Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Panulirus argus (Latreille, 1804) é uma das principais espécies de lagosta no Atlântico, sendo um dos maiores recursos pesqueiros do Atlântico Ocidental, onde apresenta um alto valor comercial. A forte explotação da espécie resulta em uma grande pressão sobre suas populações. Recentemente, foi descoberto que sob o binômio P. argus estão contidas duas espécies crípticas que ocorrem em alopatria, uma na região do Caribe e outra na costa brasileira. Esta tese tem como objetivo estudar como se estruturam geneticamente as populações dessas duas espécies, com o propósito de fornecer mais informações para a determinação de estoques e um correto manejo das espécies, e analisar os processos históricos evolutivos que moldaram suas histórias demográficas. Para tal, foram estudados dois marcadores mitocondriais (região controle e o gene da Citocromo Oxidase I) e loci de microssatélites de indivíduos de 7 regiões do Caribe (Florida, Bahamas, Turks e Caicos, Porto Rico, Cuba, Colômbia e Venezuela) e 11 estados do Brasil (Pará, Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo). Dentro de cada espécie foram observadas duas linhagens mitocondriais diferentes, que co-ocorriam, de maneira homogênea, ao longo de suas distribuições. Hipotetiso que essas linhagens foram formadas a partir de um evento de vicariância com contato secundário ou como consequência de um efeito gargalo seguido de expansão. As duas linhagens são evidentes nas sequências da região controle mitocondrial, mas no gene da COI foram evidentes apenas em P. cf. argus do Caribe. As linhagens do Brasil se separaram há aproximadamente 233 - 288 mil anos e cada uma sofreu expansão em tempos diferentes, a primeira se expandiu há 100 mil anos e a segunda linhagem há 50 mil anos. As linhagens do Caribe se separaram cerca de 1 milhão de anos atrás e possuem o mesmo tempo de expansão, 50 mil anos. Os microssatélites não revelaram subdivisão populacional para nenhuma das duas espécies, porém os marcadores, juntos, sugeriram um fluxo gênico diferenciado entre localidades expostas a diferentes correntes marítimas. Considerando que essas lagostas são intensamente explotadas, é importante ser cuidadoso no momento de definir estoques pesqueiros. Para a espécie do Brasil, dois estoques pesqueiros foram sugeridos, o primeiro do Pará à Bahia e o segundo do sul da Bahia a São Paulo. Para a espécie do Caribe, foi mantida e reforçada a hipótese de quatro estoques sugerida pela FAO (Norte, Sul, Centro-Norte e Centro-Sul). / Panulirus argus (Latreille, 1804) is one of the main lobster species in the Atlantic, and one of the largest fisheries in the western Atlantic, with a high commercial value. The heavy exploitation of the species results in much pressure on its populations. Recently, it was discovered that under the name P. argus there are two cryptic species that occur in allopatry, one in the Caribbean and the other on the coast of Brazil. This thesis studies the population genetic structure of those two species with the purpose of providing more information to delimitate stocks for fisheries management, and for understanding the historical processes that have shaped their evolutionary demographic histories. For this, we analysed two mitochondrial markers (control region and the Cytochrome Oxidase I gene) and microsatellite markers of individuals from 7 localities in the Caribbean (Florida, Bahamas, Turks and Caicos, Puerto Rico, Cuba, Colombia, and Venezuela) and 11 States of Brazil (Pará, Maranhão, Piauí, Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, and São Paulo). Within each species two different mitochondrial lineages were observed. They occurred throughout their distributions, and it is hypothesized that they were formed from a vicariance event with secondary contact or are the result of a genetic bottleneck followed by expansion. The lineages of P. cf. argus from Brazil were only observed in the mitochondrial control region and were separated approximately 233-288 thousand years ago, and each lineage underwent expansion at different times: the first expanded 100,000 years ago and the second 50,000 years ago. The lineages of the Caribbean species were found for the two mitochondrial markers. They were separated about 1 million years ago and have had the same expansion time, 50,000 years. Microsatellites revealed no population subdivision for either species, but the molecular markers together suggest a differential gene flow between localities exposed to different currents. Since these lobsters are heavily exploited, it is important to be conservative when defining their fishing stocks. For the species from Brazil, two fishing stocks are suggested, the first from Pará to Bahia States and the second from Southern Bahia to São Paulo State. For the species of the Caribbean, our data give support to the four stocks suggested by FAO (North, South, North Central and South Central).

