Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / A galactosemia é um erro inato do metabolismo em que há deficiência no metabolismo da galactose, levando ao acúmulo de galactose e seus metabólitos nos tecidos e líquidos biológicos de pacientes. Os sinais incluem alterações comportamentais e deficiência intelectual, bem como danos hepáticos, renais e musculares, podendo ocasionar a morte. Estudos têm demonstrado que administrações crônicas e com altas concentrações de galactose causam efeitos deletérios em diversos tecidos corporais, incluindo o sistema nervoso central. Entretanto, a fisiopatologia da doença ainda não está totalmente desvendada. O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da administração aguda de Dgalactose sobre parâmetros de metabolismo energético e de estresse oxidativo em estruturas cerebrais de ratos jovens. Foram utilizados ratos Wistar machos, de 30 dias de vida, divididos em dois grupos: controle e galactosemia. Para a avaliação de parâmetros de metabolismo energético, os animais do grupo galactosemia receberam uma única administração subcutânea de galactose (5 μmol/g), enquanto os animais controles receberam solução salina no mesmo volume. Uma hora após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral, soro e liquido cefalo raquidiano foram isolados e analisados. Para a avaliação de parâmetros de estresse oxidativo, o protocolo de administração foi idêntico ao anterior. Uma, doze e vinte e quatro horas após a administração, os animais sofreram eutanásia e o córtex cerebral e cerebelo foram isolados limpos e analisados. Observou-se que a administração aguda de D-galactose em ratos jovens causou diminuição significativa da succinato desidrogenase (SDH) em córtex cerebral, no período de uma hora. Também houve alteração da homeostase redox em córtex e cerebelo, com danos oxidativos e prejuízo das defesas antioxidantes, em todos os tempos estudados. Além disso, houve aumento significativo do estresse nitrosativo em córtex cerebral em todos os tempos estudados, porém em cerebelo apenas no período de doze horas da admistração de D-galactose. Os resultados do presente trabalho sugerem alterações no metabolismo energético cerebral e danos oxidativos e nitrosativos precoces em cérebro de ratos jovens. Tais achados podem colaborar para o esclarecimento dos danos cerebrais encontrados em pacientes galactosêmicos.

Altos níveis de galactose circulantes e cerebrais são encontrados em portadores da galactosemia clássica não tratada, cujos pacientes comumente desenvolvem problemas cognitivos e motores ao longo da vida. Entretanto pouco se conhece a respeito dos mecanismos da disfunção celular e molecular responsáveis por estes sintomas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi de investigar o efeito da injeção intracerebroventricular de galactose sobre a memória (aversiva e de reconhecimento de objetos) e a coordenação motora em ratos Wistar. Além disso, a atividade, o imunoconteúdo e a expressão gênica da acetilcolinesterase no hipocampo e córtex cerebral foram também avaliados. No cerebelo, foram medidos parâmetros histológicos (contagem de células e imunohistoquímica) e bioquímicos (imunoconteúdo de caspase-3 ativa e BDNF, atividade e imunoconteúdo da acetilcolinesterase, níveis de glutationa e sulfidrilas, bem como o índice de dano ao DNA). Ratos Wistar receberam uma injeção intracerebroventricular de galactose (4 mM) ou salina (controles) sendo esses submetidos às tarefas comportamentais e/ou decapitados em diferentes tempos (1 h, 3 h ou 24 h), logo após, o hipocampo, córtex cerebral e cerebelo foram dissecados. Os resultados mostraram que a galactose prejudicou a memória aversiva e de reconhecimento de objetos, quando injetada antes do treinamento, bem como alterou a atividade e a expressão gênica da acetilcolinesterase em hipocampo. Em relação ao comportamento motor e aos parâmetros histológicos e bioquímicos realizados no cerebelo, a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a coordenação motora e reduziu o número de células e a imunomarcação de neurônios e astrócitos. A galactose, também aumentou o imunoconteúdo de caspase-3 ativa, a atividade da acetilcolinesterase e o índice de dano ao DNA, bem como diminuiu o imunoconteúdo de BDNF e acetilcolinesterase e os níveis de glutationa e sulfidrilas no cerebelo. Tomados em conjunto, nossos resultados mostram que a administração intracerebroventricular de galactose prejudicou a memória e a coordenação motora. Além disso, o modelo experimental utilizado mostrou diversas alterações a nível celular e molecular, os quais podem contribuir pelo menos em parte com o entendimento da fisiopatologia da galactosemia clássica. / Non-treated patients with classical galactosemia present high levels of galactose in the bloodstream and brain. Patients usually develop cognitive and motor impairments during life. However, little is known about the cellular and molecular mechanisms responsible for these symptoms. Thus, the aim of this study was to investigate the effect of intracerebroventricular galactose injection on memory (aversive and object recognition) and motor coordination in Wistar rats. Acetylcholinesterase activity, immunocontent and gene expression were investigated in hippocampus and cerebral cortex. In the cerebellum, we performed histological (cell counting and immunohistochemistry) and biochemical (active caspase-3 immunocontent, BDNF, acetylcholinesterase activity and immunocontent, glutathione and sulfhydryl levels, as well as DNA damage index) parameters. Wistar rats received a single intracerebroventricular injection of galactose (4 mM) or saline (control). The animals performed behavioral tasks and/or were decapitated at different times (1 h, 3 h or 24 h) after injection. The hippocampus, cerebral cortex and cerebellum were dissected. The results showed that injecting galactose before training provokes impairment on aversive and object recognition memories, as well as altered the activity and gene expression of acetylcholinesterase in hippocampus. Regarding to the histological and biochemical parameters measured in the cerebellum, intracerebroventricular galactose injection impaired motor coordination, reduced the number of cells and immunostaining of neurons and astrocytes. In the cerebellum, galactose also increased active capase-3 immunocontent, acetylcholinesterase activity and DNA damage index, as well as decreased BDNF and acetylcholinesterase immunocontent, and glutathione and sulfhydryl levels. Altogether, our results show that intracerebroventricular injection of galactose impaired memory and motor coordination. Moreover, the experimental model used showed several alterations at cellular and molecular levels. These findings may contribute at least in part with the understanding of the physiopathology in classical galactosemia.

