Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2010-11-16T17:45:46Z No. of bitstreams: 1 2010_EderAlvesBarbosa.pdf: 2016959 bytes, checksum: d0a01e4a8d5a19d2073a2e7c900a90a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-11-16T22:59:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_EderAlvesBarbosa.pdf: 2016959 bytes, checksum: d0a01e4a8d5a19d2073a2e7c900a90a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-11-16T22:59:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_EderAlvesBarbosa.pdf: 2016959 bytes, checksum: d0a01e4a8d5a19d2073a2e7c900a90a8 (MD5) / O presente trabalho descreve um modelo experimental que permite avaliar as alterações nos níveis de transcrição de RNAs, síntese e processamento de peptídeos presentes nas secreções cutâneas de anfíbios. A partir deste modelo, foram utilizadas ferramentas de biologia molecular em associação com técnicas de obtenção de imagens moleculares por espectrometria de massa, com o objetivo de avaliar como Hypsiboas raniceps reage a um modelo experimental no qual anfíbios são submetidos a diferentes tipos de estresses (bióticos e abióticos). A utilização das técnicas de biologia molecular conjugadas a imagens de íons moleculares por espectrometria de massa permitiu as análises dos níveis de transcrição de diversos genes, assim como da síntese dos peptídeos codificados a partir destes, em uma mesma região do tecido animal. Os resultados sugerem que a aplicação do estímulo elétrico (estresse abiótico) promove um aumento imediato dos níveis de transcrição dos genes e seus respectivos peptídeos antimicrobianos em H. raniceps o qual se estende por até 36 horas, período no qual as glândulas granulares tornam-se carregadas de peptídeos novamente e os níveis de transcrição voltam a diminuir. De forma análoga aos dados anteriores, a presença de micro-organismos (Estresse biótico) na pele de H. raniceps parece estimular o sistema imune inato de defesa ao promover o aumento dos níveis de transcrição dos genes que codificam peptídeos antimicrobianos. Sob condições experimentais complementares às anteriores, anfíbios submetidos ao contato tópico com os antibióticos, oxacilina, gentamicina e ampicilina, apresentaram níveis de expressão gênica superiores àqueles dos anfíbios que foram expostos unicamente a micro-organismos. O modelo experimental proposto apresenta-se como uma estratégia alternativa para estudos de análise da expressão diferencial de peptídeos em tecidos biológicos. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The present work describes a strategy for in situ identification of antimicrobial peptides present in frog skin, their respective RNA transcription levels and peptide synthesis variation analysis. The chosen experimental model is based on molecular biology and imaging mass spectrometry (IMS) techniques to investigate the antimicrobial peptide skin composition of Hypsiboas raniceps when the anuran is submitted to biotic and abiotic stress. Under a mild electrical shock stimulation high transcriptional levels of RNA encoding antimicrobial peptides can be observed for 36 hours, only after that antimicrobial peptides ions are detected by IMS experiments whereas the transcriptional levels decrease. When the animals are exposed to pathogenic microorganisms (biotic stress) there is an evident increase in gene expression levels leading to a corresponding increment on antimicrobial polypeptide content in the skin. In a complementary experiment, frogs were washed with an antibiotic solution, containing oxacillin, gentamicin and ampicilin. Under this conditions superior RNA expressions levels than the previous experiments were observed suggesting that the microorganism-based molecules that composed the antibiotic solution may have triggered the defense mechanism more efficiently. The experimental model introduced here represents an alternative strategy for differential gene expression analysis and peptides identification directly on biological tissue.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2010. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2010-11-10T19:47:58Z No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-12-08T22:54:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-12-08T22:54:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_EvelineQueirozdePinhoTavares.pdf: 10549437 bytes, checksum: 9aa3d943af10dc802ad268d781829074 (MD5) / O Bioetanol é um combustível alternativo particularmente interessante, pois paralelamente às técnicas já estabelecidas pela indústria sucroalcooleira no Brasil, são geradas imensas quantidades de bagaço-de-cana, um resíduo bastante sub-aproveitado. Este pode apresentar de 40 a 50% de celulose, polímero resultante da repetição de unidades de Dglicose unidas por ligações ß-1,4. Estas podem ser alvo de enzimas celulolíticas produzidas principalmente por fungos filamentosos. O emprego de estratégias envolvendo sistemas heterólogos para produção destas enzimas pode favorecer o alcance dos níveis máximos de produção em prazos inferiores aos observados em sistemas nativos, além de facilitar a purificação da proteína recombinante. Neste trabalho, foi realizada a caracterização parcial da endoglicanase A (EG A) de Aspergillus nidulans, enzima de interesse biotecnológico incluída no projeto da rede Bioetanol (MCT/FINEP), onde nosso grupo desenvolve a meta de “Produção de celulases recombinantes em sistema heterólogo de Pichia pastoris”. As construções para clonagem envolveram promotores induzíveis por metanol, sendo o vetor de expressão obtido dirigido para integração no genoma de P. pastoris. Assim, após clonagem e transformação desta levedura metilotrófica, foi realizada a expressão heteróloga desta enzima seguida de sua purificação parcial. Empregando o sobrenadante dos clones recombinantes, foi obtido um produto heterólogo com atividade máxima em carboximetilcelulose (CMC) a partir de 24 h de indução. Após purificação empregando ultrafiltração e filtração em gel, a enzima recombinante foi caracterizada, atuando preferencialmente em pH ácido (de 4,5 a 5,0) e temperatura próxima a 50oC, em torno da qual esta enzima apresentou-se termoestável a 45 e 55oC por cerca de 48 h. Foi observado um incremento de 30 a 80% nos valores de atividade diante da incubação com Co2+, DTT e ß-mercaptoetanol. A degradação de substratos alternativos mostrou-se significativa somente na incubação com CMC e, em menor extensão, em papel de filtro. Além disso, a análise de atividade em gel e o perfil eletroforético das amostras das etapas da purificação confirmaram a massa molecular de 34 kDa, conforme esperado. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Bioethanol is an alternative fuel of particular interest because in Brasil, the techniques used in fuel industry generate an enormous amount of a by-product, which could be further degraded: the sugarcane bagasse. It can presents 40-50% of cellulose content, which is a polymer composed by repeated units of D-glucose, linked by ß-1,4 bonds. These bonds can be cleaved by cellulolytic enzymes produced specially by filamentous fungi. The use of heterologous expression strategies to produce these enzymes can be advantageous in order to higher levels of production in shorter periods compared as those observed with wild type enzymes, besides the feasibility of recombinant protein purification methods. In this work, we describe the partial characterization of endoglucanase A (EG A), produced by Aspergillus nidulans. On account of the biotechnological interest, this enzyme was included in the project of the Bioethanol net (MCT/FINEP), and our group was responsible for developing the “Recombinant cellulases production employing Pichia pastoris as a heterologous expression system. The cloning vector was constructed using methanol-induced promoters, with the foreign DNA being directed to be integrated in the Pichia pastoris genome. Finally the enzyme was partially purified and characterized. To examine whether higher levels of activity towards CMC would occur, we used the supernatant of the recombinant clones. We observed the highest level of activity after 24h of induction. After ultrafiltration and gel filtration purification procedures, we characterized an enzyme that acts preferentially at pH 4, which is thermostable at a temperature of approximately 50ºC. It was observed an increased enzyme activity when the enzyme was incubated in the presence of Co2+, DTT and ß-mercaptoethanol. The hydrolysis of lignocellulosic substrates was significant only with CMC and, at a lesser extent, with filter paper. Also, the analysis of activity in gel and the electrophoretic profile of the purified samples confirmed the molecular mass of 34 kDa, as predicted.

