoter sequences, the aim of this study is to purify the σ factor through the heterologous expression of the rpoD gene from the M. hyopneumoniae strain 7448, that will allow reconstituting RNA polymerase holoenzyme. As this CDS has three UGA stop codons – which encode tryptophan in mycoplasma –, a PCR-based method to introduce the necessary mutations (TGA→TGG) was used. The site-direct mutagenesis methodology, employed in this work, showed a relative good efficiency to substitute the targets nucleotides. The full length mutated gene was subcloned into pET23a-d(+) vector and expressed in fusion with a C-terminal polihistidine tag. In agreement with the fact that σ factors show slower mobility on SDS-PAGE, the expressed protein exhibited an apparent molecular mass of 64 kDa in despite of the 58 kDa that was deduced from the nucleotide sequence. However, most of the protein was insoluble under the conditions used. Therefore, to obtain a functional recombinante σ factor, different protocols related to the expression, solubilization, and purification will be tested.

No presente trabalho está descrita a análise de experimentos de microarranjos de DNA realizados pelos pesquisadores do Projeto GENOLYPTUS em conjunto com a empresa NimbleGen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), assim como a validação dos resultados gerados por essa análise, com a finalidade de encontrar genes diferencialmente expressos entre folhas e xilema de E. grandis para futuro estudo. O processo de análise dos microarranjos de DNA envolveu a busca por um software com programas estatísticos adequados ao estudo de grande quantidade de dados com mínima probabilidade de erro. A comprovação dos resultados gerados pelo software escolhido foi realizada com o uso da técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa (em tempo real) precedida de transcrição reversa (qRT-PCR). Alguns dos genes mais diferencialmente expressos foram selecionados para esta etapa, juntamente com alguns genes com expressão não tão alta. Os genes mais expressos nas folhas que foram escolhidos codificam para; (i) uma proteína semelhante à metalotioneína do tipo 3 (MT-3); (ii) uma glicolato-oxidase; (iii) uma catalase; (iv) uma fosforribulocinase precursora de cloroplasto (PRK); (v) um fator de transcrição MYB do tipo MYB142 e, (vi) uma proteína tipo “dedo-de-zinco”. Os genes mais expressos no xilema escolhidos foram os que codificam (i e ii) duas proteínas expressas em Arabidopsis thaliana; (iii) uma proteína hipotética expressa em Nicotiana benthamiana; (iv) uma descarboxilase de UDPglicuronato do tipo 2, (v) uma quitinase do tipo ELP; (vi) uma celulosesintase tipo 3; (vii) um fator de transcrição MYB; (viii) uma cafeoil-CoA-3- O-metiltransferase (CCoAOMT) e; (ix) uma proteína rica em prolina híbrida do tipo 2 (HyPRP2). Os resultados das qRT-PCRs demonstraram que o experimento de microarranjo e seus resultados foram consistentes e válidos, embora os primeiros tenham demonstrado valores de expressão freqüentemente mais altos. Acreditamos que tanto a análise dos microarranjos de DNA quanto a equivalência das amostras (duplicatas) biológicas estudadas foram totalmente sustentadas pelos resultados da qRT-PCR, pois foram robustas o suficiente para estimar um grande número de genes simultaneamente e indicar aqueles mais importantes como candidatos para futuras análises. / In the present work it is described the analysis of DNA microarray experiments developed by GENOLYPTUS researchers together with Nimblegen Systems Inc. (Reykjavik, Iceland), as well as the validation of the generated results with the aim to find differentially expressed genes between leaves and xylem tissue of E. grandis for further study. The DNA microarray analysis process comprised the search for software containing statistical programs satisfactory for studying an enormous amount of data with a very low false discovery rate. The confirmation of the generated data by the chosen software was made with the use of quantitative (real-time) reverse-transcription followed by polymerase chain reaction (qRT-PCR). Some of the most differentially expressed genes were selected for this step, along with some genes with average expression. Leaf chosen genes were those that codify (i) a metallothionein-like protein type 3 (MT-3), (ii) a glycolate oxidase, (iii) a catalase, (iv) a precursor phosphoribulokinase (PRK) from chloroplast, (v) a MYB transcription factor (MYB142), and (vi) a CONSTANS-LIKE 16 zincfinger protein. Xylem chosen genes were those codifying (i and ii) two expressed proteins from Arabidopsis thaliana, (iii) a hypothetic protein expressed in Nicotiana benthamiana, (iv) a putative UDP-glucuronate decarboxylase type 2, (v) a chitinase type ELP (ectopic deposition of lignin in pith), (vi) a cellulose synthase type 3, (vii) a MYB transcription factor, (viii) a caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase (CCoAOMT), and (ix) a hybrid proline-rich protein type 2 (HyPRP2). Our qRT-PCR results proved the full consistency and validation of the microarray experiments, although the relative expression ratios of the first were often higher. We believe that our microarray analysis as well as the equivalence of biological samples (duplicates) were fully supported by the qRT-PCR findings since they were robust enough to evaluate a massive number of genes and able to point out important candidate genes.

