Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'élasticité d'une molécule d'ADN simple brin à l'aide de pinces magnétiques. Les modèles de polymères idéaux ne rendent pas bien compte de l'élasticité de cette molécule, alors qu'ils décrivent très bien l'ADN double brin. Nous avons donc étudié expérimentalement l'élasticité d'une molécule simple brin dans différentes conditions salines, i.e. d'écrantage de charges, et dans des conditions modulant les interactions internes du polymère. En utilisant des conditions dénaturantes, nous avons pu séparer les effets des différentes interactions intramoléculaires et ainsi mieux caractériser leur importance respective pour décrire l'élasticité de la molécule. Il est ressorti de ces mesures qu'une description complète de l?ADN simple brin doit prendre en compte d'une part la formation de structures secondaires à basses forces, et d'autre part les effets de volume exclu: contrairement au double brin, le simple brin est tellement flexible que les répulsions électrostatiques dues aux groupements phosphates le long de la chaîne ne peuvent plus être négligées. Des simulations numériques prenant en compte ces deux effets sont en excellent accord avec nos observations expérimentales. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons étudié l'activité de deux hélicases à l'échelle de la molécule unique. Les hélicases sont des moteurs moléculaires qui catalysent la séparation des deux brins de la double hélice d?ADN, permettant ainsi l'accès aux bases individuelles formant le code génétique. Dans notre expérience, une unique molécule d'ADN double brin était immobilisée par pinces magnétiques et son extension mesurée avec une précision de 10 nm. Ceci nous a permis de suivre l'activité des hélicases, puisque celles-ci provoquent un changement de l'extension de la molécule lorsque le double brin est converti en simple brin. Cette méthode présente l'avantage de permettre l'observation en temps réel de l'activité d'une seule protéine. L'analyse statistique des données nous a permis d'accéder aux distributions complètes de vitesse et de processivité des enzymes. Nous avons ainsi caractérisé le comportement dynamique d?hélicases uniques (leur vitesse, leur processivité, leur coopérativité et leur pas élémentaire sur l'ADN). Le suivi en temps réel de l'activité des hélicases nous a permis d'observer une instabilité dans leur mode d'ouverture, et ainsi de rendre compte de mesures de vitesse obtenues en volume.

UPF1 (Up-Frameshift 1) est une hélicase multifonctionnelle conservée chez tous les eucaryotes. Elle est essentielle à la voie de surveillance du NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay), qui dégrade des ARNm portant un codon stop prématuré. UPF1 est l’archétype d’une famille d’hélicases qui partagent des corps similaires mais sont impliquées dans des voies cellulaires variées. Cependant, les relations structure-fonction et les caractéristiques biophysiques intrinsèques de ces moteurs moléculaires restent à ce jour peu connues. In vitro, le coeur hélicase d’UPF1 est hautement processif, il traverse des milliers de bases sur l’ARN ou l’ADN et déroule des doubles brins. Dans ce travail, nous avons cherché les facteurs clés régissant cette remarquable processivité en combinant des techniques de biochimie et de biophysique. En particulier, nous avons utilisé des pinces magnétiques pour étudier en temps réel des hélicases à l’échelle de la molécule unique. Contrairement à UPF1, l’hélicase IGHMBP2 de la famille UPF1-like n’est pas processive ; la processivité n’est donc pas un trait conservé au sein de la famille. Grâce à une étude fine de la structure 3D des deux hélicases, nous avons conçu divers mutants que nous avons utilisés pour identifier les éléments structuraux qui modulent la processivité. Notre approche révèle qu’UPF1 a une prise très ferme sur les acides nucléiques, garantissant de longs temps de résidence et d’action qui dictent sa haute processivité. Grâce à la variété de comportements des mutants, nous avons construit un modèle mécanistique expliquant le lien entre énergie d’interaction et processivité. Nous démontrons aussi que la processivité d’UPF1 est requise pour un processus de NMD efficace in vivo. Nous avons utilisé les mêmes outils biochimiques et biophysiques pour étudier une isoforme naturelle d’UPF1 humaine se déplaçant plus vite que l’isoforme majeure, et pour comparer la régulation d’UPF1 humaine et de levure par leurs domaines flanquants. Nous avons également caractérisé