O nosso grupo está explorando como alternativa para a identificação de novas estratégias de tratamento o reposicionamento de drogas. Nesse contexto, nosso laboratório mostrou que memantina, um antagonista de receptores de glutamato NMDA, apresenta uma atividade tripanocida no ciclo de vida do T. cruzi, in vitro. Com base nessas informações, avaliamos o efeito da memantina em animais infectados com a cepa Y. O tratamento apresentou uma redução da parasitemia (40%) no 8º dpi e redução da carga parasitária no tecido cardíaco no 15º dpi. Uma vez que a cepa Y invade preferencialmente macrófagos, avaliamos o efeito de memantina em células RAW 264.7. Memantina diminuiu a produção de NO por células estimuladas com LPS, diminuiu o Ca2+i, e não houve uma redução de EROs. Memantina também interferiu no ciclo intracelular do parasita, reduzindo o número de células infectadas. Nossos resultados sugerem que o tratamento com memantina pode direcionar o sistema imune de modo a modular os receptores de tipo NMDA, através de um efeito direto ou indireto produzido pelo tratamento. / The search for new therapeutic targets has been of extreme importance for the specific treatment of Chagas disease. Our group is exploring as an alternative, a strategy for drug repurposing. In this context, our laboratory showed that memantine, an antagonistic of NMDA glutamate receptors, has a trypanocidal activity along the life cycle of T. cruzi, in vitro. Based on this information, we evaluated the effect of memantine in animals infected with Y strain. The treatment showed a reduction of parasitemia (40%) in 8th dpi and reduced parasitic load in cardiac tissues at 15th dpi. As the Y strain preferably invades macrophages, we evaluated the effect of memantine in RAW 264.7 cells. Memantine decreased NO production by cells stimulated with LPS, decreased Ca2+i, and did not cause a reduction in ROS. Memantine also interfere with the intracellular parasite cycle, reducing the number of infected cells. Our results suggest that treatment with memantine can target the immune system to modulate the NMDA receptor, through direct or indirect effect caused by the treatment.

A sulfito oxidase (SO) é uma enzima que catalisa a última reação na rota de degradação de aminoácidos sulfurados, a oxidação de sulfito a sulfato. A deficiência da SO é um erro inato do metabolismo que pode ser causado tanto pela deficiência isolada da enzima como por defeitos na síntese do seu cofator molibdênio, cuja principal característica bioquímica é o acúmulo tecidual e a excreção urinária aumentada de sulfito, tiossulfato e S-sulfocisteína. Os pacientes acometidos pela doença têm sintomatologia predominantemente neurológica, e exames de imagem evidenciam encefalomalácia cística, atrofia cerebral e edema, perda neuronal e astrogliose, os quais se concentram na região cortical. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nos danos encontrados na deficiência da SO, porém dados apontam para uma ação tóxica dos metabólitos acumulados. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi o de investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre a neurotransmissão glutamatérgica e parâmetros de estresse oxidativo em fatias de córtex cerebral de ratos. As fatias foram expostas ao sulfito ou tiossulfato (10 – 500 μM) durante 1 ou 3 h para a realização dos experimentos, nos quais medimos a captação de glutamato dependente de sódio, a atividade da enzima glutamina sintetase, os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS), o conteúdo de glutationa (GSH) e de sulfidrilas, a formação de carbonilas e as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), glutationa redutase (GR), glutationa S-transferase (GST) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Também avaliamos a viabilidade celular através dos testes liberação da lactato desidrogenase e a redução do MTT. Foi observado que o sulfito diminui a captação de glutamato e que o tiossulfato diminui a atividade da glutamina sintetase. Uma tendência quase significativa de que o sulfito diminui a atividade da glutamina sintetase também foi verificada. Quanto à homeostase redox, verificamos que o sulfito, na concentração de 10 μM, aumentou os níveis de TBA-RS e diminuiu as concentrações de GSH, sem alterar a formação de carbonilas. Já o tiossulfato não teve nenhum efeito significativo sobre esses parâmetros. Ainda verificamos que 500 μM de sulfito aumentaram o conteúdo de grupamentos sulfidril em córtex cerebral de ratos e o conteúdo de GSH em um meio sem amostra biológica, o que pode ser explicado pela capacidade do sulfito em reduzir pontes dissulfeto a grupos sulfidril. Ao medir as atividades das enzimas antioxidantes GPx, GR, GST e G6PDH, não houve diferença com qualquer dos metabólitos durante 1 h de incubação, porém, ao realizarmos os mesmos experimentos com amostras incubadas por 3 h com sulfito, observamos inibição das atividades da GPx, da GST e da G6PDH. Finalmente, observamos que o sulfito não alterou a redução do MTT e a liberação de lactato desidrogenase, indicando que os resultados encontrados não são devidos à morte celular. Pode ser concluído que um prejuízo na neurotransmissão glutamatérgica e estresse oxidativo causados pelos metabólitos acumulados na deficiência da SO estão envolvidos, pelo menos