As enzimas da via do chiquimato são alvos atraentes para o desenvolvimento de agentes para tratar a tuberculose já que esta via é essencial para Mycobacterium tuberculosis e está ausente em humanos. A enzima chiquimato desidrogenase de M. tuberculosis (MtbSD), codificada pelo gene aroE, catalisa a quarta reação na via do chiquimato. Estudos de estrutura tridimensional, de perfis de pH e de mutagênese sítio-direcionada envolvendo muitas chiquimato desidrogenases sugerem a participação da Lisina-69 e do Aspartato-105 (numeração de acordo com a seqüência da MtbSD) na catálise e/ou na ligação ao substrato. A determinação das propriedades cinéticas de enzimas mutantes pode permitir importantes proposições acerca do papel destes resíduos para a enzima MtbSD. A mutagênese foi realizada usando uma técnica de amplificação por PCR para as seguintes proteínas mutantes: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Testes de diversas condições experimentais foram feitos para obter a expressão das proteínas MtbSD mutantes na fração solúvel. Além disso, empregamos um protocolo de purificação otimizado para obter as enzimas MtbSD não mutante e K69A aparentemente homogêneas. Realizamos ensaios cinéticos em estado estacionário e medidas espectrofluorimétricas destas duas enzimas, e os resultados indicam que o resíduo conservado Lisina-69 tem função catalítica e não está envolvido na ligação ao substrato para a MtbSD. Estudos estruturais, de mutagênese sítio-direcionada e de cinética enzimática podem trazer importantes contribuições para o desenho racional de novos e efetivos fármacos para tratar a tuberculose. / The shikimate pathway is an attractive target for the development of antitubercular agents because it is essential in Mycobacterium tuberculosis but absent in humans. Mycobacterium tuberculosis aroE-encoded shikimate dehydrogenase (MtbSD) catalyzes the forth reaction in the shikimate pathway. Three-dimensional structure studies, pH-rate profiles and site-directed mutagenesis studies involving many shikimate dehydrogenases have suggested participation of Lysine-69 and Aspartate-105 (M. tuberculosis numbering) in catalysis and/or substrate binding. Importantly, investigation of the kinetic properties of mutant enzymes can bring important insights about the role of these residues for the MtbSD enzyme. Mutagenesis was performed using a PCR-amplification technique for the following mutant proteins: K69A, K69H, K69I, K69Q, D105A, D105N. Screening of experimental conditions has been performed to obtain the expression of the MtbSD mutant proteins in the soluble fraction. In addition, an improved purification protocol was used to obtain homogeneous wild-type MtbSD and K69A mutant enzymes. We have carried out steady-state kinetic assays and spectrofluorimetric measurements for the wild type and the K69A enzymes. Results indicate that the conserved Lysine-69 residue in MtbSD plays a catalytic role and is not involved in substrate binding. Enzyme kinetics, site-directed mutagenesis and structural studies provide a framework on which to base the rational design of new and effective agents to treat tuberculosis.

Les mucopolysaccharidoses (MPS), un sous-groupe des maladies de surcharge lysosomale, sont causées par le défice d'une enzyme lysosomale intervenant dans le catabolisme des glycosaminoglycanes. L'absence de dégradation de ces molécules entraîne leur accumulation dans les lysosomes conduisant à une souffrance cellulaire. La plupart des MPS s'accompagnent de désordres neurologiques. Les formes sévères de MPS I (défice en α-L-iduronidase (IDUA)) se caractérisent par des manifestations neurologiques sévères. Actuellement, les approches thérapeutiques pour les MPSI s'agitent de la greffe de moelle osseuse (GMO) ou de l'injection d'enzyme purifiée (TRE). La greffe de moelle osseuse haplo-identique et géno-identique peut stopperle processus de la maladie y compris la neurodégénérescence mais les taux de mortalité et de morbidité sont élevés. L'enzymothérapie substitutive n'est pas efficace contre les atteintes du système nerveux central (SNC) car l'enzyme ne traverse pas la barrière hématoencéphalique. Les lésions de surcharge lysosomale étant diffuses dans tout le SNC, l'objectif est d'apporter l'enzyme dans la totalité de l'encéphale. Ceci peut se concevoir grâce à la thérapie génique in situ en injectant des vecteurs viraux directement dans le parenchyme cérébral par une méthode stéréotaxique, créant ainsi une source intracérébrale d'enzyme. Les vecteurs AAV sont capables de transduire les neurones et les cellules gliales du SNC. Dans ce travail nous présentons un protocol prè-clinique de thérapie génétique avec des vecteurs AAV2.5-IDUA injectés dans le striatum des souris agées de 6-semaines. L'injection a été bilaterale. Nos résultats indiquent que le transfert de gène induit une expression persistante de l'IDUA dans les cellules et entraîne une disparition des lésions de surcharge. Nous avons démontré l'efficacité et faisabilité de cette approche therapeutique pour traiter les lesions de surchage dans le cerveau des souris MPSI. Ainsi, nous proposons l'association de ce protocol de thérapie génique avec une thérapie systemique (TRE ou GMO), dans un age precoce, comme une approche thérapeutique adéquate et efficace pour le traitement global du MPS I. / As mucopolissacaridoses (MPS) constituem um subgrupo de doenças lisossomais de depósito, causadas pela deficiência em uma enzima lisossomal envolvida no catabolismo de glicosaminoglicanos. A ausência de degradação destas moléculas leva ao seu acúmulo nos lisossomas, conduzindo a um processo de dano ou degeneração celular. A maior parte das MPS apresenta desordens neurológicas. As formas serveras de MPS I [déficite em α-L-iduronidase (IDUA)] caracterizam-se por manifestações neurológicas severas. Atualmente, as abordagens terapêuticas para MPSI resumem-se ao transplante de medula óssea (TMO) e à terapia de reposição enzimática (TRE). O TMO haplo-idêntico ou geno-idêntico pode desacelerar ou mesmo parar o processo patológico, inclusive a neurodegeneração. As taxas de mortalidade e morbidade, entretanto, são elevadas. A TRE não é eficaz contra o comprometimento do sistema nervoso central (SNC), já que a enzima não pode atravessar a barreira hemato-encefálica. As lesões de depósito lisossomal são difusas por todo o SNC. Assim, o objetivo é fornecer a enzima para