No description available.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:42:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000431688-Texto+Completo-0.pdf: 567174 bytes, checksum: 5a3c8a6c18361741aa700b9c3a83b24f (MD5) Previous issue date: 2011 / Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease that operates through joint inflammation becomes chronic over the years and may develop a deformity and destruction of these joints due to erosion of cartilage and bone. This disease affects people of both sexes and varying ages. The diagnosis depends on a number of combinations of clinical symptoms, laboratory and radiographic diagnostics. The etiology of RA is multifactorial resulting from the interaction of environmental factors, hormonal and genetic factors that contribute to its occurrence and expression. Epidemiologic studies show that genetic factors are reported as increasing the risk for RA. It is believed that several genes may be involved with the onset of RA, and one of them is the MBL2 gene, responsible for encoding the protein Mannose binding lectin. MBL is a protein family of collectins important for the immune system, related to the promotion of phagocytosis of microorganisms, modulation of inflammatory response and apoptosis. The low serum levels of MBL are associated with genetic mutations by MBL2 gene polymorphisms. Three single nucleotide polymorphisms (SNPs) were located in exon 1 at codons 52 (variant allele D), 54 (variant allele B) and 57 (variant allele C) the presence of any of the variant alleles (B, C or D) has been collectively labeled O, whereas the simultaneous absence of variants at the three positions has been called allele A. We analyzed MBL2 gene polymorphisms in 322 Brazilian patients with RA and 343 healthy controls ethnically matched through sequencing. When we compared European-derived and African-derived controls we observed a significantly difference in both, genotypic and allelic frequencies, particularly concerning the frequency of the C allele (European-derived patients 0. 0220 vs. African-derived patients 0. 205, European-derived controls 0. 029 vs. African-derived controls 0. 144, both P-values <0. 001).We also analyzed MBL genotype in relation to extraarticular manifestations. When considering MBL variants together we found an increased frequency of the OO genotype among patients with rheumatoid nodules (P=0. 031). This finding suggests an association of the OO genotype and disease severity, but more studies are needed to clarify the true role of MBL in RA. / A artrite reumatóide é uma doença do sistema auto-imune que atua através de uma inflamação nas articulações tornando-se crônica com o passar dos anos, podendo desenvolver uma deformidade e destruição destas articulações devido à erosão da cartilagem e do osso. Esta doença atinge pessoas de ambos os sexos com idades variáveis. O diagnóstico da doença depende de uma série de combinações de sintomas clínicos, diagnósticos laboratoriais e radiográficos. A etiologia da AR é multifatorial, resultando da interação de fatores ambientais, hormonais e genéticos, que contribuem para sua ocorrência e expressão. Evidências epidemiológicas mostram que fatores genéticos são relatados como risco para o aumento da AR. Acredita-se que vários genes possam estar envolvidos com o aparecimento da AR, e um deles é o gene MBL2, responsável pela codificação da proteína Lectina de Ligação à Manose. A MBL é uma proteína da família das colectinas importante para o sistema imunológico, relacionada com a promoção de fagocitose de microorganismos, modulação da resposta inflamatória e apoptose. Os baixos níveis séricos de MBL estão associados com mutações genéticas através de polimorfismos do gene MBL2. Três polimorfismos de base única (SNPs) foram localizados no éxon 1 nos códons 52 (alelo variante D), 54 (alelo variante B) e 57 (alelo variante C). A presença de qualquer uma dessas variantes é chamada de alelo O, enquanto que a ausência das variantes em qualquer uma das três posições é chamada alelo A. Neste estudo, analisamos o polimorfismo do gene MBL2 em 322 pacientes brasileiros com AR e 343 indivíduos saudáveis através da técnica de sequenciamento. Quando comparamos indivíduos saudáveis euro-descendentes e afro-descendentes observamos uma diferença significativa nas frequências genotípicas e alélicas, isto devido a frequência maior do alelo C (pacientes euro-descendentes 0. 0220 vs. Pacientes Afro-descendentes 0. 205, controles euro-descendentes 0. 029 vs. Controles afro-descendentes 0. 144, valores P<0. 001). Também analisamos o genótipo MBL em relação a manifestações extra-articular. Quando consideramos as variantes MBL juntas, nós encontramos um aumento da frequência do genótipo OO em pacientes com nódulos reumatóides (P=0. 031). Estes achados sugerem uma associação do genótipo OO e a severidade da doença, entretanto mais estudos são necessários pra esclarecer a verdadeira função da MBL na AR.