Dissertação (mestrado)-Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Débora Amorim Romcy Pereira (deboraromcy@bce.unb.br) on 2011-06-22T13:54:39Z No. of bitstreams: 1 2010_GabrielaMatsunagaMenezes.pdf: 9488298 bytes, checksum: d068429718fff57eea878d5a6c0e70a3 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-22T14:14:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_GabrielaMatsunagaMenezes.pdf: 9488298 bytes, checksum: d068429718fff57eea878d5a6c0e70a3 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-22T14:14:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_GabrielaMatsunagaMenezes.pdf: 9488298 bytes, checksum: d068429718fff57eea878d5a6c0e70a3 (MD5) / As sedas de aranhas combinam biocompatibilidade e biodegradabilidade e são conhecidas pelas suas propriedades mecânicas, o que as torna visadas para aplicações médicas, militares e têxteis. Acredita-se que características como força e extensibilidade resultem de motivos de proteína específicos e várias tentativas para sua produção in vitro têm sido feitas, mas as características das fibras sintéticas ainda não são comparáveis às exibidas pelas fibras nativas. A microscopia de força atômica (MFA) foi escolhida para descrever a estrutura da superfície e o comportamento mecânico de 19 fibras sintéticas de aranha, e a microscopia eletrônica de varredura (MEV) foi utilizada para caracterização em dimensões maiores. As seqüências de DNA sintéticas foram construídas combinando motivos de força e extensibilidade, e duas proteínas foram produzidas em Escherichia coli, consistindo as variações em dois resíduos de aminoácidos na seqüência repetitiva de cada proteína (A1S820 e Y1S820). Grupos controle foram mantidos e algumas das fibras foram submetidas a diferentes tratamentos, que incluem testes de tensão e banhos de metanol, isopropanol e /ou água. Imagens da superfície (MEV) e imagens de topografia e fase (MFA) foram adquiridas. Seis parâmetros de rugosidade foram analisados e medidas de espectroscopia de força foram realizadas para a obtenção da mecânica local das fibras. Tratamentos distintos resultaram em diferenças significativas e as fibras sintéticas apresentaram-se heterogêneas, com irregularidades de superfície na maioria dos casos. As diferenças na rugosidade e nos parâmetros mecânicos medidos evidenciam importantes distinções entre as fibras resultantes da proteína A1S820 e da Y1S820. Mostra-se, portanto, que a sequência primária das proteínas é fundamental para as propriedades mecânicas das fibras. Os resultados mostram ainda uma melhoria das propriedades verificadas para o os grupos A1S820 tratados com isopropanol e para o grupo Y1S820 tratado com água. Este estudo avaliou as fibras sintéticas qualitativa e quantitativamente, apontando MFA e MEV como técnicas capazes de descrever de forma única os detalhes particulares da estrutura de superfície das fibras sintéticas de aranha. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Spider silks combine biocompatibility and biodegradability and are well known for their mechanical properties, what makes them suitable for medical, military and textile purposes. Characteristics such as strength and extensibility are believed to result from specific protein motifs and various attempts on spider silk in vitro production have been made, but synthetic fibers’ characteristics are still not comparable to the properties exhibited by native fibers. Atomic force microscopy (AFM) has been chosen to describe the surface structure and the mechanical behavior of 19 synthetic spider fibers and scanning electron microscopy (SEM) has been used for characterization in higher dimensions. The synthetic DNA sequence was engineered combining strength and extensibility motifs and two synthetic proteins were produced in Escherichia coli. Variations consisted on two amino acid residues on the repetitive sequence of each protein (A1S820 e Y1S820). Control groups were maintained and the some of the fibers were submitted to different types of treatments, which include tensile tests and methanol, isopropanol and/or water bath. Surface images (SEM) and topography and phase images (AFM) were obtained. Six roughness parameters were analyzed and force spectroscopy measurements were also performed in order to verify fibers local mechanics. Distinct treatments resulted on significant differences and the synthetic fibers appeared very heterogeneous, with surface irregularities in most cases. Differences in roughness could also be noticed and the mechanical parameters measured evidence important distinctions among the A1S820 and the Y1S820 fibers. Therefore, it has been shown that the primary sequence of the proteins is fundamental for the mechanical properties of the fibers. Moreover, the results show an improvement of the material properties measured for the A1S820 isopropanol treated groups and the Y1S820 water treated group. This study was able to evaluate synthetic fibers qualitatively and quantitatively, pointing AFM and SEM as techniques able to describe uniquely particular details of synthetic spider fibers surface structure.

