Made available in DSpace on 2015-05-22T12:36:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000468517-Texto+Completo-0.pdf: 6892081 bytes, checksum: c5aa659f71c5093d831d4810c3ab482c (MD5) Previous issue date: 2014 / The understanding of gene function in the externally visible characteristcs (EVC) expression has several uses in human population evolution studies or in forensic investigations. To this last, some effort has been done to discover an efficient and easy model for prediction of skin and eye color in humans. The obvious advantage of the prediction of such EVCs through the use of DNA is to be incorporated as routine in forensic labs and to be applied to police investigations. In our study we combined the genotyping of eight SNPs in pigment-related genes (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) with different analytical approaches. Considering this SNP panel we evaluated allele frequencies from HAPMAP and ALFRED data obtained from subjects with High Melanin Content (HMC; from African populations), and Low Melanin Content (LMC; from European populations) and defined the alleles H (to predict HMC subjects) and alleles L (to predict LMC subjects). The cumulative distribution of alleles H and alleles L in two phenotypically different color groups of 134 South Brazilian subjects showed that 82% of HMC subjects (N = 61) had eight or more allele H and 100% of LMC subjects (N = 73) had less than eight allele H, with accuracy value of 96. 3%.We performed other analyses using AUC (Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), PGL (Calculation of Pathway Genetic Load), and GP (Genetic Probability) approaches. The AUC was 0. 99 in predicting both HMC and LMC phenotypes; PGL showed the eight SNPs panel had 93% of concordance between genotype and HMC or LMC phenotypes; and GP approach showed 91% of concordance between prediction and HMC or LMC phenotypes. Our high-throughput genotyping technology combined with different analytical approaches reached very high accuracy to predict the extreme phenotypes of human pigmentation. We believe this forensic DNA phenotyping (FDP) technique would be particularly useful in cases in which the genetic profiles of crime scenes were not found in the DNA data banks or to help classify degraded cadavers skeletons, or biological clues of dismissed people. / A compreensão da função e expressão dos genes envolvidos nos traços externamente visíveis (EVC; do inglês externally visible characteristics) têm sido amplamente utilizada em vários estudos de evolução humana e investigações forenses. Para este último propósito, vários esforços têm sido feitos para descobrir um modelo eficiente e fácil para a predição da cor da pele e dos olhos em seres humanos. A vantagem óbvia da predição de tais EVCs, através da utilização do DNA, é sua incorporação na rotina em laboratórios forenses, sendo assim aplicada em investigações policiais. Em nosso estudo, relacionamos o genótipo de oito SNPs em genes relacionados com a pigmentação (rs4778138 - OCA2; rs12913832 - HERC2; rs16891982 - SLC45A2; rs8045560 - MC1R; rs1426654 - SLC24A5; rs2733832 - TYRP1; rs1042602 - TYR; rs916977 - HERC2) com diferentes abordagens analíticas. Este painel de SNPs considerou as frequências alélicas obtidas de dados do HapMap e Alfred a partir de indivíduos com Alto Conteúdo de Melanina (HMC; do inglês High Melanin Content; a partir de populações africanas), e Baixo Conteúdo de Melanina (LMC; do inglês Low Melanin Content; a partir de populações europeias) e definiu os alelos H (para predizer os HMC) e alelos L (para predizer os LMC). A distribuição cumulativa dos alelos H e L nos dois grupos com características de pigmentação fenotipicamente distintas, dos 134 indivíduos da nossa população, mostrou que 82% dos indivíduos HMC (N = 61) tinham oito ou mais alelos H e 100% dos indivíduos de LMC (N = 73) tinham menos de oito alelo H, com o valor de precisão de 96,3%.Outras abordagens como AUC (do inglês; Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve), cálculo de PGL (do inglês; Pathway Genetic Load) e GP (do inglês; Genetic Probability) foram realizadas. A análise AUC foi de 0,99 tanto para a predição fenotípica dos HMC quanto LMC; as análises PGL, para o painel com 8 SNPs, teve 93% de concordância genótipo-fenótipo nos HMC ou LMC; e a abordagem GP mostrou 91% de concordância para predição dos fenótipos HMC e LMC. Nossa tecnologia de genotipagem de alto rendimento, combinada com diferentes abordagens analíticas, chegou a uma precisão muito alta para predizer os fenótipos extremos de pigmentação humana. Acreditamos que esta técnica de fenotipagem forense pelo DNA (FDP; do inglês forensic DNA phenotyping), seria particularmente útil nos casos em que os perfis genéticos de locais de crime não fossem encontrados no bancos de dados de DNA ou para ajudar a classificar cadáveres degradados, esqueletos, ou vestígios biológicos de pessoas desaparecidas.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2014. / Submitted by Gomes Neide (neide@bce.unb.br) on 2014-07-01T14:32:45Z No. of bitstreams: 1 2014_CristianeJeyceGomesLima.pdf: 2985345 bytes, checksum: db850aa8ace65d4ebecbb3e3436c8a2b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-01T20:46:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_CristianeJeyceGomesLima.pdf: 2985345 bytes, checksum: db850aa8ace65d4ebecbb3e3436c8a2b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-01T20:46:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_CristianeJeyceGomesLima.pdf: 2985345 bytes, checksum: db850aa8ace65d4ebecbb3e3436c8a2b (MD5) / CNPq / Introdução: O hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) é o principal regulador do eixo hipotálamo-hipofise-gonadal (HHG), mas novos neuropeptídeos podem mediar a ação dos esteróides sexuais em nível hipotalâmico. Em 2000, um fator hipotalâmico da família RFamida, a mesma da kisspeptina, capaz de inibir o eixo HHG em codornas foi descoberto e denominado Hormônio Inibidor das Gonadotrofinas (GnIH). O peptídeo relacionado à RFamida-3 (RFRP-3), ortólogo do GnIH, e seu receptor GPR147 foram recentemente identificados no hipotálamo humano. No entanto, ainda não há evidências do papel funcional do sistema RFRP3/GPR147 em