Dans cette thèse, nous nous intéressons au problème de recherche incrémentale de motifs dans des séquences fortement similaires (On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences), issues de technologies de séquençage à haut débit (SHD). Ces séquences ne diffèrent que par de très petites quantités de variations et présentent un niveau de similarité très élevé. Il y a donc un fort besoin d'algorithmes efficaces pour effectuer la recherche rapide de motifs dans de tels ensembles de séquences spécifiques. Nous développons de nouveaux algorithmes pour traiter ce problème. Cette thèse est répartie en cinq parties. Dans la première partie, nous présentons un état de l'art sur les algorithmes les plus connus du problème de recherche de motifs et les index associés. Puis, dans les trois parties suivantes, nous développons trois algorithmes directement dédiés à la recherche incrémentale de motifs dans un ensemble de séquences fortement similaires. Enfin, dans la cinquième partie, nous effectuons une étude expérimentale sur ces algorithmes. Cette étude a montré que nos algorithmes sont efficaces en pratique en terme de temps de calcul / In this thesis, we are interested in the problem of on-line pattern matching in highly similar sequences, On-line Pattern Matching on Highly Similar Sequences, outcoming from Next Generation Sequencing technologies (NGS). These sequences only differ by a very small amount. There is thus a strong need for efficient algorithms for performing fast pattern matching in such specific sets of sequences. We develop new algorithms to process this problem. This thesis is partitioned into five parts. In the first part, we present a state of the art on the most popular algorithms of finding problem and the related indexes. Then, in the three following parts, we develop three algorithms directly dedicated to the on-line search for patterns in a set of highly similar sequences. Finally, in the fifth part, we conduct an experimental study on these algorithms. This study shows that our algorithms are efficient in practice in terms of computation time.

Les objectifs de cette thèse s’inscrivent dans la large problématique du traitement des données issues de séquenceurs à très haut débit, et plus particulièrement des reads longs, issus de séquenceurs de troisième génération.Les aspects abordés dans cette problématiques se concentrent principalement sur la correction des erreurs de séquençage, et sur l’impact de la correction sur la qualité des analyses sous-jacentes, plus particulièrement sur l’assemblage. Dans un premier temps, l’un des objectifs de cette thèse est de permettre d’évaluer et de comparer la qualité de la correction fournie par les différentes méthodes de correction hybride (utilisant des reads courts en complément) et d’auto-correction (se basant uniquement sur l’information contenue dans les reads longs) de l’état de l’art. Une telle évaluation permet d’identifier aisément quelle méthode de correction est la mieux adaptée à un cas donné, notamment en fonction de la complexité du génome étudié, de la profondeur de séquençage, ou du taux d’erreurs des reads. De plus, les développeurs peuvent ainsi identifier les limitations des méthodes existantes, afin de guider leurs travaux et de proposer de nouvelles solutions visant à pallier ces limitations. Un nouvel outil d’évaluation, proposant de nombreuses métriques supplémentaires par rapport au seul outil disponible jusqu’alors, a ainsi été développé. Cet outil, combinant une approche par alignement multiple à une stratégie de segmentation, permet également une réduction considérable du temps nécessaire à l’évaluation. À l’aide de cet outil, un benchmark de l’ensemble des méthodes de correction disponibles est présenté, sur une large variété de jeux de données, de profondeur de séquençage, de taux d’erreurs et de complexité variable, de la bactérie A. baylyi à l’humain. Ce benchmark a notamment permis d’identifier deux importantes limitations des outils existants : les reads affichant des taux d’erreurs supérieurs à 30%, et les reads de longueur supérieure à 50 000 paires de bases. Le deuxième objectif de cette thèse est alors la correction des reads extrêmement bruités. Pour cela, un outil de correction hybride, combinant différentes approches de l’état de l’art, a été développé afin de surmonter les limitations des méthodes existantes. En particulier, cet outil combine une stratégie d’alignement des reads courts sur les reads longs à l’utilisation d’un graphe de de Bruijn, ayant la particularité d’être d’ordre variable. Le graphe est ainsi utilisé afin de relier les reads alignés, et donc de corriger les régions non couvertes des reads longs. Cette méthode permet ainsi de corriger des reads affichant des taux d’erreurs atteignant jusqu’à 44%, tout en permettant un meilleur passage à l’échelle sur de larges génomes et une diminution du temps de traitement, par rapport aux méthodes de l’état de l’art les plus efficaces. Enfin, le troisième objectif de cette thèse est la correction des reads extrêmement longs. Pour cela, un outil utilisant cette fois une approche par auto-correction a été développé, en combinant, de nouveau, différentes méthodologies de l’état de l’art. Plus précisément, une stratégie de calcul des chevauchements entre les reads, puis une double étape de correction, par alignement multiple puis par utilisation de graphes de de Bruijn locaux, sont utilisées ici. Afin de permettre à cette méthode de passer efficacement à l’échelle sur les reads extrêmement longs, la stratégie de segmentation mentionnée précédemment a été généralisée. Cette méthode d’auto-correction permet ainsi de corriger des reads atteignant jusqu’à 340 000 paires de bases, tout en permettant un excellent passage à l’échelle sur des génomes plus complexes, tels que celui de l’humain. / The