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

A atrofia muscular espinal (AME) é uma das doenças de herança autossômica recessiva mais frequentes, com uma incidência estimada de 1 em cada 10.000 nascidos vivos. A AME se caracteriza por degeneração de neurônios motores na medula espinal, causando fraqueza progressiva de membros e tronco, seguida de atrofia muscular. Os pacientes são classificados em AME tipo I, AME tipo II e AME tipo III, baseado na idade de início dos sintomas e na evolução clínica. As três formas clínicas são causadas por alterações no gene de sobrevivência do neurônio motor (SMN1), que apresenta uma cópia homóloga (SMN2). Em torno de 95% dos pacientes com AME são homozigotos para ausência do exon 7 do gene SMN1, devido a uma deleção desse gene ou à uma conversão para SMN2. A ausência de SMN2 não tem consequências clínicas e é encontrada em aproximadamente 5% dos indivíduos normais, mas o número de cópias de SMN2 modula o fenótipo de pacientes com AME. Devido a este espectro uniforme de mutação, a análise molecular realizada mais frequentemente é a detecção de deleções e conversões dos éxons 7 e/ou 8 dos genes SMN1 e SMN2 nos pacientes com suspeita clínica de AME. Neste trabalho, um protocolo baseado no sistema TaqMan® foi desenvolvido e comparado com a metodologia de PCR-RFLP (restriction fragment length polymorfism) utilizada no laboratório, avaliando o potencial de aplicação no diagnóstico molecular de pacientes com AME. Amostras de DNA de 100 indivíduos com suspeita clínica de AME foram analisadas pelos dois métodos. Amostras suspeitas de apresentar conversão foram analisadas por sequenciamento direto de DNA. Homozigotos para a ausência do exon 7 do gene SMN1 foram identificados em 58 casos (58%), sendo a maioria devido à deleção desse gene. Destes pacientes, 56 foram classificados, de acordo com os critérios diagnósticos revisados para AME, e distribuídos da seguinte forma: 26 (46,4%) do tipo I, 16 (28,6%) tipo II e 14 (25,0%) tipo III. Oito casos de conversão do gene SMN1 para SMN2 foram encontradas entre os pacientes e a distribuição desses casos entre as três formas clínicas foi a seguinte: 4 pacientes do tipo III, 3 do tipo II e 1 do tipo I. Cinco casos de homozigotos para ausência do gene SMN2 foram identificados entre os demais indivíduos. A comparação do método PCR-RFLP com o método baseado no sistema TaqMan® descrito neste estudo mostrou que ambos foram específicos e precisos para essas análises. No entanto, o ensaio TaqMan® foi mais sensível e mais rápido e parece ser um método adequado para o diagnóstico de AME. / Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most frequent autosomal recessive disorder with an estimated incidence of 1 case in each 10,000 live-births. SMA is characterized by degeneration of motor neurons in the spinal cord, causing progressive weakness of the limbs and trunk, followed by muscle atrophy. Patients have been classified in type I–III SMA based on age at onset and clinical course. All three types of SMA are caused by alterations in the survival motor neuron gene (SMN1) that also have a homologous copy named SMN2. About 95% of SMA patients show homozygous absence of SMN1 exon 7 due a deletion of this gene or a conversion into SMN2. The absence of SMN2 is found in about 5% of individuals with no clinical phenotype, but number of SMN2 copies modulates the phenotype of SMA patients. Considering this uniform mutation spectrum, direct molecular genetic testing consists basically of detecting deletions and conversions of exons 7 and 8 of these genes in SMA patients. In this work, we develop a real time PCR TaqMan® method and compared with the most commonly used PCR restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) assay, evaluating the potential application of molecular diagnosis of SMA patients. DNA samples from 100 individuals with clinical features of SMA were analyzed by both methods. Besides, patients DNA samples carrying a conversion event were analysed by direct DNA sequencing. Homozygous for SMN1 exon 7 absence were identified in 58 cases (58%) being the majority due to gene deletion and eight cases of gene conversion. From those, 56 were classified, according to the revised diagnostic criteria, and distributed as follows: 26 (46.4%) SMA type I, 16 (28.6%) SMA type II and 14 (25.0%) SMA type III. In addition, gene conversion was observed in 4 SMA type I patients, 3 SMA type II and 1 SMA type III patient. Among the remaining individuals five samples were found to be homozygous for absence of SMN2 gene. Comparing PCR-RFLP method and the method based on the TaqMan® system describe in this study, we verify that both were precise and specific for these analyses. However, the TaqMan® assay was faster and more sensitive than PCR-RFLP and was shown to be a suitable method for the diagnosis of SMA.