humanos. Objetivos: Investigar a associação do sistema inibidor das gonadotrofinas RFRP-3/GPR147 com a regulação do desenvolvimento puberal e capacidade reprodutiva em seres humanos. Métodos: Oitenta pacientes com puberdade precoce central idiopática (PPC) e 51 com hipogonadismo hipogonadotrófico idiopático normósmico (HHI) foram investigados. Cinquenta pacientes formaram o grupo controle. A sequência codante dos genes NPVF and NPFFR1, que codificam respectivamente o RFRP e o GPR147, foram amplificadas e sequenciadas. As frequências dos polimorfismos (SNP) foram comparadas entre os grupos e a razão de probabilidades (odds ratio) para a ocorrência de cada SNP de PPC ou HHI foi determinada. Resultados: Todos os SNPs já estavam descritos em bancos de dados genéticos (NCBI database). Uma deleção in frame de três nucleotídeos foi identificada no gene NPVF (p.I71_K72), com uma proporção levemente menor no grupo CCP, se comparado ao grupo com HHI (5% versus 15%, respectivamente; p=0.06). Isto resulta na deleção da isoleucina na posição 71, adjacente à lisina em um dos sítios de clivagem endoproteolítica do peptídeo precursor. Este SNP esteve associado a proteção para a occorrência de PPC (OR 0.33; IC 95%: 0.09-0.89); interessantemente, apenas dois homens com HHI foram homozigotos para esta variante. Um total de cinco SNPs missense foram encontrados no gene NPFFR1, com frequências semelhantes entre os grupos e sem associação com o tempo de puberdade. Esta é a primeira descrição de variantes genéticas dos genes NPVF and NPFFR1 em uma série de pacientes com desordens puberais GnRH-dependentes e controels saudáveis. Conclusão: Concluímos que o sistema RFRP-3/GPR147 deve ter um papel secundário na regulação do desenvolvimento puberal; propõe-se um efeito modulador da variante p.I71_K72 do gene NPVF sobre a ativação do eixo gonadotrópico. _________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Introduction: Gonadotropin-releasing hormone (GnRH) is the main regulator of hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis, but new discovered neuropeptides can mediate the action of sexual steroids on hypothalamic level. In 2000, a hypothalamic factor of RFamide peptide family, the same one of kisspeptin, capable of inhibiting the HPG axis in quails, was discovered and named gonadotropin-inhibitory hormone (GnIH). RFamide-related peptide-3 (RFRP-3), the ortholog of avian gonadotropininhibitory hormone, and its receptor GPR147 have been recently identified in the human hypothalamus. However, there are still no evidences of the functional role of RFRP-3/GPR147 system in humans. Objectives: Our aim was to investigate the association of the gonadotrophin inhibitory system RFRP-3/GPR147 with the regulation of puberal development and reproductive capacity in humans. Methods: Eighty patients with idiopathic central precocious puberty (CPP) and 51 with normosmic isolated hypogonadotropic hypogonadism (nIHH) were investigated. Fifty healthy subjects comprised the control group. The coding sequence of the NPVF and NPFFR1 genes, which encode respectively RFRP and GPR147, were amplified and sequenced. The frequencies of polymorphisms (SNP) were compared among the groups and the odds ratio of each SNP for the occurrence of CPP or nIHH was determined. Results: All SNPs were already described in NCBI database. A 3- nucleotide in frame deletion was identified in the NPVF gene (p.I71_K72), with a slightly smaller proportion in the CPP (5%) as compared to the nIHH (15%) group (p=0.06). It results in the deletion of the isoleucine at position 71, adjacent to lysine at an endoproteolytic cleavage site of the precursor peptide. This SNP was associated to protection for the occurrence of CPP (OR 0.33; 95%CI: 0.09-0.89); interestingly, only 2 men with nIHH were homozygotes for it. A total of 5 missense SNPs were found in the NPFFR1 gene with similar frequencies among groups and no association with pubertal timing. This is the first description of NPVF and NPFFR1 genetic variants in a series of patients with GnRH-dependent pubertal disorders and healthy controls. Conclusion: We concluded that RFRP-3/GPR147 may play secondary, modulatory roles on the regulation of pubertal development; a restraining modulatory effect of the NPVF p.I71_K72 variant on gonadotropic axis activation is proposed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-06-01T14:07:26Z No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-03T20:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_ValquiriaAliceMichalczechenLacerda.pdf: 1778305 bytes, checksum: 30a61c667aee974c75ac4c6915715f22 (MD5) / Após a fecundação natural ou a clonagem por transferência nuclear, um padrão epigenético preexistente deve sofrer uma reprogramação correta para garantir o desenvolvimento embrionário. Contudo, essa reprogramação é ineficiente na clonagem, pois o carioplasto possui um padrão metilação do DNA diferente dos gametas. Acredita-se num aumento da eficiência da clonagem de mamíferos se os carioplastos utilizados possuírem um DNA hipometilado. Este é o primeiro estudo a utilizar a procaína como agente desmetilante no cultivo in vitro em linhagem celular de fibroblastos de bovinos. Os objetivos foram avaliar os efeitos da procaína no cultivo in vitro sobre a viabilidade celular, avaliar a integridade cromossômica e analisar o padrão de metilação no DNA para as regiões diferencialmente metiladas (DMRs) dos genes imprinting IGF2 e XIST, por tratamento com bissulfito de sódio seguido de seqüenciamento, em linhagem celular de Bos taurus indicus. O cultivo celular com a procaína apresentou crescimento celular e a suplementação com 0,1 e 0,5 mM levou a um aumento no número de células viáveis em relação ao grupo controle e ao tratamento com 2,0 mM (P≤0,05). A quantidade de células totais foi menor apenas para o grupo com suplementação de 2,0 mM (P≤0,01). A citogenética não mostrou diferença entre os grupos. O padrão de metilação não foi diferente para as DMRs dos genes avaliados. Existe um efeito benéfico nas células que receberam os tratamentos com 0,1 mM ou 0,5 mM de procaína, por existir um aumento da quantidade de células viáveis sem apresentar anomalias cromossômicas. Há a possibilidade de ter ocorrido uma desmetilação