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Nous avons identifié une nouvelle forme de phospho-S27-S33-Ku70 constitutivement surexprimée dans des cellules issues de la leucémie lymphocytaire chronique résistante à la chimiothérapie basée sur des agents alkylants de l’ADN et/ou analogues nucléotidiques. La protéine Ku70 est une protéine essentielle du maintien de la stabilité génomique par son rôle dans la réparation non-homologue (système NHEJ) des cassures double brin de l’ADN (CDB) et par sa fonction télomérique. Le laboratoire d’accueil a déjà démontré, in vitro et in vivo, dans les cellules LLC résistantes une altération de la réparation par le système NHEJ et un dysfonctionnement télomérique. Le travail de thèse a porté sur la caractérisation fonctionnelle de cette nouvelle forme phospho-S27-S33-Ku70. Pour ceci, nous avons utilisé des vecteurs d’expression permettant simultanément d’inhiber l’expression du Ku70 endogène (shRNA) et d’exprimer de façon épisomale différentes formes de Ku70 exogène. Ainsi, nous avons démontré : i) une stricte colocalisation de pS27-pS33-Ku70 avec les foyers γ-H2AX; ii) des cassures double brin (DSB) induisent la phosphorylation de S27-S33-Ku70 sous forme hétérodimère avec Ku80. Cette phosphorylation a lieu quelques minutes après le stress génotoxique et implique l'activité et l'interaction physique avec pS2056-DNA-PKcs, reliant ainsi pS27-pS33-Ku70 au système NHEJ ; iii) les cellules exprimant la forme sauvage exogène S27-S33-Ku70 ou la forme phosphomimétique E27-E33-Ku70 présentent une cinétique de réparation de l’ADN plus rapide que celle des cellules exprimant la forme mutée A27-A33-Ku70. Cependant, iv) la forme sauvage de Ku70 contribue à un niveau plus élevé d'aberrations structurales chromosomiques après la première division cellulaire suite à un stress génotoxique indiquant une infidélité lors de la réparation des dommages de l’ADN. En outre, les cellules exprimant A27-A33-Ku70 possèdent un index cellulaire plus élevé qui est corrélé avec une activation de la voie β-caténine. En adéquation avec sa surexpression dans la forme résistante de la LLC, l’ensemble de ces résultats suggère un rôle oncogénique de la forme phosphorylée de Ku70. Nous avons ensuite testé l’effet des nanodiamants hydrogénés (ND-H) dans des lignées exprimant différentes formes de Ku70. Grâce à leurs propriétés physico-chimiques les ND-H sont capables de potentialiser sous irradiation la production intracellulaire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) et ainsi augmenter le taux des cassures (simple et double brin de l’ADN) et solliciter d’avantage le système de réparation de l’ADN. Nous observons que indépendamment de la forme exprimée de Ku70, ce double traitement induisait la sénescence cellulaire ; une découverte d’un intérêt à la fois fondamental (compréhension des voies apoptotiques vs senescence) et d’utilité pharmacologique potentielle. / We have identified a new form of phospho-S27-S33-Ku70 constitutively overexpressed in a subset of chronic lymphocytic leukemia (CLL) B cells resistant to apoptosis induced by DNA double strand breaks (DSB). Ku70 is one of the essential proteins involved in the maintenance of genomic stability through its role in DNA double strand break repair (non-homologous end-joining, NHEJ) and in telomeric protection.Laboratory previously established that resistant CLL cells disclose an upregulated NHEJ DNA repair and an impaired structure of telomeres. The goal of this thesis was to characterize the biological function(s) of this new form of Ku70. For this purpose we have constructed specific EBV-based vectors (siRNA / cDNA) enabling a simultaneous inhibition of endogenous Ku70 and an expression of different forms (mutated, wild, phosphomimetic at ser27-33) of Ku70 resistant to siRNA. Thus, we showed: i) a strict colocalisation of phospho-Ku70 with γ-H2AX foci; ii) that DSB induces the phosphorylation of Ku70 within minutes after genotoxic stress in heterodimer complex Ku70/Ku80. This phosphorylation necessitates both the physical interaction and the activity of pS2056-DNA-PKcs and/or ATM, linking phospho-Ku70 to NHEJ-mediated DNA DSB repair; iii) cells expressing mutated A27-A33-Ku70 exhibit a delayed G2/M cell cycle arrest, slower kinetic of DNA repair, lower level of genotoxic stress-induced chromosomal aberrations, and a higher cellular impedance correlated with translocation of transcriptional factor β-catenin from cytoplasmic membrane to the nucleus. Together, these data unveil an involvement of phospho-Ku70 in fast and inaccurate DNA repair; new paradigm for NHEJ regulation and to the control of resistance and maintenance of malignant cells.In parallel, we have initiated experimental approaches to explore other potential roles of phospho-Ku70. Especially, we were interested to determine whether it could play a role in an initiation of cell senescence induced by combined cells’ treatment by hydrogenated nanodiamonds (H-NDs) particles and ionizing irradiation. H-NDs exhibit positive surface charge in aqueous solutions allowing, when irradiated by photons, electrons’ emission and the release of reactive oxygen species (ROS) causing DNA damage. Effectively, we have established an intracellular increase of ROS that drive cell cycle arrest in G1/S in addition to the G2 arrest activated by irradiation alone. Finally, cells underwent the senescence process characterized byγ-galactosidaze activity, persistent large γ-H2AX foci and senescence-associated heterochromatinisation. Noteworthy, the senescence induced in this way occurred independently of Ku70 (ser27-ser33) status and irrespectively of cell resistance to genotoxic agents administrated alone; a finding of potential use in clinical trials.

