Até o momento nenhuma espécie daninha de importância agrícola tinha sido sequenciada no Brasil, dessa forma o arroz vermelho oferece uma oportunidade ímpar para isso, podendo levar a um melhor entendimento do seu genoma e facilitar o desenvolvimento de estratégias mais eficientes de controle destas plantas em condições de campo. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi sequenciar o genoma de dois genótipos de arroz vermelho coletados no estado do Rio Grande do Sul, e que possuem degrane elevado (AV60) intermediário (AV53), bem como realizar uma análise estrutural dos genes relacionados a este caráter. Vários programas montadores foram comparados e o Abbys foi o que gerou o maior número de scaffolds, totalizado um tamanho de genoma de 391,7 e 390,2 megabases, respectivamente para os genótipos AV53 e AV60, o que representa cerca de 90% do genoma referência do arroz. A cobertura do sequenciamento foi de 36.6 X e 32.1 X respectivamente para os mesmos genótipos. A análise estrutural de seis principais genes relacionados ao degrane relevou que a composição gênica é similar entre os genótipos analisados, corroborando com resultados de estudos anteriores. Um grande número de variantes genômicos foi descoberto (SNPs e INDELs). O alinhamento dos genótipos com o genoma de referênciaOryza sativa ssp. indica revelou relativamente menor número de variantes, com frequência de um SNP a cada 264 pb. Por outro lado, o alinhamento contra o genoma referência de Oryza sativa ssp. japonica gerou uma frequência média de 1 SNP a cada 154pb, sendo que a mesma tendência foi observada para os INDELs. A menor frequência de SNPs e INDELs no primeiro alinhamento sugere maior similaridade entre as espécies alinhadas, indicando que o arroz vermelho do sul do Brasil é provavelmente originário da espécieOryza sativa spp indica. / So far no weed species of agricultural importance had been sequenced in Brazil, thus weedy red rice provided a unique opportunity for it, leading to a better understanding of genomic and facilitating the development of more effective strategies to control these plants under field conditions. The objective of this study was sequencing the genome of two weedy red rice genotypes found in the Rio Grande do Sul state, which present high (AV60) and intermediate (AV53) degree of shattering,and perform a structural analysis of the genes related to this trait. Several genome assemblers programs were compared, and Abbys was the one that generated the highest number of scaffolds, totalizing a genome size of 391.7 and 390.2 Mb, respectively for AV53 and AV60 genotypes, which represent about 90% of the rice reference genome. The sequencing coverage was 32.1 and 36.6X respectively for the same genotypes. The structural analysis of 6 key genes related to seed shattering revealed that its genetic composition is similar among the genotypes analyzed, confirming results from previous studies. A large number of genomic variants (SNPs and INDELs) were discovered. The alignment of AV53, and AV60 with the Oryza sativa ssp. indica reference genome showed relatively lower number of variants, with a frequency of 1 SNP every 220 bp, whereas the alignment with the Oryza sativa spp. japonica yielded an average frequency of 1 SNP every 154pb; the same trend was observed for INDELS. The lower frequency of SNPs and INDELS in the first alignment suggests greater similarity between the aligned species, indicating that the origin of weedy red rice in southern Brazil is most likely from the Oryza sativa spp indica.

A ferrugem da folha é a doença que causa maiores prejuízos à triticultura. A resistência genética é comprovadamente o método mais eficiente e econômico de controle. Em trigo, a resistência à ferrugem da folha pode ser específica à raça e não específica à raça. Atualmente a melhor estratégia para manter uma proteção efetiva contra a ferrugem da folha consiste em empregar combinações de genes, independente do tipo de resistência que conferem. A piramidização de genes é facilitada com o uso de marcadores moleculares. Os mecanismos moleculares de resistência dos genes que conferem resistência específica à raça têm sido amplamente estudados, no entanto da resistência não específica à raça pouco se sabe. Assim, este projeto teve como objetivos: I) validar marcadores moleculares para seleção assistida para a resistência à ferrugem da folha em genótipos brasileiros de trigo; II) identificar marcadores moleculares potencialmente associados a genes de resistência não específica à raça à ferrugem da folha; III) identificar e caracterizar análogos a genes de resistência em trigo;IV) caracterizar mecanismos moleculares da resistência não específica à raça a ferrugem da folha em trigo. Para a validação foram avaliados cinco marcadores PCR-específcos associados aos genes Lr1, Lr9, Lr10 e Lr24. Os marcadores associados aos genes Lr9, Lr10 e Lr24 apresentaram potencial para uso na seleção assistida, pois foram específicos para plantas contendo estes genes. Para a identificação de RGAs foram utilizadas três combinações de primers degenerados. A maioria das seqüências apresentou os motivos comuns a genes de resistência. Uma seqüência apresentou alta homologia com genes de resistência previamente identificados. Os primers derivados das seqüências identificadas apresentaram alto polimorfismo, sendo que um destes