Este trabalho teve por objetivo avaliar a combinação de processos de tratamento de esgoto e a partir dos efluentes produzidos com diferentes padrões de qualidade elencar as possibilidades para reúso de acordo com legislação internacional. Foi feito o monitoramento da estação piloto de tratamento de esgoto constituído reator UASB seguido de lodo ativado cujos efluentes foram utilizados neste estudo, não somente para análises físico-químicas e microbiológicas, mas também para posterior tratamento físico-químico em laboratório com equipamento jarteste utilizando dois coagulantes - cloreto férrico e sulfato de alumínio. Após os tratamentos combinados seis amostras diferentes foram analisadas, sendo elas: efluente do UASB, efluente do lodo ativado, tratamentos UASB-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\', UASB-\'FE\'CL IND.3\', lodo ativado-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\' e lodo ativado-\'FE\'CL IND.3\'. Os ensaios realizados com cloreto férrico foram os que melhor promoveram remoção dos microrganismos indicadores e de (oo)cistos, de DQO e SST. Porém, mesmo após o tratamento físico-químico não será possível reutilização agrícola, urbana e/ou industrial dos efluentes, conforme legislação internacional e diretrizes da OMS, uma vez que a concentração de microrganismos indicadores ainda é muito elevada. Os valores médios de E. coli, coliformes totais e Giardia spp., mesmo após o tratamento que forneceu melhor remoção microbiológica (lodo ativado \'FE\'CL IND.3\') foram de 4,31 x \'10 POT.2\', 7,68 x \'10 POT.3\' e 2,17 x \'10 POT.2\', respectivamente. / The present dissertation reports to evaluate the combination of process wastewater treatment and from the effluent produced with different standards quality list the possibilities for reuse in accordance with international Law. Was monitored from the wastewater treatment plant pilot consists of a UASB reactor followed by activated sludge whose effluents were used in this study not only physical-chemical and microbiological analyzes, but also for subsequent physical-chemical treatment in the laboratory with equipment jartest using two coagulants ferric chloride and aluminum sulfate. After the treatments combined six different samples were analyzed: UASB effluent, activated sludge effluent, treatments UASB-\'AL IND.2\'(\'SO IND.4\')IND.3\', UASB-\'FE\'CL IND.3\', activated sludge-activated sludge and activated sludge-\'FE\'CL IND.3\'. The tests with ferric chloride were better promoted removal of the microbiological indicators and (oo)cysts, COD and TSS. However, even after physical-chemical treatment will not be possible wastewater reuse in agriculture, urban and/or industrial, according international law and the WHO guidelines, since the concentration of indicator microorganisms is still very high. The average values of E. coli and total coliform and Giardia spp., even after the treatment which promoted better microbiological removal, were 4,31 x \'10 POT.2\', 7,68 x \'10 POT.3\' e 2,17 x \'10 POT.2\', respectively.

Esgotos urbanos constituem compartimentos ambientais que favorecem a emergência e re-emergência enfermidades de veiculação hídrica. Este estudo objetivou analisar cistos de Giardia spp., oocistos de Cryptosporidium spp., assim como cistos, ovos e larvas de outros protozoários e helmintos patogênicos; Coliformes Totais e Termotolerantes, Rotavírus e Adenovírus em amostras de esgoto bruto e tratado da Estação de Tratamento de Esgoto de Ribeirão Preto - SP. As coletas de esgoto foram realizadas no ponto de entrada e no ponto de saída da ETE-Ribeirão Preto/SP. As análises de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. foram realizados pelo Método 1623 da EPA. Ovos, cistos e larvas de outros protozoários e helmintos foram analisados pelo Método de Sedimentação proposto pela CETESB (1989). A análise de coliformes totais e termotolerantes foi realizada pela Técnica de Tubos Múltiplos (Colilert®). A análise de vírus foi realizada através do Teste de Elisa com o KIT da RIDASCREEN® Enzimaimunoensaio. Os resultados obtidos revelaram que a concentração de Giardia spp. no esgoto bruto variou de 120 a 2200 cistos/L, já no esgoto tratado essa concentração variou de 0,45 a 3,5 cistos/L. Com relação aos oocistos de Cryptosporidium spp. a concentração no esgoto bruto variou de não detectável a 28,9 oocistos/L e no esgoto tratado as concentrações variaram de não detectável a 1,05 oocistos/L. O processo de lodos ativados na ETE-RP promoveu uma remoção parcial de parasitas, tais como: Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hystolitica, Ancylostoma sp., Ascaris sp. Fasciola hepatica e Strongyloides stercoralis, cujo fator de redução variou entre 18,2 e 100%. Pode-se observar que houve diferença estatisticamente significante entre o número mais provável de coliformes totais e termotolerantes no esgoto bruto e esgoto tratado, mostrando uma redução na concentração desses organismos indicadores após o tratamento do esgoto na ETE-Ribeirão Preto/SP. Não houve correlação significativa entre as concentrações de coliformes totais e termotolerantes em relação à concentração de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp.. A análise de vírus mostrou resposta positiva para Rotavirus e Adenovirus em todas as amostras analisadas (esgoto bruto e tratado), mostrando menor absorvância no esgoto tratado. Os resultados obtidos contribuem para a identificação e caracterização de microorganismos de veiculação hídrica no esgoto tratado na ETE-RP, fornecendo dados úteis para a definição de políticas públicas de saneamento, referentes ao controle da qualidade microbiológica do esgoto no país. / Sewage treatment is still precarious in many Brazilian cities, which has contributed to the emergence and re-emergence of waterborne diseases. This study analyzed Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts, as well as cysts, eggs and larvae of other protozoa and helminthes. Also part of the study were total and thermotolerant coliforms, Rotavirus and Adenovirus in samples of raw and treated sewage of the Sewage Treatment Station (ETE) of Ribeirão Preto, SP, Brazil. Sewage samples were taken at the points of entry and exit of the ETE, Ribeirão Preto. Analyses of Giardia spp. cysts and Cryptosporidium spp. oocysts were performed through the EPA\'s method 1623. Eggs, cysts and larvae of other protozoa and helminthes were analyzed utilizing the method of sedimentation as proposed by CETESB (1989). Analyses of total and thermotolerant coliforms were performed using the Multiple Tube method (Colilert®). Viral analyses were performed