global, que não foi detectada nas regiões analisadas. A suplementação do meio de cultivo com procaína aumentou a viabilidade de fibroblastos in vitro de bovinos, sem alterar a integridade cromossômica. Isso é importante, pois os próximos estudos poderão contribuir, por exemplo, com um aumento dos índices da transferência nuclear de célula somática, maior obtenção de mamíferos transgênicos e possivelmente de células-tronco a partir de células diferenciadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / After natural fertilization and cloning by nuclear transfer, an epigenetic pattern must be reprogrammed to guarantee viable embryo development. This is the first study to use procaine as a demethylation agent in in vitro culture of of cattle fibroblast cell line. The aim was to investigate the effects of procaine in fibroblast cell line, to evaluate the chromosome integrity and to analyze DNA methylation patterns for DMRs of IGF2 and XIST genes imprinting, by bisulphite tratament followed by sequencing, in Bos taurus indicus. The cell culture with procaine was viable and the supplementation with 0.1 and 0.5 mM led to an increase in the number of cells with intact membrane in comparison to control group and to the treatment with 2.0 mM (P ≤ 0.05). The amount of total cells was lower only for the group supplemented with 2.0 mM (P ≤ 0.01). Cytogenetics showed no difference between groups The methylation pattern was not different for the DMR genes evaluated. We notice a beneficial effect on cells that received treatments with 0.1 mM or 0.5 mM procaine, because there is an increase in number of viable cells which did not present chromosomal abnormalities. It may have occurred a global demethylation, which was not detected in the analyzed regions. Supplementation of medium culture with procaine increased the viability of in vitro culture of bovine fibroblasts, with no alteration in chromosomal integrity. The results obtained here may contribute to increase the levels of cloning and transgenic mammals and possibly stem cells from differentiated cells.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Gabriela Ribeiro (gaby_ribeiro87@hotmail.com) on 2011-09-22T14:36:54Z No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaBasilioMedeiros.pdf: 1972250 bytes, checksum: 2c6a4f860e50de260168b211ef063a49 (MD5) / Approved for entry into archive by Repositorio Gerência(repositorio@bce.unb.br) on 2011-09-27T12:38:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaBasilioMedeiros.pdf: 1972250 bytes, checksum: 2c6a4f860e50de260168b211ef063a49 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-09-27T12:38:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_PatriciaBasilioMedeiros.pdf: 1972250 bytes, checksum: 2c6a4f860e50de260168b211ef063a49 (MD5) / O hormônio folículo estimulante (FSH) pertence à família das gonadotrofinas. Esse hormônio glicoprotéico é um heterodímero formado pela associação não-covalente de duas subunidades, α e β. As duas subunidades possuem ligações dissulfeto internas e sítios para N-glicosilação. A formação do dímero, com a estruturação quaternária da proteína, é essencial para ligação ao receptor e para a atividade biológica de FSH. O FSH é responsável por uma série de processos reprodutivos, como estimulação de funções testiculares e ovarianas, regulação da gametogênese e síntese de estrógeno. O FSH possui aplicações na veterinária, sendo utilizado em processos de transferência de embriões, sincronização de ciclo estral e superovulação de vacas. O rebanho bovino brasileiro é o maior rebanho comercial do mundo, sendo que o Brasil é o maior exportador mundial de carne bovina. Uma das estratégias utilizadas para aumentar a produtividade do gado brasileiro é a tecnologia de transferência de embriões, utilizando FSH. O FSH para uso veterinário é purificado a partir de extratos hipofisários de porcos. Esse método apresenta desvantagens como produtividade, purificação e questões sanitárias. A tecnologia do DNA recombinante poderia superar essas limitações. O sistema de expressão em Pichia pastoris é vantajoso devido à sua manipulação genética fácil e rápida e ao baixo custo e fácil escalonamento da produção. O objetivo deste trabalho foi expressar FSH bovino recombinante (bFSH) em Pichia pastoris. Três construções gênicas foram arquitetadas: 1) fusão βα(bFSH-fus); 2) fusão βα separada por um peptídeo conector (bFSH-L); fusão βα separada pelo peptídeo CTP de gonadotrofina coriônica equína (bFSH-CTP). Os genes foram clonados no vetor de expressão pPIC9 e utilizados para transformação de Pichia pastoris, linhagem GS115. Clones positivos foram selecionados e utilizados para a indução da expressão em frasco. A expressão das proteínas de fusão em frasco foi eficiente, mas o nível de produção foi baixo. A expressão das proteínas em fermentador está sendo otimizada juntamente com a indústria Ouro Fino. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Follicle-stimulating hormone (FSH) belongs to the family of gonadotropins. This glycoprotein hormone is a heterodimer of non-covalently associated α and β subunits. There are five intra-chain disulfide bridges in the α-subunit and six in the β, each containing two N-linked oligosaccharides. The association of the two subunits and the structural conformation of the whole molecule are essential for receptor binding and biological activity. FSH is responsible for several reproductive processes such as stimulation of testicular and ovarian functions, regulation of gametogenesis and steroid hormone synthesis. In veterinary medicine, FSH has been used for genetic improvement of cattle, in processes such as embryo transfer, superovulation and estrous cycle synchronization. The Brazilian livestock is very expressive making this country a great meat exporter. One of the strategies used to increase the productivity of Brazilian cattle is the embryo transfer technology. FSH for veterinary use is purified from pig pituitary extracts. This method presents obstacles associated with productivity, purification, and sanitary issues. Recombinant DNA technology can overcome these difficulties by heterologous expression in microbial hosts. The yeast Pichia pastoris expression system shows many advantages as easy genetic manipulation, simple and cheap growth media, and easy scale-up. This work aimed at the production of recombinant bovine FSH (bFSH) in Pichia pastoris. Three constructs were made: 1) direct βα fusion (bFSH-fus); 2) βα fusion separated by a synthetic linker (bFSH-L); 3) βα fusion separated by the CTP sequence from equine chorionic gonadotropin (bFSH-CTP). The fusion genes were cloned into pPIC9 expression vector and used for Pichia pastoris (GS115 strain) transformation. Expression of the heterologous proteins was efficiently done in shake-flask cultures, but the protein levels were low. Expression in fermenter cultures has been done together with Ouro Fino industry for the achievement of higher protein expression levels.