A doença de Gaucher (DG) é uma doença lisossômica de depósito, de herança autossômica recessiva, causada pela deficiência da enzima glicocerebrosidase (GC). Essa deficiência é causada por mutações no gene (GBA) que codifica esta enzima. Até o momento, mais de 250 mutações já foram identificadas nesse gene. O objetivo deste estudo foi identificar mutações na região codificante do gene GBA de pacientes brasileiros com DG através de PCR longo, seguido de nested PCR e sequenciamento direto. As análises foram realizadas em 54 pacientes não-aparentados com DG, confirmados por apresentar baixa atividade enzimática e com pelo menos um alelo mutante não-identificado após a triagem para 4 mutações comuns (p.N370S, p.L444P, 84insG e IVS2+1G>A). O protocolo introduzido permitiu a identificação de 7 variações de sequência novas (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC e IVS10+1G>T) no gene GBA de pacientes com DG. Todas essas novas variações de sequência são provavelmente alterações responsáveis pela doença, pois alteram resíduos conservados da proteína, inserem um aminoácido ou prejudicam o splicing normal do RNA mensageiro. Consequentemente, estas mutações causam mudanças na estrutura e/ou na função da GC. Além dessas, 24 mutações raras que já foram descritas previamente, também, foram identificadas nesse trabalho, contribuindo na definição do genótipo dos pacientes. A identificação dos alelos mutantes é importante para o conhecimento do espectro de mutações no nosso país e para aumentar o conhecimento das bases moleculares da doença. Além disso, essas informações podem também contribuir para a melhor compreensão de correlações genótipo-fenótipo, assim como, para o aconselhamento genético e/ou para a oferta de análises moleculares individualizadas para famílias em risco. / Gaucher disease (GD) is an autosomal recessive lysosomal storage disorder caused by deficiency of the glucocerebrosidase (GC). This deficiency is caused by mutations in the gene (GBA) coding for this enzyme. To date, more than 250 mutations have been identified associated with GD. The aim of this study was to identify mutations in the coding region of the GBA gene in Brazilian patients with GD through long-range PCR, followed by nested PCR and direct sequencing. Analyses were carried out in 54 unrelated GD patients who presented low enzymatic activity and had at least one unidentified disease-associated allele after screening for 4 common mutations (p.N370S, p.L444P, 84insG, and IVS2+1G>A). Protocol described here allowed the identification of 7 novel sequence variations (p.S125N, p.F213L, p.P245T, p.W378C, p.D399H, 982-983insTGC, and IVS10+1G>T) in the GBA gene of patients with GD. As these new sequence variations change conserved protein residues, insert an amino acid or affect mRNA normal processing, they are likely to be disease causing mutations. Consequently, these mutations cause changes in the GC structure and/or function. Besides, 24 rare mutations that were previously described were also identified in this work leading to the definition of patients´ genotype. The identification of mutant alleles is crucial for improving the knowledge of GBA mutation spectrum in our country and to the better understanding of molecular basis of the disease. Furthermore, such information may also contribute to the establishment of genotype-phenotype correlations as well as for more specific genetic counseling and/or to offer a customized molecular analysis for families at risk.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T22:36:45Z No. of bitstreams: 1 2010_GabrielFalcaoAlencar.pdf: 7027823 bytes, checksum: 3bf1e72d9a1d70ddb841a4686fc1d977 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-05-21T22:48:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_GabrielFalcaoAlencar.pdf: 7027823 bytes, checksum: 3bf1e72d9a1d70ddb841a4686fc1d977 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-21T22:48:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_GabrielFalcaoAlencar.pdf: 7027823 bytes, checksum: 3bf1e72d9a1d70ddb841a4686fc1d977 (MD5) / Introdução: A maloclusão de Classe III pode ser