parcialmente, na disfunção neurológica observada nessa doença. / Sulfite oxidase (SO) is the enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite to sulfate, which is the last step in the pathway of degradation of sulfur-containing amino acids. SO deficiency is an inborn error of metabolism caused either by isolated deficiency in this enzyme, or by defects in the synthesis of its molybdenum cofactor. The main biochemical characteristic of this disorder is the tissue accumulation and high urinary excretion of sulfite, thiosulfate and cysteine-S-sulfate. Patients present predominantly neurological symptoms and brain abnormalities, such as cystic encephalomalacia, brain atrophy and swelling and neuronal loss, which prevail in the cortical region. Although available data point towards a toxic mechanism of the accumulating metabolites, little is known about the exact pathomechanisms exerted by these compounds. Therefore, our objective in this study was to investigate the in vitro effects of sulfite and thiosulfate on glutamatergic neurotransmission and oxidative stress parameters in rat cerebral cortex slices, a system with preserved integrity. Slices were exposed to sulfite or thiosulfate (10 – 500 μM) for 1 or 3 h. After the incubation, we measured sodium-dependent glutamate uptake, glutamine synthetase activity, thiobarbituric acid-reactive substances (TBA-RS) levels, glutathione (GSH) and sulfhydryl content, carbonyl formation and the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR), glutathione S-transferase (GST) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). Lactate dehydrogenase and MTT reduction were also evaluated. We verified that sulfite reduced the glutamate uptake and that thiosulfate inhibited glutamine synthetase activity. A pronounced trend toward glutamine synthetase inhibition caused by sulfite was also seen. Regarding redox homeostasis, 10 μM sulfite increased TBA-RS levels and decreased GSH concentrations, without altering protein carbonyl formation. Moreover, thiosulfate had no effect on these parameters. Five hundred micromolar sulfite also increased sulfhydryl content in rat cerebral cortex slices and increased GSH content in a medium devoid of biological samples, which can be explained by the fact that sulfite is able to directly reduce disulfide bonds to thiol groups. We further verified that sulfite did not alter the activities of the enzymes GPx, GR, GST and G6PDH when cortical slices were incubated in the presence of sulfite during 1 h. However, after an incubation of 3 h, sulfite decreased the activities of GPx, GST and G6PDH. Finally, sulfite did not change MTT reduction and lactate dehydrogenase release, suggesting that the effects observed were not due to cell death. Therefore, it is concluded that glutamatergic neurotransmission impairment and oxidative stress induced by the accumulating metabolites in SO deficiency may contribute to the neurological dysfunction observed in this disorder.

O enriquecimento ambiental oferece estímulos sensoriais, sociais e cognitivos possibilitando ao animal bem-estar e comportamentos mais próximos ao seu natural. Alterações ambientais podem gerar mudanças de expressão gênica, bem como de comportamento. Assim, o primeiro objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de diferentes protocolos de enriquecimento ambiental sobre o perfil comportamental do peixe-zebra (Danio rerio) adulto. Utilizando pedras ao fundo do aquário, plantas artificiais e os animais em cardume, foram montados três protocolos de enriquecimento ambiental. O “Protocolo 1” foi desenhado para avaliar se um ambiente enriquecido com os componentes básicos de complexidade por sete dias já induziria alterações no comportamento do peixe-zebra. Os resultados obtidos com o teste de open tank demonstraram que os animais do grupo ambiente enriquecido (AE) apresentaram um perfil locomotor diferenciado, com redução de distância percorrida total e velocidade média, quando comparado com animais do grupo ambiente padrão (AP). Entretanto, esta diferença se deve a uma instabilidade comportamental apresentada pelo grupo AP através do aumento de distância percorrida no fundo do aquário. Não foram observadas alterações no comportamento tipo ansiedade e preferência social entre os grupos. Desse modo, desenhamos o “Protocolo 2” a fim de avaliar se a reposta comportamental se manteria durante uma exposição mais longa (quatorze dias) ao enriquecimento ambiental. Entretanto, a diferença no perfil locomotor entre os grupos não foi apresentada neste protocolo. Com esses resultados, demonstrou-se a intensidade do estresse provocado pela simples troca entre aquários idênticos utilizados normalmente em biotérios, necessitando uma ambientação mínima de duas semanas no aquário moradia antes da realização de testes comportamentais Por último, realizamos a avaliação do “Protocolo 3”, com o intuito de estudar se a renovação de itens da complexidade do enriquecimento ambiental dentro do período quatorze dias teria alteração nos resultados já observados. Os animais do grupo AE não apresentaram diferença no perfil comportamental geral mesmo com a inserção de novos objetos, entretanto, houve uma redução de distância percorrida no fundo do aparato. Em peixe-zebra, estudos já demonstraram a indução da plasticidade