Le virus influenza a (via) est responsable d'epidemies annuelles et de pandemies sporadiques. un element clef, impactant a la fois la replication du virus et les symptomes de l'hote, est la reponse immunitaire innee. le via perturbe les voies metaboliques des cellules infectees, notamment la macroautophagie. la macroautophagie, par la suite appelee simplement autophagie, est une voie du catabolisme cellulaire. l'autophagie est constitutive dans les cellules nucleees et participe au maintien de l'homeostasie cellulaire. en reponse a un stress cellulaire, l'autophagie peut etre stimulee. un grand nombre de virus perturbe l'autophagie, soit en la stimulant, soit en l'inhibant. le via induit l'autophagie mais inhibe sa phase finale, un mecanisme impliquant sa proteine de matrice 2 (m2). les impacts de cette perturbation de l'autophagie sur la replication virale et sur la reponse de la cellule hote sont encore peu compris. au cours de ma these, j'ai developpe des modeles cellulaires dans lesquels la capacite d'autophagie peut etre specifiquement restauree dans des lignees cellulaires autrement incapables d'autophagie. l'utilisation de ces modeles m'a permis de montrer que l'autophagie ne change ni l'infectiosite du virus ni si capacite de replication intracellulaire mais inhibe l'induction de l'interferon-β et des genes induits par celui-ci. j'ai mis en evidence que m2 n'inhibe la phase finale de l'autophagie que dans le cadre de l'infection et de l'activation de l'apoptose. une meilleure comprehension des perturbations de l'autophagie pourrait permettre de developper des molecules antivirales et de nouveau virus attenues induisant une plus forte reponse immunitaire. / Influenza a virus (iav) is responsible for yearly epidemics and sporadic pandemics. understanding the mechanism by which the inflammatory response is mounted and controlled is key to manage the disease. iav perturbs a variety of metabolic pathways including macroautophagy. macroautophagy, hereafter referred to as autophagy, is a catabolic pathway that is active in all nucleated cells. in stress condition, autophagic activity can be increased. a variety of viruses perturb autophagy. iav has been described to both induce autophagy and block its completion mainly through its matrix protein 2 (m2). however, the impact of such perturbation on viral replication and host cell response to infection is still unknown. i developed cellular models in which autophagy capacity can be specifically restored in cell lines that are otherwise autophagy-incompetent. using these models, i showed that autophagy does not impact iav infection and replication but inhibits interferon-β induction at early stages post infection, leading to dampened induction of interferon-stimulated genes. i showed that m2 does not prevent autophagy completion by itself but only in the context of iav in a caspase-activation dependent fashion. in summary, my thesis work, using these novel autophagy models, revealed that early autophagy induction post-iav infection inhibits ifn-β, leading to a global decrease in interferon stimulated gene expression. indeed, sustained autophagy perturbation through m2 may allow iav to limit the ifn-β response throughout its life cycle. preventing m2-mediated autophagy perturbation may allow us to develop new antiviral strategies as well as new live attenuated iav vaccines.

Durant l’infection par le virus Influenza A (IAV), les changements physiques et immunologiques du poumon prédisposent l’hôte aux surinfections bactériennes. Les cellules T Natural Killer invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T innés pouvant avoir des rôles bénéfiques ou délétères durant l’infection. Nos objectifs ont visé à (i) étudier le rôle naturel des cellules iNKT et (ii) à rechercher l’effet d’une activation exogène des cellules iNKT dans la surinfection bactérienne post-influenza.Lors de mon arrivée, le laboratoire venait de décrire, pour la première fois en contexte infectieux, que les cellules iNKT étaient capables de produire de l’IL-22 au cours de l’infection grippale. Cette cytokine joue un rôle majeur dans les processus de maintien et de réparation des épithéliums. L’une des causes des surinfections bactériennes post-grippales étant l’altération et/ou la perte de l’intégrité de l’épithélium pulmonaire, nous nous sommes proposés d’étudier le rôle potentiel de cette cytokine dans un modèle expérimental de surinfection bactérienne à S. pneumoniae. Nous avons ainsi pu montrer que si cette cytokine ne joue pas un rôle majeur dans la réponse anti-virale de l’hôte, l’IL-22 participe au contrôle de l’inflammation au cours de l’infection grippale et joue un rôle protecteur dans la surinfection bactérienne.Par ailleurs, l’utilisation de souris dépourvues en cellules iNKT (Jα18-/-) a permis de montrer que les cellules iNKT limitent la susceptibilité aux surinfections et réduisent le synergisme létal de la coinfection virus/bactérie. Au moment de l’infection bactérienne, les cellules iNKT des souris grippées sont incapables de produire de l’IFN-γ, cytokine dont nous avons montré le rôle essentiel dans les mécanismes de défense antibactérienne. Le défaut d’activation des cellules iNKT chez les souris surinfectées est lié à l’interleukine-10 (IL-10), cytokine immunosuppressive induite par l’infection virale, plutôt qu’à un défaut intrinsèque des cellules iNKT. L’IL-10 inhibe l’activation des cellules iNKT en réponse au pneumocoque en inhibant la production d’IL-12 par les cellules dendritiques dérivées de monocytes (MoDCs). La neutralisation de l’IL-10 restaure l’activation des cellules iNKT et augmente la résistance à la