through the RIDASCREEN® enzyme immunoassay ELISA test kit. The results revealed that the concentration of Giardia spp. in raw sewage varied from 120 to 2,200 cysts/L; this concentration varied from 0.45 to 3.5 cysts/L in treated sewage. The concentration of Cryptosporidium spp. oocysts in raw sewage varied from non-detectable to 28.9 oocysts/L and from non-detectable to 1.05 oocysts/L in treated sewage. The activated sludge process used in ETE promoted a partial removal of parasites such as: Endolimax nana, Entamoeba coli, Entamoeba hystolitica, Ancylostoma sp., Ascaris sp. Fasciola hepatica and Strongyloides stercoralis. Reduction factors varied from 18.2 to 100%. A statistically significant difference was observed between the most probable number of total and thermotolerant coliforms in raw and treated sewage, showing a reduction in the concentration of these indicators after the treatment of sewage in ETE, Ribeirão Preto. No statistically significant correlation was found between the concentrations of total and thermotolerant coliforms in relation to the concentration of Giardia cysts spp. and Cryptosporidium spp. oocysts. Analyzing viruses showed positive responses for Rotavirus and Adenovirus in all the studied samples (raw and treated sewage), with a smaller absorbance in the treated sewage. The results contribute to the identification and evaluation of the prevalence of waterborne microorganisms in treated sewage in ETE, Ribeirão Preto, providing useful data for the definition of public policies for sanitation concerning microbiological quality control in Brazil\'s sewage.

Introdução: O risco à saúde humana ocasionado pela contaminação biológica de águas captadas para abastecimento público é realçado pela ocorrência de surtos de doenças associadas aos protozoários Giardia e Cryptosporidium, que possuem baixas doses infecciosas e alta capacidade de sobrevivência no ambiente, além de serem capazes de resistir ao processo tradicional de desinfecção da água (cloração). Partindo-se da hipótese de que há um risco elevado de infecção por estes protozoários pela ingestão de água tratada por métodos convencionais e que fazem uso de mananciais superficiais impactados por contaminação biológica, resultando num possível incremento da incidência de diarréias, este estudo se propôs a verificar a ocorrência destes protozoários em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP, caracterizar sua patogenicidade e avaliar o risco associado ao seu consumo através da água tratada. Métodos: Foram coletadas 48 amostras do ribeirão dos Cristais no ponto de captação da estação de tratamento de água, semanalmente, durante 12 meses (de 16/05/2013 a 21/05/2014). A detecção e a análise da concentração dos protozoários foram realizadas de acordo com Método 1623.1 da United States Environmental Protection Agency e a extração e caracterização dos espécies/genótipos de Giardia e Cryptosporidium foi realizada através metodologias moleculares e seqüenciamento. O risco de infecção pela ingestão de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium presentes na água tratada foi calculado usando a ferramenta da Avaliação Quantitativa do Risco Microbiológico, a partir dos dados de concentração dos patógenos obtidos pelo Método 1623.1, eficiência de remoção dos (oo)cistos durante o processo convencional de tratamento da água, modelo dose-resposta e taxa de ingestão diária de água para indivíduos menores de 5 anos e maiores de 21 anos. Resultados: Cistos de Giardia foram detectados em 83,3% das amostras (40/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 8,6 cistos/L. Oocistos de Cryptosporidium foram etectados em 37,5% das amostras (18/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 2 oocistos/L. As espécies/genótipos encontrados (Giardia intestinalis A e B e Cryptosporidium parvum e hominis) são característicos de contaminação antrópica e são frequentemente identificados em estudos epidemiológicos como responsáveis por surtos. A estimativa do risco anual de infecção por Giardia foi de 3,3x10-3 (IC95% 4,6x10-3) para crianças e de 11,5x10-3 (IC95% 13,3x10-3) para adultos, enquanto o risco por Cryptosporidium foi de 1,1x10-3 (IC95% 1,7x10-3) para crianças e de 3,9x10-3 (IC95% 5,0x10-3) para adultos. O incremento da incidência de diarréias foi observado no cenário de estudo após um acidente que resultou em transbordamento de esgotos não tratados no manancial, coincidindo com o aumento na detecção de (oo)cistos. Conclusão: Os resultados evidenciaram que a vulnerabilidade do ribeirão dos Cristais a contaminações biológicas pode culminar em um risco elevado de infecção e adoecimento por Giardia e Cryptosporidium através da ingestão de água tratada. Portanto, o caso é preocupante, tanto do ponto de vista do tratamento e abastecimento de água potável, quanto da degradação e contaminação do manancial, evidenciando a necessidade de se estabelecer medidas de intervenção direcionadas a promover a qualidade da água e garantir sua segurança / Introduction: The risk to human health caused by biological contamination of source water from public water supply is highlighted by the occurrence of outbreaks associated with the protozoa Giardia and Cryptosporidium, which have low infectious doses and high capacity of survival in the environment, besides being capable of withstanding traditional process for water disinfection (chlorination). Considering that there is a high risk of infection by these protozoa through drinking water treated with conventional methods uptaked from surface waters impacted by biological contamination, resulting in a possible increase in the incidence of diarrhea, this study aimed to verify the occurrence of these protozoa in waters collected for public supply in Cajamar-SP, characterize their pathogenicity and evaluate the risk associated with its consumption. Methods: Forty eight samples were collected in ribeirão dos Cristais, at uptake point of the water treatment plant, weekly, for 12 months (from 05/16/2013 to 05/21/2014). The detection and quantification of protozoa were carried out according to the United States Environmental Protection Agency Method 1623.1, and the extraction and characterization of species/genotypes of iardia and Cryptosporidium were performed through molecular methods and sequencing. The risk of infection by ingestion of Giardia and Cryptosporidium (oo)cysts present in the treated water were calculated using the Quantitative Microbial Risk Assessment tool, based on the concentration data of pathogens obtained by the Method 1623.1, removal efficiency of (oo) cysts in the conventional