aims of this thesis are part of the vast problematic of high-throughput sequencing data analysis. More specifically, this thesis deals with long reads from third-generation sequencing technologies. The aspects tackled in this topic mainly focus on error correction, and on its impact on downstream analyses such a de novo assembly. As a first step, one of the objectives of this thesis is to evaluate and compare the quality of the error correction provided by the state-of-the-art tools, whether they employ a hybrid (using complementary short reads) or a self-correction (relying only on the information contained in the long reads sequences) strategy. Such an evaluation allows to easily identify which method is best tailored for a given case, according to the genome complexity, the sequencing depth, or the error rate of the reads. Moreover, developpers can thus identify the limiting factors of the existing methods, in order to guide their work and propose new solutions allowing to overcome these limitations. A new evaluation tool, providing a wide variety of metrics, compared to the only tool previously available, was thus developped. This tool combines a multiple sequence alignment approach and a segmentation strategy, thus allowing to drastically reduce the evaluation runtime. With the help of this tool, we present a benchmark of all the state-of-the-art error correction methods, on various datasets from several organisms, spanning from the A. baylyi bacteria to the human. This benchmark allowed to spot two major limiting factors of the existing tools: the reads displaying error rates above 30%, and the reads reaching more than 50 000 base pairs. The second objective of this thesis is thus the error correction of highly noisy long reads. To this aim, a hybrid error correction tool, combining different strategies from the state-of-the-art, was developped, in order to overcome the limiting factors of existing methods. More precisely, this tool combines a short reads alignmentstrategy to the use of a variable-order de Bruijn graph. This graph is used in order to link the aligned short reads, and thus correct the uncovered regions of the long reads. This method allows to process reads displaying error rates as high as 44%, and scales better to larger genomes, while allowing to reduce the runtime of the error correction, compared to the most efficient state-of-the-art tools.Finally, the third objectif of this thesis is the error correction of extremely long reads. To this aim, aself-correction tool was developed, by combining, once again, different methologies from the state-of-the-art. More precisely, an overlapping strategy, and a two phases error correction process, using multiple sequence alignement and local de Bruijn graphs, are used. In order to allow this method to scale to extremely long reads, the aforementioned segmentation strategy was generalized. This self-correction methods allows to process reads reaching up to 340 000 base pairs, and manages to scale very well to complex organisms such as the human genome.

Les gliomes constituent les plus fréquentes des tumeurs malignes primaires du système nerveux central. Les liens qui existent entre ces tumeurs et un certain nombre de cancers rares héréditaires, comme les Neurofibromatoses I et II ou les syndromes de Turcot et de Li-Fraumeni, attestent d’une prédisposition génétique aux gliomes. L’observation d’un risque deux fois plus élevé de développer un gliome chez les parents de premier degré de patients atteints suggère aussi une possible prédisposition génétique dans les gliomes sporadiques. Par ailleurs, l’analyse à haut débit permet de préciser le profil somatique des gliomes et d’identifier des biomarqueurs pronostiques voire prédictifs et s’inscrire dans une démarche de traitement personnalisé du patient. Durant ma thèse, je me suis focalisé sur deux axes de recherches complémentaires; l’identification de gènes de susceptibilité et la découverte de nouveaux gènes fréquemment mutés dans les gliomes, afin de déterminer les voies de signalisation contribuant à la gliomagenèse. Dans leur ensemble, les résultats obtenus dans cette thèse apportent non seulement des informations importantes sur la nature de la prédisposition génétique aux gliomes mais également de son association spécifique pour les différents sous-types de tumeurs. La découverte d’un nouveau gène muté, offre la perspective à plus long terme d’un traitement personnalisé pour chaque patient sur la base du profil génétique de sa tumeur. / Gliomas are the most common adult malignant primary tumour of the central nervous system. Thus far, no environmental exposures has been linked to risk except for ionizing radiation, which only accounts for a very small number of cases. Direct evidence for inherited predisposition to glioma is provided by a number of rare inherited cancer syndromes, such as Turcot's and Li–Fraumeni syndromes, and neurofibromatosis. Even collectively, these diseases however account for little of the twofold increased risk of glioma seen in first-degree relatives of glioma patients. My research was centred on two complementary research activities: Identifying susceptibility genes for glioma to delineate key biological pathways contributing to disease pathogenesis and to identify new recurrent mutated genes for glioma to provide for further insights into glial oncogenesis and suggesting targets for novel therapeutic strategies. Collectively the findings in this thesis provide increased insight into the nature of genetic predisposition to glioma and substantiate the often distinct associations between susceptibility variants and glioma molecular groups. In addition the discovery of a new mutated gene in glioma offers the potential to support drug development and advance precision medicine for this tumours.