mostrou-se associado ao gene Lr26 e a resistência de planta adulta à ferrugem da folha. A combinação da técnica de AFLP com linhagens diferenciais contrastantes para os genes Lr13 e Lr34 permitiu identificar duas seqüências potencialmente associadas ao gene Lr34. O uso da SSH permitiu identificar genes diferencialmente expressos na resistência não específica à raça à ferrugem da folha no cultivar Toropi. Dentre as seqüências identificadas estão genes codificadores de proteínas de membranas potencialmente associados à percepção do patógeno e genes com domínios característicos de sinalizadores secundários para a resistência como NPR1, Rar1, Sgt1 e calmodulina. Além destas, foram identificados também seqüências com homologia a genes codificadores de enzimas chaves no controle de rotas de síntese de substâncias relacionadas à defesa e envolvidas no metabolismo primário, principalmente produção de energia. Os marcadores e seqüências obtidas e mecanismos elucidados neste trabalho representam ferramentas valiosas para a obtenção de cultivares de trigo com resistência ampla e durável à ferrugem da folha. / Leaf rust is one of the most important wheat diseases worldwide. The genetic resistance is the most efficient and economical method to leaf rust control. Host resistance to leaf rust can either be race-specific or no race-specific. The best strategy to maintain an effective protection against leaf rust consists in resistance gene combinations, independent of the resistance type. Marker-assisted selection greatly facilitates gene pyramidization. The molecular mechanisms of race-specific resistance genes have been well studied, however there is little known about the no race-specific resistance gene mechanisms. The objectives of this project were: I) to validate molecular markers for marker-assisted selection to leaf rust resistance genes in Brazilian wheat cultivars; II) to isolate and characterize resistance gene analogues (RGAs) in wheat; III) to identify molecular markers potentially associated to leaf rust no race-specific resistance genes; IV) to characterize molecular mechanisms from no race-specific resistance genes to leaf rust in wheat. Five PCR-specific markers previously identified as associated to the Lr1, Lr9, Lr10 and Lr24 genes were evaluated. The markers associated to the Lr9, Lr10 and Lr24 genes were specific to the cultivars carrying them in the Brazilian wheat cultivars, demonstrating potential for marker-assisted selection. Three degenerate primer combinations were used for the RGAs identification and most of the identified sequences showed the conserved motifs from resistance genes. One sequence showed high homology with previous identified plant resistance genes. The primers from identified sequences showed high polimorphism, and one of these is associated to the Lr26 leaf rust resistance gene and to the adult plant resistance present in cultivar BR35(?). The use of AFLP (amplified fragment length polymorphism) technique with near-isogenic lines carrying Lr13 and Lr34 genes from wheat cv. Thatcher allowed to identify two sequences potentially associated to the Lr34 gene. SSH were used to identify leaf rust induced genes from no race-specific resistance wheat cultivar Toropi. Among the identified sequences there are proteins of membranes for genes potentially associated to the pathogen perception and genes with secondary signals resistance domains as NPR1, Rar1, Sgt1 and calmodulin binding protein. Besides these, we identified sequences with homology to genes for key enzymes in the control of the related defense substances synthesis and involved in the primary metabolisms, mainly energy production. The markers and sequences obtained and the mechanisms elucidated in this work represent a valuable tool for the development of wheat cultivars with more reliable resistance to leaf rust.

O trevo vermelho é uma das leguminosas forrageiras mais utilizadas na agricultura mundial sendo adaptada a um grande número de condições edafo-climáticas. O objetivo deste trabalho foi de avaliar a diversidade genética presente na coleção nuclear de trevo vermelho usando marcadores morfológicos, moleculares e bioquímicos. Os acessos de trevo vermelho da coleção nuclear do NPGS-USDA foram analisados com 21 marcadores morfológicos, 14 loci microsatélites (SSR), 114 marcadores RAPD e 15 loci isoenzimáticos (esterase). Os marcadores moleculares, utilizados pela primeira vez na coleção nuclear, juntamente com os marcadores morfológicos e bioquímicos evidenciaram a alta diversidade genética presente na espécie, principalmente ao nível intrapopulacional. A análise de agrupamentos realizada com os dados morfológicos revelou cinco grupos distintos em relação ao florescimento precoce, médio e tardio, bem como grupos que mostraram maior persistência e produção nas condições do sul do Brasil. Um total de 78 fragmentos (SSR) foi analisado e um PIC variando de 0,70 a 0,91 com média de 0,86 foi obtido. A distância média de Rogers, baseada nos 78 fragmentos SSR, foi de 0,49. A similaridade média de Jaccard baseada nos 114 fragmentos RAPD foi de 0,21 e permitiu a identificação de todos os acessos. A heterozigosidade média (He) baseada nos dados isoenzimáticos foi de He = 0,238 e a distância média de Rogers foi de 0,14. Os dados isoenzimáticos classificaram os acessos em quatro grupos. Os grupos