process of water treatment, dose-response model and rate of daily water intake for individuals under the age of 5 years and over 21 years. Results: Giardia cysts were detected in 83.3% of the samples (40/48), with concentrations ranging rom the detection limit (<0.1) to 8.6 cysts/L. Cryptosporidium oocysts were detected in 7.5% of the samples (18/48), with concentrations ranging from the detection limit (<0.1) to 2 oocysts/L. The species/genotypes found (Giardia intestinalis A and B and Cryptosporidium parvum and hominis) are characteristic of anthropogenic contamination and are often identified in epidemiological studies as being responsible for outbreaks. The estimated annual risk of infection by Giardia was 3,3x10-3 (95% CI 4,6x10-3) for children and 11,5x10-3 (95% CI 13,3x10-3) for adults, while the risk for Cryptosporidium was 1,1x10-3 (95% CI 1,7x10-3) for children and 3,9x10-3 (95% CI 5,0x10-3) for adults. The increase in the incidence of diarrhea was observed in the study scenario after an accident that resulted in an overflow of untreated sewage that reached the reservoir, coinciding with an increase in the detection of the (oo)cysts. Conclusion: The results showed that the vulnerability of the ribeirão dos Cristais to biological contamination may result in a high risk of infection and illness by Giardia and Cryptosporidium through the drinking water consumption. Therefore, the case is of concern, both from the point of view of the treatment and supply of drinking water, as well as to the degradation and contamination of the water source, highlighting the need to establish intervention measures aimed at promoting water quality and ensure its safety

Giardia duodenalis est le protozoaire responsable de la giardiose, la parasitose intestinale la plus répandue dans le monde. Cette infection se caractérise par une malabsorption intestinale, des diarrhées, une perte de poids et des douleurs abdominales intenses chez l’Homme et de nombreux mammifères. Par ailleurs, cette maladie dont l’impact en santé publique et vétérinaire est reconnu, peut entraîner d’importantes déficiences nutritionnelles en particulier chez les sujets jeunes. L’infection est causée par l’ingestion de kystes de Giardia duodenalis (syn. G. lamblia, G. intestinalis) présents dans les aliments ou l’eau contaminée. Infectieux à très faibles doses, ces kystes survivent pendant plusieurs semaines dans l’environnement et sont résistants aux différents désinfectants. Suite au dékystement, la forme végétative de Giardia, le trophozoïte, adhère à l’épithélium intestinal au niveau des parties supérieures de l’intestin grêle et se multiplie, causant les symptômes. Cette phase se termine par un nouvel enkystement et l’excrétion de kystes par les fèces. Le nombre croissant d’infections liées à la contamination de l’eau potable, à l’émergence de souches résistantes aux médicaments disponibles, à la fréquence des échecs thérapeutiques et à l’importance des effets secondaires associés aux traitements font de cette maladie un sujet d’actualité de plus en plus préoccupant qui nécessite le développement de traitements alternatifs. Il est désormais bien établi que le microbiote et/ou certaines souches de bactéries probiotiques ont un impact bénéfique dans la giardiose. En particulier, la bactérie probiotique Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) a un rôle protecteur contre la croissance de Giardia in vitro et in vivo. Nous avons cherché dans ce travail de Thèse à décrypter les mécanismes moléculaires associés à l’effet inhibiteur des facteurs sécrétés par LjLa1. Nous avons montré qu’in vitro, LjLa1 agissait en libérant des enzymes de type Bile Salt Hydrolases (BSH) qui modifient alors des composants de la bile non-toxiques pour le parasite (sels biliaires conjugués) en des composants toxiques (sels biliaires déconjugués). Les 3 gènes BSH codés dans le génome de LjLa1 ont été clonés chez Escherichia coli et les protéines taguées histidine purifiées pour étudier leurs propriétés biochimiques et biologiques. Obtenues sous forme active, nous avons pu en définir les spécificités de substrats et montrer qu’elles sont capables d’inhiber significativement la croissance de G. duodenalis in vitro et in vivo, dans un modèle murin de la giardiose (souriceaux OF1 non sevrés). En parallèle, nous avons identifié, à l’issue d’un large criblage de souches de lactobacilles selon leur activité anti-Giardia in vitro, une souche probiotique aux effets inhibiteurs comparables à ceux de LjLa1 : Lactobacillus gasseri CNCM-4884. Administrée in vivo dans le modèle murin de la giardiose, cette souche a réduit de 93% la charge parasitaire dans l'intestin grêle des nouveaux nés et a également réduit de façon significative le nombre de kystes libérés dans l’environnement, permettant ainsi de réduire la transmission de Giardia. Des travaux parallèles ont été réalisés au cours de ce projet de Thèse, notamment le développement d’outils de moléculaire pour l’expression hétérologue de molécules d’intérêt en santé animale chez divers lactobacilles. Le développement de ces « vecteurs mucosaux » permettra à terme de proposer une stratégie de surexpression de BSH par les lactobacilles afin d’accroitre l’activité BSH in vivo, et renforcer ainsi l’élimination du parasite. Ces résultats permettent de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques originales contre les giardioses humaines et animales, basées sur l’utilisation de lactobacilles probiotiques ou sur les activités BSH qui en sont dérivées. Ces traitements offrent alors une alternative sérieuse aux antibiotiques et permettront de pallier aux actuels fréquents échecs thérapeutiques. / Giardia duodenalis is a protozoan parasite responsible for giardiasis, the most common intestinal parasitic disease worldwide. This infection is characterized by intestinal malabsorption, diarrhea, weight loss and abdominal pain in humans and various mammalian species. Besides, this disease has a high veterinary and public health impact, leading to important nutritional deficiencies in young subjects. The infection is caused by the ingestion of food or water contaminated with infectious cysts of the parasite. Giardia cysts can survive for several weeks in the environment and are highly resistant to disinfectants. Giardia excysts in the intestinal tracts of its host and replicates under the trophozoite stage causing the symptoms. Trophozoites adhere to the intestinal epithelium of the small intestine and multiply, causing the symptoms. The cycle ends by a new encystment and infectious cysts are released in environments with feces. The