INTRODUÇÃO: Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito e contribuem independentemente para o risco cardiovascular. O reconhecimento dos AGE pelo receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) potencializa vias de sinalização pró-aterogênicas. Antagonistas do receptor de angiotensina II (ANGII) do tipo 1 (AT-1) diminuem a expressão de RAGE em área de lesão aterosclerótica. No presente projeto, avaliou-se, na aorta de camundongos dislipidêmicos (knockout para apoE) tratados ou não com inibidor do receptor AT-1 (losartana, LOS), o efeito do tratamento crônico com albumina-AGE sobre o infiltrado de lípides, a expressão de mRNA e proteínas envolvidas no eixo AGE/RAGE, ANGII/AT-1, modulação da resposta inflamatória e fluxo de lípides, além da secreção de citocinas inflamatórias por macrófagos tratados com albumina controle ou AGE, concomitantemente ou não a losartana, isolados da cavidade peritoneal de camundongos apoE knockout. MÉTODOS: Camundongos machos knockout para apoE de 12 semanas de idade foram mantidos em dieta padrão e divididos, aleatoriamente, em quatro grupos experimentais (n = 20/grupo): grupo Controle (C), C+LOS, albumina-AGE (AGE) e AGE+LOS. Os animais receberam injeção intraperitoneal diária, durante 30 dias, de 2 mg de albumina controle (grupos C e C+LOS) ou albumina AGE (AGE e AGE+LOS). Os animais C+LOS e AGE+LOS foram tratados durante todo o período experimental com losartana (100 mg/L água). Secções do arco aórtico foram utilizadas para imunofluorescência para RAGE, carboximetil-lisina (CML), AT-1 e 4-hidroxinonenal (4-HNE) e determinação infiltrado lipídico por coloração com Oil Red-O. Análise do mRNA de Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogênio) foi realizada por de qRT-PCR. Ensaio in vitro para secreção de IL-6 por ELISA e expressão de Il1b (IL-1beta) e Il18 (IL-18) por alfaRT-PCR, foi realizado com macrófagos peritoneais isolados camundongos apoE knockout incubados com albumina C ou AGE (2 mg/mL), concomitante ou não ao tratamento com losartana (1 uM). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação ao peso corporal, colesterol total, triglicérides e glicose plasmáticos, no período basal e final. A pressão arterial sistólica foi reduzida nos animais tratados com losartana quando comparados aos não tratados (p < 0,05). Não foi detectada a presença de infiltrado macrofágico na aorta por meio de ensaios de imunofluorescência para CD-68 e pela análise de coloração com hematoxilina-eosina. Todavia, o infiltrado de lípides foi 5,3 e 2 vezes maior no grupo AGE quando comparado, respectivamente, ao grupo C e AGE+LOS (p < 0,05). O conteúdo proteico de RAGE e CML, assim como do marcador de peroxidação lipídica (4-HNE) foi maior no grupo AGE em comparação aos demais grupos, o que não prevenido no grupo AGE+LOS (p < 0,05). A expressão do mRNA de Ager, Orl1 e Tnf foi maior no grupo AGE em comparação ao C, ao passo que o tratamento com losartana impediu o aumento da expressão destes genes (p < 0,05). Isto não foi observado para aumento de Cybb estimulado por albumina-AGE. A losartana diminuiu o mRNA de Agtr1a (AT-1) em ambos os grupos tratados. Não foram observadas diferenças na expressão do mRNA de Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt e Nfkb. Macrófagos tratados com albumina-AGE apresentaram secreção de IL-6 aumentada em 1,4 vezes em comparação ao grupo C, o que foi prevenido pela losartana (p < 0,05). Nestas mesmas células, a albumina-AGE aumentou a expressão de Il1b e Il18, em comparação à albumina-C, o que não foi prevenido pela losartana. CONCLUSÃO: A administração crônica de albumina-AGE em modelo animal de dislipidemia isento de DM, aumentou o infiltrado de lípides no aorco aórtico, independentemente de variação na pressão arterial, lípides plasmáticos e da modulação local de componentes do sistema renina-angiotensina. A ação da albumina-AGE foi consequente ao maior insulto oxidativo e inflamatório associado ao maior conteúdo de RAGE e CML. A losartana, por reduzir o insulto oxidativo e inflamatório contrapõe-se à albumina-AGE, contribuindo para prevenção da aterogênese / INTRODUCTION: Advanced glycated end-products (AGE) elevated in diabetes mellitus and independently contribute to cardiovascular risk. The AGE binding to the receptor for AGE (RAGE) potentializes pro-atherogenic signaling pathways. Antagonists of angiotensin II receptor type 1 (AT-1) diminish RAGE expression in atherosclerotic plaques. In this study, we evaluated in the aortic arch of dyslipidemic mice (apoE knockout), treated or not with AT-1 blocker losartan (LOS), the effect of chronic treatment with AGE-albumin in aortic root lipid infiltration, mRNA expression and protein content of components of AGE/RAGE, ANGII/AT-1 axes and modulators of lipid flux and inflammation, and also the secretion of inflammatory cytokines by peritoneal macrophages treated either with control (C) or AGE-albumin, together with or not by losartan treatment,. METHODS: 12-week old male apoE knockout mice were fed chow diet and ramdomly assigned into four groups (n = 20/group): Control (C), C+LOS, AGE-albumin (AGE) and AGE+LOS. Animals received daily intraperitoneal injection of 2 mg of C- albumin (C and C+LOS) or AGE-albumin (AGE and AGE+LOS) during 30 days. LOS groups were treated with losartan (100 mg/L water). Immufluorescence for RAGE, AT-1, carboxymethyllysine (CML) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), and Oil red-O staining for lipid infiltration was performed in sections from the aortic arch. mRNA expression of Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogen) was evaluated by qRT-PCR. In vitro assay for IL-6 secretion was performed by ELISA and Il1b (IL-1beta) and Il18 (IL-18) mRNA expression was performed by qRT-PCR in peritoneal macrophages from of apoE knockout mice after treatment with C or AGE-albumin (2 mg/mL), with or without losartan (1 ?M). RESULTS: No differences among groups were observed in body weight, plasma total cholesterol, triglycerides and glucose in basal and final periods. Sistolic blood pressure was reduced in both LOS groups when compared to non-treated groups (p < 0.05). It was not observed CD-68 infiltration in the arterial wall. However, lipid infiltration was, respectively, 5.3 and 2 times greater in AGE group in comparison to C and AGE+LOS groups (p < 0.05). RAGE and CML protein and the lipid peroxidation marker (4-HNE) were greater in AGE group when compared to other groups, which was prevented in AGE+LOS (p < 0.05). Ager, Orl1 and Tnf mRNA expression was increased in AGE group when compared to C, and losartan was able to prevent this event (p < 0.05), except for Cybb. Losartan decreased Agtr1a mRNA expression in both groups (p < 0.05). No differences were observed among groups for Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt and Nfkb mRNA expression. Macrophages treated with AGE-albumin presented 1.4 times great IL-6 secretion, which was prevented by losartan (p < 0.05). In these cells, AGE-albumin increased Il1b and Il18 mRNA expression in AGE group, but this was not prevent by losartan. CONCLUSION: Chronic administration of AGE-albumin in non diabetic dyslipidemic mice increased aortic lipid infiltration, independently of changes in blood pressutre, plasma lipids and local modulation of renin angiotensin system components. The role of AGE-albumin was consequent to the enhanced inflammatory and oxidative insult associated to the higher content of CML and RAGE. Losartan by reducing oxidation and inflammation counteracts the effects of AGE-albumin contributing to prevent atherogenesis