encontrados não separam os acessos conforme a origem geográfica ou tipo de população (cultivar, selvagem e variedade local). No entanto, algumas concordâncias foram encontradas entre as análises, uma vez que as cultivares do norte da Europa foram agrupadas em ambos os tipos de análise. Os resultados encontrados aqui evidenciaram uma grande e complexa diversidade genética na coleção nuclear de trevo vermelho. Além disso, mostraram algumas populações promissoras que podem ser usadas em programas de melhoramento de trevo vermelho no Brasil. / Red clover is one of the most utilized leguminous forage species in the world agriculture being adapted to a great number of edaphic-climatic conditions. The objective of this work was to evaluate the genetic diversity in the core collection of red clover using morphologic, molecular and biochemical traits. The accessions of red clover from the core collection of NPGS-USDA were analyzed with 21 morphological characters, 14 microsatellite loci (SSR), with 114 RAPD markers and with 15 loci of isozyme (esterase) markers. The molecular markers, used for the first time in the core collection, together with the morphological and biochemical markers pointed out for the high genetic diversity present in the species, mostly at the intrapopulational level. The cluster analysis of the morphological data revealed five distinct clusters that separated early, medium and wild blooming types as well as groups with more persistence and high dry matter production in the Southern Brazilian conditions. A total of 78 fragments (SSR) were scored and the PIC ranged from 0.70 to 0.91 with 0.86 as mean value. The mean Rogers’ genetic distance based on the 78 SSR markers was 0.49. The Jaccard’s similarity based on 114 RAPD markers was 0.21 and allowed the identification of all accessions. The mean expected heterozygosity (He), based on isozyme data, was He = 0.238 and the mean Rogers’ genetic distance was 0.14. Isozyme data clustered the accessions of red clover in four groups. The clusters found with morphological and biochemical markers were not separated according to their geographic origin or type of populations (cultivar, wild or landrace). However, some coincidences between analyses were found once cultivars from north Europe were clustered in both types of analyze. The results found here evidenced the high and complex diversity in red clover core collection. Indeed, they highlighted some promising populations that could be used in the Brazilian breeding programs of red clover.

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Orientador: Edivaldo Aparecido Amaral da Silva / Banca: Juliana Pereira Bravo / Banca: João Nakagawa / Banca: Ana Dionísia da Luz Coelho Novembre / Resumo: A planta de Solanum paniculatum pertence à família Solanaceae e apresenta crescimento e desenvolvimento em condições ambientais desfavoráveis, tais como estresse hídrico e salino, solos ácidos e solos com deficiência em nutrientes. Por tanto, o objetivo deste trabalho foi estudar o transcriptoma de sementes de S. paniculatum L induzidas a tolerar déficit hídrico. As sementes secas foram acondicionadas em tubos contendo 15 mL de solução de PEG 8000 com potencial osmótico de -0,4; -0,8; -1,0 e - 1,2MPa e mantidas à temperatura de 15 °C durante 15 dias. Em seguida, as sementes foram colocadas para germinar em condições de déficit hídrico, que foi realizado pelo uso de meio germinativo contendo soluções de PEG 8000 nos potenciais de 0,0, -0,2, - 0,4, -0,6, -0,8 e -1.0 MPa na temperatura de 25 °C e luz constante. Após a conclusão dessa etapa, o melhor tratamento (-1,0 MPa) foi utilizado para os estudos moleculares. Posteriormente, foi extraído o RNA total das sementes condicionadas e não condicionadas (NC). Em seguida a integridade do RNA foi verificada em Bioanalyzer e as bibliotecas foram preparadas utilizando o protocolo TruSeq RNA sample prep v2. O sequenciamento foi realizado no HiScanSQ (Illumina) e os dados gerados analisados pela plataforma CLC Genomics Workbench versão 6.0.2 (CLC bio, Denmark). Os contigs foram anotados usando o programa Blast2go e o enriquecimento funcional pelo GO e Bingo. Os genes diferencialmente obtidos foram validados via RT-qPCR. Observou-se aumento na porcentagem de germinação total das sementes condicionadas (-1,0 MPa) em relação às não condicionadas (NC). Foram gerados 34.640 transcritos, onde 208 transcritos foram diferencialmente expressos, porém, 23 apresentaram respostas a estresse em sementes de S. paniculatum L, associados com estresse abiótico (déficit hídrico, estresse térmico e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Solanum paniculatum L belongs to the Solanaceae family and presents growth and development in unfavorable environmental conditions such as drought and salt stress, acid soils and soils poor in nutrients. Therefore, the objective of this work was to study the S. paniculatum L seed transcriptome induced to tolerate drought stress. The dried seeds were placed in tubes containing 15 mL of PEG 8000 solution with osmotic potential of -0.4; -0.8; -1.0 and -1.2MPa followed by incubation at 15° C for 15 days. Then the seeds were subjected to germinate under drought conditions, which was generated by the use of germination medium containing PEG 8000 solutions at potentials of 0,0, -0,2, -0,4, -0,6, -0, 8 and -1,0 MPa at 