increasing number of giardiasis cases, mainly due to water contaminations, the emergence of parasite strains resistant to drugs and therapeutic failures, make research on alternative therapeutic strategies and treatments highly needed. Nowadays, it is well known that the microbiota and probiotics play an important role in protection against this parasite. For instance, the probiotic strain Lactobacillus johnsonii La1 (LjLa1) prevents the establishment of Giardia in vitro and in vivo. In this thesis, we have tried to point out the molecular mechanism(s) involved in this inhibitory effect(s). We showed in vitro that LjLa1 was releasing "Bile Salt Hydrolases" (BSH) – like activities that modify some components of bile (conjugated bile salts) into toxic compounds (deconjugated bile salts) for Giardia. We have cloned and expressed each of the three bsh genes present in the genome of LjLa1 in Escherichia coli in order to study their enzymatic and biological properties. Two BSH were obtained as recombinant active enzymes and biochemical tests showed that they have distinct substrate specificities despite similar predicted 3D structures. Moreover, these two BSHs of LjLa1 exhibited anti-giardial effects in vitro and in vivo in a murine model of the giardiasis (OF1suckling mice), comforting the hypothesis of the biological role of active BSH, derived from probiotics, against Giardia. A wide collection of diverse lactobacilli strains was screened to assess their effectiveness to also display both anti-giardial and BSH activities. This screening allowed the identification of several strains exhibiting strong anti-giardial effects such as Lactobacillus gasseri CNCM I-4884. In a murine model of giardiasis, this strain dramatically reduced the parasite burden in the small intestine of treated animals and significantly reduced the number of cysts in the colon, which could contribute to blockage of parasite transmission in environments. Additional studies were realized in parallel in order to explore the potency of lactobacilli to exert beneficial effects on health. For this, molecular tools were successfully developed in various lactobacilli strains to express and deliver therapeutic molecules at mucosal surfaces. The development of these tools will further allow the overexpression of BSH by lactobacilli to increase their in vivo BSH-activity and strengthen the elimination of the parasite. Altogether, this thesis work proposes new original therapeutic strategies against human and animal giardiasis, based on the use of BSH-positive lactobacilli strains or recombinant BSH- derived from probiotic strains, to counteract the frequent therapeutic failures, offering a serious alternative to antibiotics.

Giardia e Cryptosporidium são protozoários cosmopolitas cuja epidemiologia é especialmente importante devido ao seu expressivo potencial zoonótico. Animais silvestres são frequentemente relatados como reservatórios da giardiose e criptosporidiose humanas, todavia, são escassas as evidências sobre sua real importância na manutenção e disseminação destas protozooses. No intuito de avaliar a ocorrência e determinar os genótipos responsáveis pela infecção de mamíferos neotropicais, 452 amostras fecais procedentes de 52 diferentes espécies, in situ e ex situ, de sete localidades distintas foram avaliadas por métodos de diagnóstico microscópico, seguidos por técnicas moleculares de amplificação (Nested PCR), sequenciamento e caracterização genotípica. Os resultados revelaram prevalência aparente de 6,2% para Giardia spp. e de 4,8% para Cryptosporidium spp. (n=343). Dezessete diferentes espécies de mamíferos silvestres foram positivas, sendo 11 para Giardia spp., nove para Cryptosporidium spp. e três para ambos os protozoários. A caracterização molecular revelou a predominante presença de genótipos zoonóticos em mamíferos cativos (Giardia duodenalis genótipo AI) e de genótipos hospedeiro-específicos em animais de vida livre (Cryptosporidium sp. rat genotype III e Cryptosporidium wrairi). Foram também identificados Giardia duodenalis genótipo D em cachorro-do-mato Cerdocyon thous e Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV em bugio-preto Alouatta caraya, ambos mantidos em cativeiro. Aspectos ecológicos, como habitat, guilda trófica, estratégia do uso do ambiente e influência antrópica, foram considerados relevantes para a ocorrência dos parasitas. Tais achados demonstraram que animais silvestres podem ser infectados por genótipos zoonóticos e específicos dos agentes, o que revela a importância de estudos envolvendo esta abordagem para sugerir possíveis relações entre os protozoários, hospedeiros humanos, animais domésticos e silvestres perante diferentes características ambientais. / Giardia and Cryptosporidium are cosmopolitan protozoans whose epidemiology is especially important due to its significant zoonotic potencial. Wild animals are often reported as reservoirs of human giardiosis and cryptosporidiosis, however, there is little evidence about their real importance in the maintenance and dissemination of these protozoosis. In order to evaluate the occurrence and determine the genotypes responsible for neotropical mammals infection, 452 fecal samples of 52 different species, in situ and ex situ, of seven locations were evaluated by microscopic methods of diagnosis, followed by molecular amplification (Nested PCR), sequencing and genotypic chacacterization techniques. The results revealed an apparent prevalence of 6,2% for Giardia spp. and 4,8% for Cryptosporidium spp. (n=343). Seventeen different species of wild mammals were positive, 11 for Giardia spp., nine for Cryptosporidium spp. and three for both protozoans. Molecular characterization shows predominant presence of zoonotic genotypes in captive mammals (Giardia duodenalis genotype AI) and host-specific genotypes in free-living animals (Cryptosporidium sp. rat genotype III and Cryptosporidium wrairi). Giardia duodenalis genotype D in crab-eating fox Cerdocyon thous and Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV in black howler monkey Alouatta caraya, both in captivity, were also identified. Ecological aspects, like habitat, trophic guilds, strategy of using the environment and human influence, were considered relevant to occurrence of the parasites. These findings could demonstrate wild mammals can be infected by zoonotic and specific genotypes of agents, which shows the importance of studies using this approach to suggest possible relationships between protozoans, human hosts, domestic animals and wildlife facing different environmental characteristics.

