O vírus linfotrópico de células T humanas (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus descrito e está etiologicamente ligado a duas principais doenças: a leucemia/linfoma de célula T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Apenas 0,3 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem essas doenças associadas, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda não está totalmente esclarecido. Atualmente, uma abordagem promissora no entendimento de mecanismos, bem como na fisiopatogênese das infecções virais tem sido a avaliação da função de microRNAs (miRNAs). Há poucos dados na literatura envolvendo estas moléculas na infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+ bem como no estabelecimento da doença HAM/TSP. No presente estudo, foi avaliada a expressão de miRNAs dos linfócitos T CD4+ isolados de portadores sem HAM/TSP (HAC), pacientes HAM/TSP e indivíduos sadios (CT) por meio de PCR em tempo real. A análise do perfil de expressão dos miRNAs nessas células revelou que 56 e 10 miRNAs apresentavamse mais 1,5 vezes aumentados no grupo HAM/TSP e HAC, respectivamente. O miR- 125b-1-1 apresentou expressão significamente maior no grupo HAC e o miR-146a, no grupo HAM/TSP. A análise in silico de predição de alvo demonstrou que o gene IFNG era potencialmente alvo do miR-125b-1-1 e os genes IRAK1 e TRAF6 do miR- 146a. Foi demonstrado que a expressão do IFNG no grupo HAC era 1,3 vezes mais elevado que o grupo CT e 1,8 vezes mais elevado no grupo HAM que no grupo CT. Houve um aumento na expressão de TRAF6 de 15,7 e 1,5 vezes nos grupos HAM/TSP e HAC, respectivamente. Não foi observada diferença na expressão de IRAK1 entre os três grupos. O ensaios de superexpressão do miR-125b-1-1 alterou a expressão do IFNG e do miR-146a alterou a expressão do gene IRAK1 e sua proteína. Os resultados evidenciados neste trabalho ressaltam a importância dos miRNAs na modulação de genes e proteínas importantes durante a infeção pelo HTLV-1. A correlação entre o miR-125b-1-1 e gene IFNG sugere que este miRNA esteja envolvido nos mecanismos de desenvolvimento de HAM/TSP. Além disso, a interação entre o miR-146a e os genes IRAK1 e TRAF6 sugerem que este miRNA esteja relacionado a mecanismos de persistência viral da infecção pelo HTLV-1 em linfócitos T CD4+. / Human T-cell lymphotropic vírus type 1 (HTLV-1) was the first human retrovirus discovered and it is related with two major diseases: adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and HTLV-1 -associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TS). About 0.3 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1 related diseases, while the majority will remain life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development is noy well elucidated. Currently, a promising approach on understanding the mechanisms as well as physiopathogenesis of viral infections has been the evaluation of the role of microRNAs (miRNAs) roles. There are few data involving CD4+ T cells miRNA expression in HTLV-1 infection as well as HAM/TSP establishment. To identify miRNAs differentially expressed in CD4+ T cells among non-infected individuals (CT), asymptomatic (HAC) and HAM/TSP patients we applied quantitative real time PCR. The analysis of miRNA expression profile in these cells showed 56 and 10 miRNAs upregulated 1.5 times in HAM/TSP and HAC groups, respectively. miR- 125b-1-1 was upregulated in HAC group and miR-146a in HAM/TSP. In silico analysis of target prediction showed that IFNG was a potentially miR-125b-1-1 target and IRAK1 and TRAF6 were miR-146a targets. IFNG expression was 1.3 higher in HAC than CT group and 1.8 higher in HAM/TSP than CT group. It was observed that TRAF6 expression was 15.7 and 1.5 times higher in HAM/TSP and HAC groups, respectively. There was no difference of IRAK1 expression among the three groups. Overexpression assays of miR-125b-1-1 altered IFNG expression and overexpression of miR-146a altered IRAK1 gene and protein expression. The results revealed that miRNAs modulate genes and proteins during HTLV-1 infection. miR- 125b-1-1 and IFNG gene correlation suggests that miR-125b-1-1 seems to contribute to HAM/TSP development. Besides, miR-146a and IRAK1 and TRAF6 interaction suggests that miT-146a seems to contribute to HTLV-1 establishment in CD4+ T cells.