surinfection. Ainsi, les cellules iNKT ont un rôle bénéfique (en amont de la colonisation bactérienne) dans le contrôle de la surinfection bactérienne de la grippe et représentent une cible de l’immunosuppression.Nous avons par la suite étudié la possibilité que le superagoniste des cellules iNKT, l’ α-galactosylceramide (α-GalCer) puisse limiter la surinfection bactérienne. Pour cela, les souris ont été traitées par voie intranasale avec de l’α-GalCer à différents temps post-influenza, juste avant l’infection par le pneumocoque. Le traitement à jour 3, au pic de la réplication virale, limite fortement la surinfection. Cependant, l’inoculation d’α-GalCer pendant la phase aiguë du virus (jour 7) ne permet pas d’activer les cellules iNKT pulmonaires et n’a pas d’effet sur la surinfection. L’absence d’activation des cellules iNKT n’est pas intrinsèque et est associée à une disparition complète des cellules dendritiques CD103+ respiratoires (cDCs), lesquelles sont cruciales dans l’activation des cellules iNKTs. À des temps plus tardifs (jour 14), les cDCs repeuplent le poumon et l’α-GalCer promeut l’activité antibactérienne des cellules iNKT.Pris dans son ensemble, cette étude souligne le rôle des cellules iNKT dans la surinfection bactérienne de la grippe et ouvre de nouvelles voies thérapeutiques afin de limiter les surinfections bactériennes post-influenza. / XDurant l’infection par le virus Influenza A (IAV), les changements physiques et immunologiques du poumon prédisposent l’hôte aux surinfections bactériennes. Les cellules T Natural Killer invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T innés pouvant avoir des rôles bénéfiques ou délétères durant l’infection. Nos objectifs ont visé à (i) étudier le rôle naturel des cellules iNKT et (ii) à rechercher l’effet d’une activation exogène des cellules iNKT dans la surinfection bactérienne post-influenza.Lors de mon arrivée, le laboratoire venait de décrire, pour la première fois en contexte infectieux, que les cellules iNKT étaient capables de produire de l’IL-22 au cours de l’infection grippale. Cette cytokine joue un rôle majeur dans les processus de maintien et de réparation des épithéliums. L’une desDuring the infection by the virus Influenza A ( IAV), the physical and immunological changes of the lung predispose the host to the bacterial secondary infections. The invariant cells(units) T Natural Killer iNKT ) are lymphocytes T innate being able to have beneficial or noxious roles during the infection. Our objectives aimed at i) to study the natural role of cells(units) iNKT and ii) to look for the effect of an exogenous activation of cells(units) iNKT in the bacterial secondary infection post-influenza. During my arrival, the laboratory had just described, for the first time in infectious context, that cells(units) iNKT were capable of producing of IL-22 during the flu-like infection. This cytokine plays a major role in the processes of preservation and repair of epitheliums [...]

Lors de la réplication du virus de la grippe, la protéine de matrice M1 prend part au transport des complexes vRNP. Elle interagit également avec les queues cytoplasmiques des protéines virales membranaires et la membrane plasmique de la cellule hôte au site d'assemblage, et est responsable de la structure de la particule virale. Le domaine N-terminal de M1, composé des 164 premiers acides aminés, possède deux motifs basiques exposés : un signal de localisation nucléaire (NLS, 101-105) sur l'hélice 6 et un triplet d'arginines (76-78) sur l'hélice 5. L'objectif de cette thèse était d'étudier (1) le rôle de ce domaine basique, en comparaison avec le NLS, dans l'accrochage membranaire de M1 et dans l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1pdm2009 et (2) de définir dans notre système expérimental cellulaire les protéines virales requises pour la production de VLP (Virus Like Particles) de la grippe contenant M1. In vitro, par des tests de cosédimentation de protéines recombinantes M1 (domaine N-terminal) sauvages ou mutées avec des LUVs (Large Unilamellar Vesicles) contenant des lipides chargés négativement, il fut possible d'observer que les domaines basiques (NLS et triplet d'arginines) sont impliqués dans l'interaction M1-membranes biomimétiques, via une interaction électrostatique entre M1 et les lipides chargés négativement (comme la PS). In cellulo, nous avons pu observer que M1, lorsqu'elle est exprimée seule, ne s'accroche pas de manière efficace à la membrane. Par contre, lorsque M2 et NS1/NEP sont coexprimées, la fraction de M1 liée aux membranes est dix fois plus importante. De plus, la coexpression de M1, M2 et NS1/NEP nous permet d'observer la production de VLP par Western blot et AFM (Atomic Force Microscopy), même en absence des glycoprotéines d'enveloppe HA et NA. Par mutagenèse dirigée, nous avons pu observer que les résidus chargés négativement de la queue cytoplasmique de M2 sont nécessaires à la localisation membranaire de M1 et à la production de VLP, comme décrits dans la littérature. De manière intéressante, quand un mutant du triplet d'arginines est exprimé, il y a trois fois moins de M1 accrochée aux membranes (M1 reste cytosolique), et la production de VLP est fortement diminuée. Un mutant du NLS diminue également l'accrochage membranaire de M1 mais seulement de 10%. Ces domaines basiques, et plus particulièrement le triplet d'arginines, semblent donc être impliqués dans des interactions électrostatiques entre M1 et les lipides chargés de la membrane, ou M1 et les résidus chargés de la queue cytoplasmique de M2, ou les deux. L'ensemble de ces travaux apporte une nouvelle vision moléculaire de l'assemblage