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade em Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-11-18T14:37:31Z No. of bitstreams: 1 2013_VitorGuilhermeBritoAraujo.pdf: 6223798 bytes, checksum: 31ca57dd5c98b44059fceb4fa5af3935 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2013-12-10T12:19:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_VitorGuilhermeBritoAraujo.pdf: 6223798 bytes, checksum: 31ca57dd5c98b44059fceb4fa5af3935 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-10T12:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_VitorGuilhermeBritoAraujo.pdf: 6223798 bytes, checksum: 31ca57dd5c98b44059fceb4fa5af3935 (MD5) / A hiperplasia adrenal congênita (HAC) é o grupo hereditário de desordens na esteroidogênese adrenal causada por uma deficiência enzimática. O gene CYP21A2 codifica a enzima 21-hidroxilase (21-OH) e mutações nesse gene podem provocar HAC. Localizado no em 6p21.3 ele integra o módulo RCCX formado pelos genes RP, C4, CYP21 e TNX, que estão organizados em repetições em tandem, submetendo-o a eventos de recombinações gênicas não-alélicas o que resulta em região altamente polimórfica. CYP21A2 e seu homólogo, o pseudogene CYP21A1P, são similares em 96% na região intrônica e de 98% na região exônica, o que promove a troca de fragmentos de DNA entre eles. HAC pela deficiência da 21-OH é autossômica recessiva e é classificada nas formas perdedora de sal (PS) e virilizante simples (VS), ambas com virilização pré-natal da genitália externa feminina. A deficiência de aldosterona caracteriza a forma perdedora de sal, que constitui 75% dos casos da forma clássica. A deficiência da 3β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 2 (3βHSD2) representa uma rara variante da HAC. Também é autossômica recessiva, codificada pelo gene HSD3B2, localizado em 1p13.1. Esta enzima afeta todas as três vias esteroidogênicas e o espectro fenotípico é amplo e varia desde perdedor de sal grave até a forma não-perdedora, com ou sem formação de genitália ambígua em neonatos 46,XY. Este trabalho tem por objetivo investigar e descrever a variabilidade genética numa série de indivíduos com o diagnóstico clínico da forma clássica de HAC pela deficiência da 21-OH ou pela deficiência da 3β-HSD residentes no Distrito Federal (DF) e padronizar um método eficiente de diagnóstico molecular para HAC no DF. Foram selecionados 29 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de deficiência de 21-hidroxilase e 1 paciente com deficiência de 3β-HSD, atendidos no Ambulatório de Endocrinologia de Gônadas e Adrenais e na Unidade de Endocrinologia Pediátrica do Hospital Universitário de Brasília. O DNA genômico foi extraído pelo método de Salting-out e a análise molecular foi realizada inicialmente pelo método de sequenciamento automático; nos indivíduos com deficiência de 21-OH, associou-se o Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification – MLPA. Foram descritas as mutações presentes nos 30 portadores de HAC. No CYP21A2, foram descritas 13 mutações de ponto e uma nova mutação missense, p.L12M. Adicionalmente, foram identificados oito alelos apresentando grandes deleções, quatro alelos com inserções e quatro com grandes conversões. A mutação mais frequente foi I2 Splice (IVS2-13A/C>G) ocorrendo em 34,5% dos indivíduos. Além disso, 72,4% dos indivíduos são heterozigotos compostos e a correlação genótipo-fenótipo foi observada em 64,2% dos indivíduos. No gene HSD3B2 foi encontrada uma homozigose para p.P222Q. O caso descrito aqui corrobora a forte correlação entre o genótipo e o fenótipo associado à mutação p.P222Q. A investigação molecular do gene CY21A2 é interessante por ser altamente polimórfico. O estudo molecular do HSD3B2 é importante pela raridade e necessidade de maior conhecimento sobre suas características genéticas. Por fim, descrevemos os defeitos genéticos responsáveis pela HAC nessa série de indivíduos e padronizamos o sequenciamento associado ao MLPA como um método eficaz para o diagnóstico molecular da HAC por deficiência da 21-hidroxilase. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is a group of inherited disorders of steroidogenesis caused by an enzyme deficiency. The CYP21A2 gene encodes the enzyme 21-hydroxylase (21-OH) and mutations in this gene can cause CAH. Located in the 6p21.3, it integrates the RCCX module, formed by the genes RP, C4, CYP21 and TNX, which are arranged in tandem repeats. This leads to a highly polymorphic region, in which events of non-allelic genetic recombination frequently occur. CYP21A2 and its counterpart, the pseudogene CYP21A1P, are similar at 96% in the intronic region and 98% in the exonic, which promotes the exchange of DNA fragments between them. Classic HAC caused by 21-OH deficiency is autosomal recessive and is classified as salt wasting (PS) and simple virilizing (SV) forms, both with prenatal virilization of female external genitalia. Aldosterone deficiency characterizes the salt-wasting form, which constitutes 75% of cases of classical form. 