Les LPSNC représentent une localisation rare des lymphomes B diffus à grandes cellules (LBDGC), d’immunophénotype post-GC, dont la tumorigenèse reste mal connue.Notre objectif était de caractériser les altérations moléculaires des LPSNC à l’aide de techniques d’analyse haut débit.Notre projet a montré comme principaux résultats : 1/ la haute fréquence de mutations touchant des gènes impliqués dans la voie de signalisation BCR/TLR/NF-κB, en particulier MYD88, CD79B et TBL1XR1 ; 2/ des déséquilibres chromosomiques récurrents, en particulier la perte du 6q22 et du 6p (locus HLA) ; 3/ des mutations du promoteur de TERT et 4/ des transcrits de fusions ETV6-IGH.Plusieurs altérations semblent être des biomarqueurs pronostiques (i.e perte du 6q22 et délétions homozygotes de CDKN2A), prédictifs de réponse au traitement ou des cibles prometteuses pour des thérapies innovantes.En conclusion, il existe une grande similitude entre le profil moléculaire des LPSNC et celui des LBDGC extra-cérébraux avec néanmoins quelques spécificités. Les LPSNC peuvent résulter d’une tumorigenèse propre mais aussi de son microenvironnement singulier. / PCNSL represent a rare extranodal diffuse large B cell lymphoma (DLBCL) with a post-GC phenotype whose tumorigenesis is still poorly unknown.Our objective was to characterize the molecular genetic alterations of PCNSL using high throughput technologies.Results: We demonstrated 1/ a high incidence of somatic mutations in genes involved in the BCR/TLR/NF-κB pathway, especially MYD88, CD79B and TBL1XR1; 2/ recurrent chromosome imbalances such as 6q22 loss and 6q (HLA locus) homozygous deletions; 3/ TERT promoter mutations and 4/ gene fusions such as ETV6-IGH. Several alterations are associated with a prognostic impact (6q22 loss and CDKN2A homozygous deletions) or are promising targets for novel therapies.To conclude, PCNSL and extracerebral DLBCL share many similarities in terms of molecular genetic profile despite some specificities. PCNSL may result from a specific tumorigenesis but also from its peculiar microenvironment.

Le poisson Astyanax mexicanus est un modèle particulièrement intéressant pour l'étude de l'évolution. En effet, dans cette espèce de poissons d'eau douce, il existe des populations vivant de façon pérenne dans des grottes. Dans cet environnement, l'obscurité est totale et permanente et les ressources en nourriture souvent faibles. Les poissons cavernicoles se sont adaptés à la vie souterraine et ils présentent de nombreuses modifications phénotypiques comme la dépigmentation, la perte des yeux, l’augmentation du nombre et de la taille d’organes sensoriels non-visuels et plusieurs changements du comportement. Un des problèmes majeurs est de savoir si ces modifications phénotypiques sont dues à des mutations préexistantes à la colonisation de l'environnement cavernicole ou si elles sont apparues après. Pour répondre à cette question, connaître l'âge des populations est un facteur important car dans une population récente, il n'y aura probablement pas eu suffisamment de temps pour l'apparition de beaucoup de mutations et leur fixation. L'objet de cette thèse est donc l'estimation de l'âge d'une population, celle de la grotte Pachón qui est souvent considérée comme étant une des plus anciennes et une des plus isolées. Au cours de ces travaux de thèse, nous avons développé une nouvelle méthode de datation qui repose d’une part sur la caractérisation du polymorphisme nucléotidique à l’intérieur de chaque population et entre populations, et d’autre part la comparaison de ces données avec des simulations de l’évolution du polymorphisme. Les résultats obtenus, ainsi que la réanalyse de données sur le polymorphisme d’haplotypes mitochondriaux et de loci microsatellites précédemment publiées, suggèrent que les populations cavernicoles seraient bien plus récentes qu’habituellement indiqué dans la littérature (quelques milliers d’années, et non plusieurs centaines de milliers d’années). Les conséquences d’un tempo rapide d’évolution sur le mode d’évolution de ces poissons cavernicoles ont aussi été présentées. / The fish Astyanax mexicanus is a particularly suitable model for evolutionary biology studies. Indeed, in this species there are several subterranean populations which live in the total and permanent darkness of cave. These cavefish are well adapted to the life in this inhospitable environment and they show several differences with their surface conspecific such as depigmentation, eye loss and behavioral changes. A major unresolved issue is about the relative role of surface fish standing genetic variation and de novo mutations appeared in cavefish populations after their settlement in caves in their phenotypic evolution. In order to examine this issue, accurate estimations of population ages are very important because many new mutations cannot appear and fix in a recent population. In this thesis we aimed to estimate the age of the Pachón cave population which is considered as one of the oldest and most isolated populations. We developed a new method which is based on measures of the distribution of single nucleotide polymorphism within each population and between populations. Our results, as well as reanalyses of published data about mitochondrial haplotypes and microsatellite loci polymorphism suggest that cavefish populations are much more recent than previously thought (several thousand years and not several hundred thousand years). The consequences of a fast tempo of evolution on the mode of evolution of cavefish are also discussed.