l'interaction d’UPF1 de levure avec de nouveaux partenaires. Nos travaux montrent comment la combinaison d'outils biochimiques, biophysiques, structuraux etin vivo offre des aperçus inattendus quant au mode de fonctionnement des moteurs moléculaires. / UPF1 (Up-Frameshift 1) is a multifunctional helicase that unwinds nucleic acids and is conserved throughout the eukaryote kingdom. UPF1 is required for the Nonsense Mediated mRNA Decay (NMD) surveillance pathway, which degrades mRNAs carrying premature termination codons, among other substrates. UPF1 is the archetype of a family of 11 helicases sharing similar cores but involved in various cellular pathways. However, the structure-function relationship and intrinsic biophysical properties of these molecular engines remain poorly described. In vitro, the UPF1 helicase core is highly processive, it travels along thousands of RNA or DNA bases and unwinds double-strands. In this work, we looked for key factors governing this remarkable processivity. We combined biochemical and biophysical techniques. In particular, we used magnetic tweezers to study helicases in real time at a single molecule scale. In contrast to UPF1, the related IGHMBP2 is not processive, thus processivity is not a shared family trait. Based on the 3D structures of both proteins, we designed various mutants and used them to identify structural elements that modulate processivity. Our approach reveals that UPF1 has a very firm grip on nucleic acids, guaranteeing long binding lifetimes and action times that dictate its high processivity. Thanks to the variety in mutant behaviors, we built a novel mechanistic model linking binding energy to processivity. Furthermore, we show that UPF1 processivity is required for an efficient NMD in vivo. In addition, we used the same biochemical and biophysical tools to investigate a natural human UPF1 isoform moving faster than the major isoform, and to compare the regulation of human andyeast UPF1 by their flanking domains. We also characterized the interaction of yeast UPF1 with new NMD partners. Our work shows how a combination of biochemical, biophysical, structural and in vivo tools can offer unexpected insights into the operating mode of molecular motors.

Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation. / RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est un virus à simple brin positif qui appartient au genre Lentivirus dans la famille retroviridae et qui constitue l’agent étiologique du SIDA pandémique.Pendant le cycle réplicatif du VIH-1, la traduction de protéines virales dépend exclusivement de la machinerie traductionnelle cellulaire. Pour cette raison, nous avons cherché à comprendre le rôle de quelques facteurs cellulaires qui pourraient contrôler la traduction du VIH-1 à différents nivaux. Nous avons centré nos recherches sur la traduction de l’ARN génomique (ARNg) du virus qui sert en même temps de génome pour être encapsidé et comme ARN messager pour la traduction des protéines virales Gag et Gag-Pol. 1) Le rôle de l’hélicase d’ARN DDX3 dans la traduction du VIH-1. L’ARNg du VIH-1 possède une région 5’ non traduite très structurée, raison pour laquelle nous avons spéculé sur un possible rôle de DDX3 dans la traduction du VIH-1. Nous avons utilisé une combinaison de techniques in vitro et ex vivo afin de pouvoir démontrer que DDX3 était capable de lier et faire des complexes avec l’ARN de la région 5’ non traduite pour promouvoir l’initiation de la traduction. Nous avons aussi pu démontrer que DDX3 formait des complexes avec les facteurs d’initiation de la traduction PABP, eIF4G et eIF4E. 2) Le changement programmé du cadre de lecture (PRF) dans l’ARN génomique du VIH-1. La traduction de la polyprotéine Gag-Pol du VIH-1 nécessite un décalage de phase de 1 nucléotide en arrière. Ce mécanisme permet la synthèse des protéines Gag et Gag-Pol avec des ratios de 95 et 5% respectivement à partir du même ARN. Cette proportion doit être conservée pour assurer la réplication du virus. Nous avons utilisé un système de double gène rapporteurs et un système de réplication complète du provirus pour montrer que la protéine associé aux granules de stress TIAR pouvait contrôler la réplication viral en régulant la proportion de ribosome qui assurent / Human Immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) is a positive strand RNA virus belonging to the lentivirus genus of the retroviridae family and it is the etiological agent of the pandemic AIDS, which is a major