[ES] Las plantas están emergiendo como una alternativa atractiva a los sistemas convencionales de producción heteróloga, como bacterias, cultivos celulares de mamíferos, levaduras u hongos, para la síntesis de productos de alto valor, como metabolitos secundarios y proteínas. La demanda de estos productos a menudo se ve limitada por la capacidad de producción y los costos asociados. Sin embargo, utilizar las plantas como plataformas de producción ofrece ventajas en términos de accesibilidad económica, sostenibilidad, escalabilidad y la ausencia de patógenos humanos y de animales, lo que las convierte en una opción cada vez más atractiva. A pesar de las limitaciones en la capacidad de carga, la expresión génica transitoria utilizando vectores virales proporciona un método eficiente y reproducible para la producción de proteínas recombinantes en plantas, a diferencia de la transformación estable, que requiere más mano de obra y tiempo. Los vectores derivados del virus del mosaico del tabaco (TMV), particularmente aquellos en los que el gen de la proteína de la cubierta viral (CP) se reemplaza principalmente por el gen de interés, son clásicos en la biotecnología vegetal y se utilizan con frecuencia para la producción a gran escala de proteínas recombinantes. En este trabajo, nuestro primer objetivo fue optimizar un vector de TMV para mejorar la producción. La fusión traduccional del extremo amino-terminal de la CP del TMV con la proteína recombinante de interés mostró un aumento en la acumulación de la proteína verde fluorescente, interferón alfa-2a y un nanobody contra la proteína Spike del SARS-CoV-2 en hojas de Nicotiana benthamiana. La inserción de un sitio de clivaje específico, basado en las proteasas de inclusión nuclear (NIaPro) de dos potyvirus, junto con la expresión de las proteasas correspondientes, además de la producción de la proteína recombinante madura, aumentó aún más la acumulación de las proteínas recombinantes mencionadas anteriormente. En segundo lugar, nuestro objetivo fue establecer estrategias para producir proteínas recombinantes de interés industrial y farmacéutico en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. Logramos producir grandes cantidades de una xilanasa termofílica, activa en condiciones extremas de temperatura y pH alcalino, en N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La enzima que se acumuló rápidamente en los tejidos de la planta se dirigió al apoplasto, lo que facilitó enormemente la purificación y evitó cualquier efecto adverso en el crecimiento de la planta. Se demostró que esta enzima producida en planta es útil para la producción de xilooligosacáridos probióticos. También produjimos grandes cantidades de una glucosa oxidasa (GOX) modificada en hojas de N. benthamiana utilizando un vector de TMV. La GOX producida en planta, que también se purificó fácilmente a partir de fluidos apoplásticos, exhibió potentes propiedades antimicrobianas contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli. / [CA] Les plantes están emergint com una alternativa atractiva als sistemes convencionals de producció heteròloga, com ara bacteries, cultius cel·lulars de mamífers, llevats o fongs, per a la síntesi de productes d'alt valor, com son metabòlits secundaris i proteïnes d'interés industrial i farmacéutic. La demanda d'aquests productes sovint es veu limitada per la capacitat de producció i els costos associats. No obstant això, utilitzar les plantes com a plataformes de producció ofereix avantatges en termes d'accessibilitat econòmica, sostenibilitat, escalabilitat i l'absència de patògens humans i animals, la qual cosa les converteix en una opció cada vegada més atractiva. Malgrat les limitacions en la capacitat de càrrega, l'expressió gènica transitoria mitjançant vectors virals proporciona un mètode eficient i reproducible per a la producció de proteïnes recombinants en plantes, a diferència de la transformació estable, que requereix més mà d'obra i temps. Els vectors derivats del virus del mosaic del tabac (TMV), particularment aquells en els quals el gen de la proteïna de la coberta viral (CP) és principalment reemplaçat pel gen d'interès, són clàssics en la biotecnologia vegetal i s'utilitzen sovint per a la producció a gran escala de proteïnes recombinants. En aquest treball, el nostre primer objectiu va ser optimitzar un vector de TMV per a millorar la producció. La fusió traduccional de l'extrem amino-terminal de la CP del TMV amb la proteïna recombinant d'interès va mostrar un augment en l'acumulació de la proteïna verda fluorescent, interferó alfa-2a i un nanobody contra la proteïna Spike del SARS-CoV-2 en fulles de Nicotiana benthamiana. La inserció d'un lloc de tall específic, basat en les proteases d'inclusió nuclear (NIaPro) de dos potivirus, juntament amb l'expressió de les proteases corresponents, a més de la producció de la proteïna recombinant madura, va augmentar encara més l'acumulació de les proteïnes recombinants esmentades anteriorment. En segon lloc, el nostre objectiu va ser establir estratègies per a produir proteïnes recombinants d'interés industrial i farmacèutic en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. Vam aconseguir produir grans quantitats d'una xilanasa termofílica, activa en condicions extremes de temperatura i pH alcalí, en N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. El enzim que es va acumular ràpidament en els teixits de la planta es va dirigir a l'apoplast, la qual cosa va facilitar enormement la purificació i va evitar qualsevol efecte advers en el creixement de la planta. Es va demostrar que aquesta enzima produïda en planta és útil per a la producció de xilooligosacàrids probiòtics. També vam produir grans quantitats d'una glucosa oxidasa (GOX) modificada en fulles de N. benthamiana utilitzant un vector de TMV. La GOX produïda en planta, que també es va purificar fàcilment a partir de fluids apoplàstics, va exhibir potents propietats antimicrobianes contra Staphylococcus aureus i Escherichia coli. / [EN] Plants are emerging as an attractive alternative to conventional heterologous production systems, including bacteria, mammalian cell cultures, yeast, or fungi, for the synthesis of high-value products, such as secondary metabolites and proteins. The demand for these products is often limited by production capacity and associated costs. However, using plants as production platforms offers advantages in terms of affordability, sustainability, scalability, and the absence of human and livestock pathogens, making them an increasingly appealing choice. Despite limitations in cargo capacity, transient