A nefropatia diabética (ND) é uma das principais causas de doença renal terminal. Além da lesão glomerular, o compartimento tubulointersticial é afetado no desenvolvimento da ND, não somente pela proteinúria como pelos efeitos pró-inflamatórios, profibróticos, pró-oxidantes e angiogênicos da hiperglicemia e dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Sabese que as concentrações de marcadores do estresse oxidativo estão aumentadas em pacientes com diabetes mellitus (DM). O sistema tiorredoxina (TXN) é um dos principais sistemas antioxidantes endógenos. A TXN é capaz de interagir com um grande número de fatores de transcrição e proteínas, tal como a Thioredoxin interacting protein (TXNIP) que tem sido reconhecida na patogênese do DM e de suas complicações. Além da TXNIP, a deficiência de tiamina, ou vitamina B1, já foi relatada em modelos experimentais de DM, concomitantemente a um aumento de seu clearance renal. Os transportadores de tiamina 1 (THTR1) e 2 (THTR2) (codificados pelos genes SLC19A2 e SLC19A3, respectivamente) são os responsáveis pela reabsorção de tiamina no túbulo proximal após sua filtração pelo glomérulo. Estudos já demonstraram que a excreção aumentada de tiamina pode ser um fator de risco para o declínio precoce da função renal em pacientes DM. Uma outra proteína de interesse é a beta 2 microglobulina (B2M), expressa em situações que cursam com inflamação, um fenômeno bem caracterizado na tubulopatia diabética. O estudo da ativação intrarenal de vias potencialmente associadas à evolução da ND em humanos é dificultada pela necessidade de biópsia renal. Recentemente o sedimento urinário tem sido utilizado na avaliação das doenças renais, tanto na tentativa de identificar biomarcadores que possam predizer o declínio da função renal, como para o melhor entendimento da patogênese dessa complicação. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos genesalvo TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 e B2M na patogênese da ND em portadores de DM1. Estudamos o RNA mensageiro (mRNA) do sedimento urinário de pacientes DM1 (n=55), portadores de glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF, um modelo de nefropatia não diabética, n=12) e de indivíduos controles (n=11) para avaliação da expressão dos genes-alvo, e sua associação com as manifestações da ND. Também foi extraído mRNA de células linfomononucleares de pacientes DM1 (n=162) e indivíduos controles (n=26) para comparação com os resultados obtidos no sedimento urinário e foram dosadas as concentrações plasmáticas de tiamina em um subgrupos de pacientes DM1 e de indivíduos controles. Além disso, uma linhagem de células renais humanas foi tratada com altas concentrações de glicose e albumina glicada ou não glicada in vitro para avaliar se os AGEs estão implicados na alteração de expressão dos genes-alvos. Como resultado observamos (1) um aumento na expressão de TXNIP e TXN no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e associação da expressão de TXNIP com a magnitude do declínio da taxa de filtração glomerular; (2) um aumento na expressão de TXNIP e TXN nas células linfomononucleares dos pacientes DM1; (3) um aumento na expressão de SLC19A2 no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal; (4) uma diminuição nas concentrações plasmáticas de tiamina nos pacientes DM1 em comparação aos controles; (5) um aumento na expressão de B2M no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e (6) um aumento na expressão de TXNIP e B2M nas células renais humanas tratadas concomitantemente com altas concentrações de glicose e albumina glicada. Os resultados do presente estudo sugerem fortemente a participação do sistema TXN e da B2M na etiopatogênese da ND / Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN. Descriptors: diabetes mellitus, diabetic nephropathies, urine, glycosylation end products, advanced, thiamine, thioredoxins, beta 2-microglobulin Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) compreende um espectro de alterações que inclui a esteatose simples e a esteatohepatite não alcoólica e é considerada o componente hepático da Síndrome Metabólica. Estudos já demonstraram que os produtos finais de glicação avançada (AGEs) estimulam a produção de proteínas de matriz extracelular, a geração de espécies reativas de oxigênio e de citocinas pró-inflamatórias por células hepáticas e que poderiam participar da patogênese da DHGNA. Em vista da escassez de informações sobre os efeitos metabólicos dos AGEs no fígado, apesar do seu potencial para causar dano hepático, nós avaliamos os efeitos da administração crônica de albumina modificada por glicação avançada sobre: (1) variáveis associadas com a homeostase glicêmica e a sensibilidade à insulina; (2) a expressão hepática de genes envolvidos na via dos AGEs, no metabolismo da glicose e de lípides, no estresse oxidativo e na inflamação; (3) a ativação de proteínas envolvidas na via de sinalização insulínica; (4) a morfologia e o conteúdo de glicogênio hepático. O estudo foi realizado em ratos Wistar que receberam, por via intraperitoneal, 20 mg/kg/peso corporal de albumina de rato modificada (AlbAGE) ou não (AlbCTRL) por glicação avançada durante 12 semanas. A administração crônica de AlbAGE não alterou as concentrações de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) ou outras variáveis analisadas, mas induziu a resistência insulínica, conforme detectado pelo teste de tolerância à insulina (ITT). Os demais resultados, no entanto, sugerem um aumento da sensibilidade insulínica no território hepático, conforme evidenciado pela ativação da serine/threoninespecific protein kinase (AKT), inativação da glicogênio sintase cinase (GSK3), aumento do conteúdo do glicogênio hepático e a diminuição da expressão dos genes da via da gliconeogênese Pck1 e G6pc. Outros resultados observados foram uma redução no conteúdo de gordura hepatica e na expressão dos genes lipogênicos Acaca e Fasn e dos genes pró-inflamatórios Nfkb1, Tnf e Il6. Os mecanismos que poderiam explicar a melhora concomitante da sensibilidade hepática à insulina e do perfil inflamatório após exposição crônica aos AGEs não estão claros, mas incluem a inativação da GSK3beta, enzima que exerce efeitos metabólicos e anti-inflamatórios. Nossos achados devem estar relacionados com a via de administração intraperitoneal empregada neste estudo, que resulta na absorção direta dos AGEs para a circulação portal, o que, por sua vez, torna o fígado a primeira linha de defesa contra a toxicidade desses compostos. Uma vez no fígado, os AGEs desencadeiam respostas adaptativas para contrabalançar os seus efeitos potencialmente prejudiciais / The Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a spectrum of conditions that includes simple steatosis and nonalcoholic steatohepatitis and it is considered the hepatic component of the Metabolic syndrome. Studies have shown that advanced glycation end products (AGEs) stimulate the production of extracellular matrix proteins, the generation of reactive oxygen species and of proinflammatory cytokines by liver cells, and that they could participate in NAFLD pathogenesis. In view of the paucity of information regarding the metabolic effects of AGEs on the liver, despite their potential to cause hepatic injury, we evaluated the effects of chronic administration of albumin modified by advanced glycation in (1) variables associated with glucose homeostasis and insulin sensitivity; (2) hepatic expression of genes involved in AGEs, glucose and fat metabolism, oxidative stress and inflammation; (3) activation status of proteins involved in insulin signaling and; (4) hepatic morphology and glycogen content. The study was performed in Wistar rats receiving, by intraperitoneal route, 20 mg/kg/body weight of rat serum albumin modified (AlbAGE) or not (AlbCTRL) by advanced glycation for 12 weeks. Chronic administration of AlbAGE did not alter alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) concentrations or other evaluated variables, but induced insulin resistance, as detected by the insulin tolerance test. The remaining results, however, suggested an increase in insulin sensitivity in the hepatic territory, evidenced by activation of serine/threonine-specific protein kinase (AKT), inactivation of glycogen synthase kinase (GSK3), increased hepatic glycogen content, and decreased expression of the gluconeogenesis genes Pck1 and G6pc. Other observed findings were a reduction in hepatic fat content, in the expression of the lipogenic genes Acaca and Fasn and of the proinflammatory genes Nfkb, Tnf, and Il6 genes. Mechanisms that could explain the concomitant improvement in hepatic insulin sensitivity and in the inflammatory profile after chronic exposure to AGEs are not clear, but include inactivation of GSK3beta which exerts metabolic and anti-inflammatory effects. Our findings may be related to the intraperitoneal route of administration employed in this study, which results in direct absorption of AGEs into the portal circulation and, it turn, makes the liver the first-line of defense against the toxicity of these compounds. Once in the liver, AGEs trigger adaptive responses to counterbalance their potentially damaging effects

A doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) compreende um espectro de alterações que inclui a esteatose simples e a esteatohepatite não alcoólica e é considerada o componente hepático da Síndrome Metabólica. Estudos já demonstraram que os produtos finais de glicação avançada (AGEs) estimulam a produção de proteínas de matriz extracelular, a geração de espécies reativas de oxigênio e de citocinas pró-inflamatórias por células hepáticas e que poderiam participar da patogênese da DHGNA. Em vista da escassez de informações sobre os efeitos metabólicos dos AGEs no fígado, apesar do seu potencial para causar dano hepático, nós avaliamos os efeitos da administração crônica de albumina modificada por glicação avançada sobre: (1) variáveis associadas com a homeostase glicêmica e a sensibilidade à insulina; (2) a expressão hepática de genes envolvidos na via dos AGEs, no metabolismo da glicose e de lípides, no estresse oxidativo e na inflamação; (3) a ativação de proteínas envolvidas na via de sinalização insulínica; (4) a morfologia e o conteúdo de glicogênio hepático. O estudo foi realizado em ratos Wistar que receberam, por via intraperitoneal, 20 mg/kg/peso corporal de albumina de rato modificada (AlbAGE) ou não (AlbCTRL) por glicação avançada durante 12 semanas. A administração crônica de AlbAGE não alterou as concentrações de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) ou outras variáveis analisadas, mas induziu a resistência insulínica, conforme detectado pelo teste de tolerância à insulina (ITT). Os demais resultados, no entanto, sugerem um aumento da sensibilidade insulínica no território hepático, conforme evidenciado pela ativação da serine/threoninespecific protein kinase (AKT), inativação da glicogênio sintase cinase (GSK3), aumento do conteúdo do glicogênio hepático e a diminuição da expressão dos genes da via da gliconeogênese Pck1 e G6pc. Outros resultados observados foram uma redução no conteúdo de gordura hepatica e na expressão dos genes lipogênicos Acaca e Fasn e dos genes pró-inflamatórios Nfkb1, Tnf e Il6. Os mecanismos que poderiam explicar a melhora concomitante da sensibilidade hepática à insulina e do perfil inflamatório após exposição crônica aos AGEs não estão claros, mas incluem a inativação da GSK3beta, enzima que exerce efeitos metabólicos e anti-inflamatórios. Nossos achados devem estar relacionados com a via de administração intraperitoneal empregada neste estudo, que resulta na absorção direta dos AGEs para a circulação portal, o que, por sua vez, torna o fígado a primeira linha de defesa contra a toxicidade desses compostos. Uma vez no fígado, os AGEs desencadeiam respostas adaptativas para contrabalançar os seus efeitos potencialmente prejudiciais / The Nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a spectrum of conditions that includes simple steatosis and nonalcoholic steatohepatitis and it is considered the hepatic component of the Metabolic syndrome. Studies have shown that advanced glycation end products (AGEs) stimulate the production of extracellular matrix proteins, the generation of reactive oxygen species and of proinflammatory cytokines by liver cells, and that they could participate in NAFLD pathogenesis. In view of the paucity of information regarding the metabolic effects of AGEs on the liver, despite their potential to cause hepatic injury, we evaluated the effects of chronic administration of albumin modified by advanced glycation in (1) variables associated with glucose homeostasis and insulin sensitivity; (2) hepatic expression of genes involved in AGEs, glucose and fat metabolism, oxidative stress and inflammation; (3) activation status of proteins involved in insulin signaling and; (4) hepatic morphology and glycogen content. The study was performed in Wistar rats receiving, by intraperitoneal route, 20 mg/kg/body weight of rat serum albumin modified (AlbAGE) or not (AlbCTRL) by advanced glycation for 12 weeks. Chronic administration of AlbAGE did not alter alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) concentrations or other evaluated variables, but induced insulin resistance, as detected by the insulin tolerance test. The remaining results, however, suggested an increase in insulin sensitivity in the hepatic territory, evidenced by activation of serine/threonine-specific protein kinase (AKT), inactivation of glycogen synthase kinase (GSK3), increased hepatic glycogen content, and decreased expression of the gluconeogenesis genes Pck1 and G6pc. Other observed findings were a reduction in hepatic fat content, in the expression of the lipogenic genes Acaca and Fasn and of the proinflammatory genes Nfkb, Tnf, and Il6 genes. Mechanisms that could explain the concomitant improvement in hepatic insulin sensitivity and in the inflammatory profile after chronic exposure to AGEs are not clear, but include inactivation of GSK3beta which exerts metabolic and anti-inflammatory effects. Our findings may be related to the intraperitoneal route of administration employed in this study, which results in direct absorption of AGEs into the portal circulation and, it turn, makes the liver the first-line of defense against the toxicity of these compounds. Once in the liver, AGEs trigger adaptive responses to counterbalance their potentially damaging effects

A nefropatia diabética (ND) é uma das principais causas de doença renal terminal. Além da lesão glomerular, o compartimento tubulointersticial é afetado no desenvolvimento da ND, não somente pela proteinúria como pelos efeitos pró-inflamatórios, profibróticos, pró-oxidantes e angiogênicos da hiperglicemia e dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Sabese que as concentrações de marcadores do estresse oxidativo estão aumentadas em pacientes com diabetes mellitus (DM). O sistema tiorredoxina (TXN) é um dos principais sistemas antioxidantes endógenos. A TXN é capaz de interagir com um grande número de fatores de transcrição e proteínas, tal como a Thioredoxin interacting protein (TXNIP) que tem sido reconhecida na patogênese do DM e de suas complicações. Além da TXNIP, a deficiência de tiamina, ou vitamina B1, já foi relatada em modelos experimentais de DM, concomitantemente a um aumento de seu clearance renal. Os transportadores de tiamina 1 (THTR1) e 2 (THTR2) (codificados pelos genes SLC19A2 e SLC19A3, respectivamente) são os responsáveis pela reabsorção de tiamina no túbulo proximal após sua filtração pelo glomérulo. Estudos já demonstraram que a excreção aumentada de tiamina pode ser um fator de risco para o declínio precoce da função renal em pacientes DM. Uma outra proteína de interesse é a beta 2 microglobulina (B2M), expressa em situações que cursam com inflamação, um fenômeno bem caracterizado na tubulopatia diabética. O estudo da ativação intrarenal de vias potencialmente associadas à evolução da ND em humanos é dificultada pela necessidade de biópsia renal. Recentemente o sedimento urinário tem sido utilizado na avaliação das doenças