neuronal e aumento na proliferação neuronal quando submetidos a protocolos de enriquecimento. No modelo de roedores, muitos dos efeitos do enriquecimento ambiental são relacionados ao aumento de neurogênese adulta e de ramificação dendrítica, bem como alteração da funcionalidade de alguns sistemas de neurotransmissores, como o glutamatérgico. Assim, a segunda parte dessa dissertação teve como objetivo a análise da expressão proteica de um dos transportadores vesiculares de glutamato, o vGluT2, em animais expostos aos protocolos citados anteriormente Os vGluTs são expressos em regiões dendríticas dos neurônios e quanto maior sua expressão proteica, maior é a densidade de vesículas sinápticas presentes. Os dados obtidos demonstram que essa resposta é relacionada a consolidação e habituação dos peixes a essa condição por um período mais prolongado no protocolo de enriquecimento ambiental (Protocolo 2). Neste trabalho, foi demonstrado que o protocolo de enriquecimento ambiental altera a resposta comportamental do peixe-zebra adulto, mantendo-a mais regular do que a dos controles e isso, provavelmente, é decorrente da estimulação de processos direcionados a resposta ao estresse da novidade, bem como de vias relacionadas com a adaptabilidade. Ademais, demonstramos que a habituação por um protocolo mais longo à condição de um ambiente enriquecido é mais importante para desencadear o aumento de expressão proteica de vGluT2 em cérebro de peixe-zebra. / Environmental enrichment offers social, sensory and cognitive stimuli making possible animal welfare and behavior closer to its natural. Environmental alterations can generate changes in gene expression as well as in behavior. Thus, first aim of this study was to evaluate the influence of different environmental enrichment protocols in adult zebrafish’s (Danio rerio) behavioral profile. Considering items more commonly described in the literature (stones at tank bottom, artificial plants and shoal), we designed three enriched environment protocols. “Protocol 1” was developed to evaluate if an enriched environment with basics components of complexity for seven days already induce behavior alterations in zebrafish. Results obtained with open tank test demonstrated that animals submitted to environmental enrichment (EE) presented differentiated locomotor profile by a reduction of total distance travelled and average speed when compared with animals in the standard environment (SE). However, this difference was due to a behavioral instability presented by animals of SE group reflected in an increase of distance travelled in last two minutes of the test. There were not alterations in anxiety-like behavior and social preference between the groups. In this way, the “Protocol 2” was designed to evaluate whether these behavioral responses in open tank test remain in a longer exposure (fourteen days) to environmental enrichment. However, the difference in locomotor profile was not significant between groups. With the results of these two first protocols, the intensity of stress provoked by a simple change of equal tanks, normally utilized in facilities, was demonstrated. This also presented the necessity of a minimum of two weeks of habituation in home tank, before conducting any behavioral test Finally, we realized the evaluation of “Protocol 3” in order to study if a renovation of enriched environment items of complexity within the period of fourteen days would change results already observed. Animals of EE group showed no difference in general behavioral profile even with the insertion of new objects in environment, similarly to that observed in Protocol 2, however a reduction of distance travelled was presented by these animals, reflecting a little of Protocol 1. In zebrafish, some studies have already demonstrated the induction of neuronal plasticity and increase of neuronal proliferation when animals were submitted to enriched environment protocols. In rodent models, many of effects of environmental enrichment are related to increased adult neurogenesis and dendritic branching, as well as alteration of functionality of some neurotransmitter system was known – like glutamatergic. Thus, second part of this dissertation had as objective the analyses of protein expression of one of the vesicular glutamate transporter (vGluT), the vGluT2, in those three enriched environment protocols cited previously by Western Blotting technique The vGluTs were expressed in neuronal dendritic regions and more its expression, more density of synaptic vesicles presents in analyzed region. Data obtained demonstrated that the increase of immunocontent of vGluT2 is related with consolidation and habituation of fish to this condition for a longer period in environmental enrichment (Protocol 2). In this study, there was demonstrated that environmental enrichment alters the adult zebrafish’s behavioral response, keeping it more regular than the control group (SE) and, probably, this is due to stimulation of process directed to stress response of novelty as well as of pathways related to adaptability. In addition, we have demonstrated that habituation to the condition by a longer protocol of enriched environment is more important to trigger the increase of vGluT2 protein expression in total brain of adult zebrafish.