du virus de la grippe A/H1N1. / The M1 matrix protein, lying beneath the viral lipid envelop, plays many roles in influenza virus assembly. Not only it structures the viral particle but it also associates to the vRNP complexes in the nucleus and it supposedly binds to the cell plasma membrane and to the cytoplasmic tails of the viral membrane proteins at the assembly site. M1 N-terminal domain, composed of 164 amino acids, exhibits two basic domains: the NLS (Nuclear Localization Signal) on helix 6 and a triplet of arginines on helix 5. We decided to investigate the role of those basic domains regarding the molecular assembly mechanism of the influenza A/H1N1pdm2009 virus and the attachment of M1 at the cell membrane. In vitro, we observed that when the triplet of arginines is mutated, the percentage of M1 bound to LUVs (Large Unilamellar Vesicles) containing negatively charged lipids decreases, as it is the case for a full mutant of the NLS motif. In cellulo, by using cellular fractionation, membrane flotation assays, and immunofluorescence microscopy, we observed that when expressed alone, M1 is poorly bound to the cellular membranes whereas in the presence of NS1/NEP (Non Structural protein 1 and Nuclear Export Protein) and M2 viral proteins, the M1 membrane bound fraction is increased by 10 times. M2 appears to be essential for M1 membrane localization. In order to decipher the mechanism, we used directed site mutagenesis of M1 and M2. When we mutated some negatively charged residues of the M2 cytoplasmic tail, we no longer observed either the localization of M1 at the cell membrane or VLP (Virus Like Particles) production, in agreement with the literature. In addition, when we mutated the M1 arginine triplet, M1 remained cytosolic and VLP production was almost completely abolished, even when M2 and NS1/NEP were coexpressed. Whereas a mutant of the arginine triplet decreases by 20% the percentage of M1 attached to cellular membranes, a mutant of the NLS has a mild effect (10% of decrease is observed). Thus, M1 basic domains, particularly the arginine triplet, can trigger electrostatic interactions between M1 and the lipids, or M1 and the cytoplasmic tail of M2, or both, at the viral assembly site. These results highlight the molecular mechanism of A/H1N1 influenza virus assembly.

L’épidémiologie des diarrhées aiguës (DA) hivernales a été peu décrite chez l’adulte. Ces DA sont principalement dûes à des virus entériques. Des virus influenza peuvent être détectés l’hiver dans les selles de patients grippés présentant des signes digestifs, mais on ignore s’ils peuvent être retrouvés chez des patients présentant exclusivement des troubles digestifs. Durant les hivers 2010/2011 et 2011/2012, les médecins Sentinelles (Inserm-UPMC) ont inclus 192 patients adultes consultant pour une DA et 105 patients contrôles. Un prélèvement de selles était effectué pour la recherche de norovirus (génogroupes I et II), rotavirus du groupe A, adenovirus entérique humain, astrovirus et virus influenza A(H1N1)pdm2009, A(H3N2) et B. Durant les hivers étudiés, l’incidence moyenne des DA chez l’adulte a été estimée à 3158 pour 100 000 adultes (IC 95% [2321 – 3997]). Un traitement était prescrit pour 95% des patients avec une DA, et un arrêt de travail pour 80% des patients actifs. Les examens de selles ont permis de détecter un virus entérique chez 65% des patients diarrhéiques, le plus souvent un norovirus (49%). Parmi les patients présentant une DA, 7,2% étaient positifs à un virus influenza, ces derniers n’ayant pas rapporté de signes respiratoires. Les symptômes décrits par les patients diarrhéiques adultes ne différaient pas en fonction de la présence ou absence d’un virus entérique. Les patients contrôles ne présentaient ni virus entériques ni virus influenza dans leurs selles. Aucun facteur risque évitable n’a été identifié, autre que le contact avec une personne malade au sein du foyer et/ou en dehors, rapporté chez 46,2% des patients ayant consulté pour une DA. / The epidemiology of winter acute diarrheas (AD) has not been described in adults. These AD are mainly due to enteric viruses. In winter, influenza viruses can also be detected in stools of influenza patients with digestive signs, but we don’t know if these viruses can be found in the stools of patients suffering from digestive disorders exclusively. During the 2010/2011 and 2011/2012 winters, general practitioners (GPs) from the Sentinelles network (Inserm-UPMC) included 192 adult patients consulting for an AD and 105 control patients. Stool samples were collected and tested for norovirus (genogroups I and II), group A rotavirus, human enteric adenovirus, astrovirus and influenza viruses A(H1N1)pdm2009, A(H3N2) and B.During the studied winters, the average incidence of AD in adults was estimated to be 3,158 per 100,000 adults (95% CI [2,321 – 3,997]). GPs prescribed a treatment in 95% of the patients with AD, and 80% of the working patients with AD could not go to work. Stool examinations were positive for at least one enteric virus in 65% of cases, with a predominance of noroviruses (49%). Of the patients suffuring from an AD, 7.2% tested positive for one influenza virus, none reported respiratory symptoms. Among the patients with AD, the reported clinical signs did not differ between adults with a virus in the stool sample and those with no virus found in the stool exam. None of the controls tested positive for one of the enteric and/or other influenza viruses.No preventable risk factor was identified, other than the contact with a sick person within and/or outside the household, reported by the patient in 46.2% of cases.