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_lucas_teixeira_hax.pdf: 388762 bytes, checksum: c93c16af033ccd2aa4ff52ec81723de9 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / The genes of the somatotropic axis, which act regulating the metabolism and physiology of the mammals, present polymorphism associated to some characteristics of economical interest, such as reproductive performance and milk production. Such factors may be influenced by the mutation on only one nucleotide in the base sequence of the gene of the growth hormone receptor (GHR), which may alter the density of GHR on the hepatic tissue. Changes in the coupling of the growth hormone (GH) in the hepatic tissue alter the serum concentration of the insulin-like growth factor 1 (IGF-I), as IGF-I is produced mainly by the liver when it is stimulated by the growth hormone. Different studies have evaluated the effect of polymorphisms in the gene responsible for encoding IGF-I on the reproductive performance and milk production of high production dairy cows. Among other functions, the IGF-I mediates the effects of gonadotropins on the follicular cells, stimulating the growth and differentiation of theca and granulosa follicular cells, playing also a significant role on the final growth and maturation of the dominant follicle. Furthermore, high serum IGF-I concentrations are associated with a earlier return to cyclicity post partum in high yield dairy cows. Thus, the objective of this study was to evaluated the relevance of the mutations in GHR and IGF-I on the calving conception interval, number of inseminations per pregnancy and milk production in Holstein cows. One hundred and fifty five Holstein cows, submitted to a semi extensive management system, subjected to fixed-time artificial insemination (TAI) that got pregnant up to 250 days in milk in 2011, were selected. Among the animals tested, 29% presented GHR AluI (+ / +), 57.5% AluI (+ / -) and 13.5% AluI (- / -) genotype. 34.9% presented IGF-I SnaBI (+ / +), 45.8% SnaBI (+ / -) and 19.3% SnaBI (- / -) genotype. No association was observed between GHR AluI and IGF-I SnaBI genotypes and calving conception interval, number of inseminations per pregnancy and milk yield (P> 0.05). Likewise, there was no association between the interaction of GHR AluI and IGF-I SnaBI genotypes and calving conception interval, number of inseminations per pregnancy and milk yield (P> 0.05). Finally, further studies are necessary to better understand the relevance of GHR AluI and IGF-I SnaBI genotypes to the calving conception interval number of inseminations per pregnancy and milk production in Holstein cows. / Os genes do eixo somatotrópico, que atuam na regulação do metabolismo e fisiologia dos mamíferos, apresentam polimorfismos associados a algumas características de interesse econômico, como desempenho reprodutivo e produção de leite. Tais fatores podem ser influenciados por mutações de apenas um nucleotídeo na sequência de bases do gene do receptor do hormônio do crescimento (GHR), que podem alterar a expressão do GHR no tecido hepático. Mudanças no acoplamento do hormônio do crescimento (GH) no tecido hepático alteram a concentração sérica de fator de crescimento semelhante à insulina tipo1 (IGF-I), visto que o IGF-I tem sua produção endócrina principalmente no fígado mediante estimulação do hormônio do crescimento. Diversos trabalhos têm estudado o efeito de polimorfismos no gene que codifica para IGF-I no desempenho reprodutivo e produção de leite de vacas leiteiras de alta produção. Entre outras funções, o IGF-I atua como mediador dos efeitos das gonadotrofinas nas células foliculares, estimulando o crescimento e diferenciação das células da teca e da granulosa foliculares, apresentando também um importante papel no crescimento final e na maturação do folículo dominante. As altas concentrações sanguíneas de IGF-I estão também associadas a um retorno à ciclicidade mais precoce de vacas leiteiras pós-parto de alta produção. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a importância de mutações no GHR e IGF-I no desempenho zootécnico, IPC, número de inseminações por prenhez e produção de leite em vacas da raça Holandês. Foram avaliadas 155 vacas da raça Holandês em sistema semi extensivo submetidas à inseminação artificial em tempo fixo (IATF) e que conceberam até 250 dias em lactação no ano de 2011. Entre os animais analisados, 29% apresentaram o genótipo GHR AluI, (+/+), 57,5% AluI (+/-) e 13,5% AluI (-/-). Já para o IGF-I SnaBI 34,9% apresentaram o genótipo IGF-I SnaBI (+/+), 45,8% SnaBI (+/-) e 19,3% SnaBI (-/-). Não foi observada associação entre os genótipos GHR AluI e IGF-I SnaBI e o intervalo parto-concepção, número de inseminações por prenhez e produção de leite (P>0,05). Da mesma forma, não houve associação entre a interação dos genótipos de GHR AluI e IGF-I SnaBI e o intervalo parto-concepção, número de inseminações por prenhez e produção de leite (P>0,05). Finalmente, novos estudos avaliando uma maior população de animais são necessários para elucidar a importância dos genótipos de GHR AluI e IGF-I SnaBI no intervalo parto-concepção, número de inseminações por prenhez e produção de leite.