Orientador: João Cesar Bedran de Castro / Co-orientador: José Antunes-Rodrigues / Banca: José Vanderlei Menani / Banca: Keico Okino Nonaka / Resumo: Este estudo investigou os efeitos da lesão hipotalâmica induzida por glutamato monossódico (MSG) na programação do dimorfismo sexual em parâmetros somatométricos e propriedades biofísicas do osso durante a fase pré-pubere, púbere e adulto jovem. Além disto, nós avaliamos se a alteração hipotalâmica induzida por este modelo pode influenciar nos níveis séricos de leptina e corticosterona nestes animais. A lesão com MSG foi realizada por injeção subcutânea de glutamato monossódico (dose de 4 mg/g de peso corporal, Sigma, St. Louis, MO) em ratos neonatos no 2º, 4º, 6º, 8º e 10º dia de vida. Os grupos controle foram tratados da mesma forma utilizando solução salina 0,9%. Os ratos foram submetidos a eutanásia aos 20,40, 80, 120 e 150 dias de vida. O peso corporal foi mensurado aos 20, 40, 80, 120 e 150 dias de vida e amostras sanguíneas e fêmures foram coletados. O comprimento femural e a geometria crosseccional da diáfise femural foram medidos e a densidade mineral óssea areal (DMOa) foi determinada por densitômetro de dupla emissão de raio-X (DXA). O teste biomecânico de ensaio de flexão de três pontos foi utilizado para avaliar força máxima, rigidez óssea e tenacidade. Amostras sanguíneas foram submetidas a ensaios bioquímicos para estimar os níveis de cálcio, fósforo, fosfatase alcalina, leptina e corticosterona no plasma. Ganho de peso, DMOa e propriedades biomecânicas aumentam rapidamente com relação a idade de todos os grupos. Nos animais controle o dimorfismo sexual esquelético, concentração de leptina e padrões de dimorfismo sexual de corticosterona foram evidentes após a puberdade. No entanto, nós demonstramos que a destruição de neurônios sensíveis ao MSG pode eliminar a diferença sexual no desenvolvimento esquelético, visto... / Abstract: This study investigated the effects of neonatal MSG-induced hypothalamic lesions on the programming of sexual dimorphism in somatometric parameters and the biophysical properties of bone during childhood, puberty, and adulthood. Furthermore, we evaluated whether hypothalamic changes induced by this model may influence leptin and corticosterone serum concentrations in these animals. MSG-lesion was performed by daily subcutaneous injections of monosodium glutamate (at a dose of 4 mg/g of body weight, Sigma, St. Louis, MO) to newborn rats at 2-nd, 4-th, 6-th, 8-th and 10-th day of life. The control groups were treated in the same manner with saline solution 0,9%. Rats were euthanized at 20, 40, 80, 120 or 150 postnatal days. Body weight was also measured at 20, 40, 80, 120 and 150 days of age, and blood samples and femurs were collected. The femur length and femoral diaphyseal cross-sectional geometry were measured and the areal bone mineral density (areal BMD) was determined by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA). Biomechanical three-point bending testing was used to evaluate bone breaking strength, energy to fracture, and extrinsic stiffness. Blood samples were submitted to a biochemical assay to estimate calcium, phosphorus, alkaline phosphatase, leptin, and corticosterone levels. Weight gain, areal BMD and bone biomechanical properties increased rapidly with respect to age in all groups. In control animals, skeletal sexual dimorphism, leptin concentration, and dimorphic corticosterone concentration patterns were evident after puberty. However, we demonstrated that destruction of MSG-sensitive neurons during the critical period of sexual differentiation of the brain causes a long-lasting modification in biophysical bone properties and serum leptin and corticosterone concentrations. This suggested that neonatal MSG treatment... / Mestre

Introdução: A Leucemia Linfóide Aguda (LLA) e o Linfoma não-Hodgkin (LNH) são os tipos de câncer mais incidentes em crianças e a ingestão alimentar pode ser diminuída pela quimioterapia. A sensação do gosto é resultante da detecção e resposta ao estímulo doce, salgado, azedo, amargo e umami. Esse último, identificado pelo glutamato monossódico (MSG), é relacionado ao aumento da palatabilidade, o que pode colaborar para a melhora da aceitação alimentar em crianças com câncer. Objetivo: Identificar os limiares de detecção do gosto umami e a qualidade da alimentação em crianças portadoras de LLA e LNH. Metodologia: Foi aplicado teste de sensibilidade de Threshold para determinar o limiar do gosto umami, com 6 concentrações crescentes de água deionizada e MSG. Aplicou-se recordatório 24 horas e questionário de frequência alimentar para avaliar o consumo alimentar. O peso e altura foram mensurados e IMC utilizados para classificação do estado nutricional, segundo o National Center for Health Statistics (2000). Caracterizou-se a amostra através da distribuição de frequência das variáveis, com auxílio do pacote estatístico Epinfo Versão 6.0. As análises estatísticas e gráficas foram feitas no software R, versão 2.6.2. Foi realizado teste de Cluster para caracterizar a amostra. Resultados: Dos 102 pacientes, 94 eram sensíveis ao umami. 54,3 por cento do sexo masculino e 45,7 por cento do feminino. 