Les tiques du genre Ixodes englobent un grand nombre d’espèces dont Ixodes ricinus, objet de cette étude. Ixodes ricinus peuple les sous-bois de nos régions et la plupart des grandes forêts de l’Europe centrale et de l’est. Au cours de leur cycle parasitaire, les tiques réalisent un repas sanguin au détriment de petits mammifères (mulots, lièvres,…), mais aussi de grands mammifères tels que le cerf, la biche ou le sanglier. Elles deviennent particulièrement voraces au début du printemps et en automne, c’est pourquoi à ces époques de l’année, les promeneurs et les animaux domestiques (principalement, le chien) peuvent en être infestés. Pour mener à bien leur repas sanguin, les tiques mettent en place une série de mécanismes les rendant non seulement indécelables par l’animal parasité mais aussi leur donnant la capacité de contrecarrer les défenses de l’hôte. En effet, lors de sa fixation et durant tout le repas sanguin, la tique injecte un cocktail de facteurs bioactifs qui inhibent la sensation de douleur au moment de l’ancrage dans le derme, mais également les défenses immunitaires de l’hôte parasité. De plus, certains de ces facteurs possèdent des propriétés anti-hémostatiques garantissant la fluidité du sang pendant tout le repas. Le Service de Biologie Moléculaire des Ectoparasites (anciennement Service de Génétique Appliquée) a identifié un grand nombre de séquences d’ARNm induites spécifiquement dans les glandes salivaires de la tique au cours de son repas sanguin. Deux d’entres-elles ont servi de point de départ à ce travail : il s’agit de seq16 (renommée Metis1) et de seq7 (renommée Ir-CPI). Le travail sur la séquence seq16 a conduit à l’identification d’une nouvelle famille de 5 métalloprotéases (nommée Metis pour Metalloprotease from Ixodes ricinus). L’analyse des séquences a permis de les associer à certaines métalloprotéases hémorragiques de venin de serpent. Bien que les 5 métalloprotéases décrites possèdent toutes les mêmes caractéristiques au niveau de leur séquence et de leur profil d’expression dans les glandes salivaires, les résultats d’analyse phylogénétique, d’étude de variation antigénique, de leur mode d’activation et de leur spécificité d’action permettent de les diviser en 3 sous-familles. L’utilisation de la technique d’ARN interférence en in vivo et l’analyse vaccinale soulignent le rôle essentiel de la famille Metis dans les premières heures du repas de la tique et de manière générale dans la réussite du repas sanguin. Enfin, des études d’activité ont montré que certains membres de la famille ont une activité fibrino(gèno)lytique ; plus particulièrement, la protéine Metis4 possède une activité protéolytique envers la gélatine, la caséine, la fibronectine et le fibrinogène. Ces études ont montré également un mode d’activation original ; plutôt que d’être activée par une pro-séquence en amino-terminal, Metis4 s’active spontanément en perdant un peptide à son extrémité carboxy-terminale. Le travail sur la séquence seq7 a conduit à la caractérisation d’un nouvel inhibiteur de sérines protéases. Cette protéine, nommée Ir-CPI pour « Ixodes ricinus - Contact Phase Inhibitor », possède un motif kunitz et est capable d’inhiber de manière importante la voie intrinsèque de la coagulation et dans une moindre mesure la fibrinolyse. Grâce à la technique d’ARN interférence, l’activité de la protéine recombinante a été corrélée à l’activité de la protéine native exprimée dans les glandes salivaires. Ir-CPI inhibe dans un plasma humain l’activation réciproque du facteur XII, de la prékallikréine et du facteur XI, et se fixe spécifiquement à la forme activée de ces trois facteurs. De plus, Ir-CPI est capable de bloquer la fibrinolyse en inhibant spécifiquement la plasmine. Enfin, les résultats obtenus sur deux modèles animaux indépendants établissent l’effet d’Ir-CPI comme agent anti-thrombotique en empêchant la formation de caillot et de manière remarquable sans altérer l'équilibre hémostatique. En conclusion, ce travail a identifié des protéines anti-hémostatiques qui agissent soit comme inhibiteur de protéases empêchant la coagulation soit comme protéases facilitant la lyse du caillot. Cette redondance de protéines anti-hémostatiques illustre remarquablement la capacité de la tique à agir en synergie sur des facteurs essentiels aux mécanismes de défense de l’hôte.