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) est le lymphome avec phase circulante le plus fréquent chez l’adulte dans les pays occidentaux. Elle est caractérisée par une grand hétérogénéité dans son évolution naturelle avec des formes indolentes ne nécessitant jamais de traitement spécifique et des formes agressives requérant une chimiothérapie rapidement après le diagnostic. Dans ce travail de thèse, nous avons posé la question du rôle des anomalies moléculaires et en particulier des gènes des immunoglobulines dans l’histoire naturelle de la maladie, tant au plan mécanistique que pour le pronostic. Nous avons étudié trois remaniements atypiques impliquant un gène des immunoglobulines et un partenaire inconnu dans la LLC/lymphome lymphocytique. Les points de cassure ont pu être identifiés et nous ont permis de mettre en évidence l’implication dans 2 cas d’ARN longs non codants en 17q25 et 8q24. De plus, deux cas ont des points de cassure dans une région chromosomique restreinte (espacés de 200 kb en 17q25). Il pourrait s’agir d’un locus important dans la lymphomagénèse, de même que pour la région 8q24 contenant MYC et de nombreux gènes non codants jusqu’ici peu explorés. Par ailleurs, dans l’ère du séquençage haut débit, de nombreux marqueurs pronostiques moléculaires sont décrits dans la LLC. Nous avons démontré que l’électrophorèse des protéines sériques normale (immunoglobulines polyclonales sans hypogammaglobulinémie) au diagnostic, un marqueur simple et peu couteux, reste dans l’ère du NGS, un marqueur indépendant de bon pronostic dans la LLC. Sa combinaison avec un statut IGHV muté identifie un groupe de patients qui n’auront probablement jamais besoin de traitement spécifique. Ce travail nous a conduit à mettre au point un outil performant de détection des anomalies de nombre de copies par séquençage haut débit. Celui-ci permet la mise en évidence de disomies uniparentales dont la signification pronostique n’est actuellement pas établie dans la LLC. Ces anomalies pourraient être le reflet d’une instabilité chromosomique et il serait intéressant d’étudier leur impact pronostique dans la LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most frequent lymphoma with leukemic phase in the elderly in Western countries. It is characterized by a great heterogeneity in its natural history with indolent forms never requiring any specific treatment and aggressive forms needing chemotherapy rapidly after diagnosis. In this work of thesis, we asked the question of the role of molecular abnormalities, and in particular of the immunoglobulin genes in the natural history of the disease, at mechanistic level and for prognosis. We studied three atypical rearrangements implicating an immunoglobulin gene and an unknown partner in CLL/lymphocytic lymphoma. The breakpoints have been identified and the implication of long non coding RNA was highlighted in two cases in 17q25 and 8q24. Moreover, two cases harboured breakpoints in a restricted chromosomic region (200 kb spaced in 17q25). It could be an important locus in lymphomagenesis, as is 8q24 region containing MYC and numerous other non coding genes poorly characterized by now. Furthermore, in high throughput sequencing (HTS) era, many molecular prognosis markers have been described in CLL. We demonstrated that normal serum protein electrophoresis (polyclonal immunoglobulin without hypogammaglobulinemia) at diagnosis, a simple and unexpensive marker, stays in HTS era an independent good prognosis marker in CLL. Its combination with unmutated IGHV genes status identifies a group of patients who will probably never require any specific treatment. This work led us to develop an efficient tool to detect copy number variations by THS. This tool allows to highlight uniparental disomy whose prognosis signification is not established in CLL. These abnormalities could reflect chromosomal instability and it could be interesting to study their prognosis impact in CLL.