78,4 por cento portadores de LLA e 21,6 por cento de LNH. 91,0 por cento em fase de manutenção. Quanto à idade, 38,3 por cento entre 6 e 7 anos; 20,6 por cento entre 8 e 9; 15,7 por cento entre 10 e 11; 15,7 por cento entre 12 e 13 e 9,8 por cento 14 anos. 8,5 por cento apresentaram baixo peso, 66,0 por cento eutrofia e 25,5 por cento sobrepeso ou obesidade. O produto rico em glutamato monossódico mais consumido foi macarrão instantâneo. O molho inglês e de soja foram os menos consumidos. Os alimentos preferidos foram salgadinhos e macarrão instantâneo, e o que menos gostavam era a mostarda. Não houve diferença estatisticamente significante entre os limiares de sensibilidade ao umami e as variáveis em estudo. O agrupamento da amostra caracterizou 4 grupos: Grupo 1, composto por crianças mais sensíveis ao umami, mais jovens, maioria eutrófica e do sexo masculino; Grupo 2, maioria eutrófica, do sexo feminino, com menor consumo de carboidrato e maior de proteína e lipídeo; Grupo 3, composto por crianças mais velhas, maioria eutrófica e do sexo masculino, com maior consumo calórico e de carboidrato; Grupo 4, com crianças menos sensíveis ao umami, eutróficas e com sobrepeso, maioria do sexo masculino e com ingestão calórica mais baixa. Conclusão: As crianças são sensíveis ao gosto umami e essa característica independe do sexo, idade, estado nutricional, fase de tratamento, ingestão calórica e de macronutrientes. A qualidade da alimentação e a idade foram variáveis determinantes das similiradades entre os grupos. O teste de sensibilidade para detecção do gosto umami é de grande interesse para conhecer o comportamento alimentar e auxiliar na melhora da aceitação dos alimentos / Introduction: The Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and non-Hodgkin Lymphoma (NHL) are the most frequent cancers in children and food intake can be reduced by chemotherapy. The sense of taste is a result of the detection and response to the sweet, salty, sour, bitter and umami stimulus. The latter is identified by monosodium glutamate (MSG) and is related to the increase of palatability, which may contribute to improve food acceptance in children with cancer. Objective: identification of the thresholds of detection of umami taste and food quality in children with LLA and LNH. Methodology: the threshold sensitivity test was applied in order to determine the threshold of the umami taste using six increasing concentrations of deionized water and MSG. A 24-hour recall and food frequency questionnaire were applied to check food intake. Weight and height were measured and the BMI was used to determine the nutritional status, according to the National Center of Health Statistics (2000). The sample was characterized by the distribution of the frequency of the variables, with the help of the Epinfo Version 6.0 statistical package. The statistical and graphical analyses were done using the R statistical software, version 2.6.2. The Cluster test was applied to characterize the sample. Results: from the 102 patients, 94 were sensitive to umami taste. 54,3 per cent were male and 45,7 per cent were female. 78,4 per cent had ALL and 21,6 per cent had NHL. 91 per cent were in the maintenance stage. Regarding age, 38,3 per cent were between 6 and 7 years old; 20,6 per cent were between 8 and 9 years old; 15,7 per cent were between 10 and 11 years old; 15,7 per cent were between 12 and 13 years old and 9,8 per cent were 14 years old. 8,5 per cent were underweight, 66 per cent were eutrophic and 25,5 per cent were overweight or had obesity. The most consumed product was instant noodles, rich in monosodium glutamate. The tabasco and soy sauces were the least consumed. The favorite food was snacks and instant noodles and mustard was the food they liked the least. There was no statistically significant difference between the thresholds of sensitivity to umami and the variables in study. The gathering of the sample characterized four groups: Group 1 formed by younger children, most male and eutrophic, more sensitive to the umami taste; Group 2 formed by most eutrophic and female children, showing lower intake of carbohydrates and higher intake of proteins and lipids; Group 3 formed by older children, most eutrophic and male, showing higher caloric and carbohydrate intake; Group 4 formed by eutrophic and overweight children, most male and with lower caloric intake, less sensitive to the umami taste. Conclusion: children are sensitive to the umami taste and this characteristic does not depend on the sex, age, nutritional status, treatment stage, caloric and macronutrients intake. The food quality and age were determinant variables of the similarities among the groups. The test of sensitivity for the detection of the umami taste is of great interest in the knowledge of food intake behavior and in the increase of food acceptance

O glutamato, quando em altas concentrações na fenda sináptica, é excitotóxico, podendo levar à morte celular devido à hiper-estimulação de seus receptores. Seu efeito neurotóxico tem sido relacionado a várias doenças agudas e crônicas do SNC, tais como isquemia, epilepsia, Alzheimer e Parkinson. A manutenção dos níveis de glutamato abaixo de seus níveis excitotóxicos é realizada através de um mecanismo de transporte de alta afinidade dependente de sódio. Os principais transportadores de glutamato, GLAST e GLT-1, estão presentes nos astrócitos. Alguns estudos demonstram que a captação de glutamato parece variar de acordo com o período de desenvolvimento e envelhecimento; entretanto, poucos estudos avaliam este parâmetro em animais imaturos, maduros e velhos utilizando uma única metodologia. Neste trabalho, nós traçamos um perfil ontogenético da captação de glutamato in vitro, durante o desenvolvimento e envelhecimento, usando fatias de estriado, hipocampo e córtex de ratos com 10, 21 e 60 dias, 15 e 26 meses. Também analisamos se a captação de glutamato era sensível à presença de guanosina. Em todas as estruturas a captação de glutamato foi maior em animais jovens decaindo então, até ratos velhos (15 meses) em estriado e hipocampo ou ratos adultos jovens (60 dias) em córtex. Em estriado e hipocampo observamos um aumento parcial e total, respectivamente, na captação em ratos muito velhos (26 meses). O efeito da guanosina parece ser idade e estrutura dependentes, visto que a mesma aumentou a captação basal de glutamato somente em fatias de córtex de ratos de 10 dias. A diminuição da captação de glutamato observada em animais com 15 meses em estriado e hipocampo pode estar relacionada às diversas desordens neurodegenerativas que ocorrem em idosos, e a recuperação deste parâmetro em ratos muito velhos (26 II meses), tanto parcial como total, parece ser um mecanismo de adaptação compensatório que pode estar ocorrendo durante o processo de envelhecimento.