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_kaue_rodriguez_martins.pdf: 452926 bytes, checksum: ae46017afbe7b23ca7e1d34a015987fa (MD5) Previous issue date: 2014-03-19 / There is a growing interest in using artificial insemination (AI) in sheep due to the potential for genetic improvement. However, cryopreservation damages spermatozoa, decreasing their fertilizing potential when frozen semen is deposited in the cervix. Sperm damages attributed to cryopreservation may be minimized by the addition of seminal plasma (SP), which contains several factors produced by the testis, epididhymis and accessory glands with potential to prevent premature capacitation. Supplementation of SP prior to freezing would be beneficial for various processes of periods of the selection and freezing process, reported before freezing would be beneficial for the processes of selection and freezing. The supplementation of extenders with SP from ram and boars is associated with increased sperm motility after incubation in vitro, as well as when used for cooling, freezing and thawing. The objectives of this study were to test the addition of 20% boar SP to the extender to freeze ram sperm and to evaluate parameters of sperm quality after thawing. Ejaculates from four rams and three boars were collected to form pooled SP samples. A fraction of each pooled sample was used for protein quantification. Six samples from four rams were collected and diluted in Tris-egg yolk - glycerol for freezing, forming three treatments: control (no SP); inclusion of 20% ram SP; and inclusion of 20% boar SP. After thawing, the samples were subjected to a thermal stress test for five hours. Sperm quality was assessed every two hours. Analyses by flow cytometry were done to evaluate the integrity of acrosome and membrane integrity. For the control, ram SP and boar SP treatments, the evaluated parameters of sperm quality were: motility (30.4 ± 2.0, 24.6 ± 2.0 and 30.0 ± 2.0, respectively); membrane integrity (37.5 ± 2.6; 40.9 ± 2.6 and 31.4 ± 2.6 respectively); mitochondrial functionality (70.0 ± 1.7; 61.8 ± 1.7 and 63.6 ± 1.7); and DNA integrity (91.2 ± 3.1; 96 5 ± 3.1 and 93.6 ± 3.1 respectively). For those parameters, no significant differences were observed across treataments (P > 0.05). However, addition of boar SP to the extenders was related to greater acrosome integrity (59, 3 ± 3.5) than that of the control (46.7 ± 3.5) (P < 0.05), although both means were similar (P > 0.05) to that observed for the treatment with ram SP (56.7 ± 3.5). Despite of the benefit on acrosome integrity related to addition of boar SP, no other positive effects were observed for post-thawing ram sperm viability. / O interesse pelo uso da inseminação artificial (IA) em ovinos vem crescendo, em função do avanço no melhoramento genético. Entretanto, a criopreservação causa danos aos espermatozóides, diminuindo seu potencial fertilizante, quando a IA é feita com sêmen congelado, pela via cervical. Uma alternativa para proteger ou recuperar a célula dos danos da criopreservação é a adição de plasma seminal (PS), que contém vários fatores produzidos pelos testículos, epidídimos e glândulas acessórias do macho, com potencial de prevenir a capacitação prematura e danos gerados pelo congelamento. A adição de PS antes do congelamento seria benéfica para os processos de seleção e congelamento. A suplementação do diluente com PS ovino e suíno foi associada com aumento na motilidade espermática, após a segunda hora de incubação sob condições in vitro, assim como quando usado na refrigeração, congelamento e descongelamento. Este estudo teve como objetivo testar a adição de PS suíno (20%) ao diluente para congelamento do sêmen ovino e avaliar os parâmetros seminais in vitro pós-descongelamento. Ejaculados de quatro machos ovinos e três machos suínos foram coletados para formação de amostras combinando PS de vários machos (pools). Uma fração das amostras de PS foi destinada a quantificação de proteínas. Seis coletas dos quatro machos ovinos foram colhidas e diluídas em Tris-gema de ovo-glicerol, para congelamento, compondo três tratamentos: controle (sem PS); inclusão de 20% de PS ovino; e inclusão de 20% PS suíno. Após o descongelamento, as amostras foram submetidas a um teste de termo resistência durante cinco horas. Avaliações de qualidade espermática foram realizadas a cada duas horas. Também foram realizadas análises por citometria de fluxo para as avaliações de integridade de acrossoma e integridade de membrana. Para os tratamentos controle, PS ovino e PS suíno, não foram observadas diferenças (P > 0.05) quanto a motilidade (30,0 ± 2,0; 30,4 ± 2,0 e 24,6 ± 2,0 respectivamente), integridade de membrana (37,5 ± 2,6; 40,9 ± 2,6 e 31,4 ± 2,6, respectivamente), função mitocondrial (70,0 ± 1,7; 61,8 ± 1,7 e 63,6 ± 1,7, respectivamente) e integridade de DNA (91,2 ± 3,1; 96,5 ± 3,1 e 93,6 ± 3,1, respectivamente). A integridade do acrossoma foi maior (P < 0.05) com inclusão de PS suíno (59,3 ± 3,5) em comparação com o controle (46,7 ± 3,5), mas ambas as médias foram similares (P > 0.05) à observada para o PS ovino (56,7 ± 3,5). Conclui-se que apesar do beneficio do PS suíno a 20% para a integridade de acrossoma, não se obteve resultados positivos nas demais avaliações de qualidade seminal.