Les cancers pédiatriques représentent la première cause de décès par maladie chez les enfants puisque 20% des patients présentent des résistances et rechutent. Les traitements actuels sont à leurs limites d'efficacité mais aussi de toxicité. L'amélioration des connaissances de la biologie des tumeurs résistantes et l'identification de nouvelles cibles moléculaires sont nécessaires pour ces pathologies rares, extrêmement diverses et mal comprises. Les oncogènes de fusion sont responsables de l’oncogenèse de ~ 20% des cancers. En raison de la biologie particulière des cancers pédiatriques, nous avons émis l'hypothèse qu’ils seraient dus à des oncogènes de fusion. Leur exploration, particulièrement à la rechute où les données actuelles sont limitées, permettrait de mieux comprendre ces pathologies et d’introduire de nouvelles cibles thérapeutiques. Notre premier objectif était de détecter de nouveaux transcrits de fusion parmi 48 patients pédiatriques en rechute inclus dans l'essai de médecine de précision MOSCATO-01 mené à Gustave Roussy. A partir de données de RNA-seq, nous avons détecté l’ensemble des fusions retrouvées dans ces tumeurs et classé les plus pertinentes selon leur fonction et leur potentiel thérapeutique. Un nouvel oncogène de fusion nommé LMO3-BORCS5 retrouvé chez un patient atteint de sarcome d'Ewing dans les biopsies tumorales à la rechute et au diagnostic, et dans diverses lignées cellulaires a particulièrement retenu notre attention. Nos études fonctionnelles montrent que LMO3-BORCS5 a un rôle important dans la tumorigenèse et la sensibilité au traitement et que BORCS5 fonctionnerait, in vivo, comme un gène suppresseur de tumeur. Ces résultats montrent le rôle critique des transcrits de fusion dans l'initiation et la progression tumorale ainsi que dans l’acquisition de résistance au traitement et que les fusions isolées ne doivent pas être ignorées. A l'avenir, la prise en charge des cancers réside en une médecine moléculaire de précision, les oncogènes de fusions représentant l'un des outils les plus remarquables en clinique. / Pediatric cancers represent the first cause of death by disease in children as 20% of patients harbor resistances and die from recurrence of the malignancy. Nowadays treatment are at their limits of efficacy but also toxicity. Improving the knowledge on the biology of the relapsed/resistant tumors and identifying new molecular targets are needed for these rare, extremely diverse and misunderstood pathologies. Fusion oncogenes are known to be major drivers of oncogenesis, responsible for ~20% of cancers. Due to their particular biology, we hypothesized that pediatric tumors would be more likely to harbor fusions and that their exploration, especially at relapse where very limited data are available, could help to understand the particularity of these malignancies and consequently to provide new therapeutic targets. Our first aim was to detect new fusion transcripts in a cohort of 48 pediatric patients at relapse included in the precision medicine trial MOSCATO-01, previously conducted in Gustave Roussy. From the RNA-seq data, we described the landscape of fusions in these tumors and classified the most confident candidates according to their biological function and druggability predictions. A new fusion named LMO3-BORCS5 found in biopsies of a patient with Ewing's sarcoma, at diagnosis and at relapse as well as in various cell lines particularly caught our attention. Functional studies showed that LMO3-BORCS5 has a high impact on tumorigenesis and treatment sensitivity and that BORCS5 would act, in vivo, as a tumor suppressor gene. Our results strengthened the critical role of fusion transcripts in tumor initiation, progression and resistance and reinforces the idea that a private fusion oncogene should not be ignored. Indeed, the future of cancer care lays in precision medicine, with fusion transcripts being one of the most remarkable tool for treatment decision.

Le système RUSH, de l’anglais « Retention using selective hook » est un système développé récemment qui permet d'analyser et de quantifier en temps réel le transport d'une grande diversité de protéines. Le système RUSH permet, grâce à un excès de molécules de Streptavidine (Str.) dirigées dans différents compartiments cellulaires (appelées les hameçons), de retenir des protéines appelées les rapporteurs, comportant un biocapteur fluorescent tel que la GFP (« Green fluorescent protein ») fusionné avec un peptide SBP (« Streptavidin-binding peptide »). L’addition de biotine dans le milieu perturbe l’interaction entre SBP et la Streptavidine, libérant ainsi les rapporteurs de leur hameçon. Basé sur le système RUSH, nous avons établi une méthode de criblage pour identifier des agents pharmacologiques dotés de la capacité à induire la libération d’HMGB1 (« High Mobility Group Box 1 »). La translocation d’HMGB1 depuis le noyau vers le cytoplasme, ainsi que sa sécrétion ou libération passive dans l'espace extracellulaire à travers les membranes plasmiques perméabilisées, représente un signal de danger essentiel à l’activation du système immunitaire. Dans ce système RUSH modifié, une protéine de fusion du Str-NLS3 a été utilisée comme un hameçon nucléaire pour retenir la protéine chimère constituée d'HMGB1, SBP et GFP (HMGB1-SBP-GFP). Lorsque de la biotine est ajoutée en combinaison à des chimiothérapies inductrices de la mort cellulaire immunogène (ICD) telles que les anthracyclines, elle se lie de manière compétitive à Str-NLS3 et permet la libération et la translocation nucléo-cytoplasmique des rapporteurs HMGB1-SBP-GFP. Nous avons utilisé ce système pour des criblages à