Les dérivés du platine (i.e. cisplatine et oxaliplatine) représentent une des classes pharmacologiques les plus utilisées en oncologie, notamment dans les cancers colorectaux. Cependant, leur efficacité est limitée par l’émergence de résistances acquises. Nous avons alors étudié in vitro dans différentes lignées cancéreuses coliques humaines (HCT116, LoVo, SW480, HT29) les conséquences à long terme des dérivés du platine lorsqu’ils sont utilisés dans des conditions tenant compte de la sensibilité cellulaire. Ils provoquent des cassures double-brin (objectivées par l’expression de -H2AX), dont le taux dépend du système p53/p21, du complexe MRN et du niveau de stabilité microsatellitaire. Ils induisent aux plus fortes concentrations ( IC50), une cytostase qui s’accompagne de la formation de cellules géantes macrocytaires et endopolyploïdes, dont certaines acquièrent un phénotype sénescent. Dans le même temps, l’activation des mécanismes de réparation des CDB varie en fonction du dérivé du Pt et de la lignée considérée. A plus long terme, des cellules « résistantes » se développent : elles ont une ploïdie normale, et se caractérisent par une plus grande résistance aux dérivés du platine et la présence de novo d’anomalies chromosomiques récurrentes leur conférant un avantage sélectif potentiel en terme de prolifération. Ces mécanismes pourraient contribuer à expliquer en clinique la survenue d’une résistance à une chimiothérapie pourtant initialement efficace. Parallèlement, nous avons évalué in vitro et in vivo de nouveaux complexes de platine obtenus par pharmacomodulation, et associant un noyau intercalant dérivé de la phénanthroline ou de l’acridine. Les résultats in vitro montrent globalement une amélioration significative de la cytotoxicité. Toutefois, un des composés les plus cytotoxiques in vitro, le [(5,6-diméthyl-1,10-phénanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platine(II)], n’exerce pas d’effet antitumoral dans un modèle syngénique de cancer colique chez le rat BD-IX, mais montre une néphrotoxicité marquée. Ces données soulignent l’insuffisance du criblage in vitro et la discordance in vitro/in vivo. / Platinum compounds (i.e. cisplatin and oxaliplatin) represent a class of DNA-damaging agents widely used in clinic especially in the treatment of colorectal cancer. However, their effectiveness is restricted because of emergence of acquired resistance. Therefore, long-term effects of platinum compounds, used at conditions reflecting the in vitro cellular sensibility, were assessed in vitro in several human colon cancer cell lines (HCT116, LoVo, SW480, HT29). Their cytotoxicity is related to double-strand break formation (objectived by -H2AX expression), which depends on p53/p21 status, MRN complex and microsatellite stability of the cell line. Furthermore, at the highest concentrations ( IC50), cells stopped their proliferation and exhibited phenotypic alterations resulting from progressive polyploidy and/or senescence. In the same time, DNA repair systems are activated differently according to the platinum derivate and the cell line. At later stages, cells that are more resistant to platinum compounds than their parental counterpart emerged. They have recovered their basal level of ploidy and acquired de novo recurrent chromosomal aberrations. Such mechanisms could contribute to the recurrence of clinical malignancies, even after an effective initial response to chemotherapy. On the other hand, pharmacological evaluation of new platinum compounds with phenanthroline or acridine intercalating ligand was performed in vitro and in vivo. Globally, many compounds exhibited a higher cytotoxic effect than cisplatin or oxaliplatin in all cell lines studied. Unfortunately, in vivo investigations of one of the most cytotoxic compounds ([(5,6-dimethyl-1,10-phenanthroline) (S,S-diaminocyclohexane)platinum(II)]) did not exhibit antitumor effect in BD-IX rats bearing peritoneal carcinomatosis, whatever the route of administration used (systemic or local), but it displayed nephrotoxicity. These results query the in vitro/in vivo correlation and reconsider the place of the in vivo screening.