consequência de crescimento exagerado da mandíbula, pouco desenvolvimento da maxila ou combinação de ambos. Análises de segregação apontaram diversos padrões de herança, especialmente herança autossômica dominante com penetrância incompleta, modelo poligênico com presença de um limiar, multifatorial e a presença de um gene principal. Evidência de ligação foi observada nos cromossomos 1p, 3q, 6q, 11q, 12q e 19q. Análise prévia com uma família informativa colombiana apontou para uma região candidata no cromossomo 7p. Objetivo: Identificar regiões cromossômicas envolvidas no desenvolvimento da maloclusão de Classe utilizando famílias brasileiras e colombianas. Materiais e Métodos: Foram coletadas amostras biológicas de 200 indivíduos de 36 famílias selecionadas (presença de dois ou mais membros afetados no heredograma) do Brasil e da Colômbia. Três SNPs no cromossomo 7 – rs1044701, rs1299548, and rs1882600 – que haviam mostrado evidência de ligação na análise prévia e cinco SNPs adicionais – rs1294611, rs9640034, rs9640038, rs11526212, rs7800782 – foram genotipados, via PCR em tempo real, em todas as amostras. O programa MENDEL foi utilizado para realizar a análise de ligação paramétrica e os parâmetros foram fixados: padrão de herança autossômica dominante com penetrância incompleta (80%) e 1% para o alelo causador. Após essa análise, buscamos por possíveis genes candidatos utilizando o banco de dados NCBI. Resultados: Evidência de ligação foi observada para o SNP rs1882600 (LOD=2,38) e sugestão de ligação foi observada no SNP rs1299548 (LOD máximo=1,09). Evidência de exclusão foi encontrada nos SNPs rs1044701 (LOD = -5.68) e rs7800782 (LOD = -5.34, when =0). Foi sugerido a região 7p22.2 – 7p21.3 como possível região de ligação, onde 11 genes candidatos foram propostos. Conclusão: Entre esses 11 genes candidatos, chama atenção, o COL28A1, pois já foi observada a presença da família do Colágeno no desenvolvimento da mandíbula em humanos e camundongos. Nosso resultado sugere fortemente a existência de heterogeneidade de locus no desenvolvimento da Classe III. ________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Class III Malocclusion can be caused by the overgrowth of the mandible, the undergrowth of the maxilla or a combination of both. Segregation heritability analysis pointed out several inheritance patterns, especially autosomal dominant inheritance with incomplete penetrance, polygenic threshold model, multifactorial etiology, and the presence of a major gene. Evidence of linkage was found for chromosomes 1p, 3q, 6q, 11q, 12q, and 19p. A previous analysis with one big Colombian family pointed to a possible candidate region on chromosome 7p. Aim: Identify chromosomal regions that lead to the development of Class III Malocclusion employing families from Brazil and Colombia. Material and Methods: 200 individuals from selected families (at least two affected member in the pedigree) from Colombia and Brazil had their biological samples collected. The three SNPs in chromosome 7 – rs1044701, rs1299548, and rs1882600 – that had shown evidence of linkage in the previous analysis and five additional SNPs - rs1294611, rs9640034, rs9640038, rs11526212, rs7800782 – in the q-terminal direction were genotyped, via RT-PCR, for all samples. For the parametric linkage analysis the MENDEL software was employed using the parameters for a dominant pattern of inheritance, with incomplete penetrance (80%) and 1% for the allele disease. After the analysis, we searched for possible candidate genes employing the NCBI databank. Results: Evidence of linkage (LOD=2.38) for the SNP rs1882600, suggestion of linkage for the SNP rs1299548 (LOD max.=1,09). and evidence of exclusion for rs1044701 (LOD = -5.68) and rs7800782 (LOD = - 5.34, when =0) were observed. The region between 7p22.2 – 7p21.3 was proposed as possible linked region, where 11 candidate genes were proposed. Conclusion: From the 11 candidate genes, one is very interesting, the COL28A1, due to the presence of the Collagen family in previous analysis in human and mice. The results strongly suggest the existence of locus heterogeneity.

Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T11:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Secolin_Rodrigo_D.pdf: 5866562 bytes, checksum: 5079bfd5d88341ce619480ba6e19fb16 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Fatores genéticos têm sido descritos para diversas doenças do sistema nervoso central. Uma etapa importante na identificação de genes responsáveis por estas doenças são os estudos de mapeamento genético. Além disso, devido às novas tecnologias de aquisição de dados de genótipos dos indivíduos, é necessário o estudo e desenvolvimento de programas de processamento de grande quantidade de dados para as análises estatísticas. Os objetivos deste trabalho foram: 1) criar uma interface entre os equipamentos de aquisição de dados de genótipos e os programas estatísticos, por meio de programas de processamento de dados; 2) aplicar e avaliar os modelos estatísticos em amostras de famílias segregando três doenças neuro-psiquiátricas: epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM), polimicrogiria perisylviana bilateral congênita (PPBC) e transtorno afetivo bipolar (TAB). A interface foi desenvolvida a partir de um algoritmo lógico, o qual adiciona a matriz dos dados dos genótipos provenientes dos equipamentos em uma matriz representativa dos dados das famílias. Este algoritmo, denominado JINGLEFIX, foi programado em linguagem de computador PERL e ambiente R e utilizado posteriormente nos estudos de mapeamento genético da ELTM, PPBC e TAB. Análise de segregação foi realizada em 148 famílias nucleares com ELTM, com um total de 698 indivíduos, visto que esta síndrome não possui padrão de herança conhecido. Uma família, segregando PPBC com um total de 15 indivíduos e um padrão conhecido de herança ligada ao X dominante, foi submetida à análise paramétrica de ligação por meio do pacote de programas LINKAGE, utilizando 18 marcadores microssátelites na região candidata Xq27-Xq28. Análise não paramétrica de ligação realizada em uma amostra de 74 famílias segregando TAB, totalizando 411 indivíduos, por meio do teste de transmissão de desequilíbrio de ligação (TDT), utilizando 21 single nucleotide polymosphisms (SNPs) para 21 regiões candidatas. A análise de segregação revelou a presença de um gene de maior efeito com um padrão autossômico dominante, além da presença de genes de menor efeito influenciando no fenótipo da ELTM. O posterior mapeamento genômico da ELTM, utilizando os parâmetros definidos na análise de segregação, revelou ligação genética na região 18p11. A análise paramétrica de ligação genética levou ao mapeamento da região Xq27 para a família com PPBC, diferente da região candidata previamente descrita. Esta diferença pode ser explicada pelo tipo de amostra familiar utilizada pelos dois estudos. Em relação ao TAB, a análise não paramétrica identificou a região candidata 3p22. Posterior estudo de refinamento da região 3p21-3p22 utilizando 94 SNPs adicionais e estudo de expressão gênica identificou o gene ITGA9 como possível gene de susceptibilidade para o TAB. Comparando o poder estatístico entre as análises, foi observado maior poder estatístico na análise paramétrica utilizando uma ou poucas famílias, com um número grande de indivíduos por família; enquanto que o poder estatístico foi maior nas análises não paramétricas utilizando múltiplas famílias de tamanhos moderados e estruturas variadas. Conclui-se que o algoritmo de processamento de dados e a adequada aplicação dos modelos estatísticos são fundamentais para sucesso do mapeamento genético das regiões e dos genes responsáveis pelas doenças neuro-psiquiátricas estudadas / Abstract: Genetic factors have been described for several central nervous system diseases. A main step for disease gene identification is genetic mapping study. In addition, due new genotype acquire technology, the development of genotype processing data software is required. The objectives of this work were: 1) to generate interface between genotype equipment and statistical software by processing data algorithm; 2) to apply and evaluate statistical models in family sample segregating three neurological diseases: mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), bilateral perysilvian polymicrogyria (BPP) and bipolar affective disorder (BPAD). Data interface was developed from a logic algorithm, which adds a genotype matrix