De nombreux pathogènes sont soupçonnés d'interagir entre eux lorsqu’ils circulent dans les populations humaines. L'effet de ces interactions entre pathogènes peut être synergique ou antagoniste. Les avancées technologiques récentes en microbiologie ont favorisé la multiplication des études sur les interactions entre pathogènes chez l’hôte humain, notamment au sein des voies respiratoires. En effet, ces interactions peuvent jouer un rôle dans la dynamique de transmission des pathogènes concernés et avoir un impact conséquent sur la santé publique. Néanmoins, hormis certains systèmes plus souvent étudiés comme l’interaction entre la grippe et le pneumocoque pour laquelle des hypothèses mécanistiques spécifiques ont été suggérées, les connaissances concernant les mécanismes biologiques à l’origine de ces interactions restent limitées. De ce fait, un nouveau champ d'étude se développe soulevant de nombreuses questions. Du point de vue de la modélisation épidémiologique, il est nécessaire de répondre aux questions suivantes : comment formaliser les mécanismes sous-jacents à ces interactions dans des modèles mathématiques ? Quelles sont les conséquences de ces interactions sur la dynamique des infections dans les populations ? Dans quelles conditions et avec quelles méthodes les détecter à partir de données écologiques d’incidence, telles que celles rapportées par les systèmes de surveillance ? L’objectif du présent travail de thèse est de répondre à ces questions à partir de méthodes de modélisation statistique et mathématique, en travaillant spécifiquement sur les interactions entre grippe et pneumocoque. Bien que peu utilisée dans ce contexte, la modélisation mathématique permet une approche globale de ces phénomènes car elle formalise le lien entre l’échelle individuelle où ils se produisent et l’échelle de la population à laquelle ils peuvent être détectés. Dans un premier temps, j’ai conçu et développé un nouveau modèle agent afin de simuler la propagation simultanée de deux pathogènes en interaction dans une population humaine. Ce modèle a permis d’étudier au niveau populationnel les conséquences des phénomènes complexes liés à ces interactions, formalisées au niveau individuel. Notamment, j’ai montré que différentes hypothèses sur les mécanismes d’interaction entre la grippe et le pneumocoque conduisaient à des dynamiques d’incidence spécifiques. Dans un second temps, j'ai simulé à partir du modèle agent précédent des données similaires à des données de surveillance, pour lesquelles les mécanismes d’interaction et leur intensité étaient contrôlés. Les méthodes statistiques et mathématiques classiquement employées dans la littérature ont été appliquées à ces données. Les résultats ont montré leur capacité à identifier des associations entre pathogènes à partir d'un certain seuil, variable selon les méthodes et les mécanismes d'interaction. Enfin, dans le cadre d’une collaboration avec le CNRP et Santé Publique France, nous avons proposé une nouvelle méthode d'analyse des interactions entre pathogènes à partir de séries temporelles, basée sur l’étude de leur saisonnalité. Cette méthode a permis d'identifier une association faible dans les données françaises de syndromes grippaux et infections invasives à pneumocoque sur la période 2000-2014. Ainsi, les résultats et développements issus de ce travail de thèse permettent, par une approche de modélisation mathématique, une meilleure compréhension de l’impact des interactions au sein de l’hôte sur la dynamique d’incidence au niveau populationnel. Du fait du grand nombre de facteurs impliqués (pathogènes, hôte, environnement), la co-circulation de pathogènes en interaction dans une population est un système complexe que la modélisation est particulièrement apte à appréhender. Une meilleure compréhension de ces phénomènes est un enjeu capital pour le futur, notamment quant au développement de mesures de santé publique globales visant à réduire le fardeau des maladies infectieuses. / Several pathogens have been suggested to interact with each other while circulating within human populations. These between-pathogen interactions may be synergistic, when one pathogen favours another, or antagonistic when one pathogen is detrimental to the other. Recent technological developments in the field of microbiology have created new opportunities for studying between-pathogen interactions within the human host, and particularly in the respiratory tract. These interactions may have dramatic consequences on the transmission dynamics of the implicated pathogens, and consequent public health impacts. However, despite some mechanistic hypotheses having been formulated, especially for the well-studied influenza-pneumococcus system, the underlying biological mechanisms are still poorly understood. This developing field raises numerous questions. From an epidemiological modelling perspective, how should these interaction mechanisms be formalized into models? How do these interactions impact the transmission dynamics and burden of the involved pathogens? Under which conditions, and with which methods can interactions be detected from ecological incidence data, classically reported from surveillance systems? The aim of this thesis is to address these questions using statistical and mathematical modelling tools, with a specific focus on the interaction between influenza and pneumococcus. While mathematical models have scarcely been used to address between-pathogen interactions, they are powerful tools that allow for a global approach by precisely formalizing the interactions at the individual scale and linking them to the population scale at which data are collected and phenomena observed. First, I conceived and developed a new agent-based model which simulates the co-circulation of two interacting pathogens in a human population. This model specifically formalizes between-pathogen interactions at the individual level, resulting in global dynamics at the population level. Notably, I demonstrated that different hypotheses regarding interaction mechanisms between influenza and pneumococcus lead to specific incidence dynamics and interaction burdens. Second, in order to construct in silico data mimicking surveillance data, I simulated a large number of interaction scenarios from the previous agent-based model. These simulated datasets were analysed using a variety of statistical and mathematical methods classically applied in between pathogen association studies. Results showed that all methods consistently detected between-pathogen associations as long as the simulated interaction strength remained above a threshold, which varied according to the method and the simulated interaction mechanism. Lastly, collaborating with the National Center for Pneumococcal Reference and Santé Publique France, we developed a new method to analyse between-pathogen interactions from incidence time series, based on the analysis of their seasonality patterns. By applying this method to French data of influenza-like illnesses and invasive pneumococcal diseases over the 2000-2014 period, we identified a small association, consistent with previous studies. The mathematical models developed and results presented in this thesis provide new understanding of the impact of between-pathogen interactions at the population level and the efficiency of available methods to assess them. Because the co-circulation of pathogens in populations is a complex system involving a large number of factors related to the pathogens, the host, and the environment, the development of mathematical models will be critical in the future. A better comprehension of these phenomena is of major importance as it may lead to new opportunities to reduce the public health burden of infectious diseases.