Submitted by Isaac Francisco de Souza Dias (isaac.souzadias@ufpe.br) on 2016-06-07T17:40:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-07T17:40:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Dissertação_Lylyan_2014.2.pdf: 1468134 bytes, checksum: 8d21d1e0d24b3b3ae2fff646c4652a34 (MD5) Previous issue date: 2014-11-26 / FACEPE / As Calcificações Cerebrais Familiares Primárias (CCFP) constituem uma rara condição genética de herança autossômica dominante e se caracterizam, primordialmente, pela deposição simétrica e bilateral de cálcio nos gânglios da base do cérebro. Em 2012 foi identificada a primeira mutação associada com as CCFP no gene responsável pela codificação do tipo III de um transportador de fosfato inorgânico sódio-dependente (PiT2), o SLC20A2. Ele é reportado como o principal elemento do mecanismo patológico das CCFP, visto que, sua perda funcional está relacionada com o acúmulo de fosfato inorgânico na matriz extracelular. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar o padrão de expressão do gene SLC20A2 sob o efeito de mutações encontradas em amostras de pacientes com CCFP. O cDNA foi sintetizado a partir do RNA total que foi isolado do sangue dos pacientes. Em seguida, com o uso da técnica de PCR Quantitativa em Tempo Real (qRT-PCR), quantificou-se a expressão do mRNA nas amostras com base no método ΔΔCt. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do SLC20A2 foi levemente reduzida (~10%) na amostra de um paciente portador de uma mutação nonsense, em comparação ao grupo controle. O eletroferograma do sequenciamento do cDNA indicou uma diminuição no pico do alelo mutante comparativamente ao DNA genômico, indicando que está ocorrendo o decaimento do mRNA mediado pela presença da mutação nonsense. Juntamente com os achados reportados na literatura, os dados desta pesquisa reforçam a necessidade da triagem dos genes relacionados às CCFP bem como das mutações envolvidas com suas bases moleculares. / The Primary Familial Brain Calcifications (PFBC) is a rare genetic disease which present an autosomal dominant inheritance and is characterized by bilateral calcifications affecting basal ganglia. In 2012 it was identified the first mutation in SLC20A2 associated with PFBC. The SLC20A2 gene is responsible for encoding type III carrier of inorganic phosphate (Pi) sodium-dependent (PiT2) and it is reported as the major element of the PFBC pathological mechanism, once their functional loss is associated with the Pi accumulation in extracellular matrix. Therefore, this study aimed to evaluate the SLC20A2 expression under the effect of mutations, in patients with PFBC. The cDNA was synthesized from total RNA isolated from patients peripheral blood. Quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) was used to measure mRNA level amongst patients and controls based on the ΔΔCt method. The results showed that the SLC20A2 expression was slightly decreased (~ 10%) in the proband with a missense mutation, compared to control group expression. The results of cDNA sequencing showed reduced expression compared to genomic DNA mutant allele, indicating that the mRNA decay is occurring mediated by the presence of nonsense mutation. Together with the findings already reported in the literature, our data reinforce the need to screening for genes associated to the PFBC and the mutations involved with their molecular bases.