todo ou quase todo o encéfalo. Isto pode ser alcançado através de terapia gênica in situ, injetando vetores virais diretamente no parênquima cerebral, através de método estereotáxico, criando assim uma fonte intracerebral da enzima. Os vetores derivados de vírus adeno-associados (AAV) são capazes de transduzir os neurônios e as células gliais do SNC. Neste trabalho, nós apresentamos um protocolo pré-clínico de terapia gênica com vetor AAV2.5-IDUA injetado via intra-estriatal, bilateralmente, em camundongos com 6 semanas de vida. Nossos resultados indicam que a transferência gênica induz uma expressão persistente de IDUA nas células e leva à reversão das lesões de depósito lisossomal na quase-totalidade do SNC. Assim, nós demonstramos a eficácia e a viabilidade desta abordagem terapêutica na correção e/ou prevenção das manifestações do SNC em um modelo murino de MPSI. Assim, sugerimos que a associação deste protocolo de terapia gênica com uma terapia sistêmica (ERT ou TMO), em idade precoce, poderia ser uma abordagem terapêutica adequada e eficaz para o tratamento global da MPSI. / Mucopolysaccharidosis (MPS) is a type of lysosomal storage disease, caused by a deficiency in lysosomal enzymes involved in glycosaminoglycan catabolism. The absence of degradation of these molecules leads to cellular damage or degeneration process. The majority of MPSs shows neurological disorders. Severe forms of MPSI (defficiency in α-L-iduronidase (IDUA)) are characterized by severe neurological manifestations. Currently, therapeutic approaches for MPSI are limited to bone marrow transplantation (BMT) and enzyme replacement therapy (ERT). Haplo-identical or geno-identical BMT is able to slow or stop the pathological process, including neurodegeneration. However, mortality and morbitiy rates are high. The ERT is not efficient to correct or prevent central nervous system (CNS) damage, since the enzyme is not able to cross the blood-brain barrier. Storage lesions could be diffusely found in all CNS. Thus, the aim is the widespread delivery of the enzyme for the whole brain. This can be reached through in situ gene therapy, by injecting viral vectors directly in brain parenchyma, through stereotaxical methods, creating a brain source of the enzyme. AAV vectors are able to transduce neurons and glial cells of the CNS. In the present work, we have established a gene-therapy pre-clinical protocol with AAV2.5-IDUA vector which have been administered bilaterally in the striatum of 6-weeks old mice. Our results indicate that gene transfer leads to persistent IDUA expression in the cells and to the reversion of storage lesions in almost all the CNS. We have demonstrated the effectiveness and viability of this therapeutic approach in the correction or prevention of storage lesions in the MPSI mice brain. Thus, we suggest that the association of this gene therapy protocol with systemic therapy (ERT or BMT), in early age, could be an adequate and efective therapeutic approach to the global treatment of MPSI.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-06-20T19:51:33Z No. of bitstreams: 1 2017_CamilaXavierdeCarvalho.pdf: 1778759 bytes, checksum: 82b8a24841090d839f86a39a274d63c8 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-06-20T20:01:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_CamilaXavierdeCarvalho.pdf: 1778759 bytes, checksum: 82b8a24841090d839f86a39a274d63c8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-20T20:01:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_CamilaXavierdeCarvalho.pdf: 1778759 bytes, checksum: 82b8a24841090d839f86a39a274d63c8 (MD5) Previous issue date: 2017-06-20 / Eutanásia significa morte sem dor ou sem sofrimento, existem diversas técnicas preconizadas para tal objetivo. A eutanásia em animais tem seus procedimentos regulamentados pela Lei 11.794/08, da resolução do Conselho Federal de Medicina Veterinária (CFMV) nº714/02 e CONCEA/2015. A experimentação animal tem grande importância nas pesquisas científicas, contribuindo para o desenvolvimento da ciência e da tecnologia. Animais de várias espécies são utilizados como cobaias, sendo os camundongos os mais utilizados e os mais conhecidos cientificamente. O método de eutanásia em um estudo in vivo é uma importante escolha e deve seguir as orientações das associações internacionais que regulamentam a eutanásia como uma morte humanitária. A escolha de um método de eutanásia está relacionada à facilidade do método, seu baixo custo, eficácia, disponibilidade e baixo risco ao manipulador. Porém, todas estas qualidades não comprovam que o método de escolha seja o que menos causa sofrimento ao modelo experimental. O objetivo do estudo foi comparar a expressão gênica diferencial de cérebro de Mus musculus post-mortem através de estudo em larga escala de genes diferencialmente expressos em diferentes tipos de morte. Para tanto testou-se cinco diferentes metodologias de eutanásia: deslocamento cervical, guilhotina, overdose de xilazina/quetamina, overdose de tiopental e câmara CO2 em camundongos C57BL/6J. Dividiu-se os animais em cinco grupos de quatro indivíduos e após a eutanásia e constatação da morte seus cérebros foram coletados e RNA total extraído com uso do kit IllustraRNASpin GE. Todas as amostras de RNA passaram por avaliação de qualidade e concentração. O ensaio de microarranjos utilizou-se GeneChip® MoGene 2.0 ST Array Affymetrix (Santa Clara, CA, EUA) e GeneChip Scanner 7G Affymetrix. Observou-se 4.780 genes diferencialmente expressos no tecido cerebral para todos os tipos de morte e, entre estes, 65 descritos na literatura como gene expressos em situação de dor (PainGenesdb). Destes, quatro - Gfra2, Glra2, Grasp e Stoml3 – apresentaram diferenças significativas quando as metodologias foram comparadas par a par. Os métodos físicos (guilhotina e deslocamento cervical) apresentaram menores tempos de IMCO, CO2 tempo intermediário e xilazina/quetamina o maior desvio padrão para tempo de morte. Para tanto, este estudo observou que a eutanásia com deslocamento cervical foi método com melhor reprodutibilidade seguida da decapitação por guilhotina e que as metodologias de eutanásia estudada são similares desde que bem executadas. / Euthanasia means death without pain or without suffering, several techniques exist extolled for such an objective. The euthanasia in animals has their procedures regulated by the Law 11.794/08, of