La grippe est une maladie infectieuse qui se traduit par des épidémies saisonnières et pandémies occasionnelles et qui a des conséquences importantes sur la santé publique. Elle est causée par le virus influenza, un virus à ARN négatif segmenté. Chaque segment du génome est transcrit et repliqué dans le noyau de la cellule hôte par la polymérase virale, une ARN polyméraseARN-dépendente. Afin de pouvoir produire un ARN messager (ARNm) viral qui peut être reconnu par la machinerie de traduction de la cellule, la polymérase de la grippe se sert d’un mécanisme appelé ‘cap-snatching’ (mécanisme de ‘vol de coiffe’). La polymérase virale intéragit avec un ARNm coiffé, produit par l’ARN polymérase II de la cellulle hôte, coupe cet ARN à proximité de la coiffe et l’utilise comme amorce pour l’initiation de la transcription de son propre matériel génétique. Par conséquence, la transcription virale est fonctionnellement liée à la transcription cellulaire. L’objet des recherches présentées dans cette thèse portait sur l’intéraction entre la polymérase de la grippe et la machinerie de transcription de la cellule hôte et plus précisément, la caractérisation structurale et fonctionelle de l’association entre la polymérase de la grippe et le domain C-terminal de l’ARN polymérase II (CTD), qui sert de support pour la coordination des processus de synthèse et les modifications post-transcriptionelles de l’ARNm. Les structures cristallographiques obtenues de la polymérase d’influenza A et B, associées aux peptides dérivés du domain CTD de l’ARN polymérase II, ont permis d’élucider comment la polymérase virale reconnait spécifiquement la polymérase cellulaire. La perturbation de cette intéraction mène à l’inhibition de l’amplification du virus, ce qui confirme que cette association est essentielle. Dans la seconde partie de la thèse, un complexe actif de ‘cap-snatching’ a été assemblé in vitro et caractérisé fonctionellement, constitué du complexe d’élongation contenant l’ARN polymérase II avec un ARNm coiffé et son domain CTD phosphorylé, lié à la polymérase virale elle-même transcriptionnellement active. De plus, l’intéraction de la polymérase virale avec deux facteurs impliqués dans la régulation de l’élongation par l’ARN polymérase II, DRB sensitivity-inducing factor et Tat stimulatory factor 1, a été caractérisée. En conclusion, le travail de thèse présenté ici a contribué à élucider le mécanisme de recrutement de la polymérase d’influenza à la machinerie de transcription cellulaire et a montré que l’association entre les polymérases virale et cellulaire est essentielle pour la réplication du virus. La perturbation de cette intéraction est une piste prometteuse pour la conception de nouveaux médicaments contre le virus influenza. / Influenza is an infectious disease causing seasonal epidemics and occasional pandemics, which are a significant health burden for the global human population. The causative agent, influenza virus, is a negative-strand segmented RNA virus. Each segment of the viral genome is transcribed and replicated by a virally-encoded RNA-dependent RNA polymerase in the nucleus of the infected cell. In order to produce a functional viral messenger RNA (mRNA) that can be processed by the cellular translation machinery, influenza polymerase employs a mechanism called‘cap-snatching’. The viral polymerase binds to a nascent, capped transcript, produced by the cellular RNA polymerase II, cleaves it shortly after the cap and uses it as a primer for the transcription of its own genomic segments. Viral transcription is therefore functionally dependent on cellular transcription. The studies described in this thesis aimed to investigate the interaction between influenza polymerase and the cellular transcription machinery. The main focus was to characterize structurally and functionally the association of influenza polymerase with the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II, which serves as a scaffold for coordinating co-transcriptional events during mRNA synthesis and processing. Crystal structures of influenza A and B polymerase bound to phosphorylated peptides mimicking the CTD of RNA polymerase II gave new insight on how the viral polymerase directly recognizes the transcribing cellular polymerase. Moreover, disrupting this interaction was found to be severely detrimental to viral replication, confirming the essentiality of this association. In the second part of this work, an active cap-snatching complex was assembled in vitro and characterized functionally. This comprised a reconstituted RNA polymerase II elongation complex with emerging capped transcript and phosphorylated CTD with bound and transcriptionally active influenza polymerase. Additionally, the interaction of the viral polymerase with two factors involved in the regulation of transcription elongation by RNA polymerase II, DRB sensitivity-inducing factor and Tat stimulatory factor 1, was analyzed biochemically. Overall, the work presented here gives insights into the mechanism of recruitment of the influenza polymerase to the cellular transcription machinery and shows that the association of the viral and cellular polymerase is essential for the viral replication. Targeted disruption of this interaction is therefore a promising avenue for the design of novel anti-influenza drugs.