Les plaquettes jouent un rôle majeur dans l'hémostase mais également dans les maladies cardiovasculaires qui représentent une des principales causes de mortalité dans les pays industrialisés. Au cours de l'activation plaquettaire, les phosphoinositides 3-kinases (PI3Ks) de classe I génèrent des seconds messagers lipidiques (D3-phosphoinositides) participant activement à la transmission des signaux en aval des principaux récepteurs plaquettaires. Comme l'inhibition de la PI3Kbeta protège des thromboses occlusives sans augmenter le risque de saignement, cette kinase a été proposée comme nouvelle cible antithrombotique. Toutefois, le rôle de la PI3Kbeta dans des modèles de thrombose in vivo et ex vivo, dans des conditions de forces de cisaillement élevées, restait mal documenté au début de ma thèse. Le rôle de la PI3Kalpha?était également mal connu bien que l'utilisation d'inhibiteurs peu spécifiques suggérait son implication en aval du récepteur GPVI. L'objectif de ma thèse a été d'étudier le rôle de la PI3Kbeta dans la formation du thrombus in vivo et ex vivo, et de caractériser la fonction de la PI3Kalpha plaquettaire. Grâce à des souris présentant une invalidation de la PI3Kbeta ou alpha spécifiquement dans la lignée mégacaryocytaire, j'ai montré que la PI3Kbeta plaquettaire jouait un rôle essentiel dans la stabilité du thrombus dans des conditions de forces de cisaillement élevées. Son inhibition affecte l'activation d'Akt et empêche l'inhibition de son effecteur GSK3 au sein même du thrombus. De façon intéressante, l'inhibition de GSK3 restaure la stabilité du thrombus. Ainsi, la PI3Kbeta joue un rôle critique dans le maintien de l'intégrité du thrombus exposé à des forces de cisaillement élevées et cet effet ne peut être compensé par la PI3Kalpha. D'autre part, l'absence de la PI3Kalpha plaquettaire se traduit par un défaut d'agrégation et d'activation d'Akt lors d'une stimulation de faible intensité de GPVI. In vivo, le thrombus formé par les plaquettes invalidées pour la PI3Kalpha consécutivement à une lésion superficielle des artères, est de plus petite taille que chez les souris sauvages. En condition de flux ex vivo, il est noté un retard de formation du thrombus sur les fibres de collagène suggérant l'implication de la PI3Kalpha dans la phase d'adhésion des plaquettes à la matrice. En effet, des études d'adhésion en flux sur une matrice de facteur de von Willebrand (vWF) montrent que la PI3Kalpha est essentielle pour l'adhésion stable des plaquettes à cette matrice via la signalisation outside-in de l'intégrine alphaIIbbeta3. En conclusion, mes travaux de thèse mettent à jour un rôle spécifique des PI3Ks alpha et beta de classe I dans les plaquettes. La PI3Kbeta? est cruciale dans la régulation de la croissance et de la stabilité du thrombus dans des conditions de forces de cisaillement élevées, tandis que la PI3Kalpha?est requise dans la phase initiale d'adhésion des plaquettes sur une matrice de vWF. Ce travail apporte des nouvelles données qui seront utiles notamment dans le contexte du développement d'inhibiteurs sélectifs de PI3Ks en thérapie anticancéreuse et antithrombotique. / Platelets play a major role in cardiovascular diseases which is one principal cause of worldwide death. Class I phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) are important signaling enzymes in the process of blood platelet activation, producing lipid second messengers (D3-phosphoinositides) that are actively involved downstream of major platelet receptors. PI3Kbeta has been proposed as a potential drug target to treat arterial thrombosis. Indeed, inhibition of this lipid kinase leads to protection against occlusive thrombosis without bleeding risk. Nevertheless, nothing is known regarding the role of this kinase in vivo and ex vivo during growth, stabilization, and resistance upon elevation of shear rate. One study, using pharmacological inhibitors, has suggested that both PI3Kalpha and beta are required, in a non redundant way, for full platelet activation through collagen receptor GPVI, but the role of PI3Kalpha still remains elusive in platelets. The aim of my thesis was to study the role of PI3Kbeta during thrombus formation in vivo and ex vivo, and to characterize the role of PI3Kalpha in platelets. For that, I used pharmacological approach and mice with selective deletion of PI3Kbeta?or?PI3Kalpha in the megakaryocyte lineage (PF4-Cre/p110betaflox/flox and PF4-Cre/p110alphaflox/flox). I showed that PI3Kbeta is essential for thrombus growth and stability at high shear rates. Within the growing platelet thrombus, PI3Kbeta inactivation impairs the activating phosphorylations of Akt and the inhibitory