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T10:52:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Yunes_JoseAndres_D.pdf: 5403361 bytes, checksum: 9a1f073f9811bc3a1e517f2a7f931558 (MD5) Previous issue date: 1997 / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Ciências

Orientador: Christine Hackel / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T18:56:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cabral_DanielaFarias_M.pdf: 4097915 bytes, checksum: 6be235de51a5070ba07ca11ef7addf91 (MD5) Previous issue date: 1997 / Mestrado

Orientador: Laura Sterian Ward / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T20:03:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_SolangeCampelo_M.pdf: 11916000 bytes, checksum: 395197d06c771d1626afeb749a3d8eeb (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Mutações no gene da Neoplasia Endócrina Múltipla tipo 1 (MEN1) têm sido descritas não só em portadores da Síndrome da MEN1, mas também em tumores esporádicos como gastrinomas, insulinomas, e carcinóides brônquicos. Pesquisamos o exon 2 do gene MEN1, tendo em vista a alta prevalência de mutações descritas nesta região do gene. Foram analisados 148 tumores esporádicos, endócrinos e nãoendócrinos. Setenta e oito tumores eram de tiróide: 28 adenomas foliculares (AF), 35 carcinomas papilíferos (CP), 14 carcinomas foliculares (CF), e um carcinoma anaplásico (Ana); havia 46 lesões de adrenal: 3 hiperplasias, 3 adenomas, e 35 carcinomas de córtex adrenal, 2 feocromocitomas, 2 ganglioneuroblastomas e um linfoma; e 24 tumores de mama: 6 carcinomas não invasivos, 16 do tipo infiltrante ductal, 2 do tipo invasivo lobular. A extração de DNA de 108 tumores embebidos em parafina e de 40 tecidos frescos foi realizada utilizando a técnica de fenol-clorofórmio e precipitação com álcool. Utilizamos 5 pares de primers para amplificar todo o exon 2 do gene MEN 1 pela técnica da Reação da Polimerase em Cadeia seguida por Single Strand Conformation Polymorphism Analysis (pCRSSCP). Os produtos de PCR de cinco tumores apresentaram banda suspeita de alteração ao SSCP. Esses produtos foram seqüenciados sense e anti-sense, mas não mostraram mutações. Nossos resultados sugerem que mutações no exon 2 do gene MEN 1 não ocorrem nos tumores esporádicos de tiróide, adrenal e mama / Abstract: Besides the mutations that underlie most cases of familial or sporadic Multiple Endocrine Neoplasia syndrome, somatic mutations of the MEN1 gene has also been described in sporadic tumors like gastrinomas, insulinomas and bronchial carcinoid, where MEN 1 is the known gene most frequently mutated. In order to determine whether the gene could also be involved in other types of endocrine and non-endocrinetumors, we examined this gene for exon 2 mutations in thyroid, adrenal and breast tumors. We performed polymerase chain reaction -single strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) technique to screen exon 2 of the MEN1 gene of 78 sporadic thyroid tumors: 28 follicular adenomas (FA), 35 papillary carcinomas (PC), 14 follicular carcinomas (FC) and 1 anaplastic thyroid carcinoma (Ana). We also examined 46 adrenal lesions (3 hyperplasias, 3 adenomas and 35 adrenocortical carcinomas, 2 pheochromocytomas, 2 ganglioneuroblastomas, 1 lymphoma) and 24 breast cancers (6 noninvasive, 16 infiltrating ductal, 2 invasive lobular). DNA was obtained using phenol/chIoroform extraction and ethanol precipitation from 108 formalin-fixed, paraffin embedded samples and other 40 fresh tumor tissues. A non-radioactive PCR-SSCP was performed using 5 pairs ofprimers to encompass the complete coding sequence of exon 2 of the MEN 1 gene where most mutations have been described. The product of PCR of 5 tumors suspected to present bands shift at SSCP was submit to direct sequencing, sense and antisense, but did not identify mutations. These results suggest that exon 2 of MEN 1 gene is not important in breast, thyroid or adrenal sporadic tumorigenesis / Mestrado / Clinica Medica / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Joyce Maria Annichino Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-28T15:02:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sanchez_YajairaAnayansiSingh_M.pdf: 3379773 bytes, checksum: e17058ecd9e6c695cd4f240c4256a6e4 (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: A proteína C é o componente central de um importante sistema natural de regulação antitrombótico. É uma glicoproteína plasmática dependente da vitamina K que age degradando proteoliticamente os fatores procoagulantes V e vm ativados. Além