gene expression using viral vectors provides an efficient and reproducible method for producing recombinant proteins in plants, unlike stable transformation, which is more labor- intensive and time-consuming. Vectors derived from tobacco mosaic virus (TMV), particularly those in which the viral coat protein (CP) gene is mostly replaced with the gene of interest, are classic in plant biotechnology and frequently use for large-scale production of recombinant proteins. In this work, we first aimed to optimize a TMV vector to improve production. Translational fusion of the amino- terminal end of TMV CP to the recombinant protein of interest led to increased accumulation of the green fluorescent protein, interferon alfa-2a and a nanobody against the Spike protein of SARS-CoV-2 in Nicotiana benthamiana leaves. Insertion of a specific cleavage site, based on the nuclear inclusion a proteases (NIaPro) form two potyviruses, along expression of the cognate proteases led to, in addition to production of the mature recombinant protein, a further increase in the accumulation of the aforementioned recombinant proteins. Second, we aimed to set up strategies to produce recombinant proteins of industrial and pharmaceutical interest in N. benthamiana using a TMV vector. We successfully produced large amounts of a thermophilic xylanase, active under extreme temperature and alkaline pH conditions, in N.benthamiana using a TMV vector. The enzyme that accumulated rapidly in plant tissues was targeted the apoplast, which enormously facilitated purification, and avoided any adverse effect on plant growth. This plant-made enzyme was shown to be useful for the production of probiotic xylooligosaccharides. We also produced large amounts of an engineered glucose oxidase (GOX) in N. benthamiana leaves using a TMV vector. The plant-made GOX that was also easily purified from apoplastic fluids exhibited potent antimicrobial properties against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. / This work was supported Generalitat Valenciana, grant INNEST/2021/7 from Agència Valenciana de la Innovació, and by grant PID2020-114691RB-I00 from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación, through the Agencia Estatal de Investigación (co-financed European Regional Development Fund), and by the Bio Based Industries Joint Undertaking, under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program (Project WOODZYMES, Grant Agreement H2020-BBI- JU-792070). M.N.-S. is the recipient of a predoctoral contract from the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (PRE2018-084771). / Nicolau Sanus, M. (2023). Production of Recombinant Proteins with Pharmaceutical and Industrial Applications in Plants Using a Tobacco Mosaic Virus-Derived Vector [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/200381

Le papier bioactif est obtenu par la modification de substrat du papier avec des biomolécules et des réactifs. Ce type de papier est utilisé dans le développement de nouveaux biocapteurs qui sont portables, jetables et économiques visant à capturer, détecter et dans certains cas, désactiver les agents pathogènes. Généralement les papiers bioactifs sont fabriqués par l’incorporation de biomolécules telles que les enzymes et les anticorps sur la surface du papier. L’immobilisation de ces biomolécules sur les surfaces solides est largement utilisée pour différentes applications de diagnostic comme dans immunocapteurs et immunoessais mais en raison de la nature sensible des enzymes, leur intégration au papier à grande échelle a rencontré plusieurs difficultés surtout dans les conditions industrielles. Pendant ce temps, les microcapsules sont une plate-forme intéressante pour l’immobilisation des enzymes et aussi assez efficace pour permettre à la fonctionnalisation du papier à grande échelle car le papier peut être facilement recouvert avec une couche de telles microcapsules. Dans cette étude, nous avons développé une plate-forme générique utilisant des microcapsules à base d’alginate qui peuvent être appliquées aux procédés usuels de production de papier bioactif et antibactérien avec la capacité de capturer des pathogènes à sa surface et de les désactiver grâce à la production d’un réactif anti-pathogène. La conception de cette plate-forme antibactérienne est basée sur la production constante de peroxyde d’hydrogène en tant qu’agent antibactérien à l’intérieur des microcapsules d’alginate. Cette production de peroxyde d’hydrogène est obtenue par oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydase encapsulée à l’intérieur des billes d’alginate. Les différentes étapes de cette étude comprennent le piégeage de la glucose oxydase à l’intérieur des microcapsules d’alginate, l’activation et le renforcement de la surface des microcapsules par ajout d’une couche supplémentaire de chitosan, la vérification de la possibilité d’immobilisation des anticorps (immunoglobulines G humaine comme une modèle d’anticorps) sur la surface des microcapsules et enfin, l’évaluation des propriétés antibactériennes de cette plate-forme vis-à-vis l’Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) en tant qu’un représentant des agents pathogènes. Après avoir effectué chaque étape, certaines mesures et observations ont été faites en utilisant diverses méthodes et techniques analytiques telles que la méthode de Bradford pour dosage des protéines, l’électroanalyse d’oxygène, la microscopie optique et confocale à balayage laser (CLSM), la spectrométrie de masse avec désorption laser assistée par matrice- temps de vol (MALDI-TOF-MS), etc. Les essais appropriés ont été effectués pour valider la réussite de modification des microcapsules et pour confirmer à ce fait que la glucose oxydase est toujours active après chaque étape de modification. L’activité enzymatique spécifique de la glucose oxydase après l’encapsulation a été évaluée à 120±30 U/g. Aussi, des efforts ont été faits pour immobiliser la glucose oxydase sur des nanoparticules d’or avec deux tailles différentes de diamètre (10,9 nm et 50 nm) afin d’améliorer l’activité enzymatique et augmenter l’efficacité d’encapsulation. Les résultats obtenus lors de cette étude démontrent les modifications réussies sur les microcapsules d’alginate et aussi une réponse favorable de cette plate-forme antibactérienne concernant la désactivation de E. coli K-12. La concentration efficace de l’activité enzymatique afin de désactivation de cet agent pathogénique modèle a été déterminée à 1.3×10-2 U/ml pour une concentration de 6.7×108 cellules/ml de bactéries. D’autres études sont nécessaires pour évaluer