haut débit visant à identifier des agents induisant le relargage d’HMGB1. Les agents identifiés appartiennent à trois catégories différentes : les inducteurs connus de l’ICD, les inhibiteurs des microtubules et les modificateurs épigénétiques. Leur effet a été confirmé par des méthodes multiples de mesure de la quantité protéique d’HMGB1 nucléaire, cytoplasmique et extracellulaire dans des cellules humaines et murines in vitro ainsi que dans le plasma de souris. Nos données révèlent également que ces agents induisent la libération d’HMGB1 par des mécanismes distincts : arrêt du cycle cellulaire, acétylation des histones ou effets « on-target » par l'inhibition d’ADN méthyltransférase. Il serait alors intéressant d'étudier si les effets décrits ici peuvent contribuer aux effets immunostimulateurs des médicaments utilisés pour le traitement de cancers ou de maladies parasitaires.Le système RUSH permettant la synchronisation et la quantification de la sécrétion des protéines du réticulum endoplasmique (RE) vers l'appareil de Golgi, il permet de cribler un grand nombre de composés afin d’identifier des inhibiteurs des sécrétions candidates. Nous avons conçu et construit une lignée cellulaire humaine exprimant les chimères SBP-GFP sécrétables ainsi que les hameçons Str-KDEL ciblant l’ER ; la biotine permet donc la libération du rapporteur par les voies de sécrétion classiques. Nous avons identifié et validé plusieurs médicaments qui sont capables d’inhiber la sécrétion de protéines : les anti-angineux, les antidépresseurs, les anti-helminthiques, anti-psychotiques, anti-protozoaires, et agents immunosuppresseurs. Ces composés varient dans leur capacité à inhiber la synthèse des protéines et de compromettre la morphologie du RE ou l'intégrité du Golgi. Les données ont ensuite été soumises à une analyse bio-informatique et cette procédure a permis l'identification de quatre groupes en fonction de leur mode d'action. Cette partie démontre la faisabilité et l'utilité d'un nouvel essai de criblage phénotypique basé sur le système RUSH. Nous avons conçu des systèmes de HSC (« High Content Screening ») basés sur le système RUSH, qui ont permis l'identification d'agents pharmacologiques induisant la libération d’HMGB1, ainsi que des inhibiteurs de la sécrétion protéique. / The retention using selective hooks (RUSH) system allows withholding load cargoes with fluorescent biosensor such as green fluorescent proteins (GFP) fused to a streptavidin-binding peptide (SBP) by an excess of streptavidin (Str) molecules that are addressed to different subcellular localizations. Addition of biotin competitively disrupts this interaction, liberating the reporter from its hook. Based on the RUSH system, we developed a screening assay to identify pharmacological agents endowed with HMGB1 (high mobility group box 1) releasing capacities. The translocation of HMGB1 from the nucleus to the cytoplasm and its secretion or passive release through the permeabilized plasma membrane constitutes a major cellular danger signal. Extracellular HMGB1 can interact with specific pattern recognition receptors to stimulate pro-inflammatory and immunostimulatory pathways. In this modified RUSH system, a Str-NLS3 fusion protein was used as a nuclear hook to seize SBP fused with HMGB1 and GFP. When combined with biotin, which competitively binds to Stre-NLS3 to free the HMGB1-SBP-GFP, immunogenic cell death (ICD) inducers such as anthracyclines were able to cause the nucleo-cytoplasmic translocation of HMGB1-SBP-GFP. We used this system for high-content screenings (HCS) to identify HMGB1 releasing agents. Hits fell into three functional categories: known ICD inducers, microtubule inhibitors, and epigenetic modifiers. Their effective action was confirmed by multiple methods monitoring nuclear, cytoplasmic and extracellular HMGB1 pools, both in cultured human or murine cells, as well as in mouse plasma. These agents induced HMGB1 release through a whole set of distinct mechanisms, cell cycle arrest, histone acetylation, or on-target effect. It will be interesting to learn whether such effects may contribute to the immunostimulatory effects of drugs that are used to treat malignant disease or worm infection. For HCS of identification of pharmacological inhibitors of conventional protein secretion, we constructed a human cell line co-expressing soluble secretory-SBP-GFP (ss-SBP-GFP) and Str-KDEL hook within the endoplasmic reticulum (ER) lumen, and biotin addition releases the reporter, ss-SBP-GFP via the conventional Golgi-dependent protein secretion pathway into the culture supernatant. We identified and validated a series of molecularly unrelated drugs including antianginal, antidepressant, anthelmintic, antipsychotic, antiprotozoal and immunosuppressive agents that inhibit protein secretion. These compounds vary in their capacity to suppress protein synthesis and to compromise ER morphology and Golgi integrity, as well as in the degree of reversibility of such effects. These data was then subjected to bioinformatics analysis including correlation analyses, non-supervised hierarchical clustering, and principal component analysis and led to the identification of 4 clusters of agents. We demonstrate the feasibility and utility of a novel RUSH-based phenotypic screening assay. In summary, we built HCS systems based on the improved RUSH sysytem for identification of agents that induce HMGB1 release or inhibit conventional protein secretion.