data from equipment to a family data matrix. This algorithm, called JINGLEFIX, was implemented in PERL computer language and R environment. In addition, this software was used in genetic mapping study for MTLE, BPP and BPAD. Segregation analysis was performed in 148 nuclear MTLE pedigrees, with a total of 698 individuals, since this syndrome has not known inheritance pattern. One BPP pedigree with known X-linked dominant pattern of inheritance, with a total of 15 individuals, was submitted to parametric linkage analysis by LINKAGE package, using 18 microsatellite markers on candidate region Xq27-Xq28. Non-parametric linkage analysis was performed from 74 BPAD families, with a total of 411 individuals, by transmission disequilibrium test (TDT) and using 21 single nucleotide polymorphisms (SNPs) for 21 candidate regions. Segregation analysis revealed a major effect gene with an autosomal dominant pattern of inheritance and minor gene effect, which could influence MTLE phenotype. Further whole genome analysis mapped the putative MTLE major gene on 18p11. Parametric linkage analysis mapped Xq27 locus for BPP, a different region compared to the Xq28 previous described. This difference could be explained to sample type used by the two studies. Non-parametric linkage for BPAD identified the candidate region on 3p22. Further studies using 94 additional SNPs on 3p21-3p22 and gene expression analysis identified ITGA9 as susceptibility gene for BPAD. A comparison of statistical power between statistical analyses showed a high statistical power for parametric linkage analysis from one or a few large families; whereas a high statistical power was observed for non-parametric linkage analysis using several moderate size families. The conclusion of this study is that data processing algorithm and adequate statistical model applying are fundamental tools for successful of genetic mapping of complex diseases / Doutorado / Neurociencias / Doutor em Ciências

Orientadores: Jose Paulo Cabral de Vasconcellos, Vital Paulino Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:48:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cella_WenerPassarinho_M.pdf: 8448689 bytes, checksum: a8a8a7a3ca810183c1f5f3f2964e8c29 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A Síndrome de Axenfeld-Rieger é uma entidade clínica rara, de transmissão autossômica dominante e grande variabilidade clínica, podendo chegar à penetrância incompleta. Manifesta-se clinicamente por malformações do segmento anterior do olho acompanhada ou não de malformações extra-oculares, das quais as mais comuns são alterações dos ossos craniofaciais e dos dentes e falência de involução da pele peri-umbilical. O principal fator de morbidade da síndrome é a associação com glaucoma de desenvolvimento, presente em aproximadamente 50% dos indivíduos afetados. Dois genes, PITX2, localizado no cromossomo 4q25, e FOXCl, no cromossomo 6 p25, estão associados à Síndrome de Axenfeld-Rieger. Recentemente, identificou-se o gene GJAl associado à Síndrome de Displasia Oculodentodigital, a qual compartilha aspectos clínicos com a Síndrome de Axenfeld-Rieger tais como malformações do segmento anterior ocular, glaucoma e alterações ósseas e dentárias, tornando-se, assim também, mais um gene candidato para a Síndrome de Axenfeld-Rieger. O objetivo deste estudo foi avaliar a ffeqüência e os tipos de mutações nos genes PITX2, FOXCl e GJAl em pacientes portadores da Síndrome de Axenfeld-Rieger associada a glaucoma, além de correlacionar possíveis alterações moleculares com aspectos clínicos dos pacientes. Para tanto, foram examinados oito indivíduos (casos-índice) acometidos pela síndrome associada a glaucoma, assim como seus familiares. Após avaliação oftalmológica e sistêmica, foram coletados 5ml de sangue periférico para extração de DNA genômico, o qual foi amplificado por reação em cadeia de polimerase utilizando-se pares de iniciadores específicos para as regiões codificadoras e limites íntronJexon dos genes PITX2, FOXCl e GJAl, procedendo-se com o seqüenciamento automático para o rastreamento de mutações. Não foram encontradas mutações no - gene PITX2. No gene FOXCl foram encontradas uma inserção (1359-1360insGGC), uma deleção (718-719deICT) e uma mutação de ponto do tipo sem sentido (TrpI52STOP) entre as famílias estudadas. O paciente portador da deleção no gene