l’efficacité de l’anticorps immobilisé dans la désactivation des agents pathogènes et également intégrer la plate-forme sur le papier et valider l’efficacité du système une fois qu’il est déposé sur papier. / Bioactive paper is obtained through the modification of paper substrate with biomolecules and reagents. It is used in the development of novel biosensors that are portable, disposable and inexpensive, aimed at capturing, detecting and in some cases deactivating pathogens. Generally bioactive papers are made by incorporating biomolecules such as enzymes and/or antibodies on to paper. The immobilization of such biomolecules on solid surfaces is widely used for different diagnostic applications such as in immunosensors and immunoassays but due to the sensitive nature of enzymes, their large scale incorporation into paper has faced several difficulties especially under industrial papermaking conditions. The functionalization of paper at large scale is possible because paper can be easily coated with a layer of microcapsules, which have proven to be an efficient immobilization platform for enzymes and to allow. In this study, we developed a generic alginate-based platform incorporating microcapsules that can be applied to current paper production processes to prepare antibacterial bioactive paper with the ability to capture pathogens on its surface and to deactivate them by producing an anti-pathogenic agent. The design of the antibacterial platform is based on constant production of hydrogen peroxide as the antibacterial agent inside the alginate microcapsules. Hydrogen peroxide production is achieved through oxidation of glucose, catalyzed by the enzyme glucose oxidase encapsulated inside the alginate beads. The different steps of development included the entrapment of glucose oxidase inside alginate microcapsules, the reinforcement and surface activation of microcapsules by adding an additional layer of chitosan, investigating the possibility of immobilization of antibodies (human immunoglobulin G as a model antibody) on the surface of microcapsules and, finally, verifying the antibacterial properties of the system against Escherichia coli K-12 (E. coli K-12) as a representative pathogen. During development, certain measurements and observations were made using various analytical methods and techniques such as Bradford protein assay, oxygen electroanalysis, optical and confocal laser canning microscopy (CLSM), matrix assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), etc. Appropriate tests were performed to validate the successful modification of microcapsules and to ensure that glucose oxidase is still active after each modification. It was found that the encapsulated glucose oxidase maintained the specific enzymatic activity of 120±30 U/g. Subsequent efforts were made to immobilize glucose oxidase on gold NPs of two different diameters (10.9 nm and 50 nm) to enhance the enzymatic activity and increase the encapsulation efficiency. The results obtained during this study demonstrate successful modifications on alginate microcapsules and also a successful response of such antibacterial platform regarding deactivation of the pathogen representative, E. coli K-12. The threshold for the enzymatic activity was found to be 1.3×10-2 U/ml for E. coli K-12 growth inhibition of 6.7×108 cells/ml. Further studies are needed to assess the efficiency of immobilized antibody in the capture of pathogens and also to incorporate the platform onto paper and to validate the efficiency of the system once it is coated on paper.

A sacarose é uma matéria-prima, cuja produção é considerada ecologicamente correta, sendo o Brasil seu maior produtor e exportador. O dissacarídeo pode ser convertido, através de um processo multienzimático, em substâncias de maior valor agregado: frutose e ácido glicônico, as quais são importadas pelo Brasil, tendo amplo uso nos setores químico, farmacêutico e alimentício. A conversão foi feita através da ação da invertase, glicose oxidase e catalase, utilizando os reatores descontínuo e contínuo. No procedimento utilizando reator descontínuo, o tempo de residência é igual para reagentes, produtos e catalisador. Neste caso as enzimas foram adicionadas seqüencialmente, em um primeiro momento, e na segunda etapa foram adicionadas simultaneamente. Os parâmetros de partida, a saber, concentração inicial de sacarose, pH, temperatura e atividades enzimáticas, foram testados em diferentes quantidades no intuito de encontrar a mistura inicial mais eficiente na conversão do substrato. No procedimento contínuo, utilizou-se reator com membrana, da marca MILLIPORE®, que permite integrar em uma única etapa a conversão catalítica, a separação/concentração do produto e a recuperação do biocatalisador. A temperatura foi controlada por circulação de água, tendo acoplado uma bomba peristáltica (para controlar a vazão de alimentação do substrato) e um sistema de pressurização. O reator operou com membrana de ultrafiltração (corte molecular = 100 kDa) e foi mantido sob agitação constante. Os parâmetros de partida, neste reator, foram fixados de acordo com os valores otimizados no reator descontínuo com o emprego simultâneo das enzimas. / Sucrose is produced in large amount in Brazil, being a worldwide commercialized commodity. However, it can be converted into more valuable products such as fructose and gluconic acid, both used largely in the chemical, pharmaceutical and food industry. Conversion occurred through the action of invertase, glucose oxidase and catalase, using the discontinuous and continuous reactors. In the batch reactor, the residence time is equal to reactants, products and catalyst. In this case, enzymes were added sequentially, at first, and in the second step were added simultaneously. Boot parameters, initial sucrose concentration, pH, temperature and enzyme activities were tested in different amounts in order to find the most efficient initial mixture to the conversion of the substrate. In continuous process, we used the membrane reactor, MILLIPORE®, which allows for one-step catalytic conversion, the separation / concentration of the product and recovery of the biocatalyst. The temperature was controlled by circulation of water, coupled with a peristaltic pump (to control the feed flow of the substrate) and a pressurization system. The reactor was operated with ultrafiltration membrane (molecular cutoff = 100 kDa) and was kept under constant agitation. The initial parameters in this reactor were set according to the values optimized in the batch reactor with the simultaneous use of enzymes.