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (3βHSD2) deficiency is a rare variant of CAH. It is also autosomal recessive, encoded by the HSD3B2 gene, located at 1p13.1. This disorder affects all three steroidogenic pathways, and the phenotypic spectrum is broad, ranging from severe salt-losing to a non-loser, with or without formation of ambiguous genitalia in newborns 46, XY. Our aims were to investigate and describe the genetic variability in a series of individuals from the Federal District, Brazil, with a clinical diagnosis of the classic form of CAH due to 21-OH deficiency or to 3β-HSD deficiency, and to standardize an efficient method of molecular diagnosis of CAH. We selected 29 patients with clinical and laboratory diagnosis of 21-hydroxylase deficiency and one patient with deficiency of 3β-HSD from the Gonadal and Adrenal Diseases Clinics and Pediatric Endocrinology Unit, at the University Hospital of Brasilia. Genomic DNA was extracted by the salting-out method and molecular analysis was initially performed by automatic sequencing; in the subjects with 21-OH deficiency, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA was also performed. A significant variable profile of mutations were present in the 30 patients with CAH. In CYP21A2, 13 point mutations and a new missense mutation, p.L12M, were described. Additionally, we identified eight alleles presenting large deletions, four alleles with large insertions and four conversions. The most frequent mutation was I2 splice (IVS2-13A / C> G) occurring in 34.5% of the subjects. Furthermore, 72.4% of the individuals were compound heterozygotes. Genotype-phenotype correlations were observed in 64.2% of the cases. In the HSD3B2 gene, the homozygous p.P222Q mutation was found. The case described herein confirms the strong correlation between genotype and phenotype associated with this mutation. Molecular investigation of the highly polymorphic CY21A2 gene is interesting and useful. Molecular analysis of the HSD3B2 gene is important for the rarity of the disorder and the need for greater knowledge of their genetic characteristics. Finally, we described the genetic defects associated with the classic forms of CAH in these subjects, and standardized genetic sequencing associated with MLPA as an efficient method for the molecular diagnosis of CAH due to 21-hydroxylase deficiency.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Doença de Chagas, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-03-31T15:01:18Z No. of bitstreams: 1 2013_EsterCardosoPaesRose.pdf: 9350602 bytes, checksum: cd045c2ef0d73b166b6b35a39b41c5ac (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-04-01T14:29:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_EsterCardosoPaesRose.pdf: 9350602 bytes, checksum: cd045c2ef0d73b166b6b35a39b41c5ac (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-01T14:29:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_EsterCardosoPaesRose.pdf: 9350602 bytes, checksum: cd045c2ef0d73b166b6b35a39b41c5ac (MD5) / A transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro tem repercussão na biologia evolutiva e na medicina. A este respeito, a integração de minicírculos de kDNA em vários loci do genoma de aves e mamíferos implica em modificações genotípicas que estariam associadas com a patogênese da doença de Chagas. Nesse estudo, tal associação foi comprovada no modelo Gallus gallus, refratário ao T. cruzi. A inoculação de formas tripomastigotas do T. cruzi via orifício sobre a bolha de ar do ovo fértil de aves congênicas de Praga resultou na eclosão de pintos sem a infecção ativa, mas o kDNA do protozoário ficou retido no genoma. A reprodução das aves adultas kDNA-positivas gerou progênies com as mutações. O mapeamento dos sítios de integração dos minicírculos de kDNA feitos com a técnica tpTAIL-PCR revelou as mutações quimeras em múltiplos loci em vários cromossomos de células germinativas, no sêmen e nos ovócitos das aves. As integrações de kDNA ocorreram em loci preferenciais (hotspots), tais como genes constitutivos e do metabolismo celular, e em elementos transponíveis. A hipervariabilidade da sequência de nucleotídeos dos minicírculos explica a imensa diversidade das mutações de parentais e de progênies, porque gametas com integrações de kDNA diferentes geraram progênies com mutações diferentes no mesmo locus do genoma. Este tipo de herança não-Mendeliana favorece a diversidade genética e contribui para a especiação. A mobilização dos minicírculos e a recombinação das quimeras em outros sítios secundários do genoma também foi documentada. A topologia das integrações do kDNA foi analisada nas quimeras formadas nos genes da distrofina (NW_001471534.2) e da enzima málica (NW_003763650.1). Verificou-se que na maioria desses casos a região variável da sequência era diferente ou se achava recombinada. Especificamente, o estudo sugere que as integrações frequentes do kDNA do T. cruzi nos genes da distrofina e da enzima málica, modificando a fisiologia celular, podem ter um papel na patogênese da doença. / The transfer of the Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences to the host’s genome is considered important to the evolutionary biology and medicine. It has been hypothesized that the integration of the minicircle sequences induces the host´s genotype modifications that may be associated with the pathogenesis of Chagas disease. In this study, the Gallus gallus chicken model system refractory to the T. cruzi infections was used. The inoculation of T. cruzi trypomastigotes through small orifice on the egg shell above the air chamber generated infection-free chicks, which retained the protozoan kDNA minicircle in the genome. The vertical transfer of the kDNA mutations was obtained by breeding kDNA-positive aves. The kDNA chimeras were documented by the tpTAIL-PCR, and the minicircle integrations were shown in several loci of germ line cells. The minicircle sequences integrated at several hotspots in coding regions and in transposable elements. The highly diverse minicircle sequences may explain the unlimited differences in the chimeras documented in parental and progeny. The gametes harboring diverse kDNA chimeras translated progeny with different patterns of mutation at single locus. This non-Mendelian heritage favors the unbridled diversity that contributes to speciation. The minicircle mobilization and chimera recombination was also documented. The topology of the kDNA mutations were examined in the dystrophin (NW_001471534.2) and in the malic enzyme (NW_003763650.1) genes. In these hotspots, the differences among the minicircle variable regions may be the result of hitchhiking and recombination at the secondary site. This