disso, a proteína C estimula a fibrinólise através da fonnação de um complexo com o inibidor do ativador do plasminogênio. A deficiência hereditária de proteína C é uma causa importante de doença tromboembólica venosa. Os primeiros relatos sobre esta deficiência sugeriam que a herança era autossômica dominante. Contudo, posteriormente a hipótese de uma herança autossômica recessiva, em que somente os homozigotos ou duplo heterozigotos desenvolvem trombose foi proposta. Por um longo período as bases moleculares para essas observações contlitantes não foram esclarecidas, apesar da hipótese de que em famílias com trombose a interação de outro defeito genético que interfere com o gene da proteína C, ou da associação com outros defeitos que predispõem à trombofilia devem estar presentes. O gene da proteína C está localizado no cromossomo 2 na posição q13-qI4. Composto por 9 exons e 8 introns, abrange aproximadamentellkD, e origina um RNAm de 1,6 a 1,8kb. Segundo dados do último database de mutações no gene da proteína C publicado em 1996 por Reistma et aI., foram descritas 160 mutações. Dentre estas, 135 eram diferentes mutações de ponto, sendo 79% mutações missense, 8% mutações no sítio de splicing, 6.6% mutações silenciosas e 6% mutações nonsense. Delas, 32% ocorreram em diIíucIeotídeos CpG, que são considerados hipermutáveis (hotspot). Foram também descritas 8 diferentes inserções, 12 pequenas deleções e uma grande deleção. Além disso, 4 polimorflsmos foram descritos. Neste trabalho foram estudados 6 pacientes com deficiência de proteína C que apresentaram trombose venosa. Outras deficiências que predispõem à trombose também foram avaliadas. Todos os exons e regiões intrônicas flanqueadoras do gene da proteína C foram estudados utilizando uma estratégia que combinava reação em cadeia da polimerase (PCR), análise de polimorfismo de conformação em hélice simples (SSCP) e eletroforese em gel sensível à conformação (CSGE) para o rastreamento de mutações. Os ftagmentos amplificados de PCR que apresentaram um padrão eletroforético alterado em relação aos controles normais nas análises por SSCP ou CSGE foram sequenciados para a determinação precisa das alterações moleculares. A análise pelo método de PCR-CSGE se mostrou mais eficaz no rastreamento de alterações moleculares que a análise pelo método de PCR-SSCP. Com essa metodologia foram detectadas mutações em 83% dos pacientes, identificando-se 5 mutações de ponto, incluindo uma mutação silenciosa, além de um polimorfismo para vários dos pacientes. Apenas uma dessas mutações ainda não foi descrita na literatura. A primeira, detectada em 2 pacientes não relacionados, é decorrente de uma transversão c~ T (posição 6182), que substitui o aminoáciqo Arg 157 por um codon de terminação prematura (stop), no exon 7. Este exon codifica a r~gião do peptídeo de ativação. Esta alteração r,esulta na exclusão do alelo mutante ou na síntese de uma proteína truncada que pode ou não ser secretada. A segunda, é uma transversão G~A (posição 6246), que substitui o aminoácido Arg 178 por GIn, no exon 7. Esta mutação afeta as interações entre os aminoácidos, causando uma mudança confonnacional, e rápida degradação, e conseqüente redução na secreção da proteína. A terceira, uma substituição A~G na região promotora (posição -1533), afeta a eficiência transcricional, uma vez que a mesma ocorre dentro de uma seqüência consenso de ligação com o HNF-3 (futor nuclear dos hepatócitos). A última, decorre de uma transversão G~T, (posição 3190), substituindo o aminoácido Gly 83 por Cys, no exon 5. Este exon codifica o primeiro domínio EGF. Esta mutação, que ainda não foi descrita na literatura, provavelmente afeta as interações entre aminoácidos, causando alterações na estrutura terciária, e redução na secreção da proteína. Es+..as &'terações devem ser as responsáveis pela deficiência hered.it:árúl de proteína C, pois segregam com a deficiência nos familiares estudados, e 3 delas já foram descritas como a causa da doença em outros pacientes. Nossos resultados indicam que na deficiência de proteína C é freqüente a ocorrência de mutações recorrentes, pois 4 mutações já haviam sido descritas em outros países, em famílias com essa deficiência, e 2 delas ocorreram em sítios hipermutáveis, de dimeros CpG, no exon 7. A determinação das alterações moleculares no gene da proteína C é uma importante ferramenta para o esclarecimento de àiagnósticos duvidosos de deficiência de proteína C e para a investigação da relação estrutura e função da proteína C / Abstract: Protein C is the central component of an important natural system of antithrombotic regulation. 