phosphorylation of GSK3. In line with these data, pharmacological inhibition of GSK3 restores thrombus stability. Thus, platelet PI3Kbeta has a critical role in maintaining the integrity of the formed thrombus upon elevation of shear rate. In this condition, I showed that PI3Kbeta absence cannot be compensated by PI3Kalpha. In vitro, PI3Kalpha depletion in platelets leads to a light defect of aggregation and Akt activation in response to CRP showing implication of PI3Kalpha downstream GPVI. I observed that, in vivo, thrombi formed by PI3Kalpha depleted platelets after superficial lesion of mesenteric arterial are smaller, and ex vivo, thrombus formation under flow conditions on collagen matrix is delayed. Furthermore, perfusion of these platelets on von Willebrand factor matrix (vWF) shows that PI3Kalpha is required for stable adhesion of platelets through "outside in" signaling. Altogether, these results show an involvement of PI3Kalpha in the course of early step of platelet adhesion. In conclusion, my thesis work highlights an isoform specific role of PI3Ks in platelets. PI3Kbeta is crucial in the regulation of thrombus growth and stability at a high shear rate and PI3Kalpha is required in initial stages of platelet adhesion. Since class I PI3Ks selective inhibitors are under development as cancer treatment, these results may help to anticipate the potential side effects of such treatment on haemostasis.

Les tiques du genre Ixodes englobent un grand nombre d’espèces dont Ixodes ricinus, objet de cette étude. Ixodes ricinus peuple les sous-bois de nos régions et la plupart des grandes forêts de l’Europe centrale et de l’est. Au cours de leur cycle parasitaire, les tiques réalisent un repas sanguin au détriment de petits mammifères (mulots, lièvres,…), mais aussi de grands mammifères tels que le cerf, la biche ou le sanglier. Elles deviennent particulièrement voraces au début du printemps et en automne, c’est pourquoi à ces époques de l’année, les promeneurs et les animaux domestiques (principalement, le chien) peuvent en être infestés. Pour mener à bien leur repas sanguin, les tiques mettent en place une série de mécanismes les rendant non seulement indécelables par l’animal parasité mais aussi leur donnant la capacité de contrecarrer les défenses de l’hôte. En effet, lors de sa fixation et durant tout le repas sanguin, la tique injecte un cocktail de facteurs bioactifs qui inhibent la sensation de douleur au moment de l’ancrage dans le derme, mais également les défenses immunitaires de l’hôte parasité. De plus, certains de ces facteurs possèdent des propriétés anti-hémostatiques garantissant la fluidité du sang pendant tout le repas.<p><p>Le Service de Biologie Moléculaire des Ectoparasites (anciennement Service de Génétique Appliquée) a identifié un grand nombre de séquences d’ARNm induites spécifiquement dans les glandes salivaires de la tique au cours de son repas sanguin. Deux d’entres-elles ont servi de point de départ à ce travail :il s’agit de seq16 (renommée Metis1) et de seq7 (renommée Ir-CPI).<p><p>Le travail sur la séquence seq16 a conduit à l’identification d’une nouvelle famille de 5 métalloprotéases (nommée Metis pour Metalloprotease from Ixodes ricinus). L’analyse des séquences a permis de les associer à certaines métalloprotéases hémorragiques de venin de serpent. Bien que les 5 métalloprotéases décrites possèdent toutes les mêmes caractéristiques au niveau de leur séquence et de leur profil d’expression dans les glandes salivaires, les résultats d’analyse phylogénétique, d’étude de variation antigénique, de leur mode d’activation et de leur spécificité d’action permettent de les diviser en 3 sous-familles. L’utilisation de la technique d’ARN interférence en in vivo et l’analyse vaccinale soulignent le rôle essentiel de la famille Metis dans les premières heures du repas de la tique et de manière générale dans la réussite du repas sanguin. Enfin, des études d’activité ont montré que certains membres de la famille ont une activité fibrino(gèno)lytique ;plus particulièrement, la protéine Metis4 possède une activité protéolytique envers la gélatine, la caséine, la fibronectine et le fibrinogène. Ces études ont montré également un mode d’activation original ;plutôt que d’être activée par une pro-séquence en amino-terminal, Metis4 s’active spontanément en perdant un peptide à son extrémité carboxy-terminale. <p><p>Le travail sur la séquence seq7 a conduit à la caractérisation d’un nouvel inhibiteur de sérines protéases. Cette protéine, nommée Ir-CPI pour « Ixodes ricinus - Contact Phase Inhibitor », possède un motif kunitz et est capable d’inhiber de manière importante la voie intrinsèque de la coagulation