study suggests that multiple kDNA integrations in the dystrophin and in the malic enzyme genes, introducing modification in the cell physiology, may be associated to the pathogenesis of Chagas disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-19T13:46:22Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / O vírus Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) foi isolado da solanácea Brugmansia suaveolens (conhecida como trombeteira, saia-branca) da coleção de plantas medicinais do Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brasil, sendo o isolado nomeado Bs-Campinas. Um trabalho anterior mostrou que o isolado Bs-Campinas foi transmitido por afídeos, induziu sintomas visíveis em algumas solanáceas e em duas espécies de Chenopodium sob condições experimentais, apresentando partículas e inclusões típicas de potyvírus em folhas sintomáticas, quando observadas por microscopia eletrônica de transmissão. Apenas parte do genoma do vírus era conhecida, uma região compreendendo a extremidade 3‟, o que o distinguiu suficientemente dos outros vírus para ser classificado como uma espécie nova de potyvírus. O vírus apresenta características distintas de outros potyvírus conhecidos, induzindo uma alta severidade de sintomas em diversas plantas susceptíveis, além da capacidade de infectar o tomateiro, uma cultura de alta importância econômica e social no Brasil. Essas características o tornam um excelente alvo para estudo dos genes relacionados à patogenicidade e para o desenvolvimento futuro de vetores virais. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular do isolado Bs-Campinas através da determinação de sua sequência genômica completa e determinar o seu relacionamento filogenético com os diferentes potyvírus já relatados no mundo. Para tanto, procedeu-se o emprego de várias técnicas para o completo resgate do genoma viral e posterior determinação de sua sequência. O RNA total foi extraído e o cDNA sintetizado foi obtido pela técnica de 3‟ RACE usando primers universais para potyvírus, resultando na amplificação de um fragmento de 8,3kb. A tentativa de clonagem deste fragmento, contudo, resultou em clones que apresentavam uma deleção interna neste fragmento. Dessa forma, o segundo fragmento obtido resultou da amplificação por RT-PCR utilizando-se primers específicos desenhados com base nas sequências das extremidades do fragmento de 8,3kb com o intuito de resgatar a região interna do genoma gerando um fragmento de aproximadamente 4,7kb. Primers específicos foram também desenhados baseados na sequência da extremidade 5‟ do clone de 8kb obtido e a estratégia 5‟ RACE foi usada para amplificar e clonar a extremidade 5‟ do genoma do vírus, um fragmento de 1,8kb. As amplificações por PCR resultaram no resgate de três fragmentos de cDNA, os quais totalizam a sequência completa do genoma do BsMoV. O RNA genômico consistiu de 9870 nt sem a cauda de poli-A, codificando uma poliproteína típica dos potyvírus de 3090 aa. As análises da sequência de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como, a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína, tendo o isolado Bs-Campinas exibido perfil típico de potyvírus. As análises filogenéticas, assim como, comparações com outras espécies de Potyvirus do banco de dados online revelaram que esta sequência tem uma identidade nucleotídica de 63,7% com Pepper mottle virus (PepMoV), a qual foi a sequência de potyvírus de maior identidade e, portanto, o mais estreitamente relacionado. Uma vez que este valor de identidade é inferior ao limiar (76% de identidade nucleotídica) atualmente usado para discriminar espécies de Potyvirus, foi confirmado que Brugmansia suaveolens mottle virus representa uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) was isolated from a Brugmansia suaveolens plant (known as "angel trumpet") in the collection of medicinal plants of the Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brazil, being the isolate named Bs-Campinas. A previous study showed that the isolate Bs- Campinas was transmitted by aphids and induced visible symptom on some Solanaceous plants and two Chenopodium species under the experimental conditions, showing typical potyvirus particles and inclusions in symptomatic leaves, when observed by transmission electron microscopy. Only part of the virus genome was known, a region comprising the 3' terminal region of the genome, which distinguished it sufficiently from other viruses to be classified as a new potvvirus species. The virus showed characteristics that were distinct from other known potyviruses, such as the high symptom severity in many plants and the ability to infect tomato plants, a crop of high economic and social importance in Brazil. These findings showed that it can be an excellent target for the study of genes related to pathogenicity and for the future development of viral vectors. Therefore, the objective of this study was the molecular characterization of the isolate Bs-Campinas through the determination of its complete genomic sequence and its phylogenetic analysis, when compared with different potyviruses previously reported in the world. For this purpose, some techniques were attempted to enable the rescue of the viral genome and subsequent determination of its sequence. Total RNA was extracted and cDNA synthesis was done by 3 'RACE using universal primers for potyviruses, resulting in the amplification of a fragment of ca. 8,3 kb. However, the cloning of this fragment resulted in clones that presented an internal deletion in this fragment. Therefore, a second fragment using specific primers designed based on the sequence ends of the deleted clones, was amplified by PCR and cloned in order to rescue inner region of the genome by generating a fragment of approximately 4.7 kb. Specific primers were also designed based on the 5‟ end region of the 8,3 kb clone to enable cloning of the 5‟ terminal region of the genome by 5' RACE, a fragment of 1.8 kb. PCR amplifications resulted in three cDNA fragments, comprising the complete genome of BsMoV. The RNA genome consisted of 9870 nt without a poly-A tail, encoding a putative typical potyviral polyprotein of 3090 aa. Analysis of the amino acid sequence allowed the deduction of the cleavage sites, as well as the identification of conserved sequences and motifs within the sequence of each protein, in which the Bs-Campinas isolate displayed typical potyvirus genome strategy. Phylogenetic analysis, as well as comparisons with other species of the Potyvirus genus obtained on online databases revealed that this BsMoV sequence shared 63.7% nucleotide sequence with Pepper mottle virus (PepMoV), which was the best matched potyvirus sequence and, thus the most closely related species. Since this identity value is below the threshold of 76% nt identity presently used to discriminate Potyvirus species, it was confirmed that Brugmansia suaveolens mottle virus represents a new Potyvirus species.