the resolution of Federal Council of Medicine Veterinary (CFMV) nº714/02 and CONCEA /2015. The animal experimentation has great importance in the scientific researches, contributing to the development of the science and of the technology. Animals of several species are used as animals tests, being the mice the more used and the more acquaintances scientifically. The euthanasia method in a study in vivo is an important choice and it should follow the orientations of the international associations that regulate the euthanasia as a humanitarian death. The choice of an euthanasia method is related to the easiness of the method, his/her low cost, effectiveness, readiness and low risk to the manipulator. However, all these qualities don't prove that the choice method is what fewer causes suffering to the experimental model. The objective of the study was to compare the expression differential gênica of brain of Mus musculus post-mortem through study in wide scale of genes diferencialmente expressed in different death types. For so much it was tested five different euthanasia methodologies: cervical displacement, guillotines, xilazina / quetamina overdose, tiopental overdose and camera CO2 in mice C57BL/6J. We divided the animals in five groups of four individuals and after the euthanasia and verification of their death brains they were collected and RNA extracted total with use of the kit IllustraRNASpin GE. All of the samples of RNA went by quality evaluation and concentration. The microarranjos rehearsal was used GeneChip® MoGene 2.0 ST Array Affymetrix (Santa Clara, CA, USA) and GeneChip Scanner 7G Affymetrix. It was observed 4.780 genes diferencialmente expressed in the cerebral fabric for all of the death types and, among these, 65 described in the literature as gene expressed in pain (PainGenesdb) situation. Of these, four - Gfra2, Glra2, Grasp and Stoml3. they presented significant differences when the methodologies were compared equal to equal. The physical (he/she guillotines and cervical displacement) methods presented smaller times of IMCO, CO2 intermediate time and xilazina / quetamina the largest standard deviation for time of death. For so much, this study observed that the euthanasia with cervical displacement was method with better reprodutibilidade following by the decapitation for guillotine and that the methodologies of studied euthanasia are similar since well executed.

O arroz é o alimento base para metade da população mundial. Entretanto, é uma fonte pobre em micronutrientes essenciais como Fe e Zn, que são removidos durante o processamento do grão para produção de alimento. Por essa razão, populações cujas dietas baseiam-se principalmente em arroz estão sujeitas à deficiência de Fe e Zn, que são as deficiências nutricionais mais comuns no mundo, afetando mais de dois bilhões de pessoas. Uma vez que as folhas-bandeira são uma das fontes de remobilização de metais para os grãos em desenvolvimento, a identificação dos mecanismos moleculares que contribuem no processo de transporte de metais das folhas-bandeira para os grãos pode ser útil em programas de biofortificação. Dessa forma, utilizamos duas abordagens diferentes para estudar esta questão. Primeiro, realizamos uma análise por hibridização subtrativa supressora (SSH) em folhas-bandeira de duas cultivares de arroz e isolamos 78 sequências induzidas no estágio de enchimento do grão (R5) em relação ao estágio de emergência da panícula (R3). A expressão diferencial de alguns genes selecionados (entre eles do fator de transcrição OsNAC5) foi confirmada por PCR quantitativo. Mostramos que a expressão de OsNAC5 é ativada em processos de senescência natural (envelhecimento) e induzida (escuro, aplicação de ABA, alta salinidade, frio e deficiência de Fe) e sua expressão não é afetada na presença de 6- benzilaminopurina (um inibidor de senescência) em condição de senescência induzida por escuro. A indução da expressão de OsNAC5 sob alta salinidade é abolida por nicotinamida, um inibidor dos efeitos do ABA. Este resultado e a presença de elementos cis-atuantes na região promotora do gene OsNAC5 sugere uma regulação dependente de ABA. Utilizando quatro diferentes cultivares de arroz, mostramos que a indução de OsNAC5 é maior e antecipada em folhas-bandeira e panículas de plantas da cultivar IR75862, que possui as maiores concentrações de Fe, Zn e proteínas nas sementes. Dessa forma, sugerimos que OsNAC5 é um fator de transcrição do tipo NAC dependente de ABA e associado à senescência, e sua função pode estar relacionada à remobilização de Fe, Zn e aminoácidos dos tecidos verdes para os grãos. Posteriormente, analisamos a expressão de 25 genes de arroz relacionados à homeostase de metais em folhas-bandeira de oito cultivares de arroz (com níveis contrastantes de Fe e Zn nos grãos) durante os estágios de emergência da panícula (R3) e enchimento do grão (R5). Nove destes genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 e OsNAC5) apresentaram correlação significativa entre os níveis de expressão em folhas-bandeira e as concentrações de Fe e Zn nas sementes. Assim, nosso estudo forneceu uma pequena lista de possíveis genes-alvo para manipulação da concentração de Fe e Zn em grãos de arroz. / Rice is the staple food for half of the world population. However, it is a poor source of essential micronutrients such as Fe and Zn, most of which are lost during grain processing for food production. For this reason, populations with monotonous diets consisting mainly of rice are especially prone to Fe and Zn deficiency, which are the most common and widespread nutritional disorders in the world, affecting more than 2 billion people. Since flag leaves are one of the sources of remobilized metals for developing seeds, the identification of the molecular players that might contribute to the process of metal transport from flag leaves to the seeds may be useful for biofortification purposes. In this way, we used two different appraches to address this issue. First, we conducted suppression subtractive hybridization (SSH) analysis in flag leaves of two rice cultivars and isolated 78 sequences up-regulated in flag leaves at the grain filling stage (R5) relative to the panicle exertion stage (R3). Differential expression of selected genes (including the OsNAC5 transcription factor) was confirmed by quantitative RT-PCR. We showed that OsNAC5 expression is