health concern worldwide. Throughout HIV-1 replication cycle, the production of viral proteins depends exclusively on the cellular translational machinery. This is the reason why we have explored the role of some cellular factors that could control HIV-1 translation at different stages. We have focused our studies on the translation of the full length genomic RNA (gRNA), which serves both as genome for viral encapsidation and as a messenger for translation of Gag and Gag-Pol viral polyproteins.1) The role of the RNA helicase DDX3 in HIV-1 translation Initiation The fact that HIV-1 possesses a highly structured 5’ untranslated region (5’UTR) prompted us to speculate that DDX3 may be involved in HIV-1 translation. We used a combination of in vitro and ex-vivo approaches to show that DDX3 was able to bind and form complexes with the 5’-UTR of HIV-1 to assist translation initiation. We also demonstrated that DDX3 can form a complex with initiation factors such as PABP, eIF4G and eIF4E. 2) Programmed Ribosomal Frameshift (PRF) in the genomic RNA of HIV-1Translation of HIV-1 Gag-Pol polyprotein requires a -1 PRF. This mechanism allows the synthesis of Gag and Gag-Pol polyproteins, using the same mRNA template, at ratios of 95 and 5% respectively. Keeping the -1PRF ratio is important as any change leads to reduction in virus infectivity.By means of a dual reporter construct and full provirus replication system we were able to demonstrate that the stress granules associated protein TIAR, controls HIV-1 infectious progeny by regulating the ratio of the HIV-1 PRF.

L’ARN hélicase à boite DEAD de la levure S.cerevisiae Ded1 est une protéine essentielle dont la fonction a été conservée au cours de l’évolution. Ses homologues fonctionnels sont impliqués dans le développement et le cycle cellulaire. Ded1 a longtemps été associée à l’étape de scanning de la région 5’UTR des ARNm au niveau de l’initiation de la traduction. Nous avons utilisé différentes approches comme les co-immunoprécipitations, des analyses de spectrométrie de masse, des tests de complémentation génétique, de séparation des complexes sur gradients de saccharose, des expériences de localisation in situ et d’enzymologie pour montrer que Ded1 interagissait physiquement avec des complexes cytoplasmique et nucléaire de liaison à la coiffe des ARNm. Nous avons également montré que Ded1 peut passer du noyau vers le cytoplasme par différentes voies d’export nucléaire. De façon intéressante, ses partenaires protéines sont capables de stimuler son activité ATPase. De plus, nous avons montré qu’il existait un lien génétique entre Ded1 et ses partenaires. Nous avons également montré que Ded1 colocalise partiellement avec ses partenaires dans des gradients de saccharose, suggérant que Ded1 pourrait être associée à certains mRNPs. Nos résultats encore préliminaires indiquent que Ded1 pourrait s’associer à d’autre ARNs coiffés. Ainsi, Ded1 pourrait remodeler les complexes associés à différentes étapes de la vie des ARN coiffés. / The budding yeast DEAD-box RNA helicase Ded1 is an essential yeast protein that is closely related to a subfamily of DEAD-box proteins that are involved in developmental and cell-cycle regulation. Ded1 is generally considered to be a translation-initiation factor that helps the 40S ribosome scan the mRNA from the 5' 7-methylguanosine cap to the AUG start codon. We have used IgG pulldown experiments, mass spectroscopy analyses, genetic experiments, saccharose gradients, in situ localizations, and enzymatic assays to show that Ded1 is a cap-associated factor that actively shuttles between the cytoplasm and the nucleus. We show that Ded1 physically interacts with various cap-associated factors and that its enzymatic activity is stimulated by these factors. By using various mutated proteins, we show that Ded1 is genetically linked to these factors. Ded1 comigrates with these factors on saccharose gradients, but the peak of Ded1 sediments slightly heavier than for the other factors, which suggests that Ded1 is predominately associated with a subset of the mRNPs. Finally, purification of the protein complexes associated with Ded1 and subsequent analysis by nanoLC-MS/MS indicates that Ded1 is associated with both nuclear and cytoplasmic mRNPs. Preliminary experiements showed that Ded1 can associate with other capped RNA. We conclude that Ded1 may function as a remodeling factor that is needed to form the different complexes associated with the different processing steps of the capped RNA.

