Cardiovascular diseases are among the leading causes of death in North America. Currently, there are no effective treatment options for directly repairing the damaged myocardial tissue. Therefore, cell-based therapies utilizing cardiomyocytes generated from stem cells to replace necrotic tissue will be a promising approach. However, the molecular mechanisms regulating stem cell differentiation into cardiomyocytes are not fully understood. Since GATA-4 is one of the primary regulators of cradiomyogenesis, we investigated the molecular basis of GATA-4 expression during the early stages of stem cell differentiation. Using chromatin immunoprecipitation, we have observed the direct involvement of p300 in GATA-4 gene expression. We have also examined the importance ofhHistone acetylation and acetyltransferase activity on GATA-4 expression during the early stage of cardiomyogensis using the histone deactylase inhibitor Valproic Acid and the acetyltransferase inhibitor Curcumin respectively.

Background: Erythropoietin (EPO) can reduce myocardial ischemia/reperfusion (I/R) injury. However, the cellular mechanisms have not been elucidated entirely. The present study was to investigate whether transcription factor GATA-4 could be involved in EPO-induced cardioprotection when it was administered after ischemia, immediately before reperfusion. Methods and results: Male Balb/c mice treated with or without EPO were subjected to ischemia (45 min) followed by reperfusion (4 h). TTC staining showed that the infarct size in EPO-treated mice was significantly reduced compared with untreated I/R mice (P < 0.05). Echocardiography examination suggested that EPO administration significantly improved cardiac function following I/R. TUNEL assay indicated that EPO treatment decreased apoptosis. EPO administration also significantly increased the level of nuclear GATA-4 phosphorylation in the myocardium which was positively correlated with the reduction of myocardial infarction. In vitro hypoxia/re-oxygenation study showed that EPO treatment increased the levels of phospho-GATA-4 and decreased cardiomyocyte apoptosis. More significantly, blocking GATA-4 by transfection of a dominant-negative form of GATA-4 (dnGATA-4) abolished EPO-induced cardioprotective effects. Conclusion: EPO administration after ischemia, just before reperfusion induced cardioprotection and stimulated GATA-4 phosphorylation. Activation of GATA-4 may be one of the mechanisms by which EPO induced protection against myocardial I/R injury.

Mit dem Ziel, die denaturierende Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (DHPLC) als standardisierte Methode in der molekulargenetischen Diagnostik des TBX1-Gens einzuführen, wurde an 35 Patienten mit begründetem klinischen Verdacht oder Nachweis eines congenitalen Herzfehlers die Mutationsanalyse etabliert und durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse bestätigten die kosteneffiziente und zugleich einfache Durchführung des Verfahrens. In der Evaluation wurde für die DHPLC zudem eine hohe Sensitivität und Spezifität nachgewiesen, womit der zukünftige Einsatz dieser Methode im routinemäßigen Mutationsscreening gerechtfertig ist. Mittels DHPLC konnten im Rahmen der vorliegenden Dissertation insgesamt 14 verschiedene Veränderungen im TBX1-Gen identifiziert und in der anschließenden Sequenzanalyse als Polymorphismen (Normvarianten) charakterisiert werden.

Mit dem Ziel, die denaturierende Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (DHPLC) als standardisierte Methode in der molekulargenetischen Diagnostik des TBX1-Gens einzuführen, wurde an 35 Patienten mit begründetem klinischen Verdacht oder Nachweis eines congenitalen Herzfehlers die Mutationsanalyse etabliert und durchgeführt. Die erzielten Ergebnisse bestätigten die kosteneffiziente und zugleich einfache Durchführung des Verfahrens. In der Evaluation wurde für die DHPLC zudem eine hohe Sensitivität und Spezifität nachgewiesen, womit der zukünftige Einsatz dieser Methode im routinemäßigen Mutationsscreening gerechtfertig ist. Mittels DHPLC konnten im Rahmen der vorliegenden Dissertation insgesamt 14 verschiedene Veränderungen im TBX1-Gen identifiziert und in der anschließenden Sequenzanalyse als Polymorphismen (Normvarianten) charakterisiert werden.