O ácido glutárico (AG) é o principal metabólito acumulado nos tecidos e fluidos corporais de pacientes afetados por acidemia glutárica tipo I (AG I), um erro inato do metabolismo da via catabólica dos aminoácidos lisina, hidroxilisina e triptofano causado pela deficiência severa da atividade da enzima glutaril-CoA desidrogenase. Clinicamente, os pacientes apresentam macrocefalia ao nascimento e uma hipomielinização ou desmielinização progressiva do córtex cerebral. Crises de descompensação metabólica com encefalopatia aguda ocorrem nestes pacientes principalmente entre 3 e 36 meses de vida, levando a uma marcada degeneração estriatal, que é a principal manifestação neurológica da doença. Depois de sofrer essas crises, os pacientes apresentam distonia e discinesia que progridem rapidamente e os incapacita para as atividades normais. Apesar dos sintomas neurológicos severos e achados neuropatológicos com atrofia cerebral, os mecanismos que levam ao dano cerebral na AG I são pouco conhecidos. O objetivo inicial do presente trabalho foi desenvolver um modelo animal por indução química de AG I através da injeção subcutânea do AG em ratos Wistar de forma que os níveis cerebrais deste composto atinjam concentrações similares aos encontrados em pacientes (~0,5 mM) para estudos neuroquímicos e comportamentais. Observamos que o AG atingiu concentrações no cérebro aproximadamente 10 vezes menores do que no plasma e 5 vezes menores do que nos músculos cardíaco e esquelético. O próximo passo foi investigar o efeito desse modelo sobre parâmetros do metabolismo energético no cérebro médio, bem como nos tecidos periféricos (músculo cardíaco e músculo esquelético) de ratos de 21 dias de vida Verificamos que a produção de CO2 a partir de glicose não foi alterada no cérebro médio dos ratos, bem como a atividade da creatina quinase no cérebro médio, músculo cardíaco e músculo esquelético. A atividade do complexo I-III da cadeia respiratória estava inibida em cérebro médio de ratos (25%), enquanto no músculo esquelético estavam inibidas as atividades dos complexos I-III (25%) e II-III (15%) e no músculo cardíaco não foi encontrada nenhuma inibição dos complexos da cadeia respiratória. Em seguida, testamos o efeito in vitro do AG sobre os mesmos parâmetros do metabolismo energético e observamos uma inibição das atividades do complexo I-III (20%) e da sucinato desidrogenase (30%) no cérebro médio na concentração de 5 mM do ácido. A produção de CO2, a partir de glicose e acetato, e a atividade da creatina quinase não foram alteradas pelo AG no cérebro médio dos animais. Assim, concluímos que o AG interfere no metabolismo energético celular, o que poderia explicar, ao menos em parte, a fisiopatogenia da AG I.

INTRODUÇÃO: A amígdala medial (AMe) modula comportamentos sociais e respostas a estímulos estressantes. Para tanto são necessários ajustes homeostáticos concomitantes, inclusive da função cardiovascular. Dada sua notável presença na AMe, glutamato (Glu) e GABA poderiam estar envolvidos na regulação da atividade cardíaca e da pressão arterial (PA). O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da microinjeção de Glu e GABA no núcleo medial póstero-dorsal (AMePD) de ratos não anestesiados sobre o controle cardiovascular em situação basal e após estimulação dos barorreceptores e quimiorreceptores. MÉTODOS: Ratos machos Wistar (3 meses de idade) foram mantidos em condições padrão de biotério e cuidados éticos. Os animais foram anestesiados e submetidos à cirurgia estereotáxica para implantação de cânula na AMePD direita. No quinto dia pós-cirúrgico, os animais foram novamente anestesiados e submetidos à colocação de cateter de polietileno no interior da artéria aorta abdominal e da veia cava inferior. Um dia após a canulação dos vasos, os animais (n = 7 em cada grupo respectivo) foram microinjetados na AMePD com solução salina (0,3 μl), glutamato na dose de 45 nM/0,3 μl e GABA nas doses de 2 nM/0,3 μl ou 3 μM/0,3 μl. Dados de freqüência cardíaca (FC) e de PA foram obtidos por 3 minutos em período basal (controle) e, a seguir, foram microinjetadas as substâncias mencionadas e testadas as variávies de interesse. Os reflexos pressores foram testados pela injeção de fenilefrina (8 μg/ml) e nitroprussiato de sódio (100 μg/ml) e os quimiorreceptores pela injeção de cianeto de potássio (KCN, doses crescentes desde 60 até 180 μg/kg). Os dados foram comparados pelo teste da análise da variância (ANOVA) de duas vias para medidas repetidas e pelo teste post hoc de Newman-Keuls ou pela ANOVA de uma via e pelo teste de Tukey, conforme apropriado. O nível de significância estatística foi estabelecido em p < 0,05. RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos estudados nos valores de FC, PAsistólica, PA diastólica e PA média em situação basal ou em decorrência das diferentes microinjeções nos grupos estudados (p > 0,05). Glutamato e GABA microinjetados na AMePD também não geraram nenhuma diferença significativa na FC ou na PA ou após a estimulação dos quimiorreceptores com KCN nas diferentes doses empregadas (p > 0,05). Porém, na comparação dos valores referentes ao platô de taquicardia, ou seja, a resposta máxima de FC induzida pelo decréscimo da PA mediada pelos barorreceptores após estimulação da