renais, tanto na tentativa de identificar biomarcadores que possam predizer o declínio da função renal, como para o melhor entendimento da patogênese dessa complicação. O objetivo deste trabalho foi estudar a participação dos genesalvo TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 e B2M na patogênese da ND em portadores de DM1. Estudamos o RNA mensageiro (mRNA) do sedimento urinário de pacientes DM1 (n=55), portadores de glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF, um modelo de nefropatia não diabética, n=12) e de indivíduos controles (n=11) para avaliação da expressão dos genes-alvo, e sua associação com as manifestações da ND. Também foi extraído mRNA de células linfomononucleares de pacientes DM1 (n=162) e indivíduos controles (n=26) para comparação com os resultados obtidos no sedimento urinário e foram dosadas as concentrações plasmáticas de tiamina em um subgrupos de pacientes DM1 e de indivíduos controles. Além disso, uma linhagem de células renais humanas foi tratada com altas concentrações de glicose e albumina glicada ou não glicada in vitro para avaliar se os AGEs estão implicados na alteração de expressão dos genes-alvos. Como resultado observamos (1) um aumento na expressão de TXNIP e TXN no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e associação da expressão de TXNIP com a magnitude do declínio da taxa de filtração glomerular; (2) um aumento na expressão de TXNIP e TXN nas células linfomononucleares dos pacientes DM1; (3) um aumento na expressão de SLC19A2 no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal; (4) uma diminuição nas concentrações plasmáticas de tiamina nos pacientes DM1 em comparação aos controles; (5) um aumento na expressão de B2M no sedimento urinário de pacientes DM1 com doença renal e (6) um aumento na expressão de TXNIP e B2M nas células renais humanas tratadas concomitantemente com altas concentrações de glicose e albumina glicada. Os resultados do presente estudo sugerem fortemente a participação do sistema TXN e da B2M na etiopatogênese da ND / Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN. Descriptors: diabetes mellitus, diabetic nephropathies, urine, glycosylation end products, advanced, thiamine, thioredoxins, beta 2-microglobulin Diabetic nephropathy (DN) is a major cause of end stage renal disease. Glomerular and tubulointerstitial compartments are affected not only by proteinuria but also by the pro-inflammatory, profibrotic, pro-oxidants and pro-angiogenic effects exerted by hyperglycemia and advanced glycation end products (AGEs) in the development of DN. It is well known that concentrations of oxidative stress markers are increased in patients with diabetes mellitus (DM). The thioredoxin system (TXN) is one of the majors endogenous antioxidant systems; TXN molecule is able to interact with a large number of transcription factors and proteins such as Thioredoxin interacting protein (TXNIP), which has been recognized in the pathogenesis of DM and its complications. Deficiency of thiamine, or B1 vitamin, has been reported in experimental models of DM concomitantly with an increase in its renal clearance. Thiamine transporter 1 (THTR1), encoded by the SLC19A2 gene and Thiamine transporter 2 (THTR2), encoded by the SLC19A3 gene are responsible for thiamine reabsorption in the proximal tubule after glomerular filtration. Studies have shown that increased urinary excretion of thiamine may be a risk predictor for an early decline in kidney function in diabetic patients. Another protein of interest is beta-2-microglobulin (B2M), expressed in situations of inflammation, a well-characterized phenomenon in diabetic tubulopathy. The study of activation or inactivation of intrarenal pathways potentially associated with progression of DN in humans is complicated by the need for renal biopsy. Recently urinary sediment has been used in the evaluation of kidney diseases in an attempt to identify biomarkers that can predict kidney function decline and as a tool for a better understanding of the pathogenesis of this complication. The objective of this work was to study the participation of the target genes TXNIP, TXN, SLC19A2, SLC19A3 and B2M in the pathogenesis of DN in type 1 DM (T1D) patients. We studied the urinary sediment messenger RNA (mRNA) from patients with T1D (n=55); with focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS, a non diabetic nephropathy model, n=12) and from control subjects (n=11) to assess the expression of the target genes and their association with the severity of DN. We also studied the mRNA expression of peripheral lymphomononuclear (PLMN) cells from T1D patients (n=162) and control subjects (n=26) in order to compare with the results obtained in the urinary sediment. Plasmatic concentrations of thiamine were also measured in a subgroup of T1D patients and control subjects. In addition, a lineage of human kidney cells was exposed to high glucose concentrations and to glycated and non-glycated albumin to evaluate if AGEs are implicated in the modulation of expression of the target genes. As a result we found that (1) TXNIP and TXN are upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and TXNIP is associated with the magnitude of glomerular filtration rate decline; (2) TXNIP and TXN are upregulated in PLMN cells from T1D patients; (3) SLC19A2 is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease; (4) T1D patients present decreased plasmatic thiamine concentrations compared to control subjects; (5) B2M is upregulated in the urinary sediment of T1D patients with kidney disease and (6) TXNIP and B2M are upregulated in human kidney cells exposed concomitantly to high glucose concentrations and glycated albumin. The results of the present study strongly suggest the participation of the TXN system and of B2M in the pathogenesis of DN

INTRODUÇÃO: Produtos de glicação avançada (AGE) encontram-se aumentados no diabete melito e contribuem independentemente para o risco cardiovascular. O reconhecimento dos AGE pelo receptor para produtos de glicação avançada (RAGE) potencializa vias de sinalização pró-aterogênicas. Antagonistas do receptor de angiotensina II (ANGII) do tipo 1 (AT-1) diminuem a expressão de RAGE em área de lesão aterosclerótica. No presente projeto, avaliou-se, na aorta de camundongos dislipidêmicos (knockout para apoE) tratados ou não com inibidor do receptor AT-1 (losartana, LOS), o efeito do tratamento crônico com albumina-AGE sobre o infiltrado de lípides, a expressão de mRNA e proteínas envolvidas no eixo AGE/RAGE, ANGII/AT-1, modulação da resposta inflamatória e fluxo de lípides, além da secreção de citocinas inflamatórias por macrófagos tratados com albumina controle ou AGE, concomitantemente ou não a losartana, isolados da cavidade peritoneal de camundongos apoE knockout. MÉTODOS: Camundongos machos knockout para apoE de 12 semanas de idade foram mantidos em dieta padrão e divididos, aleatoriamente, em quatro grupos experimentais (n = 20/grupo): grupo Controle (C), C+LOS, albumina-AGE (AGE) e AGE+LOS. Os animais receberam injeção intraperitoneal diária, durante 30 dias, de 2 mg de albumina controle (grupos C e C+LOS) ou albumina AGE (AGE e AGE+LOS). Os animais C+LOS e AGE+LOS foram tratados durante todo o período experimental com losartana (100 mg/L água). Secções do arco aórtico foram utilizadas para imunofluorescência para RAGE, carboximetil-lisina (CML), AT-1 e 4-hidroxinonenal (4-HNE) e determinação infiltrado lipídico por coloração com Oil Red-O. Análise do mRNA de Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogênio) foi realizada por de qRT-PCR. Ensaio in vitro para secreção de IL-6 por ELISA e expressão de Il1b (IL-1beta) e Il18 (IL-18) por alfaRT-PCR, foi realizado com macrófagos peritoneais isolados camundongos apoE knockout incubados com albumina C ou AGE (2 mg/mL), concomitante ou não ao tratamento com losartana (1 uM). RESULTADOS: Não houve diferença entre os