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Introduction: Chronic myeloid leukaemia is a blood cancer which progresses from a chronic phase to an acute blast crisis if untreated. Disease progression and treatment resistance may be precipitated by the mutator action of BCR/ABL protein tyrosine kinase (PTK), but only few protein phosphosites involved in the DNA damage response have been investigated with respect to BCR/ABL action. Aim: The aim of this PhD project was to demonstrate that BCR/ABL PTK expression can affect the response to genotoxic stress signalling at the protein phosphorylation level. Methodology: Etoposide-induced DNA damage response has been studied in control and BCR/ABL PTK-expressing Ba/F3 cells using apoptosis and γH2AX assays. Quantitative phosphoproteomics was performed with iTRAQ peptide labelling to discover putative modulated phosphorylation sites. Absolute quantification (AQUA ) performed with selected reaction monitoring was used to validate discovery phosphoproteomics. The effect of genotoxic stress on the THO complex protein Thoc5/Fmip was studied using western blots. Results: The expression of BCR/ABL PTK induced γH2AX phosphorylation after etoposide exposure. This was associated with the modulation of H2AX tyrosine 142 phosphorylation, MDC1 (serines 595 and 1053) and Hemogen serine 380 phosphorylation among proteins regulated by both BCR/ABL PTK and etoposide. We identified that leukaemogenic PTKs mediate Thoc5/Fmip phosphorylation on tyrosine 225 via Src proto-oncogene and oxidative stress, while ATM and MEK1/2 may control its phosphorylation. Human CD34+ CD38- leukaemic stem cells showed pronounced level of THOC5/FMIP tyrosine phosphorylation. Expression of phosphomutant Thoc5/Fmip Y225F might reduce apoptosis mediated by etoposide and H2O2. Conclusion: BCR/ABL PTK can sustain, create, block and change the intensity of protein phosphorylation related to genotoxic stress. Modulation of H2AX, MDC1, Hemogen and Thoc5/Fmip post-translational modifications by BCR/ABL PTK might promote unfaithful DNA repair, genomic instability, anti-apoptotic signalling or abnormal cell differentiation, resulting in leukaemia progression.

The evolutionary pressure to prevent re-replication by inactivating licensing during S phase leaves higher-eukaryotes with large genomes, such as human cells, vulnerable to replication stresses. Origins licensed in G1 must be sufficient to complete replication as new origins cannot be licensed in response to irreversible replication fork stalling. Interdisciplinary approaches between cellular biology and biophysics predict that replication of the genome is routinely incomplete in G2, even in the absence of external stressors. The frequency of converging replication forks that never terminate due to irreversible stalling (double fork stall), which result in a segment of unreplicated DNA, was modelled using high quality origin-mapping data in HeLa and IMR-90 cells. From this, hypotheses were generated that related an increase in unreplicated segments of DNA to reduced functional origin number. Presented in this thesis is the confirmation of this relation by quantifying chromosome mis-segregation and DNA damage responses when origin number was reduced using RNAi against licensing factors. The number of ultrafine anaphase bridges and 53BP1 nuclear bodies are in remarkable concordance with the theoretical predictions for the number of double fork stalls, indicating that cells are able to tolerate under-replication through such post-replicative cellular responses. 53BP1 preferentially binds to chromatin associated with large replicons, and functions synergistically with dormant origins to protect the stability of the genome. Additional candidates, inspired by common fragile site research, have also been characterised as responders to spontaneous under-replication, and include FANCD2 and MiDAS, which function in early mitosis to facilitate completion of replication before cells enter anaphase. In conclusion, a series of mechanisms that sequentially function throughout the cell cycle protects the stability of the human genome against inevitable spontaneous under-replication brought about by its large size.