et dans une moindre mesure la fibrinolyse. Grâce à la technique d’ARN interférence, l’activité de la protéine recombinante a été corrélée à l’activité de la protéine native exprimée dans les glandes salivaires. Ir-CPI inhibe dans un plasma humain l’activation réciproque du facteur XII, de la prékallikréine et du facteur XI, et se fixe spécifiquement à la forme activée de ces trois facteurs. De plus, Ir-CPI est capable de bloquer la fibrinolyse en inhibant spécifiquement la plasmine. Enfin, les résultats obtenus sur deux modèles animaux indépendants établissent l’effet d’Ir-CPI comme agent anti-thrombotique en empêchant la formation de caillot et de manière remarquable sans altérer l'équilibre hémostatique.<p><p>En conclusion, ce travail a identifié des protéines anti-hémostatiques qui agissent soit comme inhibiteur de protéases empêchant la coagulation soit comme protéases facilitant la lyse du caillot. Cette redondance de protéines anti-hémostatiques illustre remarquablement la capacité de la tique à agir en synergie sur des facteurs essentiels aux mécanismes de défense de l’hôte.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'allongement de l'espérance de vie a fait de l'insuffisance cardiaque (IC) l'un des problèmes majeurs de santé publique. Le syndrome métabolique (SMet) et l'hypertension sont deux facteurs conduisant à l'IC. Les modifications qui interviennent au niveau structural et cellulaire de la paroi artérielle dans le SMet, l'hypertension et l'IC pourraient entraîner des anomalies de l'hémostase qui aggravent ces tableaux cliniques. Nous avons montré au cour de ce travail les modifications du phénotype de l'hémostase dans différents modèles animaux de pathologies impliquées dans la mise en place de l'IC. L'altération de l'hémostase précède les modifications de la paroi et pourrait favoriser le développement de l'IC chez le rat Zucker. Le modèle de rat spontanément hypertendu SHR présente une hypercoagulablité de la paroi via les cellules musculaires lisses. Ces résultats ne permettent pas d'impliquer uniquement l'hypertension artérielle dans l'hypercoagulabilité plasmatique trouvée chez le rat Zucker. L'activation du récepteur à l'aldsotérone au niveau endothélial chez la souris induit un phénotype antithrombotique provoqué par une augmentation de la réactivité du système anticoagulant de la protéine C, via son récepteur, l'EPCR. L'étude d'une cohorte de patients insuffisants cardiaques a permis de distinguer des paramètres de fonction cardiaque et de rigidité artérielle. Cette caractérisation est indispensable pour comprendre les mécanismes des événements thrombotiques associés à l'IC. La conclusion de ce travail est que les pathologies pouvant conduire à la mise en place d'une IC modifient l'hémostase vers un état d'hypercoagulabilité qui fait intervenir la paroi artérielle / Increasing life span has made heart failure (HF) a major issue for public health. The metabolic syndrome (MetS) and hypertension are two important factors which can lead to HF. Structural and cellular modification occurring in the arterial wall in the MetS, hypertension and HF may provoke hemostasis alterations that can worsen the clinical situation. We have shown in this work, hemostasis modifications in animal models of pathologies implicated in HF development. Hemostasis alterations were shown to precede functional modifications of the arterial wall and could favor HF development in Zucker rats. Spontaneously hypertensive rats showed an arterial wall hypercoagulability via smooth muscle cells. These results don't permit the implication of hypertension in the hypercoagulable state found in the Zucker rat. A mouse model with aldosterone receptor activation in the endothelium lead to a hypocoagulable state by increasing the protein C anticoagulant system via his receptor, the EPCR. Studying a human HF patient cohort permitted the measurement of cardiac function and of arterial stiffness parameters. This characterization is important to understand thrombosis events associated with HF in humans. The general conclusion of this work is that, in pathologies leading to HF, modification of hemostasis to a procoagulable state, implicates the arterial wall

Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus – a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique I. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte. En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immunosuppressor ». Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’Iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus.<p>La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), Iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sérine protéases, et en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’Iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte.<p>Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’Iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RCL, et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés par analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD).<p>Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que l’IFN-g par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée. Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’Iris - dépourvu d’activité anti-protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa :105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire.<p>Enfin, nous avons également analysé l’importance d’Iris au cours du repas sanguin de la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques nourries sur des lapins immunisés par la protéine rIris ne survivent pas au repas. / Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les tiques sont des arthropodes ectoparasites obligatoires qui se nourrissent sur une grande variété de vertébrés sur une large partie du globe. Au cours de leur repas, les tiques sécrètent dans leur salive de nombreux facteurs leur permettant de contourner bon nombre des défenses de l’hôte. Bien que la littérature rapporte beaucoup d’informations au sujet des effets du repas de la tique sur l’hôte, la nature des facteurs actifs exprimés par les glandes salivaires de la tique est peu connue. Au cours d’anciens travaux au sein du laboratoire, le crible de deux banques d’ADN complémentaires - issues de la rétro-transcription des ARN messagers synthétisés par les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus – a permis l’identification de 27 protéines dont l'expression est spécifiquement induite ou régulée positivement pendant le repas sanguin de la tique I. ricinus. Parmi ces protéines, la protéine Seq24, induite au cours du repas sanguin, présente la capacité de moduler les immunités innée et acquise de l’hôte. En conséquence, la protéine Seq24 a été nommée Iris pour « Ixodes ricinus Immunosuppressor ». Au cours de la présente étude, notre but fût de caractériser le rôle d’Iris et de déterminer son importance dans le repas sanguin de la tique I. ricinus. La protéine Iris appartient à la famille des inhibiteurs de sérine protéases et présente une homologie significative avec l’inhibiteur d’élastase de leucocytes. Une analyse in silico a confirmé qu’Iris présentait la structure des serpines, et notamment le RCL (Reactive Center Loop), boucle responsable de l’activité anti-protéasique. Comme attendu (sur base de l’analyse in silico), Iris inhibe de manière spécifique l’activité de plusieurs sérine protéases, et en particulier l’élastase de leucocyte. Ces tests effectués, nous avons essayé de comprendre quel(s) pouvai(en)t être le(s) rôle(s) d’Iris dans l’accomplissement du repas sanguin de la tique, c’est à dire dans la lutte contre les différents systèmes de défenses de l’hôte. Tout d’abord, des tests ont démontré la capacité d’Iris à inhiber les mécanismes de l’hémostase. Des tests sur du plasma et du sang complet ont montré qu’Iris allonge le temps de fibrinolyse, la voie intrinsèque de la coagulation et l’adhésion plaquettaire. L’utilisation de mutants a également démontré que si les deux premières activités sont dépendantes du RCL, et donc d’un mode de fonctionnement anti-protéolytique, l’adhésion plaquettaire est indépendante de ce système. Ce résultat met en évidence l’existence d’autres sites actifs, isolés par analyse in silico, nommés Receptor Binding Domain (RBD). Un travail antérieur du laboratoire avait permis d’indiquer la capacité de la protéine recombinante Iris semi-purifiée à inhiber la production de TNF-a, d’IL-6, et d’IL-8 (cytokines pro-inflammatoires) ainsi que l’IFN-g par des PBMCs (Peripherical Blood Mononuclear Cells) humaines. Ces résultats ont été confirmés avec de la protéine purifiée. Des analyses complémentaires ont démontré qu’un mutant d’Iris - dépourvu d’activité anti-protéasique - conserve l’activité pro-inflammatoire. Là encore, ce mécanisme semble impliquer un ou plusieurs RBD. L’utilisation d’anticorps dirigés contre ces zones a permis de déterminer le domaine d’interaction (aa : 105-120) impliqué dans cette fonction. D’autre part, une analyse par FACS a permis de démontrer qu’Iris interagit uniquement avec les cellules d’origine monocytaire. Enfin, nous avons également analysé l’importance d’Iris au cours du repas sanguin de la tique par une approche vaccinale. Les résultats observés indiquent que 30 % des tiques nourries sur des lapins immunisés par la protéine rIris ne survivent pas au repas.