A região sul do Brasil é caracterizada pela ocorrência de diversas áreas fitoecológicas. Esta heterogeneidade de habitats pode condicionar gradientes ambientais, favorecendo a diferenciação regional e até mesmo eventos de especiação. Para investigar possíveis processos evolutivos ocorridos em plantas dessa região, analisamos os padrões de variação genética molecular em três grupos de espécies relacionadas pertencentes aos gêneros Passiflora (Passifloraceae) e Petunia (Solanaceae). Passiflora actinia e Passiflora elegans são espécies parapátricas que apresentam uma grande similaridade morfológica e genética. P. actinia é uma espécie típica da Mata Atlântica, enquanto P. elegans ocorre em matas de galeria no interior do Rio Grande do Sul (RS). Análises de marcadores nucleares e plastidiais revelaram um gradiente norte-sul nas relações intra e interespecíficas e contribuíram para a identificação de um híbrido interespecífico com morfologia intermediária encontrado na região de parapatria. É possível que a diferenciação genética entre os grupos geográficos de P. actinia e a recente divergência entre P. actinia e P. elegans tenham sido influenciadas pelos processos históricos ocorridos na região, como a migração da Mata Atlântica para o sul e o seu padrão de estabelecimento no RS. A Serra do Sudeste (RS) é um dos centros de diversidade do gênero Petunia, caracterizado pela presença de espécies com diferentes síndromes florais. P. exserta (polinizada por beija-flores, flores vermelhas) tem sua ocorrência restrita a esta região, sendo encontrada no interior de reentrâncias rochosas em torres areníticas. P. axillaris (polinizada por mariposas, flores brancas) habita áreas abertas e possui ampla distribuição geográfica. Nas torres onde estas espécies ocorrem em simpatria, foram encontradas plantas com morfologia floral intermediária, sugerindo hibridação entre elas. As análises de marcadores plastidiais corroboraram a hipótese de hibridação interespecífica e de divergência recente entre estas espécies e revelaram um baixo fluxo gênico entre as populações das torres. Entre as 11 espécies de Petunia, seis são encontradas exclusivamente nos planaltos das regiões sul e sudeste do Brasil: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola e P. scheideana. A distribuição de marcadores plastidiais concorda com a hipótese de divergência recente destas espécies. Este padrão talvez esteja relacionado com as mudanças climáticas ocorridas no Quaternário, já que o habitat destas espécies (campos de altitude) foi fortemente afetado por estas alterações. Durante os estágios glaciais havia expansão das áreas de campo e nos interglaciais avanço da floresta com araucária. É possível que o padrão fragmentado dos campos, isolados nas áreas de maior altitude do planalto e cercados por áreas de floresta com araucária, tenha contribuído para a diversificação do grupo. / Brazilian southern region is characterized by the occurrence of several phytoecological areas. This habitat heterogeneity can condition environmental gradients, favor regional differentiation, and even speciation events. To investigate the possible evolutionary process which occurred in plants of this region, we analyzed the patterns of molecular genetic variation in three groups of related species classified in the Passiflora (Passifloraceae) and Petunia (Solanaceae) genera. Passiflora actinia and Passiflora elegans are parapatric species which show high morphologic and genetic similarity. P. actinia is a species typical of the Atlantic Forest, while P. elegans occurs in gallery forests in the interior of Rio Grande do Sul (RS). Analyses of nuclear and plastid markers revealed a north-south gradient both in the intra e interspecific relationships, and contributed to the identification of an interspecific hybrid with intermediate morphology in the parapatric region. It is possible that the genetic differentiation among P. actinia’s geographic groups and the recent P. actinia/P. elegans divergence have been influenced by historical processes occurred in the region, like the Atlantic Forest southern migration and its pattern of establishment in RS. The Serra do Sudeste region (Southeast Sierra in RS) is one of Petunia’s centers of diversity, characterized by the presence of species with different floral syndromes. P. exserta (pollinated by hummingbirds, red flowers) has its occurrence restricted to this region, and is found in the interior of shelters of sand towers. P. axillaris (pollinated by hawkmoths, white flowers) live in open areas and has a wide geographical distribution. In the towers in which these species are found in sympatry, plants with intermediate flower morphology were found, suggesting hybridization between them. Plastid markers analyses confirmed the interspecific hybridization hypothesis and the recent divergence between these species, revealing a low gene flow between the populations of the towers. Among the 11 species of Petunia, six were found exclusively in the Brazilian south and southeast highlands: P. altiplana, P. bonjardinensis, P. mantiqueirensis, P. reitzii, P. saxicola and P. scheideana. Plastid markers distribution agrees with the hypothesis of recent divergence of these species. This pattern is probably related to the climatic changes occurred in the Quaternary since the habitat of these species (campos de altitude) has been strongly affected by these modifications. During the glacial stages expansion of grasslands areas occurred, while in the interglacial periods Araucaria forest would advance. Possibly the fragmented pattern of the grasslands, isolated in the high altitude areas of the plateau and surrounded by Araucaria forest, has contributed to the group’s diversification.