Comprendre les modes d'interaction des rayonnements ionisants avec la matière vivante, notamment lors de l'exposition à de faibles doses telles que celles que l'on peut trouver dans un environnement industriel ou dans la nature, reste un enjeu majeur pour l'évaluation du risque associé. Il s'agit d'un problème de société qui n'a pu malheureusement trouver de réponse dans les études épidémiologiques classiques dans la mesure où les quelques données fiables concernent plutôt des expositions accidentelles à des doses beaucoup plus élevées. L'exposition naturelle représente pourtant la première source dans la vie courante juste devant les sources d'origines médicales (radiologie, radiothérapie). Ce type d'exposition est très difficile à reproduire en laboratoire sur des lignées cellulaires. La méthode principalement utilisée, basée sur l'irradiation aléatoire de populations cellulaires, consiste à calculer le nombre moyen de particules ayant interagi par cellule et repose ainsi sur des lois de distribution statistique (loi de Poisson). En plus des inévitables impacts multiples, la variété des cibles intracellulaires touchées (noyau, cytoplasme), les effets indirects induits par les impacts sur les cellules voisines ou simplement extracellulaires sont autant de phénomènes qui compliquent alors sérieusement l'interprétation des données.<br /><br />Dans ce contexte, un microfaisceau de particules  a été développé au CENBG pour réaliser des irradiations ciblées à l'échelle sub-cellulaire avec une précision de quelques micromètres. Il est ainsi possible de contrôler le nombre exact de particules délivrées par cellule (jusqu'à la dose ultime d'un ion par cellule), de prédéterminer avec précision le point d'impact et d'irradier certaines cellules tout en vérifiant la réponse de cellules voisines.<br /><br />La validation de ce dispositif a été réalisée au cours de ce travail de thèse, sur des kératinocytes humains exprimant une protéine recombinante nucléaire fluorescente (histone H2B-GFP) en mettant en évidence des dommages nucléaires radio-induits spécifiques et dose-dépendant. La combinaison de techniques telles que le microfaisceau d'ions, la microscopie confocale et l'analyse quantitative numérique a permis de mesurer, in situ et à l'échelle de la cellule unique, la cinétique de phosphorylation de la protéine histone H2A.X et d'aborder ainsi l'étude des processus de réparation de l'ADN et d'induction de l'apoptose. Les résultats expérimentaux ont validé la méthodologie développée en démontrant la reproductibilité du tir et le contrôle de la dose grâce à la mise en évidence d'une relation dose-effet qui a été également étudiée en fonction du temps.

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The structure, function and accessibility of epidermal skin provide aunique opportunity to study the DNA damage response (DDR) of a normaltissue. The in vivo response can be examined in detail, at a molecularlevel, and further associated to the structural changes, observed at atissue level. We collected an extensive skin biopsy material frompatients undergoing fractionated radiotherapy for 5 to 7 weeks. Several end-points inthe DDR pathways were examined before, during and after the treatment. Quantification of DNA double strand break (DSB) signalling focirevealed a hypersensitivity to doses below 0.3Gy. Furthermore, aconsiderable amount of foci persisted between fractions. The low dosehypersensitivity was observed throughout the treatment and was alsoobserved for several key parameters further downstream in the DDR-pathway, such as p21-associated checkpoint activation, apoptosisinduction and reduction in basal keratinocyte density (BKD).Furthermore, for dose fractions above 1.0 Gy, a distinct acceleration inDDR was observed half way into treatment. This was manifested as anaccelerated loss of basal keratinocytes, mirrored by a simultaneousincrease in DSBs and p21 expression. Quantifications of mitotic events revealed a pronounced suppression ofmitosis throughout the treatment which was clearly low dosehypersensitive. Thus, no evidence of accelerated repopulation could beobserved for fraction doses ranging from 0.05 to 2Gy. Our results suggest that the keratinocyte response primarily isdetermined by checkpoints, which leads to pre-mitotic cell elimination by permanent growth arrest and apoptosis. A comparison between the epidermal and dermal sub-compartments revealsa consistent up-regulation of the DDR response during treatment. Adifference was however observed in the recovery phase after treatment,where miR-34a and p21 remain up-regulated in dermis more persistentlythan in epidermis. Our observations suggest that the recovery phaseafter treatment can provide important clues to understand clinicalobservations such as the early and late effects observed in normaltissues during fractionated radiotherapy.

Ionisierende Strahlung verursacht in Abhängigkeit von den strahlenphysikalischen Eigenschaften der Radionuklide Zellschäden unterschiedlicher Komplexität. An humanen Lymphozyten wurde untersucht, ob die biologische Wirksamkeit von Alpha- und Betastrahlung sowie der Einfluss von Doxorubicin der Qualität des Strahlenschadens zugewiesen werden kann. Die DNA-Schäden und deren Reparatur wurden mit zellbiologischen Methoden quantifiziert.