GATA-4 est un facteur de transcription essentiel dans la formation du tube cardiaque primitif. Dans l'intestin, GATA-4 joue un rôle dans le développement et dans le maintien de l'identité jujéno-iléale. L'analyse par micropuce à ADN effectuée sur des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 suggère un rôle de GATA-4 dans la réponse inflammatoire et des études antérieures réalisées au laboratoire ont permis de confirmer l'implication de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire C/EBPdépendante. L'objectif de mon projet était de déterminer si GATA-4 module la réponse inflammatoire par d'autres mécanismes que ceux déjà découverts au laboratoire et de générer des mutants de GATA-4 pour caractériser l'implication de certains domaines et sites spécifiques de GATA-4 dans la modulation de la réponse inflammatoire intestinale. Des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4 ou des mutants de GATA-4 de façon stable, induites ou non à l'IL-1[béta] ont été utilisées comme modèle. L'activation des voies MAPK et Akt a été vérifiée par immunobuvardage de type Western. La liaison à l'ADN des facteurs de transcription AP-1, C/EBPs et NF-[kappa]B a été vérifiée par gel de rétention. L'expression de certains gènes de réponse inflammatoire a été vérifiée par RT-PCR. Finalement, des lignées cellulaires exprimant des mutants de GATA-4 ont été partiellement caractérisées. Mes résultats montrent qu'une surexpression de GATA-4 dans les IEC-6 traitées à l'IL-1[béta] réduit la phosphorylation de p42/p44 et d'Akt. Les facteurs de transcription AP-1, C/EBP et NF-[kappa]B sont davantage recrutés à l'ADN. La nature de leurs complexes semble être également affectée. Cette induction de liaison coïncide avec une baisse d'expression des gènes pro-inflammatoires CCL5 et iNOS. La caractérisation des mutants de GATA-4 suggère que le premier doigt de zinc (216-240) pourrait moduler la morphologie cellulaire et que la région basique (294-336) pourrait contribuer à la vitesse de prolifération augmentée des cellules IEC-6 surexprimant GATA-4. En somme, mes résultats suggèrent que GATA-4 pourrait participer à l'instauration d'une tolérance immunitaire prenant place lors de la différenciation entérocytaire.

The regulation of cardiac-specific genes such as GATA-4 and its co-factor FOG-2 is paramount for normal heart development and function. Indeed, those mechanisms that regulate GATA-4 and FOG-2 function, such as nuclear transport and the post-translational modification of SUMOylation, are of critical importance for cardiogenesis. Therefore the aims of this study were to: i) elucidate the nuclear transport mechanisms of GATA-4; ii) determine the function of SUMOylation on the biological activity of both GATA-4 and FOG-2; and iii) examine how these mechanisms impact on the role of GATA-4 and FOG-2 in cardiac hypertrophy. Firstly, we characterised a non-classical nuclear localisation signal that mediates active import of GATA-4 in both HeLa cells and cardiac myocytes. Fine mapping studies revealed four crucial residues within this region that interacted with importin ?? to mediate GATA-4 import via the non-classical import pathway. In addition, a cardiac myocyte-specific CRM1-dependent nuclear export signal, which consists of three essential leucine residues, was identified. We also investigated the residues of GATA-4 that are responsible for its DNAbinding activity and therefore transcriptional control of cardiac-specific genes. Secondly, we demonstrated that SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 is exclusively carried out by SUMO-2/3. Moreover, SUMOylation is involved in the nuclear localisation of both GATA-4 and FOG-2 in cardiac myocytes as well as the transcriptional regulation of cardiac-specific genes, such as cardiac troponin I. Finally, and perhaps most biologically significant, we showed that nuclear transport as well as SUMOylation of GATA-4 is imperative for the ability of GATA-4 to induce cardiac hypertrophy. Moreover, it was determined that FOG-2 SUMOylation is involved in the ability of FOG-2 to protect against cardiac hypertrophy. In conclusion, the current study provides detailed information on the nuclear transport pathways of GATA-4 as well as the SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 and the role these two mechanisms play in gene transcription and cardiac hypertrophy.