grupos em relação ao peso corporal, colesterol total, triglicérides e glicose plasmáticos, no período basal e final. A pressão arterial sistólica foi reduzida nos animais tratados com losartana quando comparados aos não tratados (p < 0,05). Não foi detectada a presença de infiltrado macrofágico na aorta por meio de ensaios de imunofluorescência para CD-68 e pela análise de coloração com hematoxilina-eosina. Todavia, o infiltrado de lípides foi 5,3 e 2 vezes maior no grupo AGE quando comparado, respectivamente, ao grupo C e AGE+LOS (p < 0,05). O conteúdo proteico de RAGE e CML, assim como do marcador de peroxidação lipídica (4-HNE) foi maior no grupo AGE em comparação aos demais grupos, o que não prevenido no grupo AGE+LOS (p < 0,05). A expressão do mRNA de Ager, Orl1 e Tnf foi maior no grupo AGE em comparação ao C, ao passo que o tratamento com losartana impediu o aumento da expressão destes genes (p < 0,05). Isto não foi observado para aumento de Cybb estimulado por albumina-AGE. A losartana diminuiu o mRNA de Agtr1a (AT-1) em ambos os grupos tratados. Não foram observadas diferenças na expressão do mRNA de Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt e Nfkb. Macrófagos tratados com albumina-AGE apresentaram secreção de IL-6 aumentada em 1,4 vezes em comparação ao grupo C, o que foi prevenido pela losartana (p < 0,05). Nestas mesmas células, a albumina-AGE aumentou a expressão de Il1b e Il18, em comparação à albumina-C, o que não foi prevenido pela losartana. CONCLUSÃO: A administração crônica de albumina-AGE em modelo animal de dislipidemia isento de DM, aumentou o infiltrado de lípides no aorco aórtico, independentemente de variação na pressão arterial, lípides plasmáticos e da modulação local de componentes do sistema renina-angiotensina. A ação da albumina-AGE foi consequente ao maior insulto oxidativo e inflamatório associado ao maior conteúdo de RAGE e CML. A losartana, por reduzir o insulto oxidativo e inflamatório contrapõe-se à albumina-AGE, contribuindo para prevenção da aterogênese / INTRODUCTION: Advanced glycated end-products (AGE) elevated in diabetes mellitus and independently contribute to cardiovascular risk. The AGE binding to the receptor for AGE (RAGE) potentializes pro-atherogenic signaling pathways. Antagonists of angiotensin II receptor type 1 (AT-1) diminish RAGE expression in atherosclerotic plaques. In this study, we evaluated in the aortic arch of dyslipidemic mice (apoE knockout), treated or not with AT-1 blocker losartan (LOS), the effect of chronic treatment with AGE-albumin in aortic root lipid infiltration, mRNA expression and protein content of components of AGE/RAGE, ANGII/AT-1 axes and modulators of lipid flux and inflammation, and also the secretion of inflammatory cytokines by peritoneal macrophages treated either with control (C) or AGE-albumin, together with or not by losartan treatment,. METHODS: 12-week old male apoE knockout mice were fed chow diet and ramdomly assigned into four groups (n = 20/group): Control (C), C+LOS, AGE-albumin (AGE) and AGE+LOS. Animals received daily intraperitoneal injection of 2 mg of C- albumin (C and C+LOS) or AGE-albumin (AGE and AGE+LOS) during 30 days. LOS groups were treated with losartan (100 mg/L water). Immufluorescence for RAGE, AT-1, carboxymethyllysine (CML) and 4-hydroxynonenal (4-HNE), and Oil red-O staining for lipid infiltration was performed in sections from the aortic arch. mRNA expression of Ager (RAGE), Agtr1a (AT-1), Orl1 (LOX-1), Msr1 (MCP-1), Ccl2 (SR-A), Cybb (Nox2), Nfkb (NF-kB), Tnf (TNF-alfa), Abca1 (ABCA-1), Abcg1 (ABCG-1) e Agt (angiotensinogen) was evaluated by qRT-PCR. In vitro assay for IL-6 secretion was performed by ELISA and Il1b (IL-1beta) and Il18 (IL-18) mRNA expression was performed by qRT-PCR in peritoneal macrophages from of apoE knockout mice after treatment with C or AGE-albumin (2 mg/mL), with or without losartan (1 ?M). RESULTS: No differences among groups were observed in body weight, plasma total cholesterol, triglycerides and glucose in basal and final periods. Sistolic blood pressure was reduced in both LOS groups when compared to non-treated groups (p < 0.05). It was not observed CD-68 infiltration in the arterial wall. However, lipid infiltration was, respectively, 5.3 and 2 times greater in AGE group in comparison to C and AGE+LOS groups (p < 0.05). RAGE and CML protein and the lipid peroxidation marker (4-HNE) were greater in AGE group when compared to other groups, which was prevented in AGE+LOS (p < 0.05). Ager, Orl1 and Tnf mRNA expression was increased in AGE group when compared to C, and losartan was able to prevent this event (p < 0.05), except for Cybb. Losartan decreased Agtr1a mRNA expression in both groups (p < 0.05). No differences were observed among groups for Msr1, Ccl2, Abca1, Abcg1, Agt and Nfkb mRNA expression. Macrophages treated with AGE-albumin presented 1.4 times great IL-6 secretion, which was prevented by losartan (p < 0.05). In these cells, AGE-albumin increased Il1b and Il18 mRNA expression in AGE group, but this was not prevent by losartan. CONCLUSION: Chronic administration of AGE-albumin in non diabetic dyslipidemic mice increased aortic lipid infiltration, independently of changes in blood pressutre, plasma lipids and local modulation of renin angiotensin system components. The role of AGE-albumin was consequent to the enhanced inflammatory and oxidative insult associated to the higher content of CML and RAGE. Losartan by reducing oxidation and inflammation counteracts the effects of AGE-albumin contributing to prevent atherogenesis

O papel da hiperglicemia na patogênese das complicações crônicas do diabetes mellitus tipo 1 (DM1) está bem estabelecido; um dos mecanismos propostos para explicar seus efeitos deletérios é o aumento da formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Os AGEs alteram irreversivelmente a estrutura de macromoléculas, comprometendo sua função biológica. Além disso, a interação com receptores para AGE (RAGEs) favorece vias de transdução de sinal que culminam na geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Um segundo tipo de receptor de AGEs, o AGER1 contrapõe-se à toxicidade dos AGEs, graças ao estímulo à atividade antioxidante e à redução do estresse inflamatório. Uma enzima de potencial interesse é a sirtuína 1, uma desacetilase que desempenha importante papel na resposta ao estresse e a compostos tóxicos e que parece ter sua atividade diminuída no DM, sendo negativamente modulada pelos AGEs. O sistema tiorredoxina (TXN) é um dos principais sistemas antioxidantes endógenos; a TXN é capaz de interagir com várias proteínas, tal como a TXN interacting protein (TXNIP), implicada na patogênese do DM e de suas complicações. Há poucos estudos na literatura abordando a expressão de receptores de AGEs e sua associação com complicações crônicas microvasculares no DM1. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão do mRNA dos genes que codificam o RAGE (AGER), o AGER1 (DDOST), a sirtuína 1 (SIRT1) e a TXNIP (TXNIP) pela técnica de reação em cadeia da polimerase após transcrição reversa em tempo real (RT-qPCR) em células linfomononucleares de sangue periférico de portadores de DM1 com diferentes graus de comprometimento microvascular (retinopatia diabética [RD], neuropatia autonômica cardiovascular [NAC] e nefropatia diabética [ND]). Os resultados dos genes-alvo foram normalizados pela média da expressão de dois genes controles endógenos (beta 2 microglobulina e beta actina). A expressão dos genes-alvo também foi quantificada em uma população de indivíduos controles não diabéticos (n=26, 80% do sexo feminino, idade mediana de 30 anos). Um total de 150 portadores de DM1 foi classificado em dois grupos distintos: Grupo A: pacientes sem complicações crônicas microvasculares e/ou com RD não proliferativa leve (n=68; 61,7% do sexo feminino; idade de 33 anos; idade ao diagnóstico de 12 anos; duração do DM1 de 19 anos; HbA1c de 8,1%; dados expressos em mediana) e Grupo B: pacientes com pelo menos uma das complicações microvasculares (RD não proliferativa moderada/ grave ou RD proliferativa e/ou NAC e/ou ND; n=82; 66% do sexo feminino; idade de 33 anos; idade ao diagnóstico de 11 anos; duração do DM1 de 21 anos; HbA1c de 8,2%). Fumantes não foram incluídos no estudo. As diferenças entre os grupos foram analisadas por Teste de Mann-Whitney e as correlações entre as variáveis contínuas foram avaliadas pelo teste de Spearman. Comparando-se o grupo de portadores de DM1 com o grupo controle, observou-se uma diminuição na expressão de DDOST (p=0,01) e um aumento na expressão de TXNIP (p < 0,001) no grupo DM1. Nas análises da diferença de expressão por complicação microvascular, a expressão relativa de TXNIP foi maior nos grupos A e B versus o grupo controle (p=0,01 e p=0,04, respectivamente); nos pacientes com a presença de RD não proliferativa moderada/grave e proliferativa (n=44) e naqueles com ausência de RD ou com RD não proliferativa leve (n=86) (p=0,0012 e p=0,01, respectivamente) em relação ao grupo controle; nos pacientes sem NAC (n=104) e com NAC (n=46) (p=0,03 e p=0,04, respectivamente) versus o grupo controle e por fim, em relação à taxa de filtração glomerular (TFGe) estimada, tanto os pacientes com valores <60 mL/min como aqueles com valores < 60 ml/min apresentaram maior expressão de TXNIP em relação ao grupo controle (p=0,01 e p=0,005, respectivamente). Os pacientes com ND (n=44) também apresentaram menor expressão relativa do gene DDOST (p=0,031) quando comparados aos pacientes sem ND (normoalbuminúricos, n=107) e ao grupo controle (p=0,011); os pacientes com TFGe <60 mL/min também apresentaram menor expressão de DDOST em relação ao grupo controle (p=0,03) Observou-se ainda uma correlação positiva da expressão de SIRT1 com a do AGER (? Spearman=0,51; p < 0,0001) e do DDOST (? Spearman=0,51; p < 0,0001). A expresssão de TXN correlacionou-se positivamente com a expressão de TXNIP (? Spearman=0,65; p < 0,0001), de SIRT1 (? Spearman=0,41; p < 0,0001) e de DDOST (? Spearman=0,23; p 0,004). Em um subgrupo de 30 portadores de DM1, observou-se que aqueles que consomem uma dieta rica em AGE têm maior expressão relativa de AGER (RAGE) (p=0,03). A expressão aumentada de TXNIP nas células linfomononucleares é afetada pelas anormalidades metabólicas que cursam com o DM1, mas não refletem a presença das complicações microvasculares. Por outro lado, a expressão do gene que codifica o AGER1 parece refletir o acometimento renal, já que está diminuída nos pacientes com ND e naqueles com TFGe < 60 mL/min/1,73m2 / The role of hyperglycemia in the pathogenesis of chronic complications of type 1 diabetes (T1D) is well established; one of the mechanisms proposed to explain its deleterious effects is the increased formation of advanced glycation end products (AGEs). AGEs irreversibly alter macromolecule structure, compromising its biological function. In addition, AGEs interact with its specific receptor RAGE (encoded by AGER) leading to the generation of reactive oxygen species (ROS). The AGER1 receptor (encoded by DDOST) counteracts RAGE signaling by stimulating cellular antioxidants and reducing inflammatory stress. An enzyme of potential interest is sirtuin 1, a deacetylase that plays an important role in the response to stress and to toxic compounds that may have their activity decreased in diabetes, being negatively modulated by AGEs. The Thioredoxin (TXN) system is a major endogenous antioxidant system; TXN is able to interact with several proteins, such as TXN interacting protein (TXNIP), implicated in the pathogenesis of diabetes and its complications. There are few studies addressing the expression of AGEs receptor and its association with microvascular chronic complications in T1D. The objectives of this study were to evaluate mRNA expression of the genes encoding RAGE (AGER), AGER1 (DDOST), sirtuin 1 (SIRT1) and TXNIP (TXNIP) (quantitative RT-PCR with the use of TaqMan probes) in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of T1D patients with diferent degrees of microvascular complications (retinopathy [DR], cardiovascular autonomic neuropathy [CAN] and nephropathy [DN]). The results of the target genes were normalized by the mean expression of two housekeeping genes (beta 2-microglobulin and beta actin). A total of 130 patients with T1D was sorted into two groups: Group A: patients without microvascular chronic complications or presenting mild non-proliferative DR (n = 68; 61.7% female; age 33; age at diagnostic 12; DM1 duration of 19 years, HbA1c 8.1%, data expressed as median), and Group B: patients with at least one of microvascular complication (moderate/severe non-proliferative DR or proliferative DR or CAN or ND; n = 82; 66% female; age 33 years; age at diagnosis of 11 years; duration of T1D of 21 years, HbA1c 8.2%; data expressed as median). Smokers were excluded from the study. Differences between groups were analyzed by Mann-Whitney test and correlations between continuous variables were assessed using Spearman\'s test. T1D patients presented, respectively, higher and lower relative expression of TXNIP (p<0.001) and DDOST (p=0.01) in comparison to the control group. In the analyses considering diabetes complications, TXNIP expression was higher in Groups A and B (p=0.01 and p=0.04, respectively) versus the control group. Patients with proliferative or moderate/severe non-proliferative DR (n=44) and also patients with mild non-proliferative DR or without DR (n=86) presented higher TXNIP expression versus the control group (p=0.0012 and p=0.01, respectively). Patients without (n=104) and with (n=46) CAN presented higher TXNIP expression than the control group (p=0.03 and p=0.04, respectively); finally, concerning estimated glomerular filtration rate (eGFR), both the group of patients with values <60 mL/min and < 60 ml/min presented higher TXNIP expression versus the control group (p=0.01 and p=0.005, respectivamente). Patients presenting DN (n=44) had a lower DDOST expression in comparison to patients without DN (n=107) (p=0.031) and to the control group (p=0.011); patients with eGFR <60 mL/min also presented a lower expression of DDOST in comparison to the control group (p=0.03). A positive correlation was observed between expression of SIRT1 and AGER (? Spearman=0=51; p < 0.0001) and between expression of SIRT1 and DDOST (? Spearman=0,51; p < 0.0001). The expression of TXN positively correlated with the expression of TXNIP (p Spearman=0.65; p < 0.0001), SIRT1 (p Spearman=0.41; p < 0.0001) and DDOST (p Spearman=0.23; p 0.004). In a subgroup of 30 T1D patients, a higher expression of the gene encoding RAGE was observed in those patients consuming a diet enriched in AGEs (p=0.03). Expression of TXNIP in PBMC is affected by the metabolic abnormalities of T1D but does not reflect the presence of microvascular complications while expression of the gene encoding AGER1 seems to reflect diabetic kidney impairment since it is decreased in patients with DN and in patients with an eGFR < 60 mL/min/1.73m2