up-regulated by natural (aging) and induced senescence processes (dark, ABA application, high salinity, cold and Fedeficiency) and its expression is not affected in the presence of 6-benzylaminopurine (a senescence inhibitor) under dark-induced senescence. Salt induction of OsNAC5 expression is abolished by nicotinamide, an inhibitor of ABA effects. This result and the presence of cis-acting elements in the promoter region of the OsNAC5 gene suggest an ABA-dependent regulation. Using four different rice cultivars, we showed that OsNAC5 up-regulation is higher and earlier in flag leaves and panicles of IR75862 plants, which have higher seed concentrations of Fe, Zn and protein. We suggest that OsNAC5 is a novel senescenceassociated ABA-dependent NAC transcription factor and its function could be related to Fe, Zn and amino acids remobilization from green tissues to seeds. We also analyzed the expression of 25 metal-related genes from rice in flag leaves of eight rice cultivars (showing contrasting levels of seed Fe and Zn) during panicle emergence (R3) and grain filling stage (R5). The expression level of nine of these genes (OsYSL6, OsYSL8, OsYSL14, OsNRAMP1, OsNRAMP7, OsNRAMP8, OsNAS1, OsFRO1 and OsNAC5) in flag leaves exhibited significant correlations with Fe and/or Zn concentrations in the seeds. In this way, our study has provided a short list of putative target genes to manipulate Fe and Zn concentrations in rice grains.

A endometriose é caracterizada pela presença de tecido endometrial localizado fora da cavidade uterina como peritônio, ovários e septo reto-vaginal e sua prevalência gira em torno de 6% a 10%. Mulheres com endometriose podem ser assintomáticas ou apresentar queixas de dismenorréia, dispareunia, dor pélvica crônica e/ou infertilidade. Em relação à patogênese, a teoria da menstruação retrógrada é bem aceita, embora alterações na biologia molecular do endométrio pareçam ser fundamentais para o desenvolvimento dos implantes endometrióticos. Evidências indicam que a endometriose está associada com aumento das concentrações de citoquinas pró-inflamatórias, fatores de crescimento e de angiogênese no fluido peritoneal (FP). Entre as citoquinas, a leptina é uma proteína derivada do gene da obesidade (Ob) que, além de ações no balanço energético, ingestão alimentar e controle do peso corporal também apresenta atividades imunorregulatórias e angiogênicas. A interleucina-6 (IL-6) é uma glicoproteína secretada por diversos tipos de células, incluindo macrófagos peritoneais e células estromais endometriais. A IL-6 é um marcador da resposta inflamatória de fase aguda e tem diversas atividades biológicas como indução da expressão do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), crescimento e diferenciação de linfócitos B e ativação de linfócitos T. Estas citoquinas podem ter um papel na endometriose através das suas propriedades inflamatórias e angiogênicas. No presente estudo, avaliamos a razão leptina/IMC e os níveis de IL-6 no soro e FP, bem como a expressão gênica da leptina e da forma longa do seu receptor (OB-RL) no endométrio tópico e ectópico de 30 mulheres com endometriose e 19 controles com pelve normal à laparoscopia. A razão leptina/IMC no soro foi significativamente maior no grupo com endometriose em relação às controles normais 0.61 (0.41 – 0.95) e 0.41 (0.22 – 0.71) P<0.05, respectivamente. A expressão gênica da leptina e do OB-RL foi significativamente maior no endométrio ectópico do que no endométrio tópico de pacientes com diferentes estágios da endometriose e controles. Uma correlação positiva entre níveis de RNAm da leptina e do OB-RL foi observada no endométrio ectópico e tópico das pacientes com endometriose e no endométrio tópico das controles. A imuno-histoquímica do OB-RL foi mais intensa nas células estromais e epiteliais do endométrio tópico das pacientes e controles com maiores níveis de leptina no FP. Os níveis de IL-6 no FP foram significativamente maiores no grupo com endometriose do que no controle e também nas pacientes com endometriose III e IV em comparação a I e II e controles. Houve uma correlação positiva e significativa entre os níveis de IL-6 no FP e o escore de gravidade da endometriose da American Society of Reproductive Medicine-revised (ASRM-r). Concluindo, nossos resultados sugerem que a razão leptina/IMC está associada com a presença da endometriose, o uso desta razão na prática clínica para predizer a presença de endometriose necessita ainda confirmação. Concentrações mais elevadas de leptina e OB-RL no endométrio ectópico sugerem uma modulação positiva entre a leptina e seu receptor ativo com um papel da leptina no desenvolvimento dos implantes endometrióticos. Finalmente, nosso estudo sugere que a IL-6 esteja associada com a presença da endometriose pélvica e sua gravidade. Estudos avaliando a expressão gênica e protéica da IL-6 no endométrio tópico e ectópico são necessários para melhor elucidar o papel desta citoquina na patogênese da endometriose. / Endometriosis is characterized by the presence of endometrial tissue, localized out of the uterine cavity, like peritoneum, ovaries, and rectum-vaginal septum, with a prevalence of about 6% to 10%. Women with endometriosis may be asymptomatic or present dysmenorrhea, dyspareunia, chronic pelvic pain and/or infertility. Concerning its pathogenesis, while the retrograde menses theory is well accepted, disruption on endometrial molecular mechanisms seems to be critical to development of endometrial ectopic implants. Evidences support that endometriosis is associated with abnormal levels of proinflammatory cytokines, growth and angiogenic factors on peritoneal fluid (PF). Leptin is an adipocyte derived protein and Ob-gene product. Besides the well established functions in energetic balance, food intake and body weight controls, leptin also presents imunoregulatory and angiogenic activities. Interleukin-6 (IL-6) is a glycoprotein secreted by several cell types, including peritoneal macrophages and endometrial stromal cells. IL-6 is a marker of the acute-phase inflammatory response and has several biologic activities including the induction of vascular endothelial growth factor (VEGF) expression, growth and differentiation of B lymphocytes and activation of T lymphocytes. These cytokines may play a role in endometriosis through its inflammatory and angiogenic proprieties. In the present