L'évolution de la régulation de l'expression des gènes participe à l'évolution de leur fonction. L'existence de profils d'expression spécifiques évitant la redondance fonctionnelle expliquerait le maintien des gènes dupliqués dans les génomes. La PCR quantitative en temps réel se révèle adaptée à l'étude de l'expression des familles de gènes présentant des niveaux très variés et des séquences proches. Le génome modèle d'Arabidopsis thaliana contient une famille d'ARN hélicases à boîte DEAD (RH) de 58 membres, i.e. environ deux fois plus que n'en comptent les génomes d'animaux ou celui de la levure. L'expression transcriptionnelle de 20 AtRH a été obtenue par RT-PCR quantitative dans neuf organes différents. Dans cette famille de gènes " de ménage ", deux AtRH présentent des profils spécifiques alors que les 18 autres AtRH présentent le même profil spatial, mais des niveaux d'expression transcriptionnelle très différents. L'élément régulateur principal du niveau transcriptionnel est la présence simultanée d'une boîte TATA caractéristique et d'un intron en 5' UTR. Dès lors que la boîte TATA est présente, il y a une corrélation positive significative entre la taille de l'intron en 5' UTR et le niveau d'expression. Notre travail sur l'expression des AtRH permet d'introduire un scénario sur la dynamique évolutive des gènes dupliqués qui forment une même branche terminale d'un arbre phylogénétique et dont le niveau d'expression diffère fréquemment. Après la duplication d'un gène fortement transcrit, l'altération de l'activité transcriptionnelle des copies se produirait par des événements successifs de suppression de la boîte TATA et/ou de l'intron en 5' UTR.

La voie des RLR (RIG-I like Receptors) joue un rôle essentiel dans la détection des virus à ARN, déclenchant une réponse immunitaire antivirale grâce au recrutement de la protéine adaptatrice mitochondriale MAVS (Mitochondrial AntiViral Signaling protein). Nous avons mis en évidence que les souris déficientes pour la protéine MAVS (MAVS KO) présentaient un phénotype proallergénique dans un modèle d'inflammation stérile d'hypersensibilité retardée de contact (HSRC) qui reproduit la dermatite allergique de contact (DAC) chez l'homme. Nous avons caractérisé le système immunitaire des souris MAVS KO en condition d'équilibre et durant la réponse d'HSRC. Nous avons identifié un rôle du microbiote intestinal des souris MAVS KO dans l'exacerbation de réponse d'HSRC et mis en évidence une dysbiose du microbiote bactérien. Nous avons démontré que la dysbiose était responsable du phénotype inflammatoire observé, phénotype transmissible à des souris sauvages par des expériences de cohébergement et de transplantation fécale. Cette dysbiose induit une augmentation de la perméabilité intestinale chez les souris MAVS KO lors de la réponse d'HSRC, aboutissant à une translocation bactérienne dans les organes lymphoïdes et à la modulation des réponses immunitaires à l'origine de l'exacerbation de réponse d'hypersensibilité. La 2ème partie de ma thèse vise à étudier les conséquences de la déficience en MAVS sur le métabolisme glucidique. Nos expériences ont démontré que les souris MAVS KO développaient une surcharge pondérale et une insulino-résistance sous régime riche en lipides et sucrose, dépendants de la dysbiose intestinale. Au niveau cellulaire, une altération des interactions aux points de contact entre la mitochondrie et le réticulum endoplasmique a été observée. Nos résultats permettent d'envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques des pathologies allergiques et métaboliques humaines par la modulation du microbiote intestinal / RIG-I like receptors (RLRs) play a major role in response to cytosolic viral RNAs by initiating an antiviral immune response through the recruitment of the mitochondrial adaptor protein MAVS (Mitochondrial AntiViral Signaling protein). We showed that MAVS-deficient mice developed an exacerbated response in a sterile inflammatory model of Contact Hypersensitivity (CHS), that reproduces the pathophysiology of allergic contact dermatitis (ACD) in human. We characterized the immune system of MAVS KO mice at steady state and during CHS response. We found that MAVS deficiency leads to changes in the gut bacterial composition suggesting an unexpected role of the RLR pathway in the regulation of intestinal homeostasis. We demonstrated that intestinal dysbiosis is responsible for the increased CHS response, and showed that the inflammatory phenotype of MAVS KO mice can be transferred to WT mice by cohousing and fecal transplantation. We demonstrated that the dysbiotic gut microbiota exerts its effect due to an increased intestinal permeability during DTH sensitization. The ensuing bacterial translocation within lymphoid organs enhances characteristic