O depósito de amilina é um achado histopatológico frequente em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) e parece estar relacionado à disfunção da célula beta pancreática característica desta doença. Um estudo previamente desenvolvido em nosso laboratório verificou que oligômeros de amilina humana provocam diminuição na expressão do mRNA do gene que codifica o receptor do hormônio incretínico peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (Gipr) e aumento do índice de apoptose em ilhotas pancreáticas de rato mantidas em cultura. Considerando o importante papel do depósito amilóide e das incretinas na fisiopatologia do DM 2, os objetivos deste trabalho foram investigar (1) o efeito da amilina humana sobre a expressão dos receptores de incretinas e (2) a modulação de seu efeito tóxico por outras condições concomitantes presentes no DM, como a lipotoxicidade e os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Para isto, foi realizada a avaliação da expressão do mRNA dos genes Gipr e Glp1r (receptor do peptídeo semelhante ao glucagon) por PCR em tempo real em ilhotas expostas apenas aos oligômeros de amilina humana (10 M) por 4 e 8 h e em ilhotas expostas aos oligômeros e ao palmitato (0,5 mM) por 24 e 48 h; avaliação da expressão das proteínas GIPR e GLP1R por Western blot em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina por 12 h; e avaliação do índice de apoptose pela quantificação da atividade de caspase 3 em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina isoladamente, ou na presença de palmitato (0,5mM) por 48 h ou 5 mg/ml de albumina glicada (AlbGAD) por 72 h. A amilina não provocou alteração na expressão dos genes Gipr e Glp1r após 4 h de exposição. Após 8 e 24 h de tratamento, os oligômeros modularam negativamente a expressão destes genes. Entretanto, o tratamento das ilhotas com amilina por 48 h resultou no aumento da expressão do mRNA dos receptores de incretinas. O tratamento simultâneo com palmitato não alterou o efeito modulatório da amilina sobre a expressão dos genes Gipr e Glp1r após 24 e 48 h. A exposição das ilhotas aos oligômeros de amilina por 12 h não causou alteração na expressão das proteínas GIPR e GLP1R. A lipotoxicidade e a albumina glicada não aumentaram o efeito pró-apoptótico da amilina sobre as ilhotas pancreáticas. Em conclusão, a redução na expressão gênica dos receptores de incretinas em ilhotas pancreáticas de rato expostas aos oligômeros de amilina, que poderia indicar um mecanismo adicional pelo qual a amilina exerceria seu efeito deletério sobre células beta, diminuindo o efeito insulinotrópico induzido pelas incretinas em pacientes com DM 2, não foi constatada em relação à expressão protéica de GIPR e GLP1R no período de tempo estudado. O aumento na expressão do mRNA destes receptores provocado pela amilina após 48 horas de incubação poderia ser um mecanismo de compensação das células frente aos efeitos tóxicos dos oligômeros de amilina. O efeito próapoptótico da amilina humana sobre as células beta não parece ser potencializado pela lipotoxicidade ou por AGEs / The amyloid deposit is a common histopathological feature in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and it seems to be related to the pancreatic beta cell dysfunction characteristic of this disease. A study previously developed in our laboratory found that human amylin oligomers decrease mRNA expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (Gipr) and increase apoptosis rate in rat pancreatic islets maintained in culture. Considering the important role of the amyloid deposition and of incretins in the pathophysiology of T2DM, the aims of the present study were to investigate (1) the effect of human amylin on the expression of incretin receptors and (2) the modulation of amylin toxicity by other concomitant conditions present in T2DM, as lipotoxicity and advanced glycation end products (AGEs). The evaluation of mRNA expression of Gipr and Glp1r (glucagonlike peptide -1 receptor) was performed by real time PCR in islets exposed only to human amylin oligomers (10 M) for 4 and 8 h, and in islets exposed to human amylin and palmitate (0,5 mM) for 24 and 48 h; GIPR and GLP1R protein expression was assessed by Western blot in islets treated with amylin oligomers by 12 h; apoptosis rate was evaluated by measuring caspase 3 activity in islets treated with amylin alone or combined to palmitate (0,5 mM) for 48 h or 5 mg/mL of glycated albumin (AlbGAD) for 72 h. Amylin did not affect the expression of Gipr and Glp1r mRNA following 4 h of exposure. Eight and 24 h after treatment, amylin negatively modulated the expression of these genes. However, treatment of the islets for 48 h with amylin elicited an increase in mRNA expression of both incretin receptors. The simultaneous treatment with palmitate did not change the effects of amylin on the expression of Gipr and Glp1r mRNA after 24 and 48 h. Exposure of islets to amylin for 12 h caused no change in GIPR and GLP1R protein expression. Lipotoxocity and glycated albumin did not increase the pro-apoptotic effect of amylin on pancreatic islets. In conclusion, the reduction in mRNA expression of the incretin receptors on rat pancreatic islets exposed to amylin, which could indicate an additional mechanism whereby amylin exert its deleterious effect on beta cells, reducing the insulinotropic effects of incretins in patients with T2DM was not confirm regarding GIPR and GLP1R protein expression at the time period studied. The increased mRNA expression of these receptors caused by amylin after 48 h of incubation could be a compensation mechanism against the toxic effects of amylin oligomers. The pro-apoptotic effect of amylin on human beta cells does not appear to be potentiated by lipotoxicity or by advanced glycation end products

A perda da função das células beta acelera a deterioração do controle metabólico em pessoas com diabetes tipo 2. Além da lipo- e da glicotoxicidade, os AGEs parecem contribuir para esse processo, promovendo a apoptose das ilhotas pancreáticas. Em outros tecidos, os AGEs interagem com seu receptor específico (RAGE), produzindo espécies reativas de oxigênio (ROS) e ativando o NF-kB. Para investigar o efeito temporal dos AGEs sobre a apoptose de ilhotas, bem como o potencial de compostos antioxidantes para diminuir danos causados pelos AGEs, ilhotas pancreáticas de ratos foram tratadas durante 24, 48, 72, 96 e 120 h com AGEs gerados a partir de co-incubação de albumina de soro bovino (BSA) com Dgliceraldeído (GAD, 5 mg/mL) ou tampão fostato (controle). A apoptose foi avaliada pela quantificação do DNA fragmentado (ELISA), atividade de caspase 3 e detecção da permeabilidade da membrana mitocondrial (MitoProbe JC-1). O estresse oxidativo foi avaliado pela detecção de espécies de oxigênio (Image-iT LIVE Green) e a atividade da NADPH oxidase foi mensurada pelo método de quimioluminescência da lucigenina. A expressão dos genes Bax, Bcl2 e Nfkb1 foi avaliada por reação em cadeia da polimerase quantitativa após transcrição reversa (RT-qPCR). Em um dos tempos em que foi detectado o aumento da apoptose, o efeito de dois compostos antioxidantes foi avaliado: benfotiamina (350 M), uma vitamina B1 lipossolúvel, e Mito Q (1 M), um derivado da ubiquinona com alvo seletivo para a mitocôndria. Em 24 e 48 h, os AGES promoveram um aumento do índice de apoptose em relação ao controle, concomitantemente com o aumento na expresssão do gene Bcl2 (gene anti-apoptótico) e uma redução na expressão do gene Nfkb1. Em contraste, após 72, 96 h e 120 h, os AGEs promoveram um aumento do índice de apoptose em comparação com a condição de controle, concomitantemente com uma diminuição na expressão do gene Bcl2 e um aumento na expressão do gene Nfkb1. Em 24 h, os AGEs promoveram uma diminuição do conteúdo de ROS nas ilhotas, enquanto que nos tempos de 48 e 72 h, os AGEs promoveram um efeito oposto. A benfotiamina e o Mito Q foram capazes de diminuir o índice de apoptose e o estresse oxidativo de ilhotas expostas aos AGEs por 72 h. Em conclusão, os AGEs exerceram um duplo efeito em cultura de ilhotas pancreáticas, sendo de proteção contra a apoptose após exposição curta, mas pró-apoptótica após exposição prolongada. O Mito Q e e a benfotiamina merecem ser adicionalmente estudados como drogas com o potencial de oferecer proteção às ilhotas pancreáticas em condições de hiperglicemia crônica / Loss of beta cell function hastens the deterioration of metabolic control in people with type 2 diabetes. Besides lipo- and glucotoxicity, AGEs seem to contribute to this process by promoting islet apoptosis. In other tissues, AGEs interact with their specific receptors (RAGE) and elicit reactive oxygen species (ROS) generation and NF-kB activation. In order to investigate