Introdução: O risco à saúde humana ocasionado pela contaminação biológica de águas captadas para abastecimento público é realçado pela ocorrência de surtos de doenças associadas aos protozoários Giardia e Cryptosporidium, que possuem baixas doses infecciosas e alta capacidade de sobrevivência no ambiente, além de serem capazes de resistir ao processo tradicional de desinfecção da água (cloração). Partindo-se da hipótese de que há um risco elevado de infecção por estes protozoários pela ingestão de água tratada por métodos convencionais e que fazem uso de mananciais superficiais impactados por contaminação biológica, resultando num possível incremento da incidência de diarréias, este estudo se propôs a verificar a ocorrência destes protozoários em águas captadas para abastecimento público no município de Cajamar-SP, caracterizar sua patogenicidade e avaliar o risco associado ao seu consumo através da água tratada. Métodos: Foram coletadas 48 amostras do ribeirão dos Cristais no ponto de captação da estação de tratamento de água, semanalmente, durante 12 meses (de 16/05/2013 a 21/05/2014). A detecção e a análise da concentração dos protozoários foram realizadas de acordo com Método 1623.1 da United States Environmental Protection Agency e a extração e caracterização dos espécies/genótipos de Giardia e Cryptosporidium foi realizada através metodologias moleculares e seqüenciamento. O risco de infecção pela ingestão de cistos de Giardia e oocistos de Cryptosporidium presentes na água tratada foi calculado usando a ferramenta da Avaliação Quantitativa do Risco Microbiológico, a partir dos dados de concentração dos patógenos obtidos pelo Método 1623.1, eficiência de remoção dos (oo)cistos durante o processo convencional de tratamento da água, modelo dose-resposta e taxa de ingestão diária de água para indivíduos menores de 5 anos e maiores de 21 anos. Resultados: Cistos de Giardia foram detectados em 83,3% das amostras (40/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 8,6 cistos/L. Oocistos de Cryptosporidium foram etectados em 37,5% das amostras (18/48), com concentrações variando desde o limite de detecção (<0,1) até 2 oocistos/L. As espécies/genótipos encontrados (Giardia intestinalis A e B e Cryptosporidium parvum e hominis) são característicos de contaminação antrópica e são frequentemente identificados em estudos epidemiológicos como responsáveis por surtos. A estimativa do risco anual de infecção por Giardia foi de 3,3x10-3 (IC95% 4,6x10-3) para crianças e de 11,5x10-3 (IC95% 13,3x10-3) para adultos, enquanto o risco por Cryptosporidium foi de 1,1x10-3 (IC95% 1,7x10-3) para crianças e de 3,9x10-3 (IC95% 5,0x10-3) para adultos. O incremento da incidência de diarréias foi observado no cenário de estudo após um acidente que resultou em transbordamento de esgotos não tratados no manancial, coincidindo com o aumento na detecção de (oo)cistos. Conclusão: Os resultados evidenciaram que a vulnerabilidade do ribeirão dos Cristais a contaminações biológicas pode culminar em um risco elevado de infecção e adoecimento por Giardia e Cryptosporidium através da ingestão de água tratada. Portanto, o caso é preocupante, tanto do ponto de vista do tratamento e abastecimento de água potável, quanto da degradação e contaminação do manancial, evidenciando a necessidade de se estabelecer medidas de intervenção direcionadas a promover a qualidade da água e garantir sua segurança / Introduction: The risk to human health caused by biological contamination of source water from public water supply is highlighted by the occurrence of outbreaks associated with the protozoa Giardia and Cryptosporidium, which have low infectious doses and high capacity of survival in the environment, besides being capable of withstanding traditional process for water disinfection (chlorination). Considering that there is a high risk of infection by these protozoa through drinking water treated with conventional methods uptaked from surface waters impacted by biological contamination, resulting in a possible increase in the incidence of diarrhea, this study aimed to verify the occurrence of these protozoa in waters collected for public supply in Cajamar-SP, characterize their pathogenicity and evaluate the risk associated with its consumption. Methods: Forty eight samples were collected in ribeirão dos Cristais, at uptake point of the water treatment plant, weekly, for 12 months (from 05/16/2013 to 05/21/2014). The detection and quantification of protozoa were carried out according to the United States Environmental Protection Agency Method 1623.1, and the extraction and characterization of species/genotypes of iardia and Cryptosporidium were performed through molecular methods and sequencing. The risk of infection by ingestion of Giardia and Cryptosporidium (oo)cysts present in the treated water were calculated using the Quantitative Microbial Risk Assessment tool, based on the concentration data of pathogens obtained by the Method 1623.1, removal efficiency of (oo) cysts in the conventional process of water treatment, dose-response model and rate of daily water intake for individuals under the age of 5 years and over 21 years. Results: Giardia cysts were detected in 83.3% of the samples (40/48), with concentrations ranging rom the detection limit (<0.1) to 8.6 cysts/L. Cryptosporidium oocysts were detected in 7.5% of the samples (18/48), with concentrations ranging from the detection limit (<0.1) to 2 oocysts/L. The species/genotypes found (Giardia intestinalis A and B and Cryptosporidium parvum and hominis) are characteristic of anthropogenic contamination and are often identified in epidemiological studies as being responsible for outbreaks. The estimated annual risk of infection by Giardia was 3,3x10-3 (95% CI 4,6x10-3) for children and 11,5x10-3 (95% CI 13,3x10-3) for adults, while the risk for Cryptosporidium was 1,1x10-3 (95% CI 1,7x10-3) for children and 3,9x10-3 (95% CI 5,0x10-3) for adults. The increase in the incidence of diarrhea was observed in the study scenario after an accident that resulted in an overflow of untreated sewage that reached the reservoir, coinciding with an increase in the detection of the (oo)cysts. Conclusion: The results showed that the vulnerability of the ribeirão dos Cristais to biological contamination may result in a high risk of infection and illness by Giardia and Cryptosporidium through the drinking water consumption. Therefore, the case is of concern, both from the point of view of the treatment and supply of drinking water, as well as to the degradation and contamination of the water source, highlighting the need to establish intervention measures aimed at promoting water quality and ensure its safety

Giardia e Cryptosporidium são protozoários cosmopolitas cuja epidemiologia é especialmente importante devido ao seu expressivo potencial zoonótico. Animais silvestres são frequentemente relatados como reservatórios da giardiose e criptosporidiose humanas, todavia, são escassas as evidências sobre sua real importância na manutenção e disseminação destas protozooses. No intuito de avaliar a ocorrência e determinar os genótipos responsáveis pela infecção de mamíferos neotropicais, 452 amostras fecais procedentes de 52 diferentes espécies, in situ e ex situ, de sete localidades distintas foram avaliadas por métodos de diagnóstico microscópico, seguidos por técnicas moleculares de amplificação (Nested PCR), sequenciamento e caracterização genotípica. Os resultados revelaram prevalência aparente de 6,2% para Giardia spp. e de 4,8% para Cryptosporidium spp. (n=343). Dezessete diferentes espécies de mamíferos silvestres foram positivas, sendo 11 para Giardia spp., nove para Cryptosporidium spp. e três para ambos os protozoários. A caracterização molecular revelou a predominante presença de genótipos zoonóticos em mamíferos cativos (Giardia duodenalis genótipo AI) e de genótipos hospedeiro-específicos em animais de vida livre (Cryptosporidium sp. rat genotype III e Cryptosporidium wrairi). Foram também identificados Giardia duodenalis genótipo D em cachorro-do-mato Cerdocyon thous e Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV em bugio-preto Alouatta caraya, ambos mantidos em cativeiro. Aspectos ecológicos, como habitat, guilda trófica, estratégia do uso do ambiente e influência antrópica, foram considerados relevantes para a ocorrência dos parasitas. Tais achados demonstraram que animais silvestres podem ser infectados por genótipos zoonóticos e específicos dos agentes, o que revela a importância de estudos envolvendo esta abordagem para sugerir possíveis relações entre os protozoários, hospedeiros humanos, animais domésticos e silvestres perante diferentes características ambientais. / Giardia and Cryptosporidium are cosmopolitan protozoans whose epidemiology is especially important due to its significant zoonotic potencial. Wild animals are often reported as reservoirs of human giardiosis and cryptosporidiosis, however, there is little evidence about their real importance in the maintenance and dissemination of these protozoosis. In order to evaluate the occurrence and determine the genotypes responsible for neotropical mammals infection, 452 fecal samples of 52 different species, in situ and ex situ, of seven locations were evaluated by microscopic methods of diagnosis, followed by molecular amplification (Nested PCR), sequencing and genotypic chacacterization techniques. The results revealed an apparent prevalence of 6,2% for Giardia spp. and 4,8% for Cryptosporidium spp. (n=343). Seventeen different species of wild mammals were positive, 11 for Giardia spp., nine for Cryptosporidium spp. and three for both protozoans. Molecular characterization shows predominant presence of zoonotic genotypes in captive mammals (Giardia duodenalis genotype AI) and host-specific genotypes in free-living animals (Cryptosporidium sp. rat genotype III and Cryptosporidium wrairi). Giardia duodenalis genotype D in crab-eating fox Cerdocyon thous and Cryptosporidium sp. deer mouse genotype IV in black howler monkey Alouatta caraya, both in captivity, were also identified. Ecological aspects, like habitat, trophic guilds, strategy of using the environment and human influence, were considered relevant to occurrence of the parasites. These findings could demonstrate wild mammals can be infected by zoonotic and specific genotypes of agents, which shows the importance of studies using this approach to suggest possible relationships between protozoans, human hosts, domestic animals and wildlife facing different environmental characteristics.