A funcionalização da matriz celulósica é um ponto essencial para o aprimoramento dos dispositivos microfluídicos baseados em papel (µPADs). Ela permite minimizar o preparo de amostras e a interferência do usuário, principais fontes de erro no processo analítico. A oxidação da celulose durante uma hora com m-periodato de sódio e a imobilização química de enzimas a partir da formação de bases de Schiff (iminas), via a adição direta da enzima ao substrato oxidado sem a necessidade de outras etapas, é um processo rápido e de baixo custo, apresentando grande potencialidade de aplicação nos dispositivos microfluídicos em papel. A enzima glicose oxidase imobilizada na celulose, com a adição do estabilizante trealose, apresentou elevada atividade catalítica - de 31,9 ± 5,5 mmol L-1 para a enzima não imobilizada a 14,8 ± 2,0 mmol L-1 para a enzima imobilizada e com o estabilizante - além de apresentar maior homogeneidade de sinal, condições desejáveis em testes rápidos em papel. A confecção de dispositivos em papel via impressão em cera alia rapidez e baixo custo de produção, e o arranjo em camadas para originar dispositivos tridimensionais (3D) permite ampliar as funcionalidades dos dispositivos em duas dimensões, tal como o tratamento individualizado de camadas e o armazenamento de reagentes no próprio dispositivo. O método da adição de padrão para obtenção de curvas analíticas no próprio microchip em papel surge como alternativa às curvas analíticas externas, minimizando a manipulação e o preparo de amostras. O uso do ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) - ABTS como indicador redox para as reações enzimáticas e o método de adição de padrão nos µPADs apresentou boa correlação com um modelo de crescimento e saturação de Michaelis-Menten (r2 = 0,8723) na faixa de 0 a 10 mmol L-1, e a utilização da faixa linear para quantificação de glicose (0 a 3 mmol L-1) apresentou grande correlação linear com a concentração estimada pelas curvas de adição de padrão (r2 = 0,959), demonstrando a potencialidade do método. A união da tecnologia desses dispositivos em papel com a de um software automatizado de reconhecimento de imagens (PAlizer) torna instantânea a obtenção de resultados, eliminando-se a necessidade de intervenção humana no processo, tornando os testes em papel mais robustos, reprodutíveis e rápidos. Com o contínuo aperfeiçoamento das funcionalidades e potencialidades dos dispositivos microfluídicos em papel espera-se que os testes diagnósticos de baixo custo atinjam àqueles que deles necessitam, contribuindo para a saúde da população. / Functionalization of a cellulosic matrix is essential for the success of the paper-based microfluidic analytical devices (µPADs). It allows minimization of sample preparation and user interference, both being major sources of errors in the analytical process. Cellulose oxidation with sodium m-periodate during one hour and the direct chemical immobilization of enzymes on it by Schiff-base (imines) formation, which is made by direct insertion of the enzyme on the oxidized substrate without subsequent steps, is a fast and low cost process of immobilization, presenting great potential of application in paper-based microfluidic analytical devices. The glucose oxidase enzyme immobilized on cellulose, with the addition of trehalose stabilizer presented enhanced catalytic activity - from 31.9 ± 5.5 mmol L-1 for the non-immobilized enzyme to 14.8 ± 2.0 mmol L-1 for the immobilized enzyme with the stabilizing agent - also presenting greater signal homogeneity, which are ideal characteristics in a paper-based rapid test. Wax printing is a simple, inexpensive and fast method by which micro-devices can be fabricated. Additionally, the stacking of layers originating tridimensional devices (3D) allow for the improvement of functionalities of 2-dimensional ones, such as individualized layer treatment and reagent storage at different layers in the same device. Standard addition to analytical curves in paper-based microchips is an alternative to external analytical curves, minimizing handling/sample preparation. The use of 2,2\'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid - ABTS redox indicator with the enzymatic reactions and the standard addition method in µPADs presented a good correlation in a growth and saturation Michaelis-Menten model (r2 = 0.8723), in the range of 0 to 10 mmol L-1, and the usage of the linear range to the glucose quantification (0 to 3 mmol L-1) presented a high linear correlation with the estimated concentration from the standard addition curves (r2 = 0.959), showing the potentiality of the method. The coupling of such paper-based devices to automated image analysis software, such as \'PAlizer\', turns the data acquisition process instantaneous, eliminating the need of human intervention during the process, making it more robust, reproducible and rapid. Expectations lie in improving the devices functions and potential so that these low-cost diagnostic devices can one day reach those who need them, contributing significantly to public health.

O amido resistente de milho (ARM) não é digerido em humanos fornecendo benefícios para a saúde tais como redução do colesterol, do índice glicêmico e fermentação no cólon. Porém, a substituição parcial de farinha de trigo (FT) por ARM em massa de pão resulta na diluição do glúten prejudicando a qualidade do produto. Massa de pão foi produzida com 12,5 g/100g de ARM e os efeitos das enzimas glicose-oxidase (Gox), tranglutaminase (TG) e xilanase (HE) na massa foram estudados. Massa produzida sem ARM e sem enzimas foi considerada padrão e massa produzida com ARM e sem enzimas foi considerada controle para comparação. Uma metodologia foi desenvolvida para medir o torque durante o amassamento em grande escala, utilizando um reômetro dinâmico adaptado. As propriedades reológicas foram avaliadas nos testes de medidas descritivas de textura, adesividade Chen-Hoseney, extensão uniaxial Kieffer, extensão biaxial e testes oscilatórios em reômetro. Pão produzido de acordo com as formulações padrão, controle e ótima foi avaliado com relação ao volume específico (VEP), firmeza do miolo, cor e análise sensorial para o atributo preferência. As três enzimas testadas influenciaram positivamente o torque máximo atingido durante o amassamento que variou entre (8,36 e 9,38) N m. Gox e TG apresentaram efeito positivo na altura máxima desenvolvida pela massa medida em reofermentógrafo enquanto que o efeito da HE foi negativo. Uma formulação com ARM e enzimas apresentou desempenho de panificação similar a massa padrão (altura máxima ajustada igual a (45,5 ± 3,9) mm), correspondente a adição de (4, 2,5 e 0,5) mg/100g de TG, Gox e HE respectivamente (ótima). A formulação ótima apresentou adesividade, trabalho de adesão, coesividade, dureza, resiliência, resistência à extensão e extensibilidade similares a massa padrão e diferentes da massa controle. As enzimas aumentaram o índice de strain hardening reduzido pela adição de ARM. Para o pão de forma, o VEP variou entre (3,16 e 3,64) cm3/g (diferença não significativa) e o pão produzido com a formulação ótima foi o mais escolhido como preferido. Durante o armazenamento por até 7 dias, o ARM diminuiu a taxa de envelhecimento do pão enquanto que as enzimas apresentaram efeito oposto. Em geral, a substituição parcial de FT por ARM reduziu a elasticidade da massa diminuindo a qualidade do pão enquanto que as enzimas minimizaram esse efeito. / Resistant