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_caroline_gomes_lucas.pdf: 894020 bytes, checksum: 8d27baa8c8ae08744efe112062ff8b86 (MD5) Previous issue date: 2014-02-19 / The possibility of increasing the genetic pattern and animal production make the in vitro production of embryos an extremely valuable technique for the technological development of livestock. However, due to the need for mimicking the in vivo process, that consists in several interdependent steps there are difficulties in setting the optimal conditions for each situation performed. The improvement of in vitro maturation (IVM) protocols through supplementation with different molecules can increase the efficiency of the culture medium and improve the competence of oocytes for fertilization and embryogenesis. A promising approach is the realization of mediated delivery of nanocarriers molecules. Tretinoin (TTN, all- trans retinoic acid - ATRA ) is a natural retinoid and active metabolite of vitamin A with important action in cell proliferation and differentiation and embryonic development under both in vivo and in vitro conditions. TTN acts on the cytoplasmic maturation process, in the initial embryonic development and oocyte competence, improving the quality of embryos generated. The combinations of tretinoin with polymeric nanoparticles are alternatives to enhance the solubility and chemical stability of this molecule, allowing controlled release and decreased degradation. The objective of this study was to evaluate the effects of IVM medium supplementation with tretinoin-loaded lipid-core nanocapsules (TTN-LNC) at concentrations of 0.25, 0.5 and 1 μM, by analysis of embryonic development until the blastocyst stage, production of reactive oxygen species (ROS), and expression of genes related to apoptosis and pluripotency. As main results, TTN-LNC 0.25 μM increased the rate of blastocyst production and reduced ROS production. In addition, TTN and TTN-LNC induced a lower gene expression of Bax and SHC1, suggesting beneficial effects on the development of embryos. The results indicate that nanoencapsulation allows the use of a lower dose of TTN-LNC with consequent obtention of higher percentages of blastocyst production and decreased production of ROS, making nanoembriology a potential tool for improving bovine embryos IVP. / A possibilidade de aumento do padrão genético e da produção animal torna a produção in vitro (PIV) de embriões uma técnica extremamente valiosa para o desenvolvimento tecnológico da pecuária. No entanto, devido a necessidade de uma mimetização do processo in vivo, que consiste em várias etapas interdependentes, há dificuldades em ajustar as condições ótimas requeridas para cada situação reproduzida. O melhoramento dos protocolos de maturação in vitro (MIV) através da suplementação com diferentes moléculas permite aumentar a eficiência dos meios de cultivo e melhorar a competência de oócitos para a fertilização e embriogênese. Uma abordagem altamente promissora é a realização da entrega de moléculas mediada por nanocarreadores. A tretinoína (TTN, ácido retinóico all-trans - ATRA) é um retinóide natural e metabólito ativo da vitamina A, com ação importante na proliferação e diferenciação celular, e no desenvolvimento embrionário tanto em condições in vivo como in vitro. A TTN age no processo de maturação citoplasmática, no desenvolvimento inicial embrionário e competência oocitária melhorando a qualidade dos embriões gerados. A associação da tretinoína à nanopartículas poliméricas surge como alternativa para melhorar a solubilidade e estabilidade química desta molécula, possibilitando uma liberação controlada e redução da degradação. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos da suplementação com nanocápsulas de núcleo lipídico associadas à tretinoína (TTN-LNC) no meio de MIV, nas concentrações de 0,25, 0,5 e 1 μM, através da análise do desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto, produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e expressão de genes relacionados a apoptose e pluripotência. Como principais resultados, a TTN-LNC a 0,25 μM aumentou a taxa de produção de blastocistos e reduziu a produção de EROs. Além disso, TTN e TTN-LNC induziram uma menor expressão dos genes Bax e SHC1 sugerindo efeitos benéficos sobre o desenvolvimento embrionário. Os resultados indicam que a nanoencapsulação permite a utilização de uma menor dose de TTN-LNC com consequente obtenção de maiores porcentagens de produção