Introdução Giardia intestinalis é um dos principais protozoários flagelados causadores de diarreia em humanos e animais, sendo um micro-organismo re-emergente, responsável por vários surtos de veiculação hídrica em nível mundial, razão pela qual tem merecido atenção das autoridades de Saúde Pública, e deve ser avaliado e monitorado, principalmente devido ao seu impacto negativo na qualidade do abastecimento público, em particular através do esgoto. Através de técnicas de biologia molecular é possível caracterizar e genotipar cistos presentes no esgoto, e identificar a circulação dos agrupamentos A e B, patogênicos para o homem. Neste estudo foram avaliadas amostras de esgoto bruto de cidades cosmopolitas da América Latina, no Estado de São Paulo, e em Lima, Peru. Objetivos Detectar através da técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) a presença de G. intestinalis e os agrupamentos A e B, de importância para a saúde humana, em amostras de esgoto bruto provenientes do Estado de São Paulo, Brasil e de Lima, no Peru. Material e Métodos Um total de 18 amostras de esgoto bruto provenientes de portos, aeroportos e estações rodoviárias, com alto trânsito de pessoas de cinco municípios do estado de São Paulo foram coletadas pela técnica de Moore. Adicionalmente, 10 amostras provenientes de dois bairros (urbano e semi-urbano) na entrada da ETE de Carapongo, Lima, no Peru foram coletadas e concentradas por centrifugação. O DNA genômico foi extraído utilizando kit comercial (QIAamp DNA Stool Mini Kit® - Qiagen, USA). A amplificação do gene gdh (glutamato desidrogenase) de Giardia, foi realizada por nested PCR como descrito por CACCIÓ et al., 2008, e G. intestinalis e seus agrupamentos A e B, por meio de reações de reamplificação por PCR (rePCR). Resultados No Estado de São Paulo 61,1 por cento (11/18) das amostras coletadas foram consideradas positivas para G. intestinalis, e na cidade de Lima 60 por cento (6/10) das amostras foram positivas para G. intestinalis. Os agrupamentos A e B foram obtidos em ambos os países. Conclusões Os achados indicam que na cidade de Lima e no estado de São Paulo, cistos de Giardia associados à giardíase humana estão circulando no esgoto bruto, de modo que a descarga dessa matriz em águas superficiais pode representar perigo para a saúde. Além disso, o diagnóstico proposto possibilita a caracterização molecular de Giardia presente em amostras de esgoto bruto sem a necessidade de sequenciamento ou clonagem, favorecendo as rotinas laboratoriais / Introduction Giardia intestinalis is on of the major flagellated protozoans that cause diarrhea in humans and animals, and a re-emerging microorganism, responsible for several waterborne outbreaks worldwide, therefore it has received attention from public health authorities, and should be evaluated and monitored mainly due to their negative impact on the quality of public supply, in particular through the sewage. Through molecular biology techniques it is possible to characterize and to genotype cysts present in wastewater, and to identify the circulation of Assemblages A and B, that are pathogenic to humans. In this study were evaluated samples of raw wastewater from cosmopolitan cities in Latin America, in the State of São Paulo and in Lima, Peru. Objectives Detect, through the technique of polymerase chain reaction (PCR), the presence of G. intestinalis and its Assemblages A and B, of importance to human health, in samples of raw wastewater from the State of São Paulo, Brazil and Lima, Peru. Material and Methods A total of 18 samples of raw wastewater from harbors, airports and bus stations, with high traffic of people from five municipalities of the state of São Paulo were collected by the technique of Moore. In addition, 10 samples from two districts (urban and semi-urban) at the entrance of the WWTP Carapongo, Lima, Peru, were collected and subjected to centrifugation. Genomic DNA was extracted by using a commercial kit (QIAamp DNA Stool Mini Kit ® - Qiagen, USA). The amplification of the Giardia gdh gene (glutamate dehydrogenase) was performed by nested PCR as described by Cacció et al., 2008 and G. intestinalis and its Assemblages A and B, through PCR reamplification reactions (rePCR). Results In the State of São Paulo 61.1 per cent (11/18) of the collected samples were positive for G. intestinalis, and in the city of Lima 60 per cent (6/10) of the samples were positive for G. intestinalis. Assemblages A and B were obtained in both countries. Conclusions The findings indicated that in the city of Lima and in the state of São Paulo, Giardia cysts associated with human giardiasis are circulating in raw wastewater, so that the discharge of this matrix in surface waters may pose a health hazard. Furthermore, the proposed diagnostic enables the molecular characterization of Giardia present in raw wastewater samples without the need of sequencing or cloning, favoring laboratory routines.

As doenças de veiculação hídrica são uma preocupação no mundo todo, e tem aumentado cada vez mais o interesse nos estudos relacionados aos protozoários Cryptosporidium spp. e Giardia spp.. A presença de protozoários em águas de abastecimento está vinculada ao lançamento de esgoto nos mananciais, de modo que o tratamento de esgotos sanitários é de extrema importância para reduzir o risco de surtos de protozooses. Este trabalho avaliou a ocorrência e a possibilidade de remoção de cistos de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium spp. em dois reatores UASB, um piloto e um em escala plena, operados com esgoto sanitário e um TDH de aproximadamente 8h, e um reator UASB piloto, operado com água negra simulada e um TDH aproximado de três dias. Nos dois reatores operados com esgoto sanitário as remoções foram semelhantes. A média de DQO total afluente, no reator piloto e no de escala plena, foi de 271 e 410 mg/L, respectivamente, e as remoções médias de DQO foram de 50,62 e 45,80%, respectivamente. Com relação aos exames parasitológicos, quase não houve remoção em ambos os reatores e, na maior parte dos casos, o número de (oo)cistos detectados no efluente foi maior do que no afluente. Já no reator piloto operado com águas negras, foram observadas remoções mais elevadas. A DQO total afluente desse reator variou de 837 a 3269 mg/L e a remoção média observada foi de 71,22%. Neste reator também foram observadas maiores remoções de (oo)cistos, sendo que a remoção de cistos Giardia spp. variou de 67,73 a 93,69% e, em um dos ensaios, foi observada uma remoção de 70% de oocistos de Cryptosporidium spp. Acredita-se que o melhor desempenho desse reator se deve ao seu elevado tempo de detenção hidráulico. Foi avaliada, ainda, a ocorrência de (oo)cistos no lodo dos três reatores, resultando em valores bastante elevados, da ordem de 105 cistos/g de massa seca, em todos eles. De qualquer modo, em todos os reatores avaliados, mesmo o que apresentou as maiores eficiências, o efluente ainda apresentava altas concentrações de poluentes, necessitando de um pós-tratamento para a remoção dos remanescentes de matéria orgânica, sólidos e patógenos. / The waterborne diseases are a concern worldwide, and has grown more and more interest in studies related to the protozoa Cryptosporidium spp. and Giardia spp. The presence of protozoa in drinking water is related to the release of sewage in water sources. So that, the sewage treatment is extremely important to reduce the risk of outbreaks protozoa. This study evaluated the occurrence and the possibility of removal of Giardia spp. and Cryptosporidium spp. in two UASB reactors, a pilot and a full-scale, operated with sewage and a HRT of 8 hours, approximately, and a pilot UASB reactor, operated with simulated black water and an approximate HRT of three days. Removals were similar in both reactors operated with sewage. The average influent total COD, in pilot and full scale reactors, was 271 and 410 mg/L, respectively, and the average COD removal were 50.62 and 45.80%, respectively. With the parasitological test, there was almost no removal in both reactors and, in most cases, the number of (oo)cysts detected in the effluent was higher than in the influent. In the pilot reactor operated with black water, higher removals were observed. The total COD influent of this reactor ranged from 837 to 3269 mg/L and the average removal observed was 71.22%. In this reactor (oo)cysts removals were also higher, and the removal of Giardia cysts ranged from 67.73 to 93.69%, and in one of the trials, a 70% removal of Cryptosporidium spp was observed. It is believed that the best performance of this reactor is due to its high hydraulic retention time. The occurrence of (oo)cysts in the sludge of the three reactors was also evaluated, resulting in very high values of the order of 105 cysts/g of dry weight, in all of them. Anyway, in all this reactor, even the one with the highest efficiency, the effluent still had high concentrations of pollutants, necessitating a post treatment for the removal of remaining organic matter, solids and pathogens.