25° C under constant light. Following, RNA was extracted and had the quality verified in Bioanalyzer and libraries were prepared using the TruSeq RNA sample prep protocol v2. Sequencing was performed on HiScanSQ (Illumina) and the data generated were analyzed in CLC Genomics Workbench platform version 6.0.2 (CLC bio, Denmark). The contigs were recorded using Blast2go program and functional enrichment for GO and Bingo. We observed an increase in the percentage of germination under drought stress of seeds previously subjected to PEG treatment (-1,0MPa) in comparison with seeds that were not treated. There were generated 34.640 transcripts, where 208 were differentially expressed but only 102 transcripts where associated with stress. However, only twenty three transcripts have known function which are associated with response to stress (drought, heat and oxidative stress). Among those, thirteen genes had the expression validated by qPCR. Here, we discuss the possible involvement on these genes on stress tolerance in Solanum paniculatum seeds during germination. / Doutor

Mimosa bimucronata (Maricá) é a espécie do gênero Mimosa mais abundante no Rio Grande do Sul, típica da Mata Atlântica. Poucos são os estudos citogenéticos para a espécie. O objetivo do trabalho foi determinar o número cromossômico em populações naturais da espécie dentro de sua área de distribuição no Rio Grande do Sul, verificar a possível existência de variabilidade intraespecífica e também analisar o comportamento meiótico. As 50 populações de M. bimucronata analisadas foram todas diplóides (2n=2x=26, n=13). Portanto, na área amostrada, a espécie não apresenta variação no nível de ploidia. Células polissomáticas foram observadas numa freqüência que variou de 0% a 31,5 % entre as populações, mas somente no meristema radicular, não sendo observadas nas células-mãe de grão de pólen. A meiose de M. bimucronata é peculiar, no sentido de que as células-mãe de grão de pólen permanecem agrupadas duas a duas durante todo processo de divisão meiótica, levando a formação de políades (bitétrades) com oito grãos de pólen, o que deve ser uma adaptação para uma alta produção de sementes por um único evento de polinização. / Mimosa bimucronata (Maricá) is the Mimosa species most abundant in no Rio Grande do Sul, typical of the Mata Atlântica. There are few cytogenetic studies for the species. This worked aimed to determine the chromosome number in natural populations of the species in its distribution area in Rio Grande do Sul, to verify the possible existence of intraspecific variability and to analyze meiotic behavior. All the 50 M. bimucronata populations analyzed were diploid (2n=2x=26, n=13). Therefore, in the area sampled, the species does not present variation in ploidy level. Polysomatic cells were found in the root tip meristem, ranging from 0% to 31,5 % among populations, but were absent in pollen-mother-cells. M. bimucronata meiosis is peculiar, as the pollen-mother-cells remained joined two by two during all the meiotic process, leading to the formation of polyads (bitetrads) with eight pollen grains, what should be an adaptation to a high seed production by only one pollination event.

O trevo branco (Trifolium repens L.) é uma das mais importantes leguminosas forrageiras de regiões temperadas do mundo, sendo uma das espécies mais utilizadas em pastagens durante o inverno e primavera no Rio Grande do Sul, mas que apresenta problemas de persistência, principalmente no verão, devido às altas temperaturas e à baixa disponibilidade de água nesse período. O objetivo desse trabalho foi analisar a diversidade genética entre os acessos da coleção nuclear de trevo branco proveniente do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) através de marcadores isoenzimáticos e microssatélites, além de avaliar o efeito da disponibilidade hídrica (90 e 50% da umidade de capacidade de campo do solo) sobre características morfofisiológicas de uma subamostra da coleção. Os acessos foram analisados através de 18 bandas isoenzimáticas (esterase) e nove locos microssatélites (SSR), os quais foram eficientes para detectar a alta diversidade genética existente entre os acessos. Um total de 70 fragmentos de microssatélites foram analisados, obtendo-se uma média de 7,8 alelos por loco e um conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) variando de 0,26 a 0,86, com média de 0,67. A distância genética média através do coeficiente de Nei para os dados de esterase foi 0,73, variando de 0 a 1,79, evidenciando cinco grupos formados para os 47 acessos analisados, enquanto que para os SSR a distância média foi de 0,68, variando de 0,18 a 2,25, classificando os 81 acessos em sete grupos. Em relação à tolerância à seca, verificou-se interação genótipo x nível de água para 12 das 23 variáveis medidas na primeira avaliação e 19 das 32 variáveis analisadas na segunda. Os acessos que se destacaram sob déficit hídrico foram o 75 e o 74, os quais triplicaram e dobraram, respectivamente, a eficiência do uso da água, apresentando maior média de comprimento de entrenós e conseqüentemente, maiores produções de matéria seca de parte aérea. Portanto, esse trabalho representa uma contribuição no estudo da variabilidade genética e na caracterização dos acessos que compõem a coleção nuclear da espécie, tanto através de marcadores bioquímicos