starch (RS) is not digested by humans providing benefits for health such as reduction of blood LDL cholesterol levels, reduction of post-prandial blood glucose and fermentation in the colon. However, partial replacement of wheat flour (WF) with RS prejudices bread quality due to gluten dilution. Dough was formulated with 12.5 g/100g of RS and the effects of the enzymes glucose-oxidase (Gox), tranglutaminase (TG) and xylanase (HE) were studied. Dough produced without RS or enzymes was considered as regular and dough produced with RS and without enzymes was considered as control for comparison. A methodology was developed to measure torque during dough mixing in large scale using a dynamic rheometer. With respect to dough rheology, tests performed included texture profile analysis, Chen-Hoseney stickiness, Kieffer uniaxial extension, biaxial extension and oscillatory tests in rheometer. Bread was produced from regular, control and optimum formulations and the quality was assessed concerning specific volume, firmness, color and preference by sensory panel. The three enzymes tested influenced positively the maximum torque during mixing which varied between (8.36 and 9.38) N m. Gox and TG showed positive effects on the maximum height developed by dough measured in rheofermentometer while HE showed a negative one. A formulation with RS and baking performance similar to regular dough was found (adjusted maximum height equal to (45.5 ± 3.9) mm), corresponding to (4, 2.5 and 0.5) mg/100g of TG, Gox and HE respectively (optimum). The optimum formulation showed stickiness, work of adhesion, cohesiveness, hardness, resilience, resistance to extension and extensibility, similar to the regular dough and statistically different from control dough. Strain hardening index was reduced by the addition of RS and increased by the addition of enzymes. Regarding bread tests, specific volume of bread varied between (3.16 e 3.64) cm3/g (not significant difference) and the bread produced with theoptimum dough was the most preferred by the sensory panel. During 7 days of storage, RS reduced the aging rate while enzymes had the opposite effect. In general, WF replacement by RS reduced dough elasticity affecting the bread quality while enzymes helped minimizing this effect.

Os Hidróxidos Duplos Lamelares (HDL) constituem uma classe de materiais que apresentam estrutura lamelar, consistindo de camadas positivamente carregadas de um hidróxido duplo, intercaladas com ânions hidratados no domínio interlamelar. Estes materiais têm recebido bastante atenção nos últimos tempos, devido ao baixo custo e relativa simplicidade de preparação, a possibilidade de combinação de uma variedade de cátions e ânions, aliados às propriedades que os HDL podem apresentar como: propriedades ácidas e básicas, \"efeito memória\", elevada área superficial, etc. Os HDL também podem ser utilizados em combinação com outros materiais, como por exemplo, óxido de grafeno, formando compósitos, com a finalidade melhorar as propriedades destes materiais. Podem ainda serem utilizados para a preparação de outros compósitos e/ou réplicas de carbono, por tratamento térmico de um HDL intercalado com um monômero, por exemplo, 4-vinil benzeno sulfonato (VBS), que pode ser polimerizado \"in situ\" e posteriormente carbonizado produzindo a réplica de carbono. A utilização dos materiais descritos anteriormente como suporte para imobilização de enzimas pode proporcionar uma plataforma alternativa para construção de dispositivos biossensores. O objetivo geral do trabalho foi a preparação e caracterização de materiais como HDL, Compósitos e/ou Réplicas de Carbono derivadas de HDL ou compósitos de HDL/ óxido de grafeno, como suporte da enzima Glicose Oxidase, estudando suas propriedades eletroquímicas, visando as potenciais aplicações destes materiais como biossensores. Para isto, foram preparados e caracterizados HDL de Mg-Al e Zn-Al intercalados com o ânion carbonato, pelo método de coprecipitação a pH variável; compósitos e/ou réplicas de carbono derivadas de um HDL precursor de Mg-Al-VBS, preparados, por coprecipitação a pH constante e compósitos de Mg-Al/óxido de grafeno que também foram preparados por coprecipitação a pH constante. Estes materiais foram utilizados na imobilização da enzima Glicose Oxidase (GOx), em eletrodos modificados e foi realizado o estudo eletroquímico dos mesmos e de suas potenciais aplicações. Foi possível observar que os HDL de Mg-Al-CO3, Zn-Al-CO3, Mg-Al-VBS e o compósito Mg-Al/óxido de grafeno exibiram boa cristalinidade, estabilidade térmica, e outras características como porosidade e superfícies positivamente carregadas, viabilizando a xiii utilização dos mesmos para a imobilização e estudo eletroquímico da enzima Glicose Oxidase. O estudo eletroquímico dos eletrodos modificados com estes materiais e a enzima Glicose Oxidase mostrou que os mesmos apresentam boa resposta catalítica frente ao substrato glicose e a importância destes materiais na atividade desta enzima. Os eletrodos modificados apresentaram boa sensibilidade, estabilidade à longo prazo e reprodutibilidade do método, podendo estes serem aplicados para a preparação de biossensores. / Layered Double Hydroxides (LDH) constitute a class of materials with a layered structure consisting of positively charged layers of a double hydroxide and hydrated anions intercalated in the interlayer domain. These materials have received much attention lately because they offer many advantages: they display acidic and basic properties, \"memory effect\", and high surface area; are inexpensive and easy to prepare; and can combine with a variety of cations and anions. Combination of LDH with materials like graphene oxide affords composites with improved properties as compared to the starting organic component. Heat treatment of LDH intercalated with a monomer such as 4-vinyl-benzene sulfonate (VBS), followed by \"in situ\" polymerization and carbonization, produces composites and/or carbon replica. The materials described above could be applied as support to immobilize enzymes and may provide an alternative platform for biosensor devices. In this study, we aimed to prepare and characterize LDH, composites and/or carbon replica derived from LDH, and LDH/graphene oxide composites and support glucose oxidase enzyme (GOx) on these matrixes. We investigated the electrochemical properties of the resulting materials and evaluated their potential application as biosensors. More specifically, we prepared and characterized Mg-Al and Zn-Al LDH systems intercalated with carbonate ion by the coprecipitation method; composites and/or carbon replica derived from a precursor LDH Mg-Al-VBS by coprecipitation at constant pH; and Mg-Al/graphene composites by coprecipitation at constant pH. We used these materials to immobilize GOx on modified electrodes and assessed the electrochemical activity and potential application of the immobilized enzyme as biosensor. Mg-Al-CO3, Zn-Al-CO3, Mg-Al-VBS LDH and Mg-Al/graphene oxide composite were crystalline, thermally stable, and porous and exhibited positively charged surface, which favored immobilization and electrochemical investigation of the GOx enzyme. The modified electrodes displayed good catalytic response to glucose, as substrate, and improved the activity of the enzyme as compared to GOx alone. Additionally, the modified electrodes were sensitive, stable, and reproducible, paving the way for their use in the design of biosensors.