de blastocistos e diminuição da produção de EROs, tornando a nanoembriologia uma ferramenta potencial para a melhora da técnica de PIV de embriões bovinos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_marta_amaral.pdf: 872749 bytes, checksum: 441aef851eaec2633ad2f7530bf3c07c (MD5) Previous issue date: 2009-12-28 / Transgenic animals have been used as biological models in studies of the genes functions and their mechanisms of action, as well as to improve animal production. Researchers are trying to produce transgenic animals that will be organs donors in xenotransplants. Another use of the transgenic animal is in the production of recombinant proteins for pharmaceutical interest, starting from several tissues and corporal fluids of different animal species. Using TMGT (Testis Mediated Gene Transfer), the efficiency of pEGFP transgene transmission in mice using non surgical TMGT was evaluated, without epididymis electroporation; using transfectants as DMSO, liposomes, and for the first time the DMA. To evaluate the efficiency of non surgical TMGT in F0 the EGFP expression was evaluated in vivo and detection in genome was conducted by PCR analysis. Moreover, we evaluated which transfectants were more efficient in transgene transmission and if it induce histological damage in testis, by histological analysis. EGFP expression was not detected in F0 through the ultraviolet light.The result of the PCR analysis shows that liposomes and DMSO were the best transfectants for pEGFP in F0. The histological analysis shows that injections of DMSO with exogenous DNA could affect the development of the germ cell of seminal tubules. The purpose about SMGT was to evaluate the interaction of the spermatozoa of silver catfish with pEGFP vector. It was observed that the semen after three washes in isosmotic solution and at 1000 x g centrifugation could eliminate seminal plasma proteins and preserve cellular motility. The time of action of DNase in the seminal plasma was 30 minutes, the temperature of action of DNase ranged between 33-53°C and its inhibition was detected at 70°C. In the presence of EDTA 30mM the activity of DNase was inhibited. Through PCR it was detected that in the DNA of the silver catfish s spermatozoids, the amplicon of EGFP at different concentrations of pEGFP vector (5-100 ng/106 spermatozoa). We demonstrate that spermatozoa of the silver catfish need to be washed to remove seminal plasma before contact with exogenous DNA, after several washes exogenous DNA was internalized in spermatozoa. / Os animais transgênicos vêm sendo empregados como modelos biológicos em estudos das funções dos genes e dos seus mecanismos de ação, bem como para melhorar a produção animal. Pesquisadores vêm tentando produzir animais transgênicos que serão doadores de órgãos em xenotransplantes. Outra utilização da transgênese animal é a produção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico a partir de diversos tecidos e fluidos corporais de diferentes espécies de animais. Em relação à TMGT (Testis Mediated Gene Transfer) foi avaliada a eficiência da transmissão do transgene EGFP em camundongos, utilizando a TMGT não cirúrgica, sem o uso de eletroporação no epidídimo; utilizando transfectantes como o DMSO, lipossomos, e pela primeira vez o DMA. A detecção da expressão do EGFP foi avaliada in vivo na F0 e por PCR, para comprovar a eficiência da TMGT não cirúrgica. Também foi analisado qual dos transfectantes propiciou a maior taxa de transmissão e se eles causaram danos histológicos aos testículos, através de análise histológica. Não foi detectada a expressão de EGFP, através da luz ultravioeta na F0. Os resultados da análise de PCR demonstraram que o lipossomo e o DMSO foram os melhores transfectantes do pEGFP na F0. A análise histológica demonstrou que a injeção de DMSO com o DNA exógeno, pode comprometer o desenvolvimento das células germinativas do túbulo seminal. O objetivo em relação à SMGT (Sperm-mediated gene transfer) foi avaliar a interação dos espermatozóides de silver catfish (Rhandia quelen) com o vetor pEGFP. Foi observado que o sêmen após três lavagens em solução isosmótica e centrifugadas à 1000 x g, eliminaram as proteínas do plasma seminal e preservaram a motilidade celular. O tempo de atividade da DNase no plasma seminal foi de 30 minutos, a temperatura de atividade da DNase variou entre 33-53°C e sua inativação ocorreu aos 70°C. Na presença de EDTA 30mM a atividade da DNase foi inibida. Através da PCR foi detectada a presença do pEGFP no DNA dos espermatozoides do silver catfish, que incorporaram o vetor em diferentes concentrações (5-100 ng/106 espermatozoides). Concluímos que os espermatozoides do silver catfish precisam ser lavados para retirada do da DNase do plasma seminal antes de entrar em contato com o DNA exógeno, e que após as lavagens ocorreu a internalização do DNA exógeno no espermatozoide.