1t is a pIasmatic vitamin-K dependent glicoprotein that acts degrading proteolitycal1y the procoagulant active factors V and vrn. In addition, protein C stimulates fibrinolysis through the fonnation of a complex with plasminogen activator inhibitor (PAI). The hereditary protein C deficiency is an important cause of venous thromboembolic disease. The first reports about protein C deficiency suggested that it had a dominant autossomic hereditary pattem. Nevertheless, subsequentlyan hypothesis of a recessive autossomic pattem in which only homozygotes and double heterozygotes would develop thrombosis was proposed. For a long time, the molecular basis for these conflicting observations were not elucidated, in spite ofthe hypothesis that in thrombofilic families other genetic defects which interfere with protein C gene or the association with other defects which predispose to thrombofilia might be presents. The gene which controIs the synthesis of protein C is locatedin chromosome 2, at position q13-q14. 1t spans 9 exons and 8 introns comprising a.region over llkb, which originates a rnRNA of 1.6 to 1.8kb. According to the protein C gene mutation database published by Reitsma et al.,1996; 160 mutations were described. Among these, 135 were different point mutations, 79% were miss~nse mutations, 8% were splice site mutations, 6.6% were silent mutations and 6% were nonsense mutations. Thirty two percent occurred in CpG dinucleotides, which are considered mutation hotspots. Eight different insertions, twelve short and one large deletion were descnDed. In addition, four polymorphisms were also described. In this work, 6 patients with protein C deficiency who developed venous thrombosis were studied. Other defiCÍenCÍes which predispose to thrombosis were also evaluated. All the nine exons and exon-intron boundaries of the proteinC gene were studied using a strategy which combines polymerase chain reaction (PCR), nonradioactive single-strand confonnational polymorphism (SSCP) and onfonnation-sensitive-gel electrophoresis (CSGE) ana1ysis for mutation screening. The PCR amplified fragments which revealed an altered pattem related to normal controls on SSCP or CSGE ana1ysis were sequenced to precise determination ofthe molecular alterations. The strategy which combines PCR-SCGE resulted more effective to detect alterations than the PCR SSCP strategy. This metodology allowed to detect mutations in 83% of studied patients: 5 point mutations, inc1uding a silent mutation, apart ftom a polymorphism in some patients. Only one of these mutations was not previously descnlJed. T.ae first one was detected in two unrelated patients, a C~T substitution (position 6182), that generated a premature stop codon at Arg 157, in exon 7. This exon code for the activation peptide. This mutation results in exclusion ofthe mutant allele or in a truncated protein. The second one, a G~A substitution (position6246), converted Arg178 to Gln, in exon 7. This alteration affects aminoacids interactions leading to a confonnational change withincreased degradation, that impair protein secretion. The third is a A~G substitution (position -1533), in the promoter region. This alteration affects transcriptional efficiency, since it occurs within HNF-3 (hepatocite nuclear factor) binding site consensus sequence. Finally, a G~T substitution (position 3190), converted Gly 83 to Cys, in exon 5. Tbis exon code for the first EGF domain. This mutation was not described, and could atfects aminoacids interactions, leading to terciary structure alterations and subsequent decrease of protein secretion. These alterations must be responsibles for the hereditary protein C deficiency, because they segregate with deficiency in families, and 3 of them were previously described as the cause of the disease in other patients. Our results indicate that in protein C deficiency the incidence of recurrent mutations is high1y ftequent, since 4 mutations were previously described in families with protein C deficiency in other countries and 2 of them involved the hypermutable region of CpG dimmers, in exon 7. The determination of the molecular alterations in the protein C gene is an important tool to elucidate doubtfu1 diagnostics of protein C deficiency and to investigate the relation between structure and function of protein C / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:06:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6322_1.pdf: 3851660 bytes, checksum: 8463e2b249e03f8bc135308b89ab16e7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2004 