e moleculares, como através de marcadores morfofisiológicos sob condições de estresse hídrico. / White clover (Trifolium repens L.) it is one of the most important forage legumes in temperate regions of the world, being one of the most used species in pastures during the winter and spring in Rio Grande do Sul, which has persistence problems, mainly in the summer, due to the high temperatures and the low water availability in that period. The work was aimed to analyze the genetic diversity among the accessions from the white clover core collection obtained from the United States Department of Agriculture (USDA) through isozymes and microsatellite markers, besides evaluating the effect of water availability (90 and 50% of the soil moisture field capacity) on morphophysiological traits of a sample of the collection. The accessions were analyzed through 18 isozyme bands (esterase) and nine microsatellites loci (SSR), which were efficient to detect the high existent genetic diversity among the accessions. A total of 70 SSR fragments was analyzed, obtaining an average of 7,8 alleles per locus and, a PIC varying from 0,26 to 0,86, with average of 0,67. The medium genetic distance through Nei's coefficient for the esterase data was 0,73, varying from 0 to 1,79, evidencing five groups formed for the 47 analyzed accessions, while for SSR the medium distance was 0,68, varying from 0,18 to 2,25, classifying the 81 accessions in seven groups. In relation to drought tolerance, there was interaction genotype x level of water for 12 of the 23 measured variables in the first evaluation, and 19 of the 32 variables analyzed in the second. The best accessions under water deficit were 75 and 74, which triplicate and double, respectively, the water use efficiency, showing larger internodes length and consequently larger productions of MSPA. Therefore this work represents a contribution to the study of the genetic variability and to the characterization of the accessions of the core collection of the specie, through biochemical and molecular markers, as well as through morphophysiological markers under water stress conditions.

Uma cuidadosa revisão bibliográfica, seguida por uma pesquisa in silico no banco de dados de expressed sequence tags (ESTs) do projeto GENOLYPTUS – Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus, foram realizadas visando identificar classes de genes potencialmente relacionadas com a resposta vegetal à deficiência hídrica em Eucalyptus grandis. Os principais clones de cDNA selecionados potencialmente codificam proteínas relacionadas com a síntese de osmólitos como prolina, sacarose, osmotina, poliaminas, desidrinas, fatores de transcrição, e genes de uma importante cascata de sinalização vegetal à deficiência hídrica. Duas classes de seqüências foram estudadas mais detalhadamente. A Sadenosil- metionina-descarboxilase (SAMDC) é uma enzima-chave na rota de síntese das poliaminas, aminas catiônicas envolvidas em vários processos celulares, inclusive na proteção das estruturas da célula em respostas a diferentes tipos de estresses. Dois grupos de ESTs foram inicialmente identificados por homologia a seqüências conhecidas de SAMDC e duas seqüências potencialmente completas de cada grupo foram selecionadas e denominadas EgrSAMDC1 e EgrSAMDC2. As seqüências deduzidas de aminoácidos de ambos os cDNAs apresentaram os dois principais domínios da enzima e uma estrutura conservada em relação a outras SAMDCs de plantas. Além da região de leitura aberta (ORF, do inglês, open reading frame) principal, os cDNAs apresentaram duas pequenas regiões codificadoras conservadas, denominadas tiny e small upstream ORFs na longa região 5’ não traduzida, relacionadas à regulação pós-transcricional dos genes. Em análises de Southern blot, foram detectados pelo menos dois fortes sinais de hibridização para cada amostra de DNA genômico de E. grandis digerido por endonucleases distintas, sugerindo a existência de (pelo menos) duas cópias genômicas de SAMDC. Por Northern blots, a presença de mRNAs para SAMDC foi detectada em folhas e caules jovens e, em menor quantidade, em tecidos vasculares de árvores adultas. Entretanto e nitidamente, a maior expressão de SAMDC em E. grandis ocorre em flores abertas. Análises quantitativas por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da DNApolimerase (qRT-PCR) com plântulas cultivadas in vitro por 4 meses, submetidas a diferentes tratamentos como ácido abscísico (ABA), ácido naftalenoacético (ANA), quinetina (KIN), cloreto de sódio (NaCl), seca, frio, luz ultravioleta (UV), ferimentos e extrato de leveduras, 9 demonstraram maior indução da expressão de EgrSAMDC2 na presença de ABA e NaCl. Também foi observada uma drástica redução na expressão deste gene, baseado nos níveis de mRNA-molde para as RT-PCRs, quando as plântulas foram expostas a UV e seca. Estes resultados indicaram que o gene EgrSAMDC2 pode estar mais relacionado à resposta vegetal à elevada salinidade, por intermédio da sinalização por ABA, do que à resposta a outros estresses ambientais ou bióticos. A segunda classe de genes identificados e analisados junto ao GENOLYPTUS como potencialmente relacionados à deficiência hídrica potencialmente codificam proteína-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs, do inglês, mitogen-activated protein kinases). MAPKs são proteínas