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-28Bitstream added on 2014-06-13T18:58:55Z : No. of bitstreams: 1 limaneto_jf_me_botfmvz.pdf: 482694 bytes, checksum: 8e409b567c057a2c7915beaa9c6e8077 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / O primeiro sucesso na clonagem de eqüídeos através do uso de transferência nuclear foi relatado em maio de 2003 após o nascimento de uma mula clonada a partir de células fetais. Acredita-se que a utilização de células diplóides em fase do ciclo celular G0 ou G1 facilite a coordenação entre o ciclo celular e a reprogramação nuclear após a transferência de núcleo. Sendo assim, este experimento objetivou estudar o comportamento de fibroblastos de eqüinos adultos em cultura, analisando o estado do ciclo celular e a viabilidade das células em cultivo pré- e pós-descongelação. Fragmentos de pele de 6 eqüinos adultos, sendo 3 machos e 3 fêmeas, foram divididos em pedaços de aproximadamente 1mm3 e acondicionados (10 fragmentos/garrafa) no fundo de duas garrafas de cultivo (25cm2) umedecidas com 1mL SFB. As garrafas foram inclinadas para a posição vertical e adicionado 5ml de meio DMEM alta glicose + 10% SFB, 100UI/mL Penicilina / 100æg/mL Estreptomicina e 3,0æg/mL Anfotericina B. Após 30 minutos em estufa com 5% CO2 em ar, as garrafas foram dispostas em posição horizontal, para que o meio de cultivo entrasse em contato com os fragmentos teciduais. Todas as garrafas permaneceram por sete dias em estufa com 5% CO2 em ar até o início do crescimento celular. Com 70% de confluência, foi realizada a tripsinização e a primeira passagem. O mesmo procedimento foi repetido para a segunda passagem. Para os grupos de privação de soro (0,5% de SFB) foram produzidas garrafas de cultivo em duplicata para a análise da viabilidade e do ciclo celular nos períodos de 24, 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas de cultivo. Para os grupos de confluência foram produzidas duas garrafas de cultivo para a análise da viabilidade e do ciclo celular no período em que o tapete celular atingisse a confluência... / The first success in equine cloning, using nuclear transfer, was reported in May of the 2003 after the birth of a cloned mule obtained from fetal cells. Nowadays there is an agreement, in the literature, that diploid cells in phase G0 or G1 of the cell cycle facilitate coordination between the cell cycle and the nuclear reprogramming after the nuclear transfer. This experiment aimed to study the behavior of equine fibroblasts in culture though the analysis of the cellular cycle and the viability of cells pre- and post-freezing. Skin fragments were obtained from 6 adult horses (3 females and 3 males) and divided in pieces of about 1 mm3. For culture, the bottoms of two culture bottles were moistened with 1 mL of FCS, 10 fragments of skin were deposited, and 5 ml of DMEM high glucose + 10% FCS, 100 IU/mL penicillin, 100 g/mL streptomycin and 3 g/ml amphotericin B were added with the bottles raised vertically. After 30 min incubation in 5% CO2 in air, the bottles were moved to a horizontal position allowing the culture media to make contact with the tissue fragments. All bottles were cultured for 7 days in 5% CO2 in air until the beginning of confluence. The complete culture media was replaced weekly and, at 70% of confluence, trypsinization (ATV Vernese, Adolfo Lutz Institute) and the first passage were performed. Two passages were performed before freezing. For the second passage, the culture and trypsinization were repeated. For cells subjected to serum starvation (0.5% FCS), culture bottles were produced in duplicate for viability and cellular cycle analysis at 24, 48, 72, 96, 120, 144 and 168 hours of culture. For the confluence groups bottles were produced for the analysis of viability and cellular cycle at the moment cells achieved confluence...(Complete abstract, click electronic address below)

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_priscila_marques_moura_de_leon.pdf: 3035474 bytes, checksum: 1dfa2e910533e830f4c6c01d06ca37e6 (MD5) Previous issue date: 2011-11-07 / In equine, the intersections between reproduction and genomics are numerous, however, little known about the genetic factors that acting on fertility. The conclusion of equine genome sequencing project, brings the oportunity to evaluate candidate genes and molecular biomarkers for specific reproductive characteristics. Based on this information, this PhD thesis aimed to develop genomic studies applied to equine reproduction. The first paper analyzed the expression of apoptotic-related genes (Bax, Bcl-2, survivin and p53) in equine cumulus-oocyte complex by qRT-PCR, comparing gene expression between morphologically distinct oocytes and cumulus cells during in vitro maturation. Results showed that survivin mRNA levels were higher (P<0.05) and p53 mRNA levels was lower (P<0.01) in oocytes compared to cumulus cells in morphologically healthy. On the other hand, expression of the Bax was significantly higher in morphologically healthy cumulus cells (P<0.02). The