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A variabilidade genética de acessos de melancia coletados em diferentes regiões do estado da Bahia e que está sendo conservada no Banco de Germoplasma da Embrapa Semi-Árido, foi avaliada a partir de dados morfológicos e moleculares (RAPD Random Amplified Polymorphysm of DNA; Polimorfismo de DNA Amplificado ao Acaso). Na análise foram utilizados dezessete descritores morfológicos e 64 locos RAPD (monomórficos e polimórficos). Para avaliação morfológica os 43 acessos foram avaliados em campo em delineamento em blocos ao acaso com três repetições e para análise molecular foram utilizados os mesmos acessos com repetições, totalizando 324 indivíduos. Os dados morfológicos foram submetidos a análises estatísticas, sendo realizados testes entre médias com nível de significância de 5% pelo método de Tukey e análises multivariadas envolvendo estimativas da distância generalizada de Mahalanobis e agrupamento pelo método de Tocher. A análise molecular permitiu a identificação de grupos de similaridade pelo método de Tocher a partir do coeficiente de similaridade de Jaccard. A porcentagem de locos polimórficos, assim como a variabilidade genética entre acessos, foi estimada. Os dados morfológicos revelaram dez grupos distintos, encontrando-se no grupo I acessos coletados em diferentes regiões. Nove características contribuíram com 85% para a divergência genética entre acessos. A análise molecular revelou 28 grupos, sendo alguns casos coincidentes com o agrupamento morfológico quanto à distribuição dos acessos nos grupos. A variância molecular indicou 46,3% de variabilidade genética dentro de acessos coletados numa mesma região e 24,6% entre acessos de regiões distintas. Ambos resultados indicam a existência de variabilidade genética dentro e entre acessos coletados em diferentes regiões da Bahia. Portanto, a associação de dados morfológicos a marcadores moleculares constitui-se em importante ferramenta na caracterização de acessos do Banco Ativo de Gemoplasma de melancia

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:07:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo784_1.pdf: 705508 bytes, checksum: 5725b57a45fd7f33f57457930ae04f35 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A levedura Dekkera bruxellensis, teleomorfo de Brettanomyces bruxellensis, é a maior contaminante nas destilarias que utilizam caldo de cana no mundo, provocando a diminuição da produtividade de etanol e, conseqüentemente, ocasionando prejuízos à indústria. A despeito de sua importância, poucos estudos genéticos estão publicados na literatura científica. Os trabalhos recentes do nosso grupo mostram que esta levedura apresenta uma grande adaptabilidade ao processo industrial e propomos uma análise genômica ampla para identificar os fatores responsáveis por esta característica. No presente trabalho, avaliamos o polimorfismo do gene COX2 que codifica a enzima citocromo oxidase II. Os resultados mostraram uma inesperada maior similaridade entre as seqüências do gene COX2 de isolados industriais de D. bruxellensis com seu ortólogo em D. custersii do que com a seqüência de COX2 da linhagem tipo de D. bruxellensis depositada no GenBank. Além disso, iniciamos a análise in silico comparada do genoma mitocondrial das leveduras ascomicota que possuem genoma mitocondrial seqüenciado e depositado GenBank. Com isso foi possível a construção de um mapa físico do genoma mitocondrial deste clado. Seis espécies apresentando similaridade genômica nuclear com D. bruxellensis foram submetidos a alinhamentos múltiplos através do programa computacional Mega v. 4.0. A ordem gênica foi definida como L-rRNA COII COIII S-rRNA COI ATPase 8 ATPase 6 Cyt b ATPase 9 Var 1, baseado no genoma de Saccharomyces cereviseae. Os programas CODEHOP e Codon Usage foram usados com a finalidade de refinar o desenho de primers degenerados a fim de se amplificar os genes ortólogos de D. bruxellensis. Os alinhamentos se mostraram representativos para construção dos primers, uma vez que foi observada uma alta variabilidade entre as seqüências gênicas sintênicas dos genes estruturais anteriormente citados. Estes dados proporcionam a base para futuras análises da genética e da evolução da população de D. bruxellensis, que servirá de base para o estabelecimento de correlações entre a variabilidade e genética e as capacidades fisiológicas de diferentes cepas industriais de D. bruxellensis em busca de melhor entendimento desse ―fitness competitivo‖ desta levedura no ambiente industrial