The regulation of cardiac-specific genes such as GATA-4 and its co-factor FOG-2 is paramount for normal heart development and function. Indeed, those mechanisms that regulate GATA-4 and FOG-2 function, such as nuclear transport and the post-translational modification of SUMOylation, are of critical importance for cardiogenesis. Therefore the aims of this study were to: i) elucidate the nuclear transport mechanisms of GATA-4; ii) determine the function of SUMOylation on the biological activity of both GATA-4 and FOG-2; and iii) examine how these mechanisms impact on the role of GATA-4 and FOG-2 in cardiac hypertrophy. Firstly, we characterised a non-classical nuclear localisation signal that mediates active import of GATA-4 in both HeLa cells and cardiac myocytes. Fine mapping studies revealed four crucial residues within this region that interacted with importin ?? to mediate GATA-4 import via the non-classical import pathway. In addition, a cardiac myocyte-specific CRM1-dependent nuclear export signal, which consists of three essential leucine residues, was identified. We also investigated the residues of GATA-4 that are responsible for its DNAbinding activity and therefore transcriptional control of cardiac-specific genes. Secondly, we demonstrated that SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 is exclusively carried out by SUMO-2/3. Moreover, SUMOylation is involved in the nuclear localisation of both GATA-4 and FOG-2 in cardiac myocytes as well as the transcriptional regulation of cardiac-specific genes, such as cardiac troponin I. Finally, and perhaps most biologically significant, we showed that nuclear transport as well as SUMOylation of GATA-4 is imperative for the ability of GATA-4 to induce cardiac hypertrophy. Moreover, it was determined that FOG-2 SUMOylation is involved in the ability of FOG-2 to protect against cardiac hypertrophy. In conclusion, the current study provides detailed information on the nuclear transport pathways of GATA-4 as well as the SUMOylation of both GATA-4 and FOG-2 and the role these two mechanisms play in gene transcription and cardiac hypertrophy.

Hintergrund: Der Transkriptionsfaktor GATA-4 ist für die normale Entwicklung des Endoderms essentiell. Mausmutanten mit einer homozygoten Deletion des gata-4 Gens versterben zwischen den embryonalen Tagen 8.5 - 10.5 aufgrund einer Störung der ventralen Morphogenese und der Ausbildung des Herzschlauches. Zielsetzung und experimentelle Strategie: Um die Bedeutung von GATA-4 auch nach der embryonalen Entwicklung untersuchen zu können, wurden doppelt-transgene Mäuse generiert. Diese Mausmutanten exprimieren einen Tetrazyklin-Repressor und eine gegen GATA-4 gerichtete short hairpin RNA (shGATA-4). Die Expression der shGATA-4 steht dabei unter der Kontrolle eines H1-Promotors, welcher durch ein Tetrazyklin-Operator Element modifiziert wurde. Dadurch ist das System durch Doxyzyklin induzierbar. Ergebnisse: Die Integration der Transgene in dem Genom der Maus wurde durch Southern-Blot Analyse nachgewiesen. Die Expression der shGATA-4 wurde durch die Applikation von Doxyzyklin über das Trinkwasser (20 mg/ml) induziert. Langzeitstudien am Herzen haben dabei eine signifikante Suppression von GATA-4 nach 38 Tagen ergeben (80 %). Diese Reduktion konnte durch Western-Blot Analyse bestätigt werden. Obwohl die Expression