OBJECTIFS : A l'automne 2009, le Québec a procédé à une vaccination de masse de sa population contre la grippe pandémique A(H1N1). Les objectifs de cette étude étaient de décrire le rehaussement du système de surveillance des manifestations cliniques indésirables (MCI) mis en place en vue de la campagne de vaccination contre 1'influenza pandémique et de comparer le profil des MCI rapportées dans le cadre de la surveillance faite durant la campagne de vaccination contre le virus pandémique H1N1 par rapport à ceux de la vaccination saisonnière des années précédentes. MÉTHODE : Pour le rehaussement de la surveillance, les données présentées ont été recueillies à partir des procès verbaux des rencontres des membres du groupe ESPRI depuis juin 2009, des conférences téléphoniques et des documents d'orientation pour le groupe. Pour la comparaison du profil des MCI rapportées dans le cadre de la surveillance faite durant la campagne de vaccination contre la grippe pandémique A(H1N1) par rapport à ceux de la vaccination saisonnière des six saisons précédentes (2003-2004, 2004-2005, 2005-2006, 2006-2007, 2007-2008 et 2008-2009), les données analysées proviennent des informations saisies au fichier ESPRI au 21 mai 2010. RÉSULTATS : Les principales modifications à la surveillance ont été la mise en place d'une surveillance spécifique du syndrome de Guillain Barré et la déclaration directe à la surveillance passive par les infirmières d'info-santé. Le vaccin pandémique a été associé à une fréquence trois plus élevée de MCI que le vaccin saisonnier soit 50,4 et 18,9 par 100 000 doses, respectivement. Les taux de chacune des MCI sont supérieurs avec le vaccin pandémique adjuvante que ceux des vaccins saisonniers. Cette augmentation s'est manifestée principalement pour les allergies (11.8 vs 4.1/100 000 doses), mais aussi pour des manifestations neurologiques de type anesthésie/paresthésie (2.5 vs 0.3/100 000 doses). CONCLUSION : Le Québec a opéré des modifications de sa surveillance des MCI lors de la campagne de vaccination massive de 2009. Bien qu'un taux plus élevé de MCI ait été rapporté, aucune MCI n'a été assez fréquente ou sévère pour mener à des modifications dans le déroulement du programme.

Les virus influenza comptent parmi les agents pathogènes les plus importants à l'origine d'infections respiratoires graves. Les antiviraux jouent un rôle important dans les infections grippales sévères. Cependant, un usage monothérapeutique de l'oseltamivir (OS), un inhibiteur de la neuraminidase (INA), chez les personnes immunosupprimées (IS) favorise l'émergence fréquente de résistance à ce médicament, ce qui entraîne une mortalité importante chez les individus IS. En revanche, les inhibiteurs du complexe polymérase (baloxavir marboxil (BXM) et/favipiravir (FA)) n'ont pas été bien étudiés en tant que traitement chez les hôtes IS. Par conséquent, une nouvelle stratégie thérapeutique permettant d'éradiquer rapidement les virus influenza chez les patients IS est nécessaire. La combinaison d'antiviraux ciblant différentes étapes du cycle de vie viral peut augmenter l'efficacité antivirale et réduire la fréquence de la résistance aux médicaments par rapport à la monothérapie. Nous avons, dans un premier temps, adapté une souche contemporaine A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) chez des souris C57BL/6 après 15 passages. La caractérisation moléculaire du variant adapté a démontré que la combinaison des mutations dans les gènes PA (K615E) et HA (N122D, N144E, N246K et A304T) constituent des marqueurs important de virulence dans ce modèle. Dans un second temps, nous avons évalué l'efficacité de la combinaison d'OS avec des inhibiteurs de polymérase (BXM et/ou FA) contre le virus influenza A/H3N2 chez des souris pharmacologiquement IS. Nous avons trouvé que les approches de monothérapies avec l'OS ou le FA ont seulement retardé la mortalité, alors qu'un effet synergique sur la survie (80 % de survie) et une réduction des titres viraux pulmonaires ont été observés dans le groupe de la thérapie combinée (OS/FA) comparativement à l'OS. Le BXM simple ou en combinaison avec l'OS et/ou FA a engendré une protection complète (100 % de survie) et une réduction significative des titres viraux pulmonaires. Nous avons également observé que les traitements monothérapeutiques avec l'OS et le BXM ont induit les mutations E119V dans et I38T dans les gènes de la neuraminidase et de la polymérase acide (PA), respectivement, alors que les combinaisons n'ont pas induit de mutation de résistance. Mon projet de thèse démontre que le régime thérapeutique à doses multiples du BXM seul offrait des avantages supérieurs à ceux des monothérapies à base d'OS et de FA contre les virus A/H3N2. De plus, nous avons confirmé le potentiel de la thérapie combinée pour réduire le risque d'émergence de la résistance au sein des populations IS. Le BXM, approuvé en octobre 2018 par la FDA, est un antiviral ciblant la PA des virus influenza. La substitution I38T dans la PA est le marqueur moléculaire de résistance au baloxavir le plus répandu chez les virus de la grippe saisonnière. Le risque pour la santé publique posé par les variants présentant une sensibilité réduite au baloxavir dépend de leur capacité à se répliquer et à se transmettre dans la communauté par rapport