second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The second paper analyzed a single nucleotide polymorphism (SNP) in the p53 gene, looking for associations with reproductive parameters in Thoroughbred mares. This is the first study demonstrating the Arginine/Proline SNP in equine exon 4 p53 gene. The heterozygous Arginine/Proline was found in 73.3% of Thoroughbreds compared to the homozygous Arg/Arg and Pro/Pro that was detected in 17.1% and 9.6% of mares, respectively. The Arginine/Proline genotype was significantly associated with abortion (P=0.02), while Proline/Proline mares had a lower probability of abortion (P<0.05). These results indicate that p53 may play a role in equine reproduction. The third article has determined the presence of circulating cell-free fetal DNA (ccffDNA) in pregnant mare s plasma, looking to develop a molecular test for the prenatal diagnosis of fetal sex determination using SRY gene amplification by PCR, reamplification by PCR (2nd-PCR) and real-time quantitative PCR (qPCR). This is the first report of ccffDNA in equine species. The molecular sexing test resulted in sensitivity of 72% and accuracy of 85% on the PCR. Using the 2nd-PCR and qPCR we obtained an increasing in the sexing sensitivity results (90.9%) and an accuracy of 95%. This study demonstrates for the first time the fetal sex determination in mares using ccffDNA. This PhD thesis resulted in the publication of three papers in international journals of reproduction and a patent application request. The results presented here collaborate to understand the equine reproductive biology, and indicate potential genetic markers to fertility parameters. / Em equinos, as intersecções entre a reprodução e a genômica são numerosas, no entanto, pouco se sabe sobre os fatores genéticos que atuam na fertilidade. Com o genoma equino completo, existe a possibilidade de análises moleculares e estudo de genes candidatos a biomarcadores para características reprodutivas específicas. Com base nestas informações, a presente tese teve como objetivo desenvolver estudos de genômica aplicada à reprodução equina. O primeiro artigo analisou a expressão de genes relacionados a apoptose (Bax, Bcl-2, survivin e p53) no complexo cumulus oócito equino através de qRT-PCR, comparando a expressão gênica entre oócitos e células do cumulus com diferentes características morfológicas durante a maturação in vitro. Como resultados, foi observada maior expressão do survivin (P<0.05) e menor expressão de p53 (P<0.01) em oócitos comparado a células do cumulus do grupo considerado morfologicamente saudável. Enquanto que a expressão de Bax foi maior (P<0.02) em células do cumulus do grupo saudável comparado ao grupo com características morfológicas não desejáveis. O segundo artigo analisou um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) no gene p53, relacionando-o a parâmetros reprodutivos de éguas Puro Sangue Inglês. Foi relatado pela primeira vez um SNP Arginina/Prolina na região do exon 4 do gene p53 equino. A prevalência foi de 73,3% para o genótipo heterozigoto, 17,1% do genótipo Arginina/Arginina e 9,6% do Prolina/Prolina. O genótipo Arginina/Prolina foi associado (P=0.02) a ocorrência de aborto, enquanto que o genótipo Prolina/Prolina foi associado (P<0.05) a menor probabilidade de aborto, indicando um papel da p53 na reprodução equina. O terceiro artigo determinou a presença de DNA fetal livre e circulante (ccffDNA) no plasma de éguas prenhas, desenvolvendo um teste molecular de diagnóstico pré-natal na determinação do sexo fetal através da amplificação do gene SRY pelas técnicas de PCR, de re-amplificação por PCR (2º-PCR) e de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). Este é o primeiro relato do DNA fetal livre e circulante em equinos. O teste de sexagem molecular resultou em 72% de sensibilidade e 85% de acurácia na técnica de PCR. Com o 2º-PCR e qPCR a sensibilidade foi de 90,9% e 95% de acurácia. Este estudo demonstra pela primeira vez a determinação do sexo fetal em éguas utilizando o ccffDNA. Os resultados apresentados colaboram para o entendimento da biologia reprodutiva da espécie equina, e indicam marcadores genéticos em potencial para parâmetros de fertilidade. Esta tese resultou na publicação de três artigos em periódicos internacionais da área de Reprodução e um pedido de Patente de Invenção.