cytokines production that increases CHS response. The 2nd part of my thesis aimed to study the consequences of MAVS deficiency on glucose metabolism. Our experiments showed that MAVS KO mice exhibit disorders of glucose homeostasis during high fat diet (HFD) associated with the development of overweight and insulin resistance. We also observed alterations of MAM (Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes), contact poins between mitochondria and endoplasmic reticulum. Recent preliminary data suggested that the metabolic disorders associated with MAVS deficiency are due to intestinal dysbiosis. Our results highlight a new role for the RLR pathway and allow to consider the development of new therapeutic approaches to human allergic and metabolic diseases by modulation of the intestinal microbiota

Les topoisomérases (topos) de type IA jouent un rôle primordial dans le maintien et l’organisation du génome. Cependant, les mécanismes par lesquels elles contrôlent cette stabilité génomique sont encore à approfondir. Chez E. coli, les deux principales topoisomérases de type IA sont la topo I (codée par le gène topA) et la topo III (codée par le gène topB). Il a déjà été montré que les cellules dépourvues des topos I et III formaient de très longs filaments dans lesquels les chromosomes ne sont pas bien séparés. Comme ces défauts de ségrégation des chromosomes sont corrigés par l’inactivation de la protéine RecA qui est responsable de la recombinaison homologue, il a été émis comme hypothèse que les topoisomérases de type IA avaient un rôle dans la résolution des intermédiaires de recombinaison afin de permettre la séparation des chromosomes. D’autre part, des études réalisées dans notre laboratoire démontrent que le rôle majeur de la topoisomérase I est d’empêcher la formation des R-loops durant la transcription, surtout au niveau des opérons rrn. Ces R-loops on été récemment identifiés comme des obstacles majeurs à l’avancement des fourches de réplication, ce qui peut provoquer une instabilité génomique. Nous avons des évidences génétiques montrant qu’il en serait de même chez nos mutants topA. Tout récemment, des études ont montré le rôle majeur de certaines hélicases dans le soutien aux fourches de réplication bloquées, mais aussi une aide afin de supprimer les R-loops. Chez E. coli, ces hélicases ont été identifiées et sont DinG, Rep et UvrD. Ces hélicases jouent un rôle dans la suppression de certains obstacles à la réplication. Le but de ce projet était de vérifier l’implication de ces hélicases chez le mutant topA en utilisant une approche génétique. Étonnamment, nos résultats montrent que la délétion de certains de ces gènes d’hélicases a pour effet de corriger plutôt que d’exacerber des phénotypes du mutants topA qui sont liés à la croissance et à la morphologie des nucléoides et des cellules. Ces résultats sont interprétés à la lumière de nouvelles fonctions attribuées aux topoisomérases de types IA dans la stabilité du génome. / Type 1A topoisomerases (topos) play a vital role in the maintenance and organization of the genome. However, the mechanisms by which they control genome stability still remain to be explored. In E. coli, the two type IA topoisomerases are topo I (encoded by topA) and topo III (encoded by topB). It has been shown that cells lacking topo I and III form very long filaments in which the chromosomes are not well separated. As the chromosome segregation defects are corrected by inactivation of the RecA protein, that is responsible for homologous recombination, it has been hypothesized that type IA topoisomerases have a role in the resolution of recombination intermediates to allow chromosome segregation. On the other hand, studies in our laboratory have shown that the major role of topoisomerase I is to prevent the formation of R-loops during transcription, especially at the rrn operons. These R-loops have been recently identified as major roadblocks to the progression of replication forks, which can cause genomic instability. We have genetic evidence suggesting similar effects may occur in our topA mutants. More recently, studies have shown the important role of certain helicases in eliminating roadblocks for replication forks that could sometimes be R-loops. In E. coli, these helicases have been identified and they are DinG, Rep and UvrD. The purpose of this project was to study the roles of these helicases in our topA mutant, using a genetic approach. Surprisingly, our results show that deletions of some of these genes have the effect of correcting rather than exacerbating topA mutant phenotypes that are related to the growth and cell and nucleoid morphology. These results are interpreted in the light of new functions assigned to the type IA topoisomerases in genome stability.