aux virus sensibles. Nos objectifs étaient d'étudier : (1) L'impact de la mutation PA/I38T sur la capacité réplicative et la virulence des virus A/Québec/144147/09 (H1N1) et A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) in vitro et in vivo. (2) Le potentiel de transmission par contact direct des virus A/H3N2 de type sauvage (PA/I38) et mutant (PA/I38T) dans un modèle de cochon d'inde afin de prédire la transmissibilité dans la communauté. Nous avons trouvé que la substitution PA/I38T ne modifiait pas la capacité de réplication in vitro dans les cellules ST6GalI-MDCK et A549 dans les deux backgrounds génétiques. Chez les souris, les virus A/H1N1pdm09 et A/H3N2 recombinants portant la mutation PA/I38T ont induit des titres viraux pulmonaires et des pertes de poids comparables au virus sauvage. La substitution PA/I38T-H3N2 a également induit des titres comparables à ceux des virus sauvages dans les lavages naseaux des cochons d'inde et les deux virus se sont transmis de manière équivalente par contact direct. Nous avons trouvé une légère dominance du génotype sauvage (I38) par rapport au génotype mutant (38T) chez des cochons d'inde co-infectés par des mélanges de virus de type sauvage et mutant. Cependant, chez les souris, le génotype mutant a plutôt dominé le génotype sauvage. Collectivement, les virus influenza A contemporains portant la mutation PA/I38T peuvent conserver un niveau significatif de fitness viral, ce qui justifie la surveillance de leur dissémination. / Influenza viruses are among the most important pathogens causing severe respiratory diseases. Antiviral agents are recommended for treatment of severe influenza infections. Virus clearance is usually delayed among high-risk populations, including immunosuppressed (IS) patients. To inhibit virus replication in these individuals, the prolonged use of Oseltamivir (OS), a NA inhibitor (NAI), is required, which frequently leads to the emergence of drug-resistant viruses. In contrast, polymerase inhibitors (baloxavir marboxil (BXM) and favipiravir (FA)) have not been well studied as treatment in IS individuals. Therefore, a new therapeutic strategy to rapidly eradicate influenza viruses in IS patients is needed. Combination therapy with compounds targeting multiple steps in the viral life cycle may improve treatment outcomes and prevent the emergence of resistance. First, we generated a mouse-adapted A/H3N2 virus (A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) by 15 serial passages of mouse lungs. Molecular characterization of the adapted variant demonstrated that the combination of PA (K615E) and HA (N122D, N144E, N246K and A304T) mutations were critical markers of virulence in this model. In a second step, we evaluated the efficacy of OS and polymerase inhibitors (BXM and/or FA) combinations against influenza virus A/H3N2 infections in pharmacologically IS mice. We found that all untreated animals died. OS and FA monotherapies only delayed mortality, while we observed a synergistic improvement on survival (80 %) and lungs viral titers reduction in the OS/FA group compared to OS. BXM alone or in double/triple combination provided a complete protection and significantly reduced lungs viral titers. OS and BXM monotherapies induced the NA/E119V and PA/I38T substitutions, respectively, while we did not detect mutation with combinations. Our study confirms that the multiple dose regimen of BXM alone provided superior benefits compared to OS and FA monotherapies and suggests the potential for drug combinations to reduce the incidence of resistance. BXM, licensed in 2018 by the FDA, is an antiviral targeting the highly conserved cap-dependent endonuclease region of the PA gene. The PA/I38T substitution is the most common molecular marker of BXM resistance in seasonal influenza viruses. The public health risk posed by viruses with reduced susceptibility to BXM depends on their potential capacity to replicate and transmit in the community compared to susceptible viruses. We have two principal objectives: (1) To evaluate the impact of the PA/I38T substitution on the replicative capacity and virulence of A/Quebec/144147/09 (H1N1) and A/Switzerland/9715293/2013 (H3N2) viruses in vitro and in vivo. (2) To evaluate direct contact transmission of wild-type (PA/I38) and mutant (PA/I38T) A/H3N2 viruses in a guinea pig model to predict transmission in the community. We found that the PA/I38T substitution did not alter the in vitro replication capacity in ST6GalI-MDCK and A549 cells in both genetic backgrounds (A/H1N1pdm09 and A/H3N2). In mice, recombinant A/H1N1pdm09 and A/H3N2 viruses carrying the PA/I38T substitution induced viral titers and weight losses comparable to wild-type virus. The PA/I38T-H3N2 substitution also induced titers comparable to wild-type viruses in guinea pig nasal wash samples and both viruses were transmitted equivalently by direct contact. We found a slight dominance of the wild type (I38) over the mutant (38T) genotype in guinea pigs co-infected with mixtures of wild type and mutant viruses. However, in mice, the mutant genotype rather dominated the wild type virus. Collectively, contemporary influenza A viruses carrying the PA/I38T mutation may retain a significant level of viral fitness, warranting their monitoring in the community.