Pendant plus de six décennies, les antivitamines K (AVK) ont été la seule classe d’anticoagulants oraux disponibles sur le marché. L’arrivée des Anticoagulants Oraux Directs (AOD) en 2008 a marqué un réel tournant dans l’anticoagulation par voie orale. La première partie de ce travail s’est intéressée aux caractéristiques des patients traités par anticoagulants, et les conséquences en termes d’hospitalisations pour évènement hémorragique ou ischémique. Au sein d’une cohorte de patients hospitalisés pour AVC (cohorte BIOSTROKE, Lille), aucun facteur d’influence particulier, intervenant sur la survenue et l’évolution (mortalité, de déclin cognitif, et de handicap à 3 mois) de l’AVC n’était mis en évidence. En parallèle, une étude menée dans le service d’urgences du Centre Hospitalier de Béthune sur 3 années (2012, 2014, 2016) pour suivre l’évolution des prescriptions d’anticoagulants oraux et observer l’impact de la mise sur le marché des AOD, montrait une population dont certaines caractéristiques semblaient être associées à une utilisation plus volontiers des AOD ou des AVK. Le nombre d’évènements hémorragiques et thrombotiques sous AVK restait cependant stable sur les trois périodes d’étude (770 patients inclus au total). Forts de ces données rassurantes, la deuxième partie de ce travail s’est intéressée aux pratiques de prescription et au bon usage des anticoagulants, avec un focus particulier sur les AOD, à travers trois études : la première réalisée auprès des médecins généralistes du Nord et du Pas de Calais qui montrait une population de prescripteurs plutôt méfiants envers les AOD et ayant une préférence pour les anti-Xa. Les deux autres études portaient sur le bon usage des AOD, à partir de prescriptions à l’officine (grâce à la participation des étudiants en pharmacie de la faculté de Lille en stage d’officine) et à l’hôpital (Centre Hospitalier Régional de Lille). Ces études retrouvaient globalement des chiffres de prescriptions d’AOD transposables aux données françaises, avec cependant des disparités ville/hôpital. En termes de bon usage, les prescriptions étaient pour moins d’un tiers d’entre elles non-conformes aux recommandations en vigueur, avec une forte proportion de situations de sous-dosages. En conclusion, ce travail de thèse a permis de mettre à jour des pistes de formation/information des professionnels de santé sur ces nouvelles molécules anticoagulantes qui vont participer à une prise en charge avisée et optimale des patients. / For over six decades, vitamin K antagonists (VKAs) were the only class of oral anticoagulants available on the market. The arrival of Direct Oral Anticoagulants (DOAs) in 2008 marked a real turning point in the oral anticoagulation. The first part of this work was interested in the characteristics of patients treated with anticoagulants and the consequences in terms of hospitalizations for ischemic or hemorrhagic events. In a cohort of patients hospitalized for stroke (cohort BIOSTROKE Lille), no particular influencer, on the onset and course (mortality, cognitive decline, and disability at 3 months) of stroke was highlighted. In parallel, a study conducted in the emergency department of the Hospital of Bethune on three years (2012, 2014, 2016) to observe oral anticoagulants prescriptions and the impact of DOAs arriving, showed a population where many characteristics appear to be associated with a more readily using DOAs or VKAs. The number of bleeding and thrombotic events with VKAs remained stable during the three study periods (in total 770 patients were included). With these reassuring data, the second part of this work has focused on prescribing practices and the appropriate use of anticoagulants, with a particular focus on DOAs, through three studies: one conducted among general practitioners of Nord and Pas de Calais departments, which showed a rather wary about DOAs but with a preference for anti-Xa. The other two studies focused on the appropriate use of DOAs, estimated from pharmacy (with the participation of pharmacy students of the Faculty of Lille) and hospital (Lille Regional Hospital Center) prescriptions. Data about DOAs prescriptions were transposable to French data, albeit with city / hospital disparities. Non-appropriate prescriptions were observed in less than one-third file, with a high proportion of under dosing situations. In conclusion, this work has allowed updating training tracks / information for health care professionals on these new anticoagulant molecules to improve information and optimal patients’ care.