de uma importante cascata sinalizadora, constituída por três componentes denominados MAPKKK, MAPKK e MAPK. Elas estão envolvidas na sinalização do desenvolvimento, estímulos hormonais e de estresses bióticos e abióticos. O cDNA selecionado, de aproximadamente 5 kb, representa uma seqüência imatura de mRNA (transcrito primário), no qual estão presentes dois íntrons. Nas extremidades 5’ e 3’ dos íntrons existem sítios canônicos de processamento (splicing) que indicam que o transcrito deve ser corretamente processado em um mRNA maduro. A proteína deduzida a partir da união dos éxons indica que o cDNA isolado de E. grandis potencialmente codifica uma MAPK2, com alta homologia a outras MAPKs vegetais. Além disto, a seqüência de aminoácidos representa uma proteína completa, na qual os 11 domínios conservados em MAPKs, fundamentais para o correto funcionamento da enzima, estão presentes. Análise de Southern blot indicaram que este gene está presente em cópia única no genoma de E. grandis. Em análises da expressão por qRT-PCR em plântulas submetidas aos diferentes tratamentos descritos acima, foi observado uma significativa indução da transcrição com KIN e NaCl, e uma leve indução por ABA. O tratamento com UV provocou uma drástica redução na expressão de EgrMAPK2. Este resultado fornece indícios de que este gene possivelmente esteja em envolvido em repostas a estresses abióticos. / A careful bibliographical review, followed by an in silico screening of the expressed sequence tag (EST) databank of the GENOLYPTUS Project – The Brazilian Research Network on the Eucalyptus Genome, were conducted to identify genes potentially related to drought responses in Eucalyptus grandis. The main selected clones potentially encode proteins related to the biosynthesis of different osmolites such as proline, sucrose, osmotin and polyamines, dehydrines, transcription factors and genes from an important plant signaling cascade. Two gene classes were studied in more detail. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) is one of the key regulatory enzymes in the biosynthesis of polyamines, cationic amines involved in various processes of the cell, including the protection of cellular structures in response to different stresses. Two clusters of ESTs were initially identified by homology to known SAMDC sequences and, from each of them, two full-length cDNAs were identified and named EgrSAMDC1 and EgrSAMDC2. The deduced amino acid sequences from both cDNAs showed the two main enzyme domains and a conserved protein structure in comparison to other plant SAMDCs. Besides the main open reading frame (ORF), two other tiny and small upstream ORFs were found in the long 5’ non-translated region of the cDNAs. These sequences are known to be associated with post-transcriptional regulation. Southern blot analysis resulted in two strong hybridization signals for each genomic DNA digested with different restriction enzymes, indicating (at least) two SAMDC genomic copies. Northern blots detected SAMDC mRNAs in young leaves and stems and a lower transcript level in vascular tissues from mature trees. Nevertheless, the highest levels of E. grandis SAMDC steady-state mRNA was clearly detected in opened flowers. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) with total RNA from 4-months old in vitro seedlings subjected to different treatments, such as abscisic acid (ABA), naphthaleneacetic acid (NAA), kinetin (KIN), sodium chloride (NaCl), drought, cold, ultraviolet light (UV), wounding and yeast extract, demonstrated higher expression induction of EgrSAMDC2 gene with ABA and NaCl. A drastic reduction in gene expression was observed after UV and drought treatments of the seedlings, based on RNA-template levels for RT-PCRs. These results suggested that 11 EgrSAMDC2 gene might be more related to plant response against high salinity, possibly via ABA signaling, than to other environmental or biotic-like stress responses. The second gene class identified and analyzed in the GENOLYPTUS, as potentially involved in drought responses, encodes a mitogen-activated protein kinase (MAPK). MAPKs proteins are part of an important signaling casacade, which consists of three components, MAPKKK, MAPKK and MAPK. They are associated to developmental signaling, hormonal and biotic and abiotic stimuli. The selected cDNA, of about 5 kb in length, represented an immature mRNA (primary transcript) with two non-spliced introns. The canonical 5’ and 3’ splicing sites suggested that the transcript might probably be correctly translated to a mature mRNA. The deduced protein from the union of all three exons indicated that the isolated E. grandis cDNA potentially encodes a MAPK2, with high homology to other plant MAPKs. Moreover, the amino acid sequence represented a complete protein, with all 11 domains conserved in MAPKs and known to be fundamental for the enzyme functionality. Southern blot analysis indicated that EgrMAPK2 is encoded by a single genomic copy in E. grandis. From qRT-PCR expression analysis, conducted with the same plant material described above, we observed a significant transcription induction with KIN and NaCl, and a weaker induction by ABA. The UV treatment resulted in a drastic reduction of EgrMAPK2 expression. This result strongly indicated that this gene is most probably involved in abiotic stress responses.