the temporal effect of AGEs on islet apoptosis as well as the potential of antioxidant compounds to decrease islet damage caused by AGEs, rat pancreatic islets were treated for 24, 48, 72, 96 and 120 h with either AGEs generated from co-incubation of bovine serum albumin (BSA) with D-glyceraldehyde (GAD, 5 mg/mL) or phosphate-buffered saline (PBS, control). Apoptosis was evaluated by quantification of DNA fragmentation (ELISA), caspase-3 enzyme activity and detection of mitochondrial permeability transition (MitoProbe JC-1). Oxidative stress was evaluated by oxygen species detection (Image-iT LIVE Green) and the activity of NADPH oxidase was measured by the lucigenin-enhanced chemiluminescence method. The expression of the genes Bax, Bcl2 and Nfkb1 was evaluated by reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR). In one of the time points at which increased apoptosis was detected, the effect of two antioxidant compounds was evaluated: benfotiamine (350 M), a liposoluble vitamin B1, and Mito Q (1 M), a derivative of ubiquinone targeted to mitochondria. In 24 and 48 h, AGEs elicited a significant decrease in the apoptosis rate in comparison to the control condition concomitantly with a significant increase in the RNA expression of the antiapoptotic gene Bcl2 and a significant decrease in the Nfkb1 RNA expression. In contrast, after 72 and 96 h, AGEs promoted a significant increase in the apoptosis rate in comparison to the control condition concomitantly with a significant decrease in Bcl2 RNA expression and a significant increase in Nfkb1 RNA expression. In 24 h, AGEs elicited a significant decrease in the islet content of ROS while after 48 and 72 h, AGEs promoted an opposite effect. Benfotiamine and Mito Q were able to decrease the apoptosis rate and the ROS content in islets exposed to AGEs for 72 h. In conclusion, AGEs exerted a dual effect in cultured pancreatic islets, being protective against apoptosis after short exposition but proapoptotic after prolonged exposition. Mito Q and benfotiamine deserve further evaluation as drugs that could offer islet protection in conditions of chronic hyperglycemia

O depósito de amilina é um achado histopatológico frequente em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 2 (DM 2) e parece estar relacionado à disfunção da célula beta pancreática característica desta doença. Um estudo previamente desenvolvido em nosso laboratório verificou que oligômeros de amilina humana provocam diminuição na expressão do mRNA do gene que codifica o receptor do hormônio incretínico peptídeo insulinotrópico dependente de glicose (Gipr) e aumento do índice de apoptose em ilhotas pancreáticas de rato mantidas em cultura. Considerando o importante papel do depósito amilóide e das incretinas na fisiopatologia do DM 2, os objetivos deste trabalho foram investigar (1) o efeito da amilina humana sobre a expressão dos receptores de incretinas e (2) a modulação de seu efeito tóxico por outras condições concomitantes presentes no DM, como a lipotoxicidade e os produtos finais de glicação avançada (AGEs). Para isto, foi realizada a avaliação da expressão do mRNA dos genes Gipr e Glp1r (receptor do peptídeo semelhante ao glucagon) por PCR em tempo real em ilhotas expostas apenas aos oligômeros de amilina humana (10 M) por 4 e 8 h e em ilhotas expostas aos oligômeros e ao palmitato (0,5 mM) por 24 e 48 h; avaliação da expressão das proteínas GIPR e GLP1R por Western blot em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina por 12 h; e avaliação do índice de apoptose pela quantificação da atividade de caspase 3 em ilhotas tratadas com oligômeros de amilina isoladamente, ou na presença de palmitato (0,5mM) por 48 h ou 5 mg/ml de albumina glicada (AlbGAD) por 72 h. A amilina não provocou alteração na expressão dos genes Gipr e Glp1r após 4 h de exposição. Após 8 e 24 h de tratamento, os oligômeros modularam negativamente a expressão destes genes. Entretanto, o tratamento das ilhotas com amilina por 48 h resultou no aumento da expressão do mRNA dos receptores de incretinas. O tratamento simultâneo com palmitato não alterou o efeito modulatório da amilina sobre a expressão dos genes Gipr e Glp1r após 24 e 48 h. A exposição das ilhotas aos oligômeros de amilina por 12 h não causou alteração na expressão das proteínas GIPR e GLP1R. A lipotoxicidade e a albumina glicada não aumentaram o efeito pró-apoptótico da amilina sobre as ilhotas pancreáticas. Em conclusão, a redução na expressão gênica dos receptores de incretinas em ilhotas pancreáticas de rato expostas aos oligômeros de amilina, que poderia indicar um mecanismo adicional pelo qual a amilina exerceria seu efeito deletério sobre células beta, diminuindo o efeito insulinotrópico induzido pelas incretinas em pacientes com DM 2, não foi constatada em relação à expressão protéica de GIPR e GLP1R no período de tempo estudado. O aumento na expressão do mRNA destes receptores provocado pela amilina após 48 horas de incubação poderia ser um mecanismo de compensação das células frente aos efeitos tóxicos dos oligômeros de amilina. O efeito próapoptótico da amilina humana sobre as células beta não parece ser potencializado pela lipotoxicidade ou por AGEs / The amyloid deposit is a common histopathological feature in patients with type 2 diabetes mellitus (T2DM) and it seems to be related to the pancreatic beta cell dysfunction characteristic of this disease. A study previously developed in our laboratory found that human amylin oligomers decrease mRNA expression of the glucose-dependent insulinotropic polypeptide receptor (Gipr) and increase apoptosis rate in rat pancreatic islets maintained in culture. Considering the important role of the amyloid deposition and of incretins in the pathophysiology of T2DM, the aims of the present study were to investigate (1) the effect of human amylin on the expression of incretin receptors and (2) the modulation of amylin toxicity by other concomitant conditions present in T2DM, as lipotoxicity and advanced glycation end products (AGEs). The evaluation of mRNA expression of Gipr and Glp1r (glucagonlike peptide -1 receptor) was performed by real time PCR in islets exposed only to human amylin oligomers (10 M) for 4 and 8 h, and in islets exposed to human amylin and palmitate (0,5 mM) for 24 and 48 h; GIPR and GLP1R protein expression was assessed by Western blot in islets treated with amylin oligomers by 12 h; apoptosis rate was evaluated by measuring caspase 3 activity in islets treated with amylin alone or combined to palmitate (0,5 mM) for 48 h or 5 mg/mL of glycated albumin (AlbGAD) for 72 h. Amylin did not affect the expression of Gipr and Glp1r mRNA following 4 h of exposure. Eight and 24 h after treatment, amylin negatively modulated the expression of these genes. However, treatment of the islets for 48 h with amylin elicited an increase in mRNA expression of both incretin receptors. The simultaneous treatment with palmitate did not change the effects of amylin on the expression of Gipr and Glp1r mRNA after 24 and 48 h. Exposure of islets to amylin for 12 h caused no change in GIPR and GLP1R protein expression. Lipotoxocity and glycated albumin did not increase the pro-apoptotic effect of amylin on pancreatic islets. In conclusion, the reduction in mRNA expression of the incretin receptors on rat pancreatic islets exposed to amylin, which could indicate an additional mechanism whereby amylin exert its deleterious effect on beta cells, reducing the insulinotropic effects of incretins in patients with T2DM was not confirm regarding GIPR and GLP1R protein expression at the time period studied. The increased mRNA expression of these receptors caused by amylin after 48 h of incubation could be a compensation mechanism against the toxic effects of amylin oligomers. The pro-apoptotic effect of amylin on human beta cells does not appear to be potentiated by lipotoxicity or by advanced glycation end products