verschiedener Zielgene von GATA-4 (ANF, BMP-4) ebenfalls herunterreguliert war, fiel bei den transgenen Mäusen kein kardialer Phänotyp auf. Jedoch wurde die GATA-4 Expression in den Hoden und Ovarien transgener Mäuse supprimiert, nachdem shGATA-4 durch die Applikation von Doxyzyklin induziert wurde. Weiterführende Untersuchungen an adulten Mäusen zeigten eine GATA-4 Reduktion von 20 % auch in nicht mit Doxyzyklin-induzierten Mausmutanten. Diese Reduktion könnte durch einen sog. leaky-Effekt des shGATA-4 Transgens hervorgerufen worden sein, wodurch die stark eingeschränkte Fertilität dieser Mauslinie erklärt werden könnte. Interessanterweise haben ca. 10 % der mit Doxyzyklin behandelten transgenen Weibchen Ovarial-Teratome ausgebildet. Histologisch wiesen diese Teratome überwiegend (neuro-) ektodermale, vereinzelt mesodermale und nahezu keine endodermalen Strukturen auf. Schlussfolgerung: In diesem Modell hat die Suppression von GATA-4 keinen Einfluss auf die Funktion des Herzens der adulten Maus. Jedoch scheint GATA-4 für die Fertilität der Maus von großer Bedeutung zu sein. Weiterhin scheint die Suppression von GATA-4 mit der Ausbildung von Ovarial-Teratomen assoziiert zu sein. / Background: The transcription factor GATA-4 is crucial for the normal endodermal development. In mice, homozygous deficiency of GATA-4 causes defects in ventral morphogenesis and heart tube formation, resulting in embryonic death between day e8.5 and e10.5. Aim and experimental strategy: To analyze the implication of GATA-4 beyond embryonic development a double transgenic mouse expressing the tetracycline repressor (TetR) and an inducible small interfering RNA directed against GATA-4 was generated. This expression construct contains a H1 promoter modified with a tetracycline operator upstream of the coding region for the GATA-4 short hairpin RNA (shGATA-4). Results: The integration of the transgenes in FvB mice (H1:G4/TetR) was confirmed by Southern blot. To induce the expression of the shGATA-4 construct, transgenic mice were treated with doxycycline (20 mg/ml drinking water). In longitudinal analysis, most efficient GATA-4 suppression was detected after 38 days. Quantitative PCR revealed a GATA-4 reduction of about 80 % in the heart, if normalized against the wildtype. Reduction of GATA-4 was confirmed by Western Blot. Although GATA-4 target genes (ANP, BMP-4) were down regulated, the animals showed no clinical phenotype. In opposite to wildtype mice, GATA-4 expression was undetectable in the ovaries and testis of transgenic mice with induced shGATA-4. Additional analysis in adult transgenic mice, which were not treated with doxycycline, also showed a reduction of GATA-4 expression of about 20 %, probably caused by a leaky-effect of the transgene. This may explain the significantly reduced fertility of the colony. Importantly, 10 % of transgenic females treated with doxycycline developed ovarian teratomas. Histological examination of teratomas showed predominantly (neuro-) ectodermal and to a lower degree mesodermal, but almost no endodermal compounds. Conclusions: GATA-4 reduction in the adult murine heart is – at least to a certain degree – clinically redundant. GATA-4 seems to be required for normal fertility. In our model GATA-4 deficiency seems to be associated with an increased risk for developing ovarian teratoma.