A brusone, causada pelo fungo Magnaporthe grisea (Hebert) Barr, é uma das mais importantes doenças da cultura do arroz. A resistência genética é a forma mais efetiva para o controle da doença. Os objetivos do presente trabalho foram: identificar genes envolvidos na resposta de resistência à infecção de M. grisea em arroz através das técnicas de expressão diferencial; obter e caracterizar uma biblioteca de cDNAs utilizando como modelo linhas quase-isogênicas de arroz (NILs = Near Isogenic Lines), contendo os genes de resistência Pi-1 e Pi-2; e avaliar e comparar a expressão diferencial de mRNAs, através dos cDNAs isolados em uma série de cultivares com resposta distinta à infecção de M. grisea. Foram identificados dois isolados com virulência diferencial para as NILs e um isolado para os cultivares. Os cDNAs relacionados à resistência do arroz à M. grisea foram identificados a partir de mRNAs isolados das NILs. Foram obtidos 30 fragmentos de cDNAs e 232 clones de cDNAs pelas técnicas de cDNA-AFLP e SSH, respectivamente. A análise das seqüências permitiu identificar genes envolvidos nos processos de metabolismo, transporte de íon inorgânico; transdução de sinais; fatores de transcrição; metabolismo de coenzima; conversão e produção de energia; metabolismo e transporte de carboidrato e biossíntese de proteína. Noventa clones isolados através da técnica de SSH foram selecionados e a expressão diferencial foi avaliada via hibridização em macroarranjos de cDNAs. A ausência de conservação entre os mRNAs diferencialmente expressos nas interações analisadas e a diversidade dos grupos de genes reflete a complexidade das respostas. A análise funcional in vivo desses genes poderá contribuir para utilização dos mesmos na obtenção de uma resistência de espectro amplo à brusone do arroz.

Uma cuidadosa revisão bibliográfica, seguida por uma pesquisa in silico no banco de dados de expressed sequence tags (ESTs) do projeto GENOLYPTUS – Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus, foram realizadas visando identificar classes de genes potencialmente relacionadas com a resposta vegetal à deficiência hídrica em Eucalyptus grandis. Os principais clones de cDNA selecionados potencialmente codificam proteínas relacionadas com a síntese de osmólitos como prolina, sacarose, osmotina, poliaminas, desidrinas, fatores de transcrição, e genes de uma importante cascata de sinalização vegetal à deficiência hídrica. Duas classes de seqüências foram estudadas mais detalhadamente. A Sadenosil- metionina-descarboxilase (SAMDC) é uma enzima-chave na rota de síntese das poliaminas, aminas catiônicas envolvidas em vários processos celulares, inclusive na proteção das estruturas da célula em respostas a diferentes tipos de estresses. Dois grupos de ESTs foram inicialmente identificados por homologia a seqüências conhecidas de SAMDC e duas seqüências potencialmente completas de cada grupo foram selecionadas e denominadas EgrSAMDC1 e EgrSAMDC2. As seqüências deduzidas de aminoácidos de ambos os cDNAs apresentaram os dois principais domínios da enzima e uma estrutura conservada em relação a outras SAMDCs de plantas. Além da região de leitura aberta (ORF, do inglês, open reading frame) principal, os cDNAs apresentaram duas pequenas regiões codificadoras conservadas, denominadas tiny e small upstream ORFs na longa região 5’ não traduzida, relacionadas à regulação pós-transcricional dos genes. Em análises de Southern blot, foram detectados pelo menos dois fortes sinais de hibridização para cada amostra de DNA genômico de E. grandis digerido por endonucleases distintas, sugerindo a existência de (pelo menos) duas cópias genômicas de SAMDC. Por Northern blots, a presença de mRNAs para SAMDC foi detectada em folhas e caules jovens e, em menor quantidade, em tecidos vasculares de árvores adultas. Entretanto e nitidamente, a maior expressão de SAMDC em E. grandis ocorre em flores abertas. Análises quantitativas por transcrição reversa seguida de reação em cadeia da DNApolimerase (qRT-PCR) com plântulas cultivadas in vitro por 4 meses, submetidas a diferentes tratamentos como ácido abscísico (ABA), ácido naftalenoacético (ANA), quinetina (KIN), cloreto de sódio (NaCl), seca, frio, luz ultravioleta (UV), ferimentos e extrato de leveduras, 9 demonstraram maior indução da expressão de EgrSAMDC2 na presença de ABA e NaCl. Também foi observada uma drástica redução na expressão deste gene, baseado nos níveis de mRNA-molde para as RT-PCRs, quando as plântulas foram expostas a UV e seca. Estes resultados indicaram que o gene EgrSAMDC2 pode estar mais relacionado à resposta vegetal à elevada salinidade, por intermédio da sinalização por ABA, do que à resposta a outros estresses ambientais ou bióticos. A segunda classe de genes identificados e analisados junto ao GENOLYPTUS como potencialmente relacionados à deficiência hídrica potencialmente codificam proteína-cinases ativadas por mitógenos (MAPKs, do inglês, mitogen-activated protein kinases). MAPKs são proteínas de uma importante cascata sinalizadora, constituída por três componentes denominados MAPKKK, MAPKK e MAPK. Elas estão envolvidas na sinalização do desenvolvimento, estímulos hormonais