study, we assessed leptin/BMI ratio and IL-6 levels in serum and peritoneal fluid (PF) and evaluated the gene expression of leptin and its long form receptor (OB-RL) in eutopic and ectopic endometrium of 30 women with endometriosis and 19 controls with normal pelvis at laparoscopy. Serum leptin/BMI ratio was significantly increased in endometriosis in comparison with controls [0.61 (0.41 – 0.95); 0.41 (0.22 – 0.71) P<0.05]. Leptin and OB-RL gene expression was significantly higher in ectopic endometrium than in eutopic endometrium of patients with different stages of endometriosis and controls. A positive correlation between leptin mRNA and OB-RL mRNA expression was observed in ectopic and eutopic endometrium in patients and in eutopic endometrium in controls. OB-RL immunostaining was more intense in stromal and epithelial cells of eutopic endometrium in patients and controls with higher PF leptin levels. IL-6 levels in the PF were found to be significantly higher in endometriosis group than in controls. In addition, IL6 levels in PF were significantly higher in patients with endometriosis III and IV in comparison to I and II and normal pelvis controls. There was a positive and significant correlation between IL-6 levels in PF and endometriosis ASRM-r score of severity. In conclusion, our data suggest that serum leptin/BMI ratio is associated with the presence of endometriosis, although the clinical use of leptin/BMI ratio to predict endometriosis presence still needs confirmation. Moreover, the increased expression of leptin and OB-RL in ectopic endometrium suggests a modulatory interaction between leptin and its active receptor and a role of leptin in the development of endometrial implants. In addition, our study suggests that IL-6 may be associated with the presence of pelvic endometriosis and its gravity. Further studies evaluating IL-6 gene and protein expression in topic and ectopic endometrium are needed to better elucidate the role of this cytokine on the pathogenesis of endometriosis.

Os caracteres produtivos são normalmente influenciados por muitos fatores, sendo difícil determinar todos os locos envolvidos em um fenótipo específico. Por isso, a seleção animal tem se baseado principalmente em uma estimativa direta ou indireta do fenótipo. A leptina é um importante regulador do metabolismo energético, da adiposidade e da reprodução. E por desempenhar diferentes funções, pode ser considerado um bom gene candidato para o estudo de associações entre marcadores moleculares e a eficiência reprodutiva ou ganho de peso. Em várias espécies, têm sido descritos diversos polimorfismos no gene da leptina, influenciando o ganho de peso, a reprodução, e outras características produtivas. Em bovinos, o STR IDVGA51 e o SNP LEPSau3A1, foram descritos por afetarem a performance reprodutiva, os alelos IDVGA51*181 e LEPSau3A1*2 estando associados a um aumento no intervalo entre partos de 79 e 81 dias, respectivamente, e os STRs BMS1074 e BM1500 afetam o ganho de peso, em vacas, no pós-parto: os alelos BMS1074*151 e BM1500*135 reduzindo e aumentando, respectivamente, o ganho de peso diário. Para confirmar o efeito ou não destes alelos na expressão do gene da leptina, este trabalho comparou os níveis de mRNA de leptina em animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 e BM1500*135, com os objetivos de: 1. Verificar as distribuições genotípicas e alélicas dos marcadores IDVGA51, BMS1074, BM1500 e LEPSau3A1, em uma amostra de 137 bovinos da raça Brangus-Ibagé, provenientes da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-Pecuária Sul, Bagé-RS). 2. Identificar, no rebanho, animais portadores e não portadores dos alelos IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 ou BM1500*135, previamente descritos como associados à eficiência reprodutiva e ganho de peso. 3. Avaliar os animais, criados em campo nativo, com pastagem natural, quanto à sua condição corporal. 4. Realizar procedimento cirúrgico, para obtenção de amostras de tecido adiposo subcutâneo e omental. 5. Dosar os níveis de mRNA de leptina nos adipócitos destes dois tecidos, através do método quantitativo em tempo real (Real-Time RT-PCR), comparando a expressão do gene LEP entre indivíduos portadores e não portadores dos alelos de predisposição a ganho de peso e desempenho reprodutivo. / Production characters are usually determined by multifactorial factors being difficult to determine all the individual loci involved in a specific phenotype. Therefore, animal selection had been so far applied based mainly on phenotype direct and indirect estimates. Leptin is an important regulator of energy metabolism, adiposity and reproduction. Due to these different roles it could be considered a good candidate gene for the study of association between molecular markers and reproductive efficiency or weight gain. Several polymorphisms at the leptin gene have been described as influencing weight gain, reproduction, and other productive traits in different species. In cattle, IDVGA51 STR and LEPSau3A1 SNP had been described as affecting reproductive performance, the alleles IDVGA51*181 and LEPSau3A1*2 increasing calving interval by about 79 and 81 days, respectively, and BMS1074 and BM1500 STRs seem to be related to weight gain, in postpartum cows, the alleles BMS1074*151 and BM1500*135 reducing and increasing, respectively, the daily weight gain. In order to confirm or not their effect on leptin gene expression, this paper compares the leptin mRNA levels on carriers and non-carriers animals of the IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 and BM1500*135 alleles, with the objectives: 1. To verify genotype and allele frequencies of IDVGA51, BMS1074, BM1500 STRs e LEPSau3A1 SNP in a sample of 137 Brangus- Ibagé cows from the Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA-Pecuária Sul, Bagé-RS). 2. To identify in this herd carriers and non carriers of IDVGA51*181, LEPSau3A1*2, BMS1074*151 or BM1500*135 alleles, previously described as associated to reproduction or weight gain. 3. To evaluate the body score conditions of the animals managed on native pasture in an extensive livestock system. 4. To perform surgery in these animals to obtain adipose omental and subcutaneous tissues. 5. To evaluate adipocyte mRNA levels of these two tissues, through Real-Time RT-PCR, comparing the values between animals with and without these alleles.