MicroRNAs (miRNAs) são RNA de fita simples (22 nucleotídeos) que atuam como reguladores da expressão gênica celular. Estudos recentes têm demonstrado o papel dos miRNAs como moduladores da resposta celular frente às infecções virais. O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus que apresenta genes estruturais comuns aos demais, além dos genes tax e rex, os quais dão origem às proteínas regulatórias. Entre elas, destaca-se a oncoproteína Tax, que é capaz de modular a expressão de genes celulares e virais, além de estar associada ao desencadeamento de patologias. Destacam-se duas manifestações clínicas associadas: a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). Fatores relacionados ao hospedeiro também estão correlacionados ao aparecimento das patologias. No intuito de estabelecer se miRNAs humanos podem influenciar em processos celulares que se encontram desregulados pela Tax (diferenciação, transdução de sinais, apoptose, proliferação celular e tumorigênese), o objetivo deste projeto foi analisar a expressão de miRNAs em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de indivíduos infectados HTLV-1. Para tanto, realizamos análises in silico para mapear alvos de miRNAs humanos no gene tax do HTLV-1. Foram utilizados dois algoritmos (miRanda e RNAhybrid), com os seguintes parâmetros: score de 120 na região da semente; energia livre de até -15 kcal/mol. Assim, selecionou-se os hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Adicionalmente, foi observado que as regiões do gene tax, onde se ligam os miRNAs selecionados, são extremamente conservadas entre os diferentes subtipos de HTLV-1. Após estas análises in silico, realizou-se a validação dos miRNAs eleitos. Para tanto, foram isolados PBMC de 21 amostras de indivíduos-controle (CT), 10 portadores assintomáticos do HTLV-1 (HAC) e 12 com HAM/TSP (HAM). Do total de células, 1x106 tiveram seu DNA genômico extraído para quantificação da carga proviral (CPV) pela metodologia de PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR); 1x106 foram criopreservadas para quantificação de Tax por citometria de fluxo; 1x 107células foram utilizadas na extração de RNA para validação dos miRNAs por qRT-PCR. A fase orgânica do Trizol® foi utilizada para extração de proteínas totais e posterior análise da expressão de Tax por Western blot. A CPV apresentou-se significativamente aumentada (p= 0,0046) no grupo HAM, quando utilizado teste de Mann-Whitney. A expressão de Tax apresentou correlação significativa (p=0,0128) com a CPV, pelo teste de Spearmann e auxiliou na caracterização dos pacientes. O nível de expressão dos miRNAs foi avaliado nos grupos: CT vs Pacientes e CT vs HAC vs HAM por testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-wallis, respectivamente. Os miRNAs se mostraram desregulados no grupo de pacientes quando comparado ao grupo CT. Dentre estes, o hsa-miR-125b encontra-se aumentado significativamente no grupo de pacientes em relação ao controle (p=0,0285). Utilizou-se o teste de correlação de Spearmann, para associar a expressão de Tax com os miRNAs, porém os resultados encontrados não foram significativos. Apesar de não estar correlacionado com expressão de Tax, o hsa-miR-125b é responsável pela regulação de diversas proteínas, como TNF-, uma proteína inflamatória hiper-expressa em portadores do HTLV-1. Deste modo, acreditamos que este miRNA estaria aumentado proporcionalmente na tentativa de inibir a tradução desta proteína. Os resultados deste projeto sugerem a importância de esclarecer como os miRNAs humanos podem regular a infecção pelo HTLV-1 e gerar informações para o desenvolvimento de estratégias que possam interferir com a replicação e patogênese viral. / MicroRNAs (miRNAs) are simple strand RNA (22 nucleotides), which are regulators of cellular gene expression. Recent studies have been showed miRNAs role as modulators of cellular responses, when viral infection occurs. The human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a retrovirus that presents the same regular structural genes compared to the other retrovirus, besides tax and rex genes, which encode regulatory proteins. In regard to this, Tax oncoprotein is a major determinant of viral persistence and pathogenesis. Two major diseases are related to this virus adult T cell leukemia (ATLL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Host-related factors are also correlated with HAM/TSP development. To establish if human miRNAs could influence in the unregulated cellular process caused by Tax (differentiation, signal transduction, apoptosis, cellular proliferation and tumorigenesis), this study analyzed miRNA expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from HTLV-1 infected patients. For this purpose, we performed in silico analyses to find human miRNAs that could targeted HTLV-1 tax region. We performed two algorithms (miRanda e RNAhybrid) and we set up two distinct parameters: score more than 120 in the seed region and minimum free energy until -15 kcal/mol. So, we have selected these hsa-miRNAs:149a, 648, 221, 222, 142-5p, 26a, 29a, 374 e 125b. Besides this, we compared several HTLV-1 sub-types and we observed that regions, where miRNAs are regulating, are extremely conserved. After the in silico analysis, we validated miRNAs that we have been chosen. We isolated PBMC samples from 21 control-individuals (CT), 10 from asymptomatic carriers and 12 from HAM/TSP (HAM). After the procedure, genomic DNA were extracted from 1x106 cells, in order to quantify the proviral load (PL) performing quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR). Tax was measured by flow cytometry and for this procedure, we used 1x106 criopreserved cells. Amount 1x 107cells were used to total RNA extraction that was used to miRNAs validation by qRT-PCR. The organic phase from Trizol® was employed to extract total proteins, which were used to analyze Tax expression by Western blot. The PL was significantly higher in HAM group than HAC (p= 0,0046), when Mann-Whitney statistical test was employed. The Tax expression was significantly correlated to PL (p=0,0128) by Spearmann test and this finding provided us a better characterization of the patients. The miRNAs expression was detected in the following groups: CT vs Patients and CT vs HAC vs HAM by non-parametrical tests Mann-Whitney and Kruskal-wallis, respectively. The miRNAs presented unregulated themselves in the patient group, when we compared to CT group. We observed that hsa-miR-125b expression are significantly higher in patients group than controls (p=0,0285). We have tried to associate miRNAs with Tax expression, employing Spearmann test, but this analysis did not show significant values. Despite this, hsa-miR-125b is responsible for regulating several proteins, such as TNF-, which is an inflammatory protein overexpressed in HTLV-1 carriers. In conclusion, we propose that this miRNA could be increased as a way to inhibit TNF- translation. These results suggest the importance in understanding how human miRNAs could regulated the HTLV-1 infection. In addition to this, they could generate data to be used as therapeutic strategies for the control of viral replication and pathogenic processes.