e de estresses bióticos e abióticos. O cDNA selecionado, de aproximadamente 5 kb, representa uma seqüência imatura de mRNA (transcrito primário), no qual estão presentes dois íntrons. Nas extremidades 5’ e 3’ dos íntrons existem sítios canônicos de processamento (splicing) que indicam que o transcrito deve ser corretamente processado em um mRNA maduro. A proteína deduzida a partir da união dos éxons indica que o cDNA isolado de E. grandis potencialmente codifica uma MAPK2, com alta homologia a outras MAPKs vegetais. Além disto, a seqüência de aminoácidos representa uma proteína completa, na qual os 11 domínios conservados em MAPKs, fundamentais para o correto funcionamento da enzima, estão presentes. Análise de Southern blot indicaram que este gene está presente em cópia única no genoma de E. grandis. Em análises da expressão por qRT-PCR em plântulas submetidas aos diferentes tratamentos descritos acima, foi observado uma significativa indução da transcrição com KIN e NaCl, e uma leve indução por ABA. O tratamento com UV provocou uma drástica redução na expressão de EgrMAPK2. Este resultado fornece indícios de que este gene possivelmente esteja em envolvido em repostas a estresses abióticos. / A careful bibliographical review, followed by an in silico screening of the expressed sequence tag (EST) databank of the GENOLYPTUS Project – The Brazilian Research Network on the Eucalyptus Genome, were conducted to identify genes potentially related to drought responses in Eucalyptus grandis. The main selected clones potentially encode proteins related to the biosynthesis of different osmolites such as proline, sucrose, osmotin and polyamines, dehydrines, transcription factors and genes from an important plant signaling cascade. Two gene classes were studied in more detail. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) is one of the key regulatory enzymes in the biosynthesis of polyamines, cationic amines involved in various processes of the cell, including the protection of cellular structures in response to different stresses. Two clusters of ESTs were initially identified by homology to known SAMDC sequences and, from each of them, two full-length cDNAs were identified and named EgrSAMDC1 and EgrSAMDC2. The deduced amino acid sequences from both cDNAs showed the two main enzyme domains and a conserved protein structure in comparison to other plant SAMDCs. Besides the main open reading frame (ORF), two other tiny and small upstream ORFs were found in the long 5’ non-translated region of the cDNAs. These sequences are known to be associated with post-transcriptional regulation. Southern blot analysis resulted in two strong hybridization signals for each genomic DNA digested with different restriction enzymes, indicating (at least) two SAMDC genomic copies. Northern blots detected SAMDC mRNAs in young leaves and stems and a lower transcript level in vascular tissues from mature trees. Nevertheless, the highest levels of E. grandis SAMDC steady-state mRNA was clearly detected in opened flowers. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) with total RNA from 4-months old in vitro seedlings subjected to different treatments, such as abscisic acid (ABA), naphthaleneacetic acid (NAA), kinetin (KIN), sodium chloride (NaCl), drought, cold, ultraviolet light (UV), wounding and yeast extract, demonstrated higher expression induction of EgrSAMDC2 gene with ABA and NaCl. A drastic reduction in gene expression was observed after UV and drought treatments of the seedlings, based on RNA-template levels for RT-PCRs. These results suggested that 11 EgrSAMDC2 gene might be more related to plant response against high salinity, possibly via ABA signaling, than to other environmental or biotic-like stress responses. The second gene class identified and analyzed in the GENOLYPTUS, as potentially involved in drought responses, encodes a mitogen-activated protein kinase (MAPK). MAPKs proteins are part of an important signaling casacade, which consists of three components, MAPKKK, MAPKK and MAPK. They are associated to developmental signaling, hormonal and biotic and abiotic stimuli. The selected cDNA, of about 5 kb in length, represented an immature mRNA (primary transcript) with two non-spliced introns. The canonical 5’ and 3’ splicing sites suggested that the transcript might probably be correctly translated to a mature mRNA. The deduced protein from the union of all three exons indicated that the isolated E. grandis cDNA potentially encodes a MAPK2, with high homology to other plant MAPKs. Moreover, the amino acid sequence represented a complete protein, with all 11 domains conserved in MAPKs and known to be fundamental for the enzyme functionality. Southern blot analysis indicated that EgrMAPK2 is encoded by a single genomic copy in E. grandis. From qRT-PCR expression analysis, conducted with the same plant material described above, we observed a significant transcription induction with KIN and NaCl, and a weaker induction by ABA. The UV treatment resulted in a drastic reduction of EgrMAPK2 expression. This result strongly indicated that this gene is most probably involved in abiotic stress responses.