Rizóbios são bactérias estritamente aeróbias, quimioorganotróficas, com a forma de bastonetes não formadoras de esporos, Gram-negativas, com um tamanho que varia de 0,5- 0,9 µm X 1,2-3,0 µm. Normalmente encontradas no solo, fixam nitrogênio atmosférico (N2) em simbiose com leguminosas e algumas plantas não leguminosas, induzindo a formação de nódulos nas raízes, permanecendo nestas como bacteróides fixadores de nitrogênio. No Brasil rizóbios são inoculados em lavouras de soja, pois a inoculação com bactérias fixadoras de nitrogênio supre totalmente a necessidade de utilização de adubos nitrogenados. No presente estudo foi realizada uma análise comparativa entre as espécies Bradyrhizobium japonicum (estirpe USDA 110) e Bradyrhizobium elkanii (estirpe SEMIA 587) através da aplicação da técnica de RDA (Representational Difference Analysis). RDA é uma técnica bastante útil para revelar seqüências únicas entre dois genomas ou transcritomas semelhantes. Após três ciclos de hibridizações subtrativas e amplificações dos fragmentos tester, fragmentos de aproximadamente 300 pb foram gerados. Estes fragmentos foram clonados em pUC18 e seqüênciados. Das 200 seqüências obtidas, 46 pertenceram exclusivamente à B. elkanii e 154 tiveram homologia com B. japonicum. Entre as 46 seqüências sem homologia com B. japonicum, 39 não demonstraram homologia com nenhuma seqüência depositada nos bancos de dados públicos e sete seqüências mostraram homologia com proteínas conhecidas. Estas sete seqüências foram divididas em três grupos: seqüências homólogas a outras estirpes ou espécies de Bradyrhizobium, seqüências homólogas a outras bactérias fixadoras de nitrogênio e seqüências homólogas a bactérias não fixadoras de nitrogênio. O grupo com homologia a estirpes de Bradyrhizobium foi composto por dois clones: clone i5 foi homólogo a um transportador ABC (ATP Binding Cassette, hlyB like protein) de Bradyrhizobium sp. ORS278, e o clone i29 foi homólogo à subunidade menor da carboxylase (tipo RuBisCO) da estirpe foto-organotrófica Bradyrhizobium sp. BTA1. O grupo com homologia a outras bactérias fixadoras de nitrogênio foi composto por três clones: clone i150 foi homólogo à subunidade alfa da 4-hydroxybenzoyl-CoA redutase de Mesorhizobium loti, clone i170 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Rhodopseudomonas palustris, e o clone ii23 foi homólogo ao fator de virulência mviN de Xanthobacter autotrophicus Py2. O grupo com homologia a bactérias não fixadoras de nitrogênio foi também composto por dois clones: clone i65 foi homólogo à peptidase M19 de Sphingopyxis alaskensis RB2256, e o clone i157 foi homólogo a uma proteína hipotética conservada de Nitrobacter winogradsky. Esse conhecimento genômico de B. elkanii poderá ajudar na compreensão das diferenças fisiológicas encontradas entre essas duas espécies e servir como base na caracterização de estirpes isoladas de nódulos de soja. / Rhizobia are strictly aerobic chemoorganotrophic rod-shaped sporeless bacteria. They are a Gram-negative bacteria with a size that varies between 0.5-0.9 µm to 1.2-3.0 µm. Normally found in the ground, they fix atmospheric nitrogen (N2) in symbiosis with leguminous plants and some non leguminous plants, inducing the formation of nodules in the roots where the bacterium differentiates itself into nitrogen-fixing bacteroids. In Brazil, rhizobia are inoculated in soybean crops. This inoculation totally fulfills the crop need of nitrogen. In the present study a comparative analysis was carried out between Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) and Bradyrhizobium elkanii (SEMIA 587) through the application of the RDA technique (Representational Difference Analysis). RDA is a quite useful technique to reveal the unique sequences between two genomes or transcriptomes. After three cycles of subtractive hybridizations and amplifications of the tester DNA, 300 pb fragments were obtained. These fragments were cloned into pUC18 vector and were sequenced. Two hundred RDA sequences were obtained. Forty six sequences among the 200 belonged exclusively to the tester strain B. elkanii SEMIA 587, and 154 had homology to the driver strain B. japonicum USDA110. From the 46 sequences with no homology to B. japonicum USDA 110 genome, 39 showed no homology with sequences in public databases and seven sequences showed homology with known proteins. These seven sequences were divided in three groups: homolog to other Bradyrhizobium strains, homolog to other nitrogen-fixing bacteria, and homolog to non nitrogen-fixing bacteria. The group of homolog to other Bradyrhizobium strains was composed by two clones: clone i5 was homolog to a putative toxin secretion ABC transporter from Bradyrhizobium sp. ORS278, and clone i29 was homolog to a putative carboxylase like RuBisCO small subunit from the photoorganotroph Bradyrhizobium sp. BTA1. The group of homolog to other nitrogen-fixing bacteria was composed by three clones: clone i150 was homolog to a 4-hydroxybenzoyl-CoA reductase alpha-subunit of Mesorhizobium loti, clone i170 was homolog to a conserved hypothetical protein of Rhodopseudomonas palustris, and clone ii23 was homolog to a virulence factor mviN of Xanthobacter autotrophicus Py2. The group of homolog to other non nitrogen-fixing bacteria was also composed by two clones: clone i65 was homolog to a peptidase M19 of Sphingopyxis alaskensis RB2256, and clone i157 was homolog to a conserved hypothetical protein of Nitrobacter winogradsky. This better understanding of B. elkanii genome could help us in the comprehension of physiological differences between these two species and it could be a useful tool to characterize Bradyrhizobia strains isolated from soybean nodules.

Orientador: Paulo Arruda / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T21:54:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarcioJoseda_D.pdf: 8966197 bytes, checksum: d602ca96ad1b40f775d5f4ec341ea319 (MD5) Previous issue date: 1996 / Doutorado / Genetica / Doutor em Ciências Biológicas