MALTA, T.M. Análise do perfil de expressão gênica em linfócitos T CD8+ isolados de pacientes infectados pelo HTLV-1. 2009. 137f. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) foi o primeiro retrovírus humano descrito e está etiologicamente associado a duas principais manifestações clínicas: a leucemia ou linfoma de células T do adulto (ATLL) e a mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP). É estimado que 3 a 5% das pessoas infectadas pelo HTLV-1 desenvolvem as doenças associadas, enquanto a maioria permanece assintomática. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central e o mecanismo pelo qual o HTLV-1 induz o surgimento de HAM/TSP ainda é questão de debate. Os linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTL) têm uma participação importante na resposta imunológica dirigida contra o HTLV-1 e a eficiência com que as CTLs eliminam as células infectadas pelo vírus está relacionada com a carga proviral (CPV) do indivíduo e consequentemente com o risco de desenvolvimento de HAM/TSP. No presente trabalho, foram avaliados os perfis de expressão gênica de linfócitos T CD8+ isolados de portadores assintomáticos (HAC), pacientes com HAM/TSP (HAM/TSP) e de indivíduos sadios (CT) por meio da metodologia de Serial Analysis of Gene Expression (SAGE). Os linfócitos T CD8+ utilizados foram isolados por meio de separação imunomagnética e um pool composto de quatro indivíduos infectados para cada grupo, HAC e HAM/TSP foi utilizado para a construção das bibliotecas. A análise do SAGE resultou num total de 51.017, 62.432 e 60.620 tags sequenciadas para as bibliotecas CT, HAC e HAM/TSP, respectivamente, o que permitiu a identificação de aproximadamente 12.000 transcritos diferentes em cada biblioteca. Foram identificados cerca de 900 genes diferencialmente expressos entre as bibliotecas CT e HAC ou HAM/TSP. A comparação dos grupos HAC e HAM/TSP revelou 290 genes. Um grande número destes genes diferencialmente expressos está envolvido com os processos de apoptose, adesão e migração celular. Os achados foram validados pela metodologia de PCR em tempo real em um total de 17 indivíduos assintomáticos, 14 com HAM/TSP e 24 indivíduos sadios. A validação evidenciou o aumento da expressão dos genes envolvidos na lise mediada por células PRF1, GZMB e GZMH, além do aumento de CCL5, ZAP70 e PXN nos indivíduos infectados pelo HTLV-1. Além disso, os resultados mostraram redução nos níveis de expressão de CXCR4 nesses pacientes. Adicionalmente, foi realizada a quantificação dos níveis protéicos de PRF1 e GZMB por citometria de fluxo e os resultados corroboraram com a PCR em tempo real. O perfil gênico dos linfócitos T CD8+ demonstrou a ocorrência de intensa ativação e migração celular durante a infecção pelo HTLV-1. Essas evidências indicam que as células CD8+ dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 parecem contribuir mais para a proteção e controle da infecção pelo vírus, e menos para o desenvolvimento de HAM/TSP. Este foi o primeiro trabalho a analisar a expressão global de linfócitos T CD8+ nesta infecção por meio de SAGE e permitiu a geração de dados que serão empregados em diferentes abordagens na pesquisa com HTLV-1. / MALTA, T.M. Serial Analysis of Gene Expression in CD8+ T-cells isolated from HTLV-1 infected individuals. 2009. 137f. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) was the first human retrovirus discovered and is related with two major diseases: adult T cell lymphoma/leukaemia (ATLL) and HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). About 3 to 5% of infected individuals will develop HTLV-1 related diseases, while the majority remains life-long asymptomatic carriers of the virus. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of central nervous system and the mechanism involved in HAM/TSP development are not well elucidated. CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) have an important function in the immune response against the HTLV-1 and is related with the individual proviral load and so in the risk of HAM/TSP. To identify genes differentially expressed among non-infected individuals, asymptomatic (HAC) and HAM/TSP (HAM/TSP) patients we performed a serial analysis of gene expression (SAGE) using CD8+ T cells isolated from these individuals. The CD8+ T lymphocytes were isolated by magnetic cell separation system and HAC and HAM/TSP SAGE libraries were composed by pooled of four samples. SAGE analysis of 51,017, 62,432 and 60,620 tags from control, HAC and HAM/TSP groups respectively, allowed identification of approximately 12,000 different transcripts in each library. The expression profile revealed around 900 genes differentially expressed between control group and HAC or HAM/TSP, and 290 genes were identified between HAC and HAM/TSP groups. The expression profile revealed the presence of highly frequent transcripts related to apoptosis, cell adhesion and cell migration. These results were validated by real time PCR in 17 HTLV-1 asymptomatic carriers, 14 patients with HAM/TSP and 24 healthy individuals. The validation revealed the increased levels of expression of the cytolysis genes PRF1, GZMB and GZMH, and the increases of CCL5, ZAP70 and PXN in the HTLV-1 infected individuals. Besides, the CXCR4 was suppressed in these patients. Additionally, we performed the protein quantification of PRF1 and GZMB by flow cytometry and the real time PCR results were confirmed. The CD8+ T cells profiles showed strong cell activation and cell migration in HTLV-1 infection. These data suggests that CD8+ T cells from HTLV-1 individuals seem to contribute more to the protection and virus infection control than to the HAM/TSP development. This study represents the first extensive serial analysis of gene expression of CD8+T cells in HTLV-1 infection and allowed to generate data that will be used in different approaches in HTLV-1 research.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-07T18:26:27Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO MARIELE GUERRA(PPGIM).pdf: 2138129 bytes, checksum: 16fc71d570a0b0413b7ccbe7d4b343f7 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-02-08T16:13:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO MARIELE GUERRA(PPGIM).pdf: 2138129 bytes, checksum: 16fc71d570a0b0413b7ccbe7d4b343f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-08T16:13:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO DE MESTRADO MARIELE GUERRA(PPGIM).pdf: 2138129 bytes, checksum: 16fc71d570a0b0413b7ccbe7d4b343f7 (MD5) / Capes / O vírus linfotrópico de células T humana tipo 1 (HTLV-1) é encontrado no mundo todo. A infecção pelo HTLV-1 é caracterizada por uma resposta imune exacerbada, com produção espontânea de IFN- e TNF. Estas citocinas são responsáveis por aumentar a expressão de quimiocinas e moléculas de adesão e facilitar a entrada de linfócitos ativados para o sistema nervoso central (SNC). O objetivo deste estudo foi avaliar o papel de quimiocinas e moléculas de adesão na patogênese da infecção pelo HTLV-1. Quimiocinas pró-inflamatórias (CXCL9 e CXCL10) e moléculas de adesão solúveis (sICAM-1 e sVCAM-1) foram determinadas por ELISA, no soro e líquor de diferentes grupos de indivíduos infectados pelo HTLV-1 (portador assintomático, indivíduos com bexiga hiperativa e HAM/TSP). Frequência e mediana de intensidade de fluorescência (MIF) de linfócitos e de monócitos expressando ligantes das moléculas de adesão (CD11a e CD49d) e receptor de quimiocinas (CXCR3) foram analisadas por citometria de fluxo. CXCL9 e CXCL10 estavam mais elevados tanto no soro quanto no líquor dos pacientes com HAM/TSP (p>0,05). As moléculas de adesão não diferiram entre os grupos, apesar da tendência de maior produção de sVCAM-1 na HAM/TSP. sVCAM-1 correlacionou-se positivamente com quimiocinas no soro dos indivíduos infectados pelo HTLV-1 (p>0,05). De modo geral, a MIF de células CD4+, CD8+ e CD14+ expressando CD11a e CXCR3 foi menor na HAM/TSP. Estes achados confirmam a participação das quimiocinas na migração das células infectadas pelo HTLV-1 para o SNC e sugerem, porém não são suficientes para atestar a participação das moléculas de adesão na patogênese da HAM/TSP.