Made available in DSpace on 2017-07-20T12:40:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cliciane Guadalupe de Jesus.pdf: 1994532 bytes, checksum: 0f732ce8dacf9081816c07b36ec9e75d (MD5) Previous issue date: 2013-06-21 / In this thesis, it is described the preparation, characterization and application of LbL films based on the 3- n - propylpyridinium silsesquioxane polymer (SiPy+Cl-) and copper (II) tetrasulfophthalocyanine (CuTsPc), denoted as (SiPy+Cl-/CuTsPc)n, for construction of sensors and biosensors. These films (SiPy+Cl-/CuTsPc)n, were applied as a sensor for promethazine hydrochloride (PMZ) and hydrogen peroxide (H2O2). In addition, taking advantage of the property to the film in electrocatalyzing the reduction of H2O2, an enzymatic amperometric biosensor was constructed by the immobilization of the glucose oxidase enzyme (GOx) on the film for detection of glucose, based on the detection of H2O2 produced in the enzymatic reaction. The UV-Vis spectroscopic technique showed that the adsorption of phthalocyanine occurred linearly indicating that the approximately the same amount of the species is immobilized at each bilayer. The interaction between the sulfonic group and the pyridinium ring is responsible for the support of the films due to the shift of the vibration associated with sulfonic groups. The film (SiPy+Cl-/CuTsPc)5 was highly electrocatalytic and sensitive determination of PMZ. The oxidation process of PMZ molecule presented two peaks at 0.48 and 0.79 V. After optimization of the square wave voltammetry parameters (f = 100 s-1, a = 40 mV and ΔEs = 2 mV), the peak at 0.79 V was used for quantification. Accordingly, the modified electrode obtained a linear response of 3.98 x 10-7 to 3.85 x 10-6 mol L-1 with limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) equal to 8.71 x 10-9 mol L-1 (2.79 g L-1) and 9.31 x 10-8 mol L-1 (9.31 g L-1), respectively. The recovery in pharmaceutical samples showed high stability, specificity and accuracy of the method in complex samples without any pre-treatment. The film (SiPy+Cl-/CuTsPc)2 showed excellent electrocatalytic activity for the reduction of H2O2 with a wide linear range (4.97 x 10-6 a 4.76 x 10-5 mol L-1) and low detection limit (0.33 x 10-6 mol L-1). This electrode was modified with the glucose oxidase enzyme (GOx) and coated with Nafion® (Nf) film, which was used to prevent leaching of GOx. The Fourier transform infrared, fluorescence and circular dichroism spectroscopics, showed that the GOx enzyme retains its native secondary structure when immobilized on the LbL film. The resulting biosensor (SiPy+Cl-/CuTsPc)2(SiPy+Cl-/GOx/Nf) exhibited a current response which varied linearly with the concentration of glucose in the range of 1-10 mmol L-1, with LOD = 0.17 mmol L-1, sensitivity of 1.397 μA x 10-7/mmol L-1 and a rapid response time, less than 5 seconds. The Michaelis-Menten constant apparent ( appmK ) was 10 mmol L-1. Furthermore, the biosensor also showed good reproducibility, excellent stability and a long life, without loss of enzymatic activity by a one-week period and remained active for more than three weeks. The use of the polymer Nf decreased the effect of interferents on the response of the biosensor. / Esta tese descreve a preparação, a caracterização e a aplicação de filmes automontados entre o polímero cloreto de 3- n -propilpiridínio silsesquioxano (SiPy+Cl-) e a ftalocianina tetrassulfonada de cobre (II) (CuTsPc), designados como (SiPy+Cl-/CuTsPc)n, para a construção de sensores e biossensores. Tais filmes, (SiPy+Cl-/CuTsPc)n, se mostraram promissores como sensor para detecção de cloridrato de prometazina (PMZ) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Adicionalmente, tirando-se proveito da propriedade do filme em eletrocatalisar a redução do H2O2, construiu-se um biossensor enzimático amperométrico, a partir da imobilização da enzima glicose oxidase (GOx) sobre o filme, para a detecção de glicose, baseado na detecção do H2O2 produzido na reação enzimática. A técnica de espectroscopia de UV-Vis revelou que a adsorção de ftalocianina ocorre de maneira linear indicando que a cada bicamada depositada aproximadamente a mesma quantidade de material é imobilizado. A interação entre os grupos sulfônicos e o anel piridínio é a responsável pela sustentação dos filmes, devido ao deslocamento da banda associada à vibração dos grupos sulfônicos. O filme (SiPy+Cl-/CuTsPc)5 mostrou propriedades eletrocatalíticas na determinação de PMZ. Este apresentou dois processos de oxidação em 0,48 e 0,79 V. Após a otimização dos parâmetros da voltametria de onda quadrada (f = 100 s-1, a = 40 mV e ΔEs = 2 mV), o pico a 0,79 V foi utilizado para sua quantificação. Nestas condições, o eletrodo