Il existe actuellement plusieurs tests globaux permettant l’évaluation de l’hémostase. Ces outils ont l’avantage, contrairement aux dosages individuels de facteurs ou aux tests classiques de coagulation (temps de prothrombine, temps de thromboplastine partielle activée), d’explorer le potentiel de coagulation global d’un individu, résultant de l’action combinée des facteurs pro et anti coagulants. Parmi ces tests, le test de génération de thrombine et les tests viscoélastiques ont retenu notre attention. Ils ont été utilisés pour explorer trois pathologies.La première partie de ce travail s’est focalisée sur l’évaluation du potentiel hémostatique chez les enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique pendant le traitement par asparaginase native ou pégylée. L’asparaginase et les corticoïdes sont des molécules importantes du traitement, mais comportent différents effets indésirables, entre autre sur le système hémostatique avec l’apparition de thromboses. Le test de génération de thrombine a été exploré chez 56 enfants atteints de leucémie et a permis de mettre en évidence un potentiel de coagulation augmenté au diagnostic et pendant le traitement d’induction. Cet effet était moins marqué pour les patients sous asparaginase pégylée que sous asparaginase native.La deuxième étude a exploré l’hémostase chez les patients drépanocytaires greffés. Ces derniers ayant un profil hypercoagulable, l’étude a évalué l’influence de la greffe sur la balance hémostatique. Dix-sept patients ont été inclus. Les résultats confirment un profil hypercoagulant en situation pré-greffe et une correction, certes incomplète, de ce profil vers un profil normal en situation post-greffe.La troisième partie a étudié l’efficacité in vitro de l’acide tranexamique sur la fibrinolyse, particulièrement dans la chirurgie cardiaque pédiatrique. Pendant ce type d’intervention, le système vasculaire du patient est exposé à toute une série d’agressions qui conduisent à un risque non négligeable de saignement. Afin d’accroitre la stabilité du caillot, l’acide tranexamique, agent antifibrinolytique, est largement utilisé. La concentration plasmatique minimale à cibler, permettant une inhibition complète de la fibrinolyse est peu renseignée surtout dans la population pédiatrique. Afin de répondre à cette interrogation, la dose minimale d’acide tranexamique nécessaire pour inhiber la fibrinolyse a été déterminée, après sensibilisation d’un test viscoélastique à la fibrinolyse. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Pharmacie) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Une des propriétés majeures de la thrombine est le caractère pléiotropique de ses effets physiologiques et pathologiques, à la fois dans le compartiment sanguin et tissulaire de la paroi. Notre hypothèse est que les changements phénotypiques des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) participent aux modifications des propriétés pro- et anticoagulantes de la paroi. Les objectifs ont été d’étudier : (i) le rôle prothrombotique des CMLVs dans l’hypertension chez le rat SHR et le syndrome métabolique (Smet) chez le rat Zucker, (ii) les mécanismes de régulation de la génération de thrombine par l’intégrine αvβ3 des CMLVs (récepteur de la pro- thrombine), et de développer des glyco-peptides fluorés pour l’imagerie permettant d’évaluer l’activité de cette intégrine dans la paroi, et (iii) d’évaluer l’effet de variants génétiques du locus 9p21 de susceptibilité aux maladies coronariennes sur le phénotype de coagulation. Résultats : Les CMLVs sont responsables du phénotype prothrombotique de la paroi artérielle associée à l’hypertension chez le rat SHR. Les acides gras libres et l’inflammation vasculaire augmentent la génération de thrombine dans les 2 compartiments ce qui se traduit par une fibrinolyse diminuée et une activité métallo-protéinase augmentée chez Le rat Zucker. L’invalidation de l’intégrine αvβ3 des CMLVs diminue la génération de thrombine dans les 2 compartiments et ralentit la survenue de thrombose carotidienne en réponse à une stimulation l’angiotensine. Le traçage de l’intégrine αvβ3 par des glyco-peptides comprenant une séquence RGD a été validé au niveau plaquettaire et des CMLVs. La souris invalidée pour le locus 9p21 exprime un phénotype pro-thrombotique qui est retrouvé chez l’homme pour certains variants (rs10120688 et rs1333040) dans ce locus. En conclusion, la CML est un support cellulaire clé de réactions procoagulants et pourrait être impliqué via les intégrines et/ou ses récepteurs pour la thrombine dans un couplage thrombine tissulaire – rigidité cellulaire dans les pathologies vasculaires / One of the major properties of thrombin is the pleiotropic