Submitted by Edileide Reis (leyde-landy@hotmail.com) on 2015-04-15T04:30:49Z No. of bitstreams: 1 Victor Almeida Cardoso de Oliveira Arnaut.pdf: 1120575 bytes, checksum: 7d6d91fc543f3fbe7dc1a5293fd94129 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T04:30:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Victor Almeida Cardoso de Oliveira Arnaut.pdf: 1120575 bytes, checksum: 7d6d91fc543f3fbe7dc1a5293fd94129 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / A mielopatia associada ao HTLV-1 ou paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) é uma doença desmielinizante crônica e progressiva e que afeta predominantemente a medula espinal. O equilíbrio e a locomoção nos indivíduos acometidos ficam comprometidos e exige alternativas terapêuticas para a reabilitação. Objetivo: Verificar o efeito da Wii Terapia como recurso terapêutico adicional no tratamento de pacientes com HAM/TSP, verificando impactos no equilíbrio, dor e qualidade de vida. Metodologia: Ensaio clínico randomizado duplo cego realizado com 9 indivíduos com diagnóstico confirmado pelos critérios da OMS, divididos em dois grupos – G1 que realizou exercícios terapêuticos associado ao uso de jogos do Nintendo Wii e G2 que realizou somente exercícios terapêuticos. Todos os participantes foram submetidos a uma avaliação da dor pela escala visual analógica (EVA) e do equilíbrio pela escala de Berg, responderam a um questionário sobre qualidade de vida (SF-36), antes e depois das 10 sessões. Os dados foram analisados através dos testes T pareado (intra grupo) e não pareado (inter grupo), com alfa de 5% , poder de 80% e IC 95%. Resultados: Na análise intra grupo foi encontrada diferença apenas no escore da Escala de Berg e dos domínios capacidade funcional e aspectos emocionais do grupo teste (p<0,05). Na comparação do delta dos escores entre os grupos, os domínios aspectos emocionais (p=0,027) e capacidade funcional (p=0,054) foram diferentes entre os grupos. Conclusão: A terapia com realidade virtual usando o Nintendo Wii demonstrou impacto positivo superior em relação ao protocolo de exercícios funcionais sobre o equilíbrio e sobre os domínios de capacidade funcional e aspectos emocionais na qualidade de vida dos participantes.

O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico de duas principais manifestações clínicas, a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical (HAM/TSP) e a leucemia/linfoma de células T do adulto (ATLL). O desenvolvimento de HAM/TSP, uma doença neuroinflamatória crônica é relacionada a uma complexa interação entre vírus e resposta imunológica do hospedeiro. A expressão do gene viral tax desempenha um papel importante na patogênese da HAM/TSP pela ativação de diversos genes celulares, incluindo genes das citocinas inflamatórias IFN-? e TNF- Recentemente, os exossomos surgiram como um importante fator na comunicação célula-célula contribuindo em diversos processos celulares, inclusive na modulação do sistema imunológico. Considerando o potencial papel dos exossomos na imunomodulação e no processo inflamatório, o objetivo deste trabalho foi avaliar se os exossomos produzidos por células infectadas pelo HTLV-1 carreiam moléculas virais e se poderiam participar dos processos de imunomodulação e inflamação crônica observados na HAM/TSP. Os exossomos foram isolados de células infectadas pelo HTLV-1 da linhagem celular C8166, avaliados quanto à presença de RNAm viral tax e testados quanto à capacidade de ativar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) à indução de resposta inflamatória. Neste trabalho, foi observado que, após a exposição de PBMC aos exossomos contendo RNAm viral tax, a expressão da citocina inflamatória IFN-? foi aumentada em linfócitos T CD4+ e CD8+ quando comparado ao grupo não exposto aos exossomos. Foi observado um pequeno aumento de TNF-? no grupo exposto aos exossomos. Não houve diferença na expressão das citocinas IL-4, perforina e granzima B. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que exossomos contendo tax isolados de células infectadas pelo HTLV-1 induzem a produção de citocinas inflamatórias ativam a resposta imunológica de padrão Th1, e não Th2. Estes achados podem contribuir na elucidação do papel dos exossomos na infecção pelo HTLV-1 e nos estudos relacionados à patogênese da HAM/TSP e à resposta inflamatória envolvendo a apresentação clínica desta doença. / Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the etiological agent of HTLV-1 associated myelopathy/tropical paraparesis spastic (HAM/TSP) and adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL). The development of HAM/TSP, a chronic neuroinflammatory disease, is correlated to a complex host-virus dynamic immune response interaction. Tax expression plays an important role in HAM/TSP pathogenesis by activating various cellular genes, including the cytokines IFN-? and TNF-?. Exosomes have emerged as an important factor of cell-to-cell communication contributing to diverse cellular processes, including immune modulation. Considering the potential role of exosomes in modulating the immune response and inflammation, the main objective of this study was to examine if HTLV-1-infected cells produce exosomes can carry viral tax mRNA, and if they can can participate in the chronic inflammation observed in patients with HAM/TSP. Exosomes were isolated from HTLV-1-infected cell line culture, evaluated for the tax mRNA presence and tested for the ability to activate peripheral mononuclear cells (PBMC) in inducing an inflammatory immune response. We observed that the proinflammatory cytokine IFN-? was upregulated in CD4 and CD8 T-cells after treatment of the PBMC with Tax carrying exosomes compared to the negative control. The expression of TNF-? was slightly upregulated. IL-4, Granzyme B and Perforin did not show alterations. Taken together, these results suggest that exosomes carrying Tax isolated from HTLV-1-infected cells might induce the production of proinflammatory cytokines and activate T helper (Th)1, and not Th2, immune response. This study may have important impact on the studies involving the pathogenesis of HAM-TSP and the inflammatory response involved in the clinical presentation of the disease.

O HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) foi o primeiro retrovírus humano a ser identificado. É comprovadamente o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T no adulto (ATLL) e da paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV (HAM/TSP). Porém se evidencia que o vírus possa estar relacionado a várias outras manifestações sistêmicas. A Síndrome de Sjögren (SS) é uma das desordens que têm sido associada ao HTLV-1. Embora a infecção pelo HTLV seja reconhecidamente endêmica no Brasil, não há informações sobre essa associação na população brasileira. Este trabalho propõe-se a investigar a prevalência de SS em pacientes infectados pelo HTLV e a prevalência de HTLV em pacientes diagnosticados com SS. Exames sorológicos para investigação do HTLV foram realizados em 50 pacientes da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP) que apresentavam queixas compatíveis com a SS (grupo 1). No Instituto de Infectologia Emílio Ribas foram avaliados 129 pacientes HTLV+ que passaram pelo processo diagnóstico para a SS (grupo 2). Nenhum dos pacientes do grupo 1 apresentou soropositividade para o HTLV. No grupo 2, 46 (35,7%) apresentaram algum grau de xerostomia, 18 (13,95%) apresentaram xeroftalmia, 8 (6,2%) apresentaram hipossalivação, 2 (1,55%) apresentaram fluxo lacrimal alterado e 1 paciente (0,77%) apresentou autoanticorpos reagentes (anti-SSB). Foram executadas biópsias incisionais de glândulas salivares menores em 5 pacientes do grupo 2. Apenas 2 pacientes (1,55%) HTLV+ completaram os critérios para o diagnóstico de SS. A SS mostrou ser três vezes mais prevalente em pacientes HTLV+ do IIER do que nos pacientes que buscaram atendimento no serviço de Otorrinolaringologia da ISCMSP. / HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) was the first human retrovirus identified. It is proven to be the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) and of a neurological disease known as HTLV-1 associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). However, there is the evidence that the virus could be related to several other systemic manifestations. Sjögren\'s Syndrome (SS) is one of the disorders that have been associated with HTLV-1. Although HTLV infection is known to be endemic in Brazil, there is no information about this association in Brazilian population. This study proposes to investigate the prevalence of SS among patients infected with HTLV and the prevalence of HTLV among patients diagnosed with SS. Serological tests for HTLV were performed in 50 patients from Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP) with complaints compatible with the SS (group 1). At Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas (IIER), 129 HTLV+ patients were evaluated and the diagnostic process for SS was performed (group 2). None of the patients in group 1 was positive for HTLV. In group 2, 46 (35.7%) reported any degree of xerostomia, 18 (13.95%) had xerophtalmia, hyposalivation was present in 8 (6.2%) patients and decrease in tear secretion, in only one patient (0.77%) the auto-antibodies was positive ( Anti-SSB). Incisional biopsies of labial minor salivary glands were executed in 5 patients in group 2. Only 2 HTLV+ patients (1.55%) have fulfilled the classification criteria for SS. SS proved to be three times more prevalent in HTLV patients from IIER than in patients who sought care in the service of Otorhinolaryngology at ISCMSP.

O HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) foi o primeiro retrovírus humano a ser identificado. É comprovadamente o agente etiológico da leucemia/linfoma de células T no adulto (ATLL) e da paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV (HAM/TSP). Porém se evidencia que o vírus possa estar relacionado a várias outras manifestações sistêmicas. A Síndrome de Sjögren (SS) é uma das desordens que têm sido associada ao HTLV-1. Embora a infecção pelo HTLV seja reconhecidamente endêmica no Brasil, não há informações sobre essa associação na população brasileira. Este trabalho propõe-se a investigar a prevalência de SS em pacientes infectados pelo HTLV e a prevalência de HTLV em pacientes diagnosticados com SS. Exames sorológicos para investigação do HTLV foram realizados em 50 pacientes da Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP) que apresentavam queixas compatíveis com a SS (grupo 1). No Instituto de Infectologia Emílio Ribas foram avaliados 129 pacientes HTLV+ que passaram pelo processo diagnóstico para a SS (grupo 2). Nenhum dos pacientes do grupo 1 apresentou soropositividade para o HTLV. No grupo 2, 46 (35,7%) apresentaram algum grau de xerostomia, 18 (13,95%) apresentaram xeroftalmia, 8 (6,2%) apresentaram hipossalivação, 2 (1,55%) apresentaram fluxo lacrimal alterado e 1 paciente (0,77%) apresentou autoanticorpos reagentes (anti-SSB). Foram executadas biópsias incisionais de glândulas salivares menores em 5 pacientes do grupo 2. Apenas 2 pacientes (1,55%) HTLV+ completaram os critérios para o diagnóstico de SS. A SS mostrou ser três vezes mais prevalente em pacientes HTLV+ do IIER do que nos pacientes que buscaram atendimento no serviço de Otorrinolaringologia da ISCMSP. / HTLV-1 (human T-cell lymphotropic virus type 1) was the first human retrovirus identified. It is proven to be the etiological agent of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL) and of a neurological disease known as HTLV-1 associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). However, there is the evidence that the virus could be related to several other systemic manifestations. Sjögren\'s Syndrome (SS) is one of the disorders that have been associated with HTLV-1. Although HTLV infection is known to be endemic in Brazil, there is no information about this association in Brazilian population. This study proposes to investigate the prevalence of SS among patients infected with HTLV and the prevalence of HTLV among patients diagnosed with SS. Serological tests for HTLV were performed in 50 patients from Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo (ISCMSP) with complaints compatible with the SS (group 1). At Institute of Infectious Diseases Emilio Ribas (IIER), 129 HTLV+ patients were evaluated and the diagnostic process for SS was performed (group 2). None of the patients in group 1 was positive for HTLV. In group 2, 46 (35.7%) reported any degree of xerostomia, 18 (13.95%) had xerophtalmia, hyposalivation was present in 8 (6.2%) patients and decrease in tear secretion, in only one patient (0.77%) the auto-antibodies was positive ( Anti-SSB). Incisional biopsies of labial minor salivary glands were executed in 5 patients in group 2. Only 2 HTLV+ patients (1.55%) have fulfilled the classification criteria for SS. SS proved to be three times more prevalent in HTLV patients from IIER than in patients who sought care in the service of Otorhinolaryngology at ISCMSP.