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d’infections nosocomiales sévères associées à un taux élevé de mortalité. Le système de sécrétion de Type III (SST3) et les effecteurs qu’il injecte sont considérés comme des facteurs de virulence prépondérants de P. aeruginosa. Récemment nous avons caractérisé, un groupe de souches ne possédant pas les gènes du SST3, mais dont la virulence repose sur la sécrétion d’une nouvelle toxine de 172 kDa, nommée Exolysine (ExlA) qui provoque la perméabilisation de la membrane des cellules hôtes. ExlA est sécrétée dans le milieu par une porine de la membrane externe, nommée ExlB, formant ainsi un nouveau système de sécrétion à deux partenaires (TPS), ExlBA. Outre le domaine TPS du coté N-terminal de la protéine, impliqué dans sa sécrétion, ExlA possède différents domaines ; des répétitions hémagglutinines, cinq motifs Arginine-Glycine-Acide Aspartique (RGD) et un domaine C-Terminal faiblement conservé. Des tests de cytotoxicité sur des cellules eucaryotes ont montrés que la délétion du domaine C-terminal abolissait l’activité toxique d’ExlA. En utilisant un modèle de liposomes et différents types de cellules eucaryotes, comme les globules rouges, nous avons démontré qu’ExlA forme des pores membranaires de 1.6 nm. De plus, par un criblage cellulaire à haut-débit d’une banque de mutants obtenus par une mutagenèse de transposition, nous avons montré qu’un facteur bactérien additionnel était requis dans la toxicité d’ExlA. En effet, parmi les 7 400 mutants, nous avons identifiés 3 transposons insérés dans des gènes codant pour le pili de type IV, démontrant ainsi que cet appendice impliqué dans l’adhésion des bactéries participe à la toxicité d’ExlA, en permettant un contact rapproché entre la bactérie et les cellules hôtes. Un criblage de macrophages primaires de souris KO pour différentes protéines impliquées dans la voie de l’activation de l’inflammasome, nous a permis de démontrer que le pore formé par ExlA est responsable de l’activation de la Caspase-1 par l’inflammasome NLRP3 conduisant à la maturation de l’interleukine-1ß. Une étude bio-informatique a révélé la présence de gènes homologues à exlA chez d’autres espèces de Pseudomonas non pathogènes, comme P. putida, P. protegens, P. entomophila. Nous avons montré que ces bactéries environnementales sont aussi capables de provoquer une mort cellulaire dépendante de la Caspase-1. Finalement, un criblage d’une banque de macrophages dont les gènes ont été invalidés par la technologie CRISPR/cas9 a révélé que plusieurs protéines du système immunitaire, indirectement liées à l’activation de la Caspase-1 sont impliquées dans la mort cellulaire médiée par ExlA. De plus, nous avons montré que plusieurs sgRNAs ciblant un microARN, mir-741, était grandement enrichi dans les macrophages ayant résisté à une infection avec ExlA. Mir-741 régule l’expression d’enzymes (St8sIa1 et Agpat5) impliquées dans la voie de biosynthèse des sphingolipides et des glycérophospholipides, suggérant ainsi que l’activité d’ExlA requiert un environnement lipidique particulier. / Pseudomonas aeruginosa is a human opportunistic pathogen responsible for nosocomial infections associated with high mortality. The type III secretion system (T3SS) and T3SS-exported toxins have been considered as key infectivity virulence factors. Our team recently characterized a group of strains lacking T3SS, but employing a new pore-forming toxin of 172 kDa, named Exolysin (ExlA) that provokes cell membrane disruption. In this work we demonstrated that the ExlA secretion requires ExlB, a predicted outer membrane protein encoded in the same operon, showing that ExlA-ExlB define a new active Two-Partner Secretion (TPS) system. In addition to the TPS secretion signals, ExlA harbors several distinct domains, which comprise hemagglutinin domains, five Arginine-Glycine-Aspartic acid (RGD) motifs and a non-conserved C-terminal region lacking any identifiable sequence motifs. Cytotoxic assays showed that the deletion of the C-terminal region abolishes host-cell cytolysis. Using liposomes and eukaryotic cells, including red blood cells, we demonstrated that ExlA forms membrane pores of 1.6 nm. Based on a transposon mutagenesis strategy and a high throughput cellular live-dead screen, we identified additional bacterial factors required for ExlA-mediated cell lysis. Among 7 400 mutants, we identified three transposons inserted in genes encoding components of the Type IV pili, which are adhesive extracellular appendices. Type IV pili probably mediate close contact between bacteria and host cells and facilitate ExlA cytotoxic activity. These findings represent the first example of cooperation between a pore-forming toxin of the TPS family and surface appendages to achieve host cell intoxication. Using mice primary bone marrow macrophages we showed that ExlA pores provoke activation of Caspase-1 via the NLRP3-inflamasomme followed by the maturation of the pro-interleukin-1ß. Mining of microbial genomic databases revealed the presence of exlA-like genes in other Pseudomonas species rarely associated with human infections P. putida, P. protegens and P. entomophila. Interestingly, we showed that these environmental bacteria are also able to provoke Caspase-1 cleavage and pro-inflammatory cell death of macrophages. Finally, genome-wide loss-of-function CRISPR/cas9 RAW library screen revealed that several components of the immune system response, indirectly linked to Caspase-1 are involved in the ExlA-mediated cell lysis. Moreover, we found at least three sgRNAs targeting miRNA, mir-741 were highly enriched in resistant macrophages challenged by ExlA. This miRNA regulates enzymes (St8sIa1 and Agpat5) in the sphingolipids and glycerophololipids biosynthesis pathways, suggesting that ExlA activity may require proper lipid environment.