modificado obteve uma resposta linear de 3,98 x10-7 a 3,85 x 10-6 mol L-1 com limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) iguais a 8,71 x 10-9 mol L-1 (2,79 μg L-1) e 9,31 x 10-8 mol L-1 (9,31 μg L-1), respectivamente. A recuperação em amostras farmacêuticas revelou alta estabilidade, especificidade e precisão do método, sem qualquer pré-tratamento. O filme (SiPy+Cl-/CuTsPc)2 demonstrou excelente atividade eletrocatalítica para redução de H2O2 com uma ampla resposta linear (4,97 x 10-6 a 4,76 x 10-5 mol L-1) e baixo limite de detecção (0,33 x 10-6 mol L-1). Este eletrodo foi modificado com a enzima glicose oxidase (GOx) e recoberto com filme de Nafion® (Nf), que foi usado para prevenir o lixiviamento da GOx. As técnicas espectroscópicas de infravermelho, fluorescência e dicroísmo circular mostraram que a enzima GOx mantém a sua estrutura nativa secundária quando imobilizado sobre o filme LbL. O biossensor resultante (SiPy+Cl-/CuTsPc)2(SiPy+Cl-/GOx/Nf) exibiu uma resposta de corrente que variou linearmente com a concentração de glicose na faixa de 1 a 10 mmol L-1, com LD = 0,17 mmol L-1, sensibilidade de 1,397 x 10-7 μA/mmol L-1 e um rápido tempo de resposta, inferior a 5 s. A constante de Michaelis-Menten aparente ( appmK ) foi de 10 mmol L-1. Além disso, o biossensor também apresentou boa reprodutibilidade, excelente estabilidade e longo tempo de vida, sem diminuição da atividade enzimática por um período de uma semana e permaneceu ativo por mais de três semanas. A utilização do polímero Nf possibilitou a diminuição do efeito de interferentes na resposta do biossensor. Palavras chave: Filmes LbL, polieletrólito Silsesquioxano, Biossensor Amperométrico, Glicose Oxidase.

A sacarose é uma matéria-prima, cuja produção é considerada ecologicamente correta, sendo o Brasil seu maior produtor e exportador. O dissacarídeo pode ser convertido, através de um processo multienzimático, em substâncias de maior valor agregado: frutose e ácido glicônico, as quais são importadas pelo Brasil, tendo amplo uso nos setores químico, farmacêutico e alimentício. A conversão foi feita através da ação da invertase, glicose oxidase e catalase, utilizando os reatores descontínuo e contínuo. No procedimento utilizando reator descontínuo, o tempo de residência é igual para reagentes, produtos e catalisador. Neste caso as enzimas foram adicionadas seqüencialmente, em um primeiro momento, e na segunda etapa foram adicionadas simultaneamente. Os parâmetros de partida, a saber, concentração inicial de sacarose, pH, temperatura e atividades enzimáticas, foram testados em diferentes quantidades no intuito de encontrar a mistura inicial mais eficiente na conversão do substrato. No procedimento contínuo, utilizou-se reator com membrana, da marca MILLIPORE®, que permite integrar em uma única etapa a conversão catalítica, a separação/concentração do produto e a recuperação do biocatalisador. A temperatura foi controlada por circulação de água, tendo acoplado uma bomba peristáltica (para controlar a vazão de alimentação do substrato) e um sistema de pressurização. O reator operou com membrana de ultrafiltração (corte molecular = 100 kDa) e foi mantido sob agitação constante. Os parâmetros de partida, neste reator, foram fixados de acordo com os valores otimizados no reator descontínuo com o emprego simultâneo das enzimas. / Sucrose is produced in large amount in Brazil, being a worldwide commercialized commodity. However, it can be converted into more valuable products such as fructose and gluconic acid, both used largely in the chemical, pharmaceutical and food industry. Conversion occurred through the action of invertase, glucose oxidase and catalase, using the discontinuous and continuous reactors. In the batch reactor, the residence time is equal to reactants, products and catalyst. In this case, enzymes were added sequentially, at first, and in the second step were added simultaneously. Boot parameters, initial sucrose concentration, pH, temperature and enzyme activities were tested in different amounts in order to find the most efficient initial mixture to the conversion of the substrate. In continuous process, we used the membrane reactor, MILLIPORE®, which allows for one-step catalytic conversion, the separation / concentration of the product and recovery of the biocatalyst. The temperature was controlled by circulation of water, coupled with a peristaltic pump (to control the feed flow of the substrate) and a pressurization system. The reactor was operated with ultrafiltration membrane (molecular cutoff = 100 kDa) and was kept under constant agitation. The initial parameters in this reactor were set according to the values optimized in the batch reactor with the simultaneous use of enzymes.