La sécurité des vaccins est évaluée par le biais du système de surveillance passive des manifestations cliniques indésirables (MCI). À cause du très grand nombre de personnes vaccinées lors des campagnes massives de vaccination contre l'influenza, si un effet secondaire modérément fréquent (ex. 1/1 000 vaccinés) survenait, le délai avant que la surveillance passive ait détecté un problème serait suffisamment long pour que des millions de personnes aient été vaccinés et que des milliers aient souffert de cet effet secondaire. Lors de la vaccination de masse contre l'influenza pandémique H1N1 en 2009, un projet pilote de surveillance électronique active de la sécurité du vaccin contre l'influenza pandémique chez plusieurs milliers de travailleurs de la santé a été mis sur pied. Cette surveillance visait à évaluer très rapidement la fréquence des problèmes de santé suffisamment sévères pour causer de l'absentéisme au travail ou une consultation médicale. La présente étude a évalué la qualité de cette surveillance par le biais de ses attributs comme définis dans le cadre de référence des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) pour l'évaluation des systèmes de surveillance. Une méthodologie mixte (analyse quantitative et qualitative) a été utilisée. Les résultats montrent que la simplicité, la flexibilité, l'acceptabilité et la valeur prédictive positive (VPP) étaient des attributs plutôt acquis par le système de surveillance, mais que des déficiences étaient présentes dans le contrôle de la qualité des données, la sensibilité, la représentativité et la réactivité. Des recommandations ont été émises pour améliorer ce système, qui pourraient servir dans le cas d'une nouvelle pandémie ou s'intégrer au processus formel de surveillance de la vaccination saisonnière contre l'influenza.

Objectif de la thèse est de fournir République de Djibouti inventaire de la pandémie de grippe A/H1N1/2009-H1N1p et arbovirus hiver 2010. Elle a confirmé la capacité de surveillance locale pour détecter la grippe SG pic lors de la première vague de la pandémie, dont le profil était compatible avec H1N1p. Dans l'enquête CoPanFlu, une prévalence élevée (30%) de H1N1p a été confirmée par la jeune et District 4 résidents (plus de inégalités sociales) portant le plus lourd fardeau. Par conséquent, le contrôle futur de SG exigerait une approche queue pour atteindre des individus spécifiques et vulnérables. L'absence de données de surveillance robustes dans les pays du Sud pourrait être responsable de la sous-estimation de la charge, même lorsque le profil de la maladie ressemblait à ceux des pays développés. Sur arbovirus, la plupart des facteurs prédictifs de cas étaient statistiquement mieux décrits par de l'espace de logement et les caractéristiques environnementales du quartier, qui en corrélation avec les acteurs écologiques de leurs vecteurs de la survie des individus dans la niche locale. Cela confirme circulations arbovirus autochtones dans la République de Djibouti et a fourni l'inventaire pour la cartographie des risques et les futurs programmes de prévention et de contrôle. Les arbovirus sont les plus répandus dans le centre-ville (quartier 1), mais des cas ont diminué vers la périphérie de la banlieue (District 4). L'inverse est vrai pour les cas de grippe, ce qui démontre que des solutions sur mesure convenant à un des besoins de santé de la région, se garantir un rendement optimal sur les ressources allouées. / Thesis purpose was to provide Republic of Djibouti inventory of pandemic Influenza A/H1N1/2009 (H1N1p) and arboviruses events in the winter of 2010. The demonstrated local surveillance was capable of detecting (influenza) ILI peaking during the first pandemic wave, whose profile was consistent with H1N1p. In a Copanflu investigation that occurred during second pandemic wave, a high prevalence (30%) of H1N1p was confirmed and conspicuously, the young and District 4 residents (highest social inequalities) bored the greatest burden. Therefore, concluded that future ILI control would require a tailed approach to reach specific and vulnerable individuals. Lack of robust ILI data from surveillance in southern countries could be responsible for the underestimation of burden, even when the illness profile resembled those of developed countries. On arboviral, most case predictors were statistically best described by individuals' housing space and neighbourhood environmental characteristics, which correlated with the ecological actors of their respective transmission vectors' survival in the local niche. This study confirmed autochthonous arboviral circulations in the republic of Djibouti and provided an epidemiological inventory for risk mapping and future prevention and control programs. The arboviruses were most prevalent in city centre (District 1), but cases declined towards the periphery of the suburb (District 4). The inverse was true for pandemic and ILI cases, demonstrating that a tailored solutions suiting local area health needs, would guarantee an optimal return on allocated resources.