atividade reflexa com nitroprussiato de sódio, houve diferenças significativas quando comparados os valores obtidos entre o grupo que foi microinjetado com GABA na dose de 2 nM em relação ao grupo controle (salina) ou ao que recebeu GABA na dose de 3 μM (p < 0,05 em ambos os casos). Da mesma forma, na avaliação do ganho médio ou sensibilidade média do barorreflexo, após estimulação reflexa mediada pelos barorreceptores, houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre os dados do grupo que recebeu salina e os demais grupos experimentais que receberam glutamato 45nM ou GABA em ambas as doses (menores após microinjeções de glutamato ou GABA, p < 0,01 em todos os casos). DISCUSSÃO: A AMePD, por ação de glutamato e GABA, modula respostas pressóricas reflexas e participa do controle central da PA. Tais dados, ainda inéditos, podem indicar que a AMePD se vale também de sua atividade glutamatérgica e GABAérgica local por circuitaria própria ou devido a aferências neurais para modificar variáveis cardiovasculares, provavelmente de forma concomitante à organização de comportamentos. O papel, no entanto, desses neurotransmissores químicos em condição fisiológica e/ ou patológica depende de trabalhos futuros.

A linhagem de glioma de rato C6 tem sido amplamente utilizada para investigar vários aspectos da biologia celular. Esta linhagem apresenta variações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de acordo com o número de passagens em cultivo. Segundo a literatura, culturas de passagens recentes apresentam características similares a glioblastomas, enquanto que culturas de passagens tardias assemelham-se à astroglia madura. Devido a isso, muitos estudos têm utilizado a linhagem C6 como modelo celular de glioblastoma e de astrócitos para investigar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico, como por exemplo, captação de glutamato. Entretanto, até o presente momento a caracterização e comparação desses parâmetros entre as culturas da linhagem C6 de passagens recentes e tardias ainda não foram avaliadas. O objetivo desta dissertação foi investigar e comparar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico entre as culturas de C6 com passagens recentes e tardias. As passagens recentes apresentaram um conteúdo intracelular de [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu 55% maior quando comparadas às passagens tardias e ambas as culturas atingiram o platô a partir dos 120min de incubação. Além disso, ambas as culturas apresentaram, após incubação com glutamato, os mesmos níveis de incorporação de iodeto de propídeo. Este resultado indica que o menor nível intracelular de [3H] observado nas culturas de passagens tardias não se deve a uma alteração na permeabilidade ou integridade de membrana dessas células. Ambas as culturas expressam somente o transportador Na+ dependente de alta afinidade EAAC1 (carreador de aminoácido excitatórios 1), sendo que sua expressão total foi similar tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias. Para verificar se a captação de L-[3H]-Glu estava ocorrendo através de outro sistema de transporte, as culturas foram incubadas na presença ou ausência de PDC (L-trans-2,4--trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid ) ou TBOA (DL-threo-β-Benzyloxyaspartic acid). O tratamento com os inibidores reduziu de forma similar a captação de L-[3H]-Glu tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias, indicando que este aminoácido é captado principalmente através do transportador de alta afinidade EAAC1. Com relação à liberação de glutamato, observou-se que 50% da radioatividade incorporada na forma de L-[3H]-Glu foi liberada para o meio extracelular tanto nas passagens recentes quanto nas tardias após 2h de incubação. Este resultado pode estar relacionado com o estabelecimento do platô do conteúdo intracelular de [3H] observado após 120 min de captação de L-[3H]-Glu. Para investigar se a liberação de L-[3H]-Glu ocorreu via transporte reverso dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade, ambas as culturas foram incubadas na presença do inibidor não transportável TBOA. Não foi observada alteração no perfil de liberação de radioatividade intracelular nas culturas após incubação com TBOA. Para verificar se a metabolização do L-[3H]-Glu estaria relacionado com a diferença nos níveis intracelulares de [3H], ambas as culturas foram incubadas com o análogo não-metabolizável D-[3H]-Asp. Tanto as passagens recentes como as tardias apresentaram um aumento tempo-dependente do conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp, não atingindo o platô. Além disso, o bloqueio dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade por PDC ou TBOA reduziu a captação de D-[3H]-Asp em ambas as culturas, indicando que sua captação ocorreu principalmente através deste tipo de transporte. Além disso, diferentemente do observado com L-[3H]-Glu, apenas 10% do D-[3H]-Asp captado é liberado após 2h de incubação em ambas as culturas. Este resultado, juntamente com a não inibição por TBOA da liberação da radioatividade captada na forma de L-[3H]-Glu, indica que possivelmente o que está sendo liberado para o meio extracelular é um metabólito marcado com [3H] e não o próprio L-[3H]-Glu. Além disso, nas