Submitted by Rosivalda Pereira (mrs.pereira@ufma.br) on 2017-07-07T18:52:22Z No. of bitstreams: 1 CleidivanMacena.pdf: 2189360 bytes, checksum: 599a50d965fad9ff9559783fe4574feb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-07T18:52:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CleidivanMacena.pdf: 2189360 bytes, checksum: 599a50d965fad9ff9559783fe4574feb (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Maranhão (FAPEMA) / The present work demonstrated the potential of Scanning Electrochemical Microscopy (SECM) in the understanding of enzymatic systems using the enzymes glucose oxidase (GOx) and the peroxidase of strong root (HRP) as recognition model. In addition, it evaluated different platforms, such as: Graphene (Gr) and Carbon Nanotubes (CNTs) in the response of enzymatic systems through approximation curves and images. In this sense, the reactivity of the GOx and HRP enzymes was evaluated in the generator / collector mode on an insulating platform. In addition, the HRP was studied comparatively on graphene platform Gr, CNTs and on conductive surface. The use of the SECM technique in the investigation of these systems showed its applicability in the investigation of reactions catalyzed by enzymes and also showed that CNTs were the best platform for immobilization of HRP. In addition, it showed the application of SECM in enzymatic systems for the selective determination of compounds isomers: catechol and hydroquinone. / O presente trabalho demostrou a potencialidade da Microscopia Eletroquímica de Varredura (Scanning Electrochemical Microscopy - SECM) no entendimento de sistemas enzimáticos usando as enzimas glicose oxidase (GOx) e a peroxidase de raiz forte (HRP) como modelo de reconhecimento. Ademais, avaliou diferentes plataformas, como: Grafeno (Gr) e Nanotubos de Carbono (CNTs) na resposta de sistemas enzimáticos através de curvas de aproximação e imagens. Neste sentido, a reatividade das enzimas GOx e HRP foi avaliada no modo gerador/coletor sobre plataforma isolante. Adicionalmente, a HRP foi estudada comparativamente sobre plataforma de grafeno Gr, CNTs e sobre superfície condutora. O uso da técnica SECM na investigação desses sistemas mostrou sua aplicabilidade na investigação de reações catalisadas por enzimas e mostrou ainda que os CNTs fora a melhor plataforma para imobilização da HRP. Além disso, mostrou a aplicação da SECM em sistemas enzimáticos para a determinação seletiva de compostos isômeros: catecol e hidroquinona.

A funcionalização da matriz celulósica é um ponto essencial para o aprimoramento dos dispositivos microfluídicos baseados em papel (µPADs). Ela permite minimizar o preparo de amostras e a interferência do usuário, principais fontes de erro no processo analítico. A oxidação da celulose durante uma hora com m-periodato de sódio e a imobilização química de enzimas a partir da formação de bases de Schiff (iminas), via a adição direta da enzima ao substrato oxidado sem a necessidade de outras etapas, é um processo rápido e de baixo custo, apresentando grande potencialidade de aplicação nos dispositivos microfluídicos em papel. A enzima glicose oxidase imobilizada na celulose, com a adição do estabilizante trealose, apresentou elevada atividade catalítica - de 31,9 ± 5,5 mmol L-1 para a enzima não imobilizada a 14,8 ± 2,0 mmol L-1 para a enzima imobilizada e com o estabilizante - além de apresentar maior homogeneidade de sinal, condições desejáveis em testes rápidos em papel. A confecção de dispositivos em papel via impressão em cera alia rapidez e baixo custo de produção, e o arranjo em camadas para originar dispositivos tridimensionais (3D) permite ampliar as funcionalidades dos dispositivos em duas dimensões, tal como o tratamento individualizado de camadas e o armazenamento de reagentes no próprio dispositivo. O método da adição de padrão para obtenção de curvas analíticas no próprio microchip em papel surge como alternativa às curvas analíticas externas, minimizando a manipulação e o preparo de amostras. O uso do ácido 2,2’-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfônico) - ABTS como indicador redox para as reações enzimáticas e o método de adição de padrão nos µPADs apresentou boa correlação com um modelo de crescimento e saturação de Michaelis-Menten (r2 = 0,8723) na faixa de 0 a 10 mmol L-1, e a utilização da faixa linear para quantificação de glicose (0 a 3 mmol L-1) apresentou grande correlação linear com a concentração estimada pelas curvas de adição de padrão (r2 = 0,959), demonstrando a potencialidade do método. A união da tecnologia desses dispositivos em papel com a de um software automatizado de reconhecimento de imagens (PAlizer) torna instantânea a obtenção de resultados, eliminando-se a necessidade de intervenção humana no processo, tornando os testes em papel mais robustos, reprodutíveis e rápidos. Com o contínuo aperfeiçoamento das funcionalidades e potencialidades dos dispositivos microfluídicos em papel espera-se que os testes diagnósticos de baixo custo atinjam àqueles que deles necessitam, contribuindo para a saúde da população. / Functionalization of a cellulosic matrix is essential for the success of the paper-based microfluidic analytical devices (µPADs). It allows minimization of sample preparation and user interference, both being major sources of errors in the analytical process. Cellulose oxidation with sodium m-periodate during one hour and the direct chemical immobilization of enzymes on it by Schiff-base (imines) formation, which is made by direct insertion of the enzyme on the oxidized substrate without subsequent steps, is a fast and low cost process of immobilization, presenting great potential of application in paper-based microfluidic analytical devices. The glucose oxidase enzyme immobilized on cellulose, with the addition of trehalose stabilizer presented enhanced catalytic activity - from 31.9 ± 5.5 mmol L-1 for the non-immobilized enzyme to 14.8 ± 2.0 mmol L-1 for the immobilized enzyme with the stabilizing agent - also presenting greater signal homogeneity, which are ideal characteristics in a paper-based rapid test. Wax printing is a simple, inexpensive and fast method by which micro-devices can be fabricated. Additionally, the stacking of layers originating tridimensional devices (3D) allow for the improvement of functionalities of 2-dimensional ones, such as individualized layer treatment and reagent storage at different layers in the same device. Standard addition to analytical curves in paper-based microchips is an alternative to external analytical curves, minimizing handling/sample preparation. The use of 2,2\'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid - ABTS redox indicator with the enzymatic reactions and the standard addition method in µPADs presented a good correlation in a growth and saturation Michaelis-Menten model (r2 = 0.8723), in the range of 0 to 10 mmol L-1, and the usage of the linear range to the glucose quantification (0 to 3 mmol L-1) presented a high linear correlation with the estimated concentration from the standard addition curves (r2 = 0.959), showing the potentiality of the method. The coupling of such paper-based devices to automated image analysis software, such as \'PAlizer\', turns the data acquisition process instantaneous, eliminating the need of human intervention during the process, making it more robust, reproducible and rapid. Expectations lie in improving the devices functions and potential so that these low-cost diagnostic devices can one day reach those who need them, contributing significantly to public health.