Introdução Giardia intestinalis é um dos principais protozoários flagelados causadores de diarreia em humanos e animais, sendo um micro-organismo re-emergente, responsável por vários surtos de veiculação hídrica em nível mundial, razão pela qual tem merecido atenção das autoridades de Saúde Pública, e deve ser avaliado e monitorado, principalmente devido ao seu impacto negativo na qualidade do abastecimento público, em particular através do esgoto. Através de técnicas de biologia molecular é possível caracterizar e genotipar cistos presentes no esgoto, e identificar a circulação dos agrupamentos A e B, patogênicos para o homem. Neste estudo foram avaliadas amostras de esgoto bruto de cidades cosmopolitas da América Latina, no Estado de São Paulo, e em Lima, Peru. Objetivos Detectar através da técnica de reação em cadeia pela polimerase (PCR) a presença de G. intestinalis e os agrupamentos A e B, de importância para a saúde humana, em amostras de esgoto bruto provenientes do Estado de São Paulo, Brasil e de Lima, no Peru. Material e Métodos Um total de 18 amostras de esgoto bruto provenientes de portos, aeroportos e estações rodoviárias, com alto trânsito de pessoas de cinco municípios do estado de São Paulo foram coletadas pela técnica de Moore. Adicionalmente, 10 amostras provenientes de dois bairros (urbano e semi-urbano) na entrada da ETE de Carapongo, Lima, no Peru foram coletadas e concentradas por centrifugação. O DNA genômico foi extraído utilizando kit comercial (QIAamp DNA Stool Mini Kit® - Qiagen, USA). A amplificação do gene gdh (glutamato desidrogenase) de Giardia, foi realizada por nested PCR como descrito por CACCIÓ et al., 2008, e G. intestinalis e seus agrupamentos A e B, por meio de reações de reamplificação por PCR (rePCR). Resultados No Estado de São Paulo 61,1 por cento (11/18) das amostras coletadas foram consideradas positivas para G. intestinalis, e na cidade de Lima 60 por cento (6/10) das amostras foram positivas para G. intestinalis. Os agrupamentos A e B foram obtidos em ambos os países. Conclusões Os achados indicam que na cidade de Lima e no estado de São Paulo, cistos de Giardia associados à giardíase humana estão circulando no esgoto bruto, de modo que a descarga dessa matriz em águas superficiais pode representar perigo para a saúde. Além disso, o diagnóstico proposto possibilita a caracterização molecular de Giardia presente em amostras de esgoto bruto sem a necessidade de sequenciamento ou clonagem, favorecendo as rotinas laboratoriais / Introduction Giardia intestinalis is on of the major flagellated protozoans that cause diarrhea in humans and animals, and a re-emerging microorganism, responsible for several waterborne outbreaks worldwide, therefore it has received attention from public health authorities, and should be evaluated and monitored mainly due to their negative impact on the quality of public supply, in particular through the sewage. Through molecular biology techniques it is possible to characterize and to genotype cysts present in wastewater, and to identify the circulation of Assemblages A and B, that are pathogenic to humans. In this study were evaluated samples of raw wastewater from cosmopolitan cities in Latin America, in the State of São Paulo and in Lima, Peru. Objectives Detect, through the technique of polymerase chain reaction (PCR), the presence of G. intestinalis and its Assemblages A and B, of importance to human health, in samples of raw wastewater from the State of São Paulo, Brazil and Lima, Peru. Material and Methods A total of 18 samples of raw wastewater from harbors, airports and bus stations, with high traffic of people from five municipalities of the state of São Paulo were collected by the technique of Moore. In addition, 10 samples from two districts (urban and semi-urban) at the entrance of the WWTP Carapongo, Lima, Peru, were collected and subjected to centrifugation. Genomic DNA was extracted by using a commercial kit (QIAamp DNA Stool Mini Kit ® - Qiagen, USA). The amplification of the Giardia gdh gene (glutamate dehydrogenase) was performed by nested PCR as described by Cacció et al., 2008 and G. intestinalis and its Assemblages A and B, through PCR reamplification reactions (rePCR). Results In the State of São Paulo 61.1 per cent (11/18) of the collected samples were positive for G. intestinalis, and in the city of Lima 60 per cent (6/10) of the samples were positive for G. intestinalis. Assemblages A and B were obtained in both countries. Conclusions The findings indicated that in the city of Lima and in the state of São Paulo, Giardia cysts associated with human giardiasis are circulating in raw wastewater, so that the discharge of this matrix in surface waters may pose a health hazard. Furthermore, the proposed diagnostic enables the molecular characterization of Giardia present in raw wastewater samples without the need of sequencing or cloning, favoring laboratory routines.