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Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1695521 bytes, checksum: 9a0915b224b9fc02033cedd8cfc42515 (MD5) Previous issue date: 2014-07-30 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The species of the genus Astyanax are widely distributed in the Neotropical region and have few morphological, ecological and behavioral differences, which complicates the taxonomic classification of this taxon. The nominal species Astyanax bimaculatus was described by Linnaeus in 1758 and currently species with two oval spots that occur in several Neotropical basins are considered as belonging to bimaculatus complex. The objective of this study was to determine the cytogenetic and molecular characteristics (mitochondrial DNA) of 19 populations currently assigned to Astyanax bimaculatus from complex coastal basins of southeastern Minas Gerais using conventional staining, nucleolar organizer regions Ag-NORs, C-band, DAPI, FISH and the gene cytochrome oxidase I - COI. Data were compared with other species of the complex. The karyotype 6m +20 sm +18 st +6 t occurred in all populations, with Ag-NORs ranging from two to eight stained chromosomes. The C-banding showed centromeric and pericentromeric markings, evidenced by the fluorochrome DAPI. Fluorescent 18S and 5S rDNA probes marked one chromosome pair respectively. The phylogeny obtained with the COI gene indicated the presence of two haplogroups with large molecular distance between them: haplogroup I was more closely related to the populations of the São Francisco River Basin, while haplogroup II was subdivided into a group which was more related to populations from the upper Paraná (IIA) and another group formed exclusively by coastal haplotypes (IIB). The karyotype uniformity of coastal populations is greater than the recognized Astyanax altiparanae, suggesting the persistence of large populations. Polymorphisms involving C-band patterns indicate that the addition and reduction of heterochromatin blocks are compatible with intraspecific variation. The molecular data suggest that coastal basins received migrants from continental basins, with more recent geodispersion of a coastal haplogroup, probably related to the dynamic confluence of coastal basins during glacial periods. The genetic similarity between São Francisco River Basin and coastal basins indicates that the nominal species Astyanax lacustris does not represent a valid taxon. While the Upper Paraná Basin maintained a molecular identity consistent with the existence of the nominal taxon Astyanax altiparanae that, agreeing with the cytogenetic data, also occurs in the Paraíba do Sul River Basin. It is concluded that the bimaculatus complex in southeastern Brazil is composed by three lineages, including only two species Astyanax aff. bimaculatus present in São Francisco and coastal basins and A. altiparanae present in the Upper Paraná. / As espécies do gênero Astyanax apresentam ampla distribuição na região neotropical e apresentam poucas diferenças morfológicas, ecológicas e comportamentais, o que dificulta a classificação taxonômica desse táxon. A espécie nominal Astyanax bimaculatus foi descrita em 1758 por Linnaeus e, atualmente, espécies com duas manchas ovaladas que ocorrem em diversas bacias neotropicais são consideradas como pertencentes ao complexo bimaculatus. O objetivo deste trabalho foi determinar as características citogenéticas e moleculares (DNA mitocondrial) de 19 populações consideradas como pertencentes ao complexo Astyanax bimaculatus das bacias costeiras do sudeste de Minas Gerais utilizando coloração convencional, regiões organizadoras de nucléolos Ag-NOrs, banda C, DAPI, FISH e o gene citocromo oxidase I - COI. Os dados foram comparados com outras espécies do complexo. O cariótipo 6m+20sm+18st+6t ocorreu em todas as populações, com Ag-NORs variando de dois a oito cromossomos marcados. A banda C mostrou marcações centroméricas e pericentroméricas, evidenciadas pelo fluorocromo DAPI. As sondas 18S e 5S marcaram apenas um par cromossômico respectivamente. A filogenia obtida com o gene COI indicou a presença de dois haplogrupos com grande distância molecular: o haplogrupo I mais aparentado com populações da bacia do rio São Francisco, enquanto o haplogrupo II subdividiu-se em um grupo mais aparentado com populações do alto Paraná (IIA) e outro grupo formado exclusivamente por haplótipos costeiros (IIB). A uniformidade cariotípica das populações costeiras é maior que a reconhecida em Astyanax altiparanae, sugerindo a persistência de grandes populações. Polimorfismos envolvendo padrões de banda C indicam que a adição e redução de blocos de heterocromatina são consideradas variações intraespecíficas. Os dados moleculares sugerem que as bacias costeiras receberam aporte de bacias continentais, com geodispersão mais recente de um haplogrupo costeiro, provavelmente relacionado com a dinâmica de confluência de bacias costeiras durante os períodos glaciais. A similaridade genética entre a bacia do rio São Francisco e as bacias costeiras indica que a espécie nominal Astyanax lacustris não representa um táxon válido. Enquanto a bacia do alto Paraná manteve uma identidade molecular condizente com a existência do táxon nominal Astyanax altiparanae que, condizente com os dados citogenéticos, também ocorre na bacia do rio Paraíba do Sul. Conclui-se que o complexo bimaculatus no sudeste brasileiro é composto de três linhagens, englobando apenas duas espécies: Astyanax aff. bimaculatus presente no São Francisco e nas bacias costeiras e A. altiparanae presente no alto Paraná.