passagens tardias, o conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp foi menor quando comparado com as passagens recentes aos 60 e 120 min de incubação, sugerindo que as passagens recentes possuem intrinsecamente uma maior capacidade de transporte tanto de L-[3H]-Glu quanto de D-[3H]-Asp quando comparadas às passagens tardias. Os resultados dessa dissertação demonstram que as passagens recentes e tardias da linhagem de glioma C6 diferem na sua capacidade de acumular o [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu. A maior capacidade das passagens recentes da linhagem C6 em acumular a radioatividade não está relacionada a uma maior expressão dos transportadores de glutamato e nem a uma reduzida liberação de L-[3H]-Glu para o meio extracelular. Como conclusão, os resultados obtidos nesta dissertação indicam que o número de passagens deve ser considerado em futuros estudos que pretendam avaliar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico utilizando a linhagem C6 como modelo celular. / Rat C6 lineage has been widely used to investigate several aspects of cell biology. This lineage presents morphological, biochemical and physiological variations according to number of passages in culture. Early passage cells exhibit characteristics similar to glioblastomas, whereas later passage cells resemble mature astroglia. Thus, many studies have been using C6 lineage as astroglial and glioma model to investigate several parameters related to glutamatergic system, such as glutamate uptake. However, the characterization and comparison of these parameters between C6 cultures at early and late passages have not been evaluated. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare some glutamatergic system parameters between early and late passage C6 cells in cultures. Early passages have an L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H] 55% higher when compared to later passages and both cultures reached plateau at 120 min. In addition, after incubation with glutamate, both cultures showed the same levels of propidium iodide incorporation. This result indicates that lower levels of intracellular [3H] in later passages are not due to an alteration of cellular membrane permeability. Both cultures expressed only the higher affinity Na+ dependent transporter EAAC1, and its total expression was similar in early and later passage cultures. To verify if L-[3H]-Glu uptake occurred through another kind of glutamate transport system, the cultures were incubated in the presence or absence of PDC or TBOA. Treatment with this inhibitors reduced the L-[3H]-Glu uptake in both cultures at same levels, indicating that glutamate is taken up mainly by the higher affinity transporter system. Regarding the release of glutamate, it was observed that 50% of the radioactivity incorporated as L-[3H]-Glu was released to extracellular medium in both early and late passages after 2 h of incubation. This result could be related to the establishment of the plateau observed after 120 min for intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake. To investigate if the release of L-[3H]-Glu occurred trough reverse transport, both cultures were incubated in the presence of non-transportable inhibitor TBOA. There was no alteration of intracellular radioactivity release in cultures after incubation with TBOA. In order to verify if the metabolism of L-[3H]-Glu could be related to the differences in intracellular levels of [3H], both cultures were incubated with the non-metabolizable analogue D-[3H]-Asp. Early and late passage C6 cells showed a time-dependent increase in intracellular content of [3H] derived from D-[3H]-Asp uptake, without reaching the plateau. Moreover, blockade of Na+ dependent transporters of high affinity by PDC or TBOA reduced D-[3H]-Asp uptake in both cultures, indicating that uptake occurred mainly through EAAC1. Moreover, differently from L-[3H]-Glu, only 10% of D-[3H]-Asp captured is released after 2 h of incubation in both cultures. This result, taken together with the fact that TBOA did not inhibit the release of radioactivity captured as L-[3H]-Glu, indicates that a [3H]-metabolite is being released to extracellular medium and not L-[3H]-Glu itself. Moreover, in later passages, D-[3H]-Asp-derived intracellular content of [3H] was lower when compared to early passages at 60 and 120 min of incubation, suggesting that early passage C6 cells intrinsically have a greater capacity to transport both L-[3H]-Glu and D-[3H]-Asp when compared to later passages. This study demonstrates that early and late passage C6 cells differ in their ability to accumulate L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H]. From 60 min of incubation, early passages have an intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake 55% higher in relation to later passages. This increased capacity is not related to a higher expression of glutamate transporters nether nor by reduced release of L-[3H]-Glu to extracellular medium. In conclusion, our results indicate that the number of passages should be considered in future studies that intent to evaluate parameters relating to glutamatergic system using Rat C6 lineage as cell model.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.