FOXCl era um caso isolado e apresentava apenas alterações oculares da síndrome. As outras duas mutações ocorreram em pacientes com manifestações oculares e sistêmicas da doença, estando a inserção presente em um caso isolado e a mutação sem sentido em seis indivíduos da mesma família com padrão de transmissão autossômico dominante. O rastreamento de mutações no gene GJAl evidenciou uma mutação de ponto do tipo sentido trocado (Ala253Val) em três indivíduos da mesma família, sendo que um deles era clinicamente normal e dois sintomáticos que apresentavam concomitantemente a mutação Trp152STOP no gene FOXCl. Esta é a primeira descrição de uma mutação no gene GJAl em pacientes inequivocamente portadores da Síndrome de Axenfeld-Rieger. As ITeqüências de mutações observadas nos genes PITX2, FOXCl e GJAl em oito famílias brasileiras com Síndrome de Axenfeld-Rieger e glaucoma de desenvolvimento associado foram de 0%, 37,5% e 12,5%, respectivamente, sendo esta última em combinação com a mutação Trp152STOP no gene FOXCl. Apesar da amostragem reduzida, observou-se uma tendência a maior agressividade do glaucoma em pacientes portadores de mutação somente no gene FOXCl do que nos indivíduos portadores de mutação concomitante no gene FOXCl e no gene GJAl, sugerindo um possível efeito protetor da mutação Ala253Val no gene GJAl nesta família. Outros estudos são necessários, contudo, para definir a função do gene GJAl na etiopatogênese da Síndrome de Axenfeld-Rieger / Abstract: Axenfeld-Rieger Syndrome (ARS) is arare disorder, usually transmitted in an autosomal dominant pattem characterized by anterior segment dysgenesis and often associated with developmental glaucoma. In addition to the ocular changes observed in ARS, syndromic features can also occur, such as facial bone defects, teeth anomalies and peri-umbilical skin involution. Two transcription factor genes, PITX2 on chromosome 4q25 and FOXCl on chromosome 6p25, have been associated with the ARS phenotype through mutational events. Recently, the GJAl gene (connexin 43), associated with oculodentodigital dysplasia (ODDD) syndrome, which presents some similarities with ARS, was identified. The ODDD syndrome is characterized by malformations that involve the face, eyes, teeth and bones. The ocular abnormalities include microphthalmos and anterior segment dysgenesis that may lead to glaucoma as well. The main purpose of this study was to evaluate FOXCl, PITX2 and GJAl genes mutations in Brazilian patients with ARS. Eight unrelated patients atfected by ARS (all of them with glaucoma and 5 without systemic malformations) and their families were ophthalmologically evaluated and had their blood collected for DNA extraction purposes. The coding regions and íntron/exon boundaries of these genes were completely evaluated through direct sequencing. Among the 8 patients, 3 (37,5%) presented with ditferent structural alterations in the FOXCl gene. A deletion in heterozygosis oftwo bases downstream the forkhead domaÍn was observed in a patient with no systemic malformations (718-719deICT). An insertion ofthree bases, also downstream the forkhead domain, was identified in a patient with systemic malformation (1359-1360insGGC). A new nonsense mutation (Trp152STOP) was identified in the forkhead domain of the FOXCl gene in another patient with ARS and systemic alterations as well. One patient harbored the mutation Ala253Val in the GJAl gene (12,5%). No mutations were identified in the PITX2 gene among these individuaIs. Patients who carried the GJAl (Ala253Val) and FOXCl (TrpI52STOP) mutations (:&om the same family) developed less severe glaucoma compared with family members presenting FOXCl (TrpI52STOP) mutation alone. Three new structural alterations of the FOXCl gene and one new mutation in the GJAl gene were described in Brazilian patients with ARS and the :&equencyof mutations in the PITX2, FOXCl and GJAl genes in this study were 0%, 37,5% and 12,5%, respectively. Despite the small number of patients, we found a slight trend to more severe glaucoma in patients with FOXCl mutations compared to those without them, except in the two patients with FOXCl and GJAl associated mutations, suggesting an attenuation effect of GJAl gene mutation (Ala253Vai). However, other studies are necessary to define the exact role ofGJAl in ARS / Mestrado / Oftalmologia / Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Margaret de Castro, Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-29T02:58:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vieira_AlexandreEduardoFranzin_M.pdf: 20009161 bytes, checksum: 754755440e3dcdf556da021e2b78a147 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A Neoplasia Endócrina Múltipla (NEM) tipo 2A é caracterizada pela presença de Carcinoma Medular de Tireóide (CMT), feocromocitoma e hiperparatireoidismo. Esta síndrome pode ser diagnosticada em portadores assintomáticos pertencentes a famílias de indivíduos acometidos pela síndrome utilizando-se testes periódicos de estimulação da secreção de calcitonina pela gastrina. Entretanto, a analise do DNA genomico permite a identificação destes indivíduos, possibilitando diagnostico mais precoce e tratamento preventivo. O objetivo deste trabalho foi analisar dois diferentes testes de rastreamento de CMT, com a finalidade de diagnosticar portadores assintomáticos de famílias com indivíduos com NEM 2 A: um teste bioquímico utilizando o omeprazol e a analise molecular do gene do protooncogene com NEM 2A foram submetidos ao teste de secreção de calcitonina induzida pelo omeprazol. Calcitonita e gastrina foram determinadas por imunoensaios. DNA genomico foi extraído de sangue total dos 15 indivíduos que concordaram com o estudo. Os exons 10 e 11 foram amplificados por PCR e os produtos analisados por seqüenciamento direto. O teste de estimulo da secreção de calcotonina pelo omeprazol não identificou nenhum portador assintomático. Entre os membros da família 1 encontramos três indivíduos afetados pela mutação germinativa TGC ->TAC (C634Y). Dois irmãos apresentavam CMT, sendo que na irmã associavam-se feocromocitoma e hiperparatireoidismo; o filho desta ultima, de nove anos de idade, apresentava status previamente desconhecido. O estudo da família 2 demonstrou a mutação TGC ->CGC (C634R) somente no caso-indice. Esta paciente apresentava alem do CMT, feocromocitoma, hiperparatireoidismo e líquen amiloidotico cutâneo. Seus pais e seus quatro irmãos, todos assintomáticos, não apresentaram esta mutação, sugerindo que a mutação C634R ocorreu de novo nesta paciente. Em conclusão, a especificidade do teste do omeprazol foi limitado e a eficácia deste teste permanece a ser estabelecida. As duas mutações mais freqüentemente encontradas no protooncogene RET na NEM 2A, estão presentes em famílias brasileiras. A analise molecular deverá ser o procedimento de escolha para o rastreamento de famílias com NEM 2A, desde que é preciso e dispensa testes bioquímicos repetitivos / Abstract: Patients with MEN type 2A are at risk for early medullary thyroid carcinoma (MTC), which might be diagnosed by periodical gastrin-induced calcitonin tests. However, direct DNA analysis permits the identification of asymptomatic mutant carriers in a family, providing an early and definitive diagnosis. We performed different screening tests for MTC, a recently reported biochemical screening test using omeprazole and DNA analysis. Fifteen members of two non-consanguineous Brazilian famílies with MEN 2A were submitted to the omeprazole-induced calcitonin stimulation test. Serum calcitonin and gastrin were determined by immunoassays. RET proto-oncogene analysis was carried out by direct DNA sequencing of PCR-amplified products for exons 10 and 11. Family 1 showed a TGC~ TAC (C634Y) germline mutation in three individuais. Two brothers with symptomatic MTC, one of them also associated with pheocromocytoma and hyperparathyroidism whose son was a nine-year-old boy of previously unknown status. Famíly 2 showed a TGC~CGC (C634R) mutation only in the index case, who presented cutaneous lichen amyloidosis in addition to MTC, pheocromocytoma and hyperparathyroidism. Neither her parents nor her four brothers showed this genetic mutation. The two most frequent RET protooncogene mutations in MEN 2A are present in Brazilian families. In addition, the specificity of basal and omeprazole-stimulated calcitonin is rather limited and the efficacy of the omeprazole test still remains to be systematically examined. Therefore, RET proto-oncogene analysis must be the first choice for a screening procedure to identify mutant gene carriers in MEN 2A family members and to permit early prophylactic treatment / Mestrado / Patologia Clinica / Mestre em Ciências Médicas