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T14:08:18Z No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Perfil de ativação... 2014 .pdf: 1722380 bytes, checksum: 909bc68a97d8e0a06206d205cd3557f7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T14:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raimundo Coutinho Junior. Perfil de ativação... 2014 .pdf: 1722380 bytes, checksum: 909bc68a97d8e0a06206d205cd3557f7 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / O vírus linfotrópico das células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da mielopatia associada ao HTLV / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP ), que ocorre em menos de 5 % dos indivíduos infectados. A resposta imune controla parcialmente a infecção, porém pode estar ligada a patogênese da doença. O objetivo deste estudo foi caracterizar fenotipicamente as subpopulações de linfócitos T, em pacientes assintomáticos e com diagnóstico de HAM/TSP. Foram avaliados 103 pacientes acompanhados no Centro de HTLV da Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública (EBMSP) e 19 controles não infectados. Os pacientes foram categorizados de acordo com o grau de certeza do diagnóstico de HAM/TSP: possível (Ps), provável (Pb) e definido (D), além de pacientes assintomáticos (ASS). O perfil fenotípico (CD25, CD45RA, CD45RO, HLA-DR, CD25, CCR-7, CD62L) das subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+ e a expressão da proteína Tax de FoxP3 na subpopulação T CD4+ foram avaliados por citometria de fluxo. A carga proviral do HTLV foi quantificada por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. As proporções dos linfócitos TCD4+HLA-DR+ e TCD8+HLA-DR foram significativamente maiores nos pacientes com HAM/TSP Ps, Pb e D comparados aos controles não infectados (p=0,003). Comparando-se o grupo de infectados, as proporções de linfócitos TCD4+ e TCD8+ expressando HLA-DR foram significantemente maiores em pacientes com HAM/TSP-Ps e D comparados a pacientes assintomáticos (p<0,0001). Além disso, houve uma correlação positiva entre porcentagem de linfócitos T CD4+ HLA-DR+ e a carga proviral (r=0,5, p=0,0003). As proporções de linfócitos T CD4+CD25+ foram maiores nos pacientes com HAM/TSP D comparados aos controles não infectados. Observou-se um aumento na proporção de células reguladoras (T CD4+FOXP3+) nos indivíduos assintomáticos e nos pacientes com HAM/TSP-D comparados a indivíduos não infectados (p=0,04). A carga proviral HTLV-1 foi maior no grupo de pacientes HAM/TSP-D do que em pacientes assintomáticos (p=0,0001). Observa-se uma diferença estatística entre a proporção de células CD4+TAX+ dos indivíduos assintomáticos (0,26%) e os pacientes HAM/TSP-Ps (5,26%) (p=0,04). Em conclusão, os pacientes com HAM/TSP Ps, Pb e D apresentam um perfil fenotípico de ativação celular, comparados aos controles não infectados. Além disso, os pacientes com HAM/TSP Pb e D apresentam maior expressão de HLA-DR nas subpopulações de linfócitos T CD4+ e T CD8+, comparados aos assintomáticos, indicando um perfil imunológico semelhante nestes dois subgrupos de pacientes. / The human T-cell lymphotropic vírus type 1(HTLV-1) is the etiological agent of HTLV- associated myelopathy/ Tropical spastic paraparesis(HAM/TSP), wich occurs in less then 5% of the infected individuals. The immune response partially controls the infection, but may be linked to the pathogenesis of disease. The aim of this study was to characterize phenotipically T lymphocyte subpopulations in asymptomatic and in patients diagnosed with HAM/TSP. We evaluated 103 patients treated at the center for HTLV of Bahia School of Medicine and Public Health (EBMSP) and 19 uninfected controls. Patients were categorized as asymptomatic and according to the degree of certainty of the diagnosis of HAM/TSP: Possible(Ps), Probable(Pb) and Definite(D). The phenotypic profile (CD25, CD45RA, CD45RO, HLA-DR, CCR-7, CD62L) subpopulation of CD4+ and CD8+ T Cells and expression of the protein Tax and Foxp3 in the subpopulation CD4+ T cells were evaluated by flow cytometry. The HTLV proviral load was quantified by polymerase chain reaction (PCR) in real time. The proportions of CD4+ and CD8+ expressing HLA-DR+ were significantly higher in patients (p<0.0001). In addition there were a correlation between CD4+ HLA-DR+ or CD8+ HLA-DR+ and the proviral load(R=0,5;p<0,0001). The proportions of CD4+CD25+ were higher in patients with HAM/TSP D compared to infected controls. There was an increased proportion of regulatory cells (CD4+Foxp3+) of asymptomatic individuals and patients HAM/TSP D, compared to the uninfected individuals (p=0.04). . There is a statistical difference between the proportion of CD4+TAX+ asymptomatic individuals (0.26%) patients and HAM/TSP-Ps (5.26%) (p = 0.04 ) . In conclusion, patients with HAM/TSP Ps, Pb and D exhibit a phenotypic profile of cell activation, compared to uninfected controls. In addition, patients with HAM/TSP Pb and D show higher expression of HLA -DR in subpopulations of T lymphocytes CD4+ and CD8+ T cells, compared to asymptomatic, indicating an immunological profile similar in both groups of patients

La paraparésie spastique tropicale ou la myélopathie associée à HTLV-1 (TSP/HAM) est une maladie neurologique chronique caractérisée par le développement de paralysies spastiques des membres inférieurs et de déficits sensoriels divers. Une infiltration périvasculaire souvent observée dans le système nerveux central des patients atteints de TSP/HAM correspondant essentiellement à des lymphocytes T CD4+, cibles préférentielles du HTLV-1 in vivo. Cependant, le facteur déclencheur du processus inflammatoire de la TSP/HAM est toujours méconnu. De ce fait, nous nous sommes intéressés à l'étude de l'implication d'une nouvelle population inflammatoire des T CD4+, les TH17, dans cette pathologie. Une quantification de l'expression de l'ARNm d'IL-17, la cytokine inflammatoire sécrétée par les TH17, a été menée sur les cellules du sang périphérique issues de patients infectés ainsi que sur des lignées cellulaires chroniquement infectées par HTLV-1. L'expression élevée de l'IL-17 détectée dans les lignées cellulaires est corrélée avec celle de la protéine transactivatrice du HTLV-1, Tax. Par ailleurs, Tax induit l'expression du régulateur transcriptionnel clé des TH17, RORγ, par l'intermédiaire de la cytokine pro-inflammatoire Ostéopontine. Finalement, nous avons pu montrer l'existence d'une relation dynamique entre l'expression de l'ARNm de Tax, OPN, RORγ, IL-17 et IL-22 chez les patients asymptomatiques et TSP/HAM avec une expression d'IL-17 et d'IL-22 plus élevée chez le groupe des TSP/HAM. Nos résultats suggèrent que l'infection par HTLV-1 in vivo induirait une réponse TH17 qui pourrait avoir un rôle majeur dans la pathogenèse de la TSP/HAM. / HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) is a neurological inflammatory disease of the central nervous system characterized by a chronic, progressive inflammatory demyelinating myelopathy. It is thought that the pathogenesis of this disease involves a predominant infiltration of CD4+ T cells which are the main subset of in vivo infected cells with HTLV-1. However, until now, the identity of the triggering factor which promotes the inflammatory process in HAM/TSP remains unclear. Therefore, we investigated the implication of the new CD4+ T cells inflammatory lineage TH17 in this disease. We quantified the mRNA expression levels of IL-17, a cytokine associated with the TH17 response, in peripheral blood from 10 HAM/TSP patients, 6 healthy asymotomatic carriers (HCs) and 4 normal uninfected controls as well as in HTLV-1-infected T-cell lines. Elevated production of IL-17 observed in HTLV-1-infected T-cell lines was correlated with the expression of Tax, the major HTLV-1 regulatory protein. Thus, we established that Tax increases the expression of RORγ, the TH17-lineage specific transactivator, by inducing Osteopontin expression, an inflammatory cytokine known to promote TH17 response. Finally, we demonstrated a dynamic relationship between the expression of Tax, Osteopontin, RORγ, IL-17 and IL-22 mRNAs in HCs and HAM/TSP patients, where higher expression of IL-17 and IL-22 were observed in HAM/TSP cases. These findings suggest that in vivo infection by HTLV-1 may lead to a deleterious deviation of CD4+ T Helper response to TH17, that could play a major role in HAM/TSP pathogenesis.