Lors du développement d’un nouvel avion, la phase précédant l’obtention du certificat de navigabilité est basée sur de nombreux essais au sol ou en vol. Dans le domaine spatial, le lancement est l’une des phases les plus critiques pour les systèmes et des essais au sol particulièrement rigoureux sont donc réalisés afin de vérifier que la charge utile ne sera pas endommagéeDes milliers de capteurs de pression ou de jauges de contrainte sont ainsi utilisés par les industriels du secteur pour ce type d’essais. Mais tous ces éléments sont aujourd’hui connectés par des fils, ce qui engendre des contraintes de temps, de coût et de limitation du nombre de capteurs. Leur remplacement par des réseaux de capteurs sans fil est une solution évidente qui permet également d’augmenter le nombre de points de mesure. Cependant, il n’existe aujourd’hui aucun protocole permettant de répondre aux attentes et besoins des professionnels de l’aéronautique et du spatial. Les travaux présentés dans cette thèse ont ainsi vocation à répondre aux besoins d’un canal de communication très haut débit, basse consommation, à faible puissance d’émission, fiable et autorisant un grand nombre de nœuds. Un prototype de couche physique basée sur un système OFDM ultra large bande a été réalisé, testé et validé, et permet d’atteindre un débit de plus de 200 Mbits/s. / To evaluate a system's compliance with its specified requirements, Hardware System Testing is conducted on the complete and integrated system. This phase is essential in all industry branches, especially in the very regulated and critical aerospace world. In the final phase of the development of an airplane, flight test equipment gathers and analyzes data during flight to evaluate the flight characteristics of the aircraft and validate its design, including safety aspects. One of the most critical tests is the measure of the pressure around the wings during flight. All new aircrafts are computer designed with the use of virtual wind tunnels. So very accurate measures have to be done on the aircraft to validate the model before the aircraft can be industrially produced. In the case of satellites, vibration and mechanical stress are two critical phenomena a satellite endures during launch. This is leading to the necessity for accurate ground tests using strain gauges or thermal sensors before allowing a launch. All such systems used by aircraft and satellite manufacturers today are wired systems. Sensors put around the wings or inside the satellite compartments are wired to a concentrator inside the cabin or the operator’s room. Although good performances are observed in terms of measurement accuracy, these systems have strong drawbacks. The two most important ones are the weight and the cost of both the systems and their installation. An additional drawback concerning its use on aircrafts is due to the installation of a system that increases the weight of the aircraft and immobilizes it during many weeks due to the routing of every cable inside the wings. The cost and the complexity of such systems don’t allow a great number of measurement points. The replacement of conventional measurement networks by wireless sensor networks is not an obvious solution. Despite the great interest in wireless sensor networks in the recent years, the technological barriers are still very numerous and there is currently no protocol to meet the expectations and needs of aviation professionals. The work presented in this thesis aims to meet the needs of a high-speed, low power consumption, low emission and reliable communication layer. Measurements have been performed in real conditions using commercial devices based on the protocol MB-OFDM/Wimedia, the most common standard that approach the need expressed, and have served to define the basis of the study and have helped to select best development tracks. Measurements have demonstrated also the specificity of the propagation channel. In order to reduce the time between the choice of algorithms and their testing in real conditions, it became necessary to use a design flow called Specification - Exploration – Improvement based on automatic synthesis tools. This development cycle has identified specific material needs for the design of the demonstrator.The physical layer is based on an OFDM system and UWB to achieve a data rate of over 150 Mb/s. A fully functional demonstrator, implemented on FPGA and composed of four communicating nodes was presented and has been used to validate the physical layer. Finally first steps to develop a digital ASIC are presented to achieve the goal of low power consumption