character of its physiological and pathological effects, both in the blood compartment and the tissue of the arterial wall. We hypothesized that the phenotypic changes of vascular smooth muscle cells (VSMCs) are involved in modifications of pro- and anti-coagulant properties of the arterial wall. The objectives were to examine: (i) the prothrombotic role of VSMCs in hypertension of SHR rats and in the metabolic syndrome (Smet) of Zucker rats, (ii) regulatory mechanisms of thrombin generation by integrin αvβ3 of VSMCs (a pro-thrombin receptor), and to develop fluorinated glyco- peptides for imaging, to assess the activity of this integrin in the wall, and (iii) evaluate the effect of genetic variants of the 9p21 locus that give a susceptibility to coronary heart disease on the coagulation phenotype. Results: The VSMCs are responsible for the prothrombotic phenotype of the arterial wall associated with hypertension in SHR rats. Free fatty acids and vascular inflammation increase thrombin generation in the two compartments resulting in decreased fibrinolysis and an increased metallo-proteinase activity in the Zucker rats. The invalidation of integrin αvβ3 of VSMCs reduced thrombin generation in the two compartments and slowed angiotensin-induced carotid thrombosis. Tracing of the integrin αvβ3 by glyco-peptides including RGD was validated at the platelet level and VSMCs. Mice invalidated for the 9p21 locus express a prothrombotic phenotype that is found in humans for certain variants (rs10120688 and rs1333040) in this locus. In conclusion, the VSMC is a cell supported key to procoagulant reactions and may be involved via integrins and/or its receptors for thrombin in the ”tissular thrombin - cell rigidity” coupling in vascular pathologies

La thromboélastométrie (TEM) rotative est un examen évaluant les propriétés viscoélastiques du sang dans des conditions de faible cisaillement. La TEM est capable d'apprécier dynamiquement la fonction hémostatique globale d'un patient depuis la formation du caillot à sa lyse. Le profil obtenu par cette technique peut être classé en hypercoagulable, normal ou hypocoagulable. Les études de ce travail révèlent que le sexe et la stérilisation n'affectent pas la valeur des différents paramètres TEM. L'âge est associé à l'apparition de profils hypercoagulables et à une diminution de l'activité fibrinolytique chez le beagle en bonne santé. La présence d'une inflammation évoluant à bas bruit semble impliquée dans ce processus. L'âge devrait être considéré comme un facteur de complications thromboemboliques chez le Chien. Par ailleurs, la TEM semble peu sensible dans le monitorage biologique des effets anticoagulants de l'énoxaparine sodique, une héparine à bas poids moléculaire, chez le beagle en bonne santé. Enfin, la TEM s'avère utile dans la description et la caractérisation des désordres de l'hémostase chez des chiens souffrant de leptospirose. Un profil hypocoagulable est associé à la présence de saignements et les paramètres TEM sont significativement différents entre les chiens avec et sans coagulation intravasculaire disséminée. Certains paramètres et indices TEM ont une valence pronostique à l'admission de ces chiens, un profil hypocoagulable étant associé à une augmentation du taux de mortalité / Rotational thromboelastometry (TEM) can be used to assess the viscoelastic properties of clot formation in whole blood under low shear conditions, which provides information on global hemostatic function from the beginning of clot formation through fibrinolysis. The shape of the TEM profile defines a patient’s hemostatic condition as normal, hypercoagulable, or hypocoagulable. First, the studies of this work emphasize that sex and neutered status does not affect the values of TEM parameters. The second study demonstrated an age-related hypercoagulable profile that was associated with decreased fibrinolysis ability in healthy Beagles. Low-grade inflammation seemed to be involved in this process. The incidence of thromboembolic diseases remains to be established in old dogs, but age should be considered a primary risk factor. Third, TEM is insensitive to detect the biological activities of a particular low molecular weight heparin, sodium enoxaparin, in healthy Beagles. Finally, TEM is useful for the description of hemostatic disorders in dogs with naturally occurring leptospirosis. A hypocoagulable profile is associated with bleeding diatheses and the measured TEM parameters are significantly different between dogs with and without disseminated intravascular coagulation. Some measured TEM parameters and calculated indices are associated with outcomes: a hypocoagulable profile is correlated with a higher mortality rate