Abstract Cardiovascular diseases are the leading causes of death in the developed countries and their incidence is not expected to decrease in the future. There is a lifetime risk of one in five of developing heart failure, which still has poor prognosis and current treatments only cover part of the pathophysiology behind this syndrome. Pathological processes contributing to heart failure include cardiac hypertrophy and remodeling, which involves neurohumoral activation, reactivation of fetal genes, impaired Ca2+ cycling, increased apoptosis, and increased fibrosis. Intracellular signalling pathways and transcription factors mediating the response to various extracellular stresses have a key role in the regulation of myocardial remodeling and they are investigated in order to develop new approaches for the treatment of heart failure. The aim of this thesis was to elucidate roles of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and transcription factor GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function in cell cultures, and in hearts ex vivo and in vivo. The main findings were that (i) Inhibition of p38α MAPK enhanced function of sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ -ATPase and thus cardiac contractility by increasing phosphorylation of protein phosphatase inhibitor-1 and phospholamban, (ii) p38 MAPK isoforms p38α and p38β regulated promoter activity of B-type natriuretic peptide via distinct pathways, (iii) p38α and p38β MAPKs also had different effects on gene expressions related to fibrosis and hypertrophy, and (iv) p38 and ERK1/2 MAPKs mediated stretch-induced activation of GATA-4 by phosphorylation at Ser 105. GATA-4 also seems to be regulated by ubiquitination. This study provides novel data of p38 MAPK and GATA-4 in the regulation of cardiomyocyte function. Inhibition of p38α MAPK could be beneficial in the treatment of heart failure. Also GATA-4 is a potential target for treatment of cardiovascular diseases. / Tiivistelmä Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa, eikä niiden ilmaantuvuus tule vähenemään lähitulevaisuudessa. Elinikäinen riski sairastua sydämen vajaatoimintaan on 20 %, ja sydämen vajaatoiminnan ennuste on edelleen huono. Nykyisillä hoitomuodoilla voidaan puuttua vain osittain sydämen vajaatoiminnan patofysiologisiin mekanismeihin. Sydämen vajaatoiminnan kehittymiseen liittyvät sydänlihaksen liikakasvu ja uudelleenmuovautumisprosessi, johon liittyy neurohumoraalinen aktivaatio, sikiöaikaisten geenien uudelleenilmentyminen, häiriöt solunsisäisessä Ca2+-viestinnässä sekä lisääntynyt ohjelmoitu solukuolema ja sidekudoksen muodostuminen sydämeen. Solunsisäisillä viestinvälitysketjuilla sekä transkriptiotekijöillä, jotka vastaavat solunulkoisten ärsykkeiden välittämisestä solun sisällä, on keskeinen rooli edellämainittujen prosessien säätelyssä. Uusien lähestymistapojen kehittäminen sydämen vajaatoiminnan hoitoon edellyttää myös solunsisäisen viestinvälityksen ja geenien säätelyn mekanismien selvittämistä. Tämän väitöstyön tavoite oli selvittää p38 mitogeeniaktivoituvan proteiinikinaasin (p38 MAPK) ja transkriptiotekijä GATA-4:n merkitystä sydämen vajaatoiminnan patogeneesissä soluviljelymalleissa. Päälöydöksiä olivat: (i) p38α MAPK -isoformin estäminen paransi kalsiumia solulimakalvostoon pumppaavan SERCA2a:n toimintaa ja sydänlihassolun supistumiskykyä lisäämällä fosfolambaanin ja proteiinifosfataasi-inhibiittori-1:n fosforylaatiota. (ii) p38 MAPK isoformit p38α ja p38β säätelivät B-tyypin natriureettisen peptidin geenin promoottorialuetta erillisten reittien kautta. (iii) p38α ja p38β isoformit vaikuttivat myös eri tavoin sydämen sidekudoksen muodostumiseen ja hypertrofiaan liittyvien geenien ilmentymiseen. (iv) p38 ja ERK1/2 välittävät venytyksen aiheuttaman GATA-4:n aktivaation fosforyloimalla seriini-105 fosforylaatiopaikan. Lisäksi GATA-4:n toimintaa säädellään ubiquitinaation avulla. Tämä tutkimus tuo uutta tietoa p38 MAPK:n ja GATA-4:n rooleista sydämen vajaatoiminnan kehittymisessä. p38α-isoformin toiminnan estäminen voisi olla hyödyllinen hoitomuoto sydämen vajaatoiminnassa. Myös GATA-4 on potentiaalinen lääkehoidon kohde sydänsairauksien hoidossa.