M. Tech. (Biotechnology, Department of Biosciences, Faculty of Computer and Applied Sciences) Vaal University of Technology / This study seeks to design and test specific short hairpin RNA (pshRNA) for their efficiency in knocking down the GALT gene RNA products thereby limiting the resultant enzyme activity. The following objectives were followed in designing the current study: 1. Designing a shorthairpin RNA (pshRNA) to target different regions of the coding sequence of the target GALT gene. 2. Propagating the pshRNAs in Escherichia coli (E.coli) and subsequently isolation of the respective plasmids for transfection. 3. Transfection of HeLa cells to test the efficiency of relevant pshRNAs in knocking down the GALT gene expression. 4. Transfection was followed by extraction of total mRNA, purification and quantification of total mRNA. 5. The GALT gene expression was qualitatively quantified against a house-keeping gene, glyceraldehyde phosphate dehydrogenase (GAPDH) to evaluate efficiency of knockdown using real time PCR. The three newly designed pshRNA (pshRNA2, pshRNA3 and pshRNA4) targeting the GALT gene expression showed a knockdown efficiency of 171 %, 48 % and 200 %, respectively. The results of this study will be useful for future evaluation of the possible long term glycosylation patterns under proper UDP glucose/UDP galactose levels compared with variable defective GALT gene levels.

La galactosémie congénitale est une maladie métabolique affectant la voie du galactose. En effet, l'enzyme responsable de la transformation du galactose-1-phosphate en glucose-1-phosphate, la galactose-1-phosphate uridyltransférase, est déficiente et rend donc l'utilisation du galactose par l'organisme quasiment impossible. Ceci entraîne une accumulation de galactose ainsi que ses produits dérivés, le galactose-1-phosphate et le galactitol. Ainsi, notre hypothèse de travail est que les métabolites impliqués dans cette pathologie provoquent des modifications post-traductionnelles des protéines induisant ainsi leur vieillissement prématuré. Nous avons donc étudié l'impact de la « galactation » sur la structure du collagène de type I et montré que ces modifications structurales sont beaucoup plus importantes avec le galactose qu'avec le glucose à la même concentration, aussi bien sur la structure primaire que fibrillaire. Au contact du collagène « galacté », les fonctions des cellules inflammatoires sont modifiées. La technique de spectroscopie infrarouge a été utilisée pour caractériser les métabolites impliqués dans la galactosémie ainsi que les collagènes modifiés. Dans un but de dépistage, une étude en spectroscopie infrarouge de plasmas galactosémiques nous a permis de mettre en évidence le potentiel de cette technique, du fait de sa bonne sensibilité et de son faible coût de revient. En conclusion, les modifications post-traductionnelles des protéines semblent très fortement impliquées dans la physiopathologie de la galactosémie congénitale. / The congenital galactosemia is a metabolic disease involved in the galactose pathway. Indeed, the enzyme responsible of the galactose-1-phosphate transformation in glucose-1-phosphate, the galactose-1-phosphate uridyltransferase, is deficient and then leads to a use of galactose almost impossible. This leads to an accumulation of galactose and its derived products, the galactose-1-phosphate and the galactitol. Thus, our work hypothesis is that metabolites involved in this disease cause post-translational modifications of proteins inducing their premature aging. We then studied the impact of the « galactation » on the type I collagen and showed that the structural modifications are more important with galactose than with glucose at the same concentration, on both the primary and the fibrillar structure. On contact with « galacted » collagen, the inflammatory cells functions are also modified. The infrared spectroscopy technique has been used to characterize the metabolites involved in the galactosemia, just as the modified collagens. With the aim of screening, an infrared spectroscopy study of galactosemic plasmas allowed us to highlight the potential of this technique, with its good sensibility and its low cost price. To conclude, the post-translational modifications of proteins seem strongly involved in the physiopathology of the congenital galactosemia.