Para produção de vetores virais utiliza-se uma linhagem celular empacotadora (packaging cell line – PCL), que é transfectada com os vetores componentes do sistema. As partículas virais produzidas são, posteriormente, liberadas no sobrenadante de cultura, que é processado, aliquotado e estocado. À exceção de sistemas oncovirais, baseados no vírus da leucemia murina (MLV), não existem PCLs estáveis disponíveis para emprego de vetores baseados em HIV em nível clínico. Desse modo, a transfecção transiente tem sido explorada com o intuito de maximizar a produção de vírus e de minimizar os riscos envolvendo a metodologia. Para tal finalidade, outras linhagens celulares estão sendo testadas como PCL, e variações nos protocolos de transfecção têm sido propostas. Dentro desse contexto, a avaliação da possibilidade de produção de vetores virais em linhagem de célula tronco mesenquimal murina, produzida em nosso laboratório, contribui para a investigação da aplicação potencial dessas células em terapia gênica. Os resultados mostraram que essa linhagem produz vírus em quantidades equivalentes às tradicionais PCL empregadas, sem apresentar aparente efeito sinsicial oriundo da toxicidade de proteínas virais. Tal característica permite que o período de coletas seja expandido, sem comprometimento significativo dos títulos, dentro das normas de biossegurança. Infere-se a partir dessas observações que essa linhagem possa ser uma alternativa interessante como PCL estável. Além dessas características, a sensibilidade à infecção pelos vírus recombinantes sugere que a mesma possa ser também utilizada nos processos de titulação viral. Perspectivas futuras incluem a comparação direta com uma linhagem de célula tronco mesenquimal humana e a caracterização detalhada dos vírus produzidos em ambas linhagens. / The production of viral vectors is done with packaging cell lines (PCL), which are transfected with the vectors composing the viral system. The viral particles produced are liberated in the cell culture medium which is then harvested, processed and stored. Stable PCLs are available for the production, in clinical level, of oncoviral vectors based on Moloney Leukemia Virus; this is not the case, however, for HIV-based vectors. Transient transfection has, thus, been explored with the objective of maximizing virus production and minimizing the risks concerning this methodology. Different cell lines are being tested as PCL and variations in transfection protocols are being proposed. This work aimed at the evaluation of the potential presented by a murine mesenchymal stem cell line, produced in our laboratory, to be employed as PCL for the production of viral vectors. Our results showed that this cell line produces titers as high as the traditional PCL based on 293T cells, and do not present the synsycial effects caused by toxic viral proteins which limits the use of other cell lines. This has allowed extended periods of harvesting, without compromising viral titers. This cell lineage may represent an interesting alternative as stable PCL to be used in retroviral-mediated gene therapy. Besides these aspects, the sensibility to lentivirus infection suggests that it may be used in titering process as well. Future perspectives include the comparison with a human mesenchymal stem cell line and the full characterization of the viruses produced in both lineages.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Nayara Silva (nayarasilva@bce.unb.br) on 2016-06-23T21:08:18Z No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-06-30T18:43:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-30T18:43:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_MarcoAntôniodeOliveira.pdf: 1771418 bytes, checksum: b431a54249eeded83422448470f561fb (MD5) / Durante o processo de interação patógeno-hospedeiro ambos os organismos envolvidos sofrem uma ampla reprogramação do padrão global de expressão gênica, o que tem sido mostrado ser crucial na definição da resultante dessa interação. Dentre os inúmeros genes com expressão alterada no hospedeiro encontram- se aqueles que codificam microRNAs (miRNAs), um grupo de pequenas moléculas de RNA regulatórias atuante nos mais diversos processos celulares, incluindo a regulação da resposta imune tanto inata quanto adaptativa. Embora vários trabalhos venham mostrando a importância dos miRNAs na resposta imune de hospedeiros mamíferos a bactérias e vírus, pouco se sabe a respeito do papel desses reguladores em infecções fúngicas. Nesse sentido, buscamos analisar o papel de miRNAs na resposta imune inata de hospedeiros murinos à infecção por Paracoccidioides brasiliensis, um dos agentes etiológicos da Paracoccidioidomicose (PCM), considerada a micose sistêmica de maior prevalência na América Latina. Os ensaios iniciais com macrófagos peritoneais de camundongos das linhagens A/J e B10.a, modelos definidos de resistência e suscetibilidade à PCM, respectivamente, e leveduras do isolado virulento Pb18 de P. brasiliensis revelaram o aumento dos cinco miRNAs avaliados: miR-125b, miR-132, miR-146a, miR-155 e miR-455, sugerindo a participação dessas moléculas na regulação da resposta a P. brasiliensis. No entanto, a ausência de um padrão de indução distinto entre as duas linhagens possivelmente indica que os miRNAs avaliados não possuem papel determinante no estabelecimento de respostas distintas entre as duas linhagens nas fases iniciais da interação com o fungo. Devido seu papel chave na regulação da resposta imune e aos altos níveis de acúmulo diferencial em resposta a P. brasiliensis aqui descritos, o miRNA miR-155 foi escolhido para análises mais abrangentes envolvendo sua biogênese e ação na modulação de transcritos alvo. O acúmulo do precursor pri-miR-155 observado sugere uma maior transcrição do gene MIR155HG contribuindo em parte para os altos níveis do miRNA maduro. Por sua vez, o aumento na razão entre os níveis de miR-155-3p e miR-155-5p pode indicar uma modulação do grau de estabilidade da fita 3p e regulação de seus processos de decaimento. A avaliação dos níveis de transcritos alvo de miR-155-5p forneceu resultados variáveis. Enquanto o aumento de TNFα e redução de SHIP1 estão de acordo com o já descrito na literatura em resposta a miR-155, o aumento nos níveis de SOCS1 e SOCS3, negativamente regulados pelo miRNA, demonstra as dificuldades de se estabelecer paralelos diretos entre os níveis de um miRNA e seus alvos em um contexto de alta reprogramação do padrão global de expressão gênica. Também foram realizados ensaios de infecção empregando macrófagos derivados de medula de animais nocautes para os genes de TLR4 e dectina-1 para avaliação da sua participação na modulação dos níveis de miR-155-5p. Os resultados obtidos evidenciam a sinalização desses receptores de membrana como reguladores negativos, direta ou indiretamente, de miR-155-5p em resposta a P. brasiliensis. Para possibilitar o estudo do papel funcional de miRNAs na resposta imune, experimentos foram realizados visando validar um modelo de silenciamento de miRNAs através da transfecção in vitro de inibidores (antimiR). Resultados preliminares utilizando sondas marcados com fluorescência e inibidores de um miRNA controle demonstraram uma alta eficiência de transfecção de BMDMs e eficácia no silenciamento do miRNA controle let-7. Desta forma, os resultados aqui apresentados são de relevância por sugerirem, pela primeira vez, a participação de miRNAs na regulação de vias envolvidas na resposta imune inata a P. brasiliensis. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / During host-pathogen interactions both organisms go through a wide genetic reprogramming, a process believed to be crucial in the establishment of the infection. Amongst all the host’s genes showing this altered expression are the ones encoding for microRNAs (miRNAs), small regulatory RNA molecules acting on many biological processes, including regulation of both innate and adaptive immune responses. Although the importance of microRNAs in the immune response to bacteria and viruses by mammalian hosts has been reported by many groups, little is known about their participation in fungal infections. In this context, we aimed at analyzing the role of microRNAs in the innate immune response of murine hosts to infection by Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of Paracoccidioidomycosis (PCM) – the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Initial infection assays performed with peritoneal macrophages from resistant (A/J) and susceptible (B10.a) mouse strains and yeast cells from the virulent isolate Pb18 of P. brasiliensis showed an increase of the levels of five miRNAs: miR-125b, miR-132, miR-146a, miR-155 e miR-455, indicating a participation of these molecules on the regulation of the response to P. brasiliensis. However, the similar patterns of miRNA induction on both strains possibly suggests that the miRNAs studied do not have a determinant role in the establishment of the distinct inflammatory responses presented by the two strains in the early stages of interaction with the fungus. Therefore, we chose to perform the following analyses just with the A/J strain. miR-155 was selected for a more complete characterization of its biogenesis and target transcripts regulation based on its key role in regulating many aspects of the immune response and the high levels of differential accumulation in response to P. brasiliensis observed by us. The accumulation of the precursor pri-miR-155 observed suggests an influence of the transcription of the gene MIR155HG on the increase in the mature miRNA levels. The changes in the miR-155-3p to miR-155-5p ratio following P. brasiliensis infection may indicate an altered stability degree and turnover rate of the 3p strand. The assessment of the levels of miR-155-5p target mRNAs showed varying results. While upregulation of TNFα and downregulation of SHIP1 are in accordance with the expected effects of miR-155-5p, the high levels of SOCS1 and SOCS3, negatively regulated by this miRNA, reflect the difficulties in establishing direct parallels between the levels of a miRNA and its targets in a context of broad genetic reprogramming. Finally, we performed infection assays using BMDM from TLR4 or dectin-1 knockout mice to assess the role of these receptors in the regulation of miR-155 levels. Results show that in the absence of the receptors miR-155 accumulates in even higher levels, pointing the signaling by TLR4 and dectin-1 as negative regulators, directly or indirectly, of miR-155 in respose to P. brasiliensis. In order to allow the study of the functional role of miRNAs in the immune response, we tested a model for miRNA silencing by in vitro transfection of miRNA inhibitors (antimiR). Preliminary results using fluorescent-labelled antimiR and inhibitors for a control miRNA showed a high transfection efficiency in primary macrophages and proper effect on silencing the control miRNA let-7. In conclusion, the results presented are of great significance for suggesting, for the first time, the involvement of miRNAs in the regulation of the innate immune response to Paracoccidioides brasiliensis.