Les systèmes toxine-antitoxine (TA) sont de petits modules génétiques largement présents dans les génomes bactériens. Ils codent pour une petite protéine toxique et une antitoxine. Ils sont classés en six types en fonction de la nature et du mode d'action de l'antitoxine. Ce travail a porté sur l'étude du type I, pour lequel l'antitoxine est un ARN antisens qui cible l'ARNm de la toxine afin de réprimer son expression. Au cours de cette thèse, nous avons étudié le système aapA3/IsoA3, codé sur le chromosome du pathogène gastrique humain Helicobacter pylori. À ce jour, la plupart des systèmes TA ont été étudiés à l'aide de systèmes d'expression artificiels, qui ne permettent pas de caractériser la régulation transcriptionnelle ou post-transcriptionnelle. En utilisant la létalité induite par l’expression chromosomique de la toxine obtenue en absence d’antitoxine, nous avons développé une sélection génétique de mutants suppresseurs révélés par séquençage haut-débit. Cette approche, appelée FASTBAC-Seq, nous a permis de cartographier une myriade de déterminants de toxicité localisés dans les régions codantes et non codantes du gène de la toxine AapA3. En particulier, certaines de ces mutations ont révélé l'existence de tige-boucles ARN transitoires qui agissent de manière co-transcriptionnelle pour empêcher l'initiation de la traduction pendant la synthèse de l'ARNm codant pour la toxine. Ces structures ARN métastables fonctionnelles sont nécessaires pour découpler les processus de transcription et de traduction et permettent la présence de ces gènes toxiques sur le chromosome bactérien. Bien que les ARNm non traduits deviennent rapidement instables, nos travaux ont également révélé l'existence de deux tige-boucles protectrices situées aux deux extrémités de l'ARNm. Ces structures secondaires empêchent des activités exonucléolytiques agissant en 5' et 3'. Dans l’ensemble, notre travail met en évidence les conséquences de la forte pression de sélection pour limiter l'expression des toxines sous laquelle évoluent les systèmes TA. Cela nous a permis de mieux comprendre l’influence du repliement secondaire des ARNm, non seulement lors de la régulation posttranscriptionnelle, mais aussi co-transcriptionnelle de l’expression de cette famille particulière de gènes. Ces caractéristiques de régulation basées sur l'ARN peuvent être exploitées à l'avenir pour des applications biotechnologiques (p. ex., production accrue de protéines par stabilisation d'ARNm) ou biomédicales (p.ex., développement de stratégies antimicrobiennes alternatives pour l'activation de la synthèse de toxines). / Toxin-antitoxin (TA) systems are small genetic modules widely present in bacterial genomes. They usually code for a small toxic protein and its cognate antitoxin and can be classified into six types depending on the nature and mode of action of the antitoxin. This work focuses on the study of type I, for which the antitoxin is an antisense RNA that targets the toxin mRNA to inhibit its expression. We characterized the aapA3/IsoA3 system, encoded on the chromosome of the human gastric pathogen Helicobacter pylori. To date, most TAs have been studied using artificial expression systems, which do not allow the characterization of transcriptional or post-transcriptional regulation. Taking advantage of the lethality induced by the toxin chromosomal expression in the absence of antitoxin, we developed a high-throughput genetic selection of suppressor mutations revealed by Next-Generation Sequencing. This approach, named FASTBAC-Seq, allowed us to map a myriad of toxicity determinants located in both, coding and noncoding regions, of the aapA3 toxic gene. More precisely, some suppressor mutations revealed the existence of transient RNA hairpins that act co-transcriptionally to prevent translation initiation while the toxinencoding mRNA is being made. Such functional RNA metastable structures are essential to uncouple the transcription and translation processes and allow the presence of these toxic genes on bacterial chromosomes. Although untranslated mRNAs become rapidly unstable, our work also revealed the presence of two protective stem-loops located at both mRNA ends that prevent from both, 5’ and 3’ exonucleolytic activity. Altogether, our work evidenced the consequences of the strong selection pressure to silence toxin expression under which the TAs evolve, and highlighted the key role of mRNA folding in the co- and post-transcriptional regulation of this family of genes. These RNA-based regulatory mechanisms may be exploited in the future for biotechnological (e.g., increased protein production through mRNA stabilization) or biomedical (e.g., development of alternative antimicrobial strategies aiming at the activation of toxin synthesis) applications.

Les études d'interaction protéine-ligand aident à mieux comprendre la structure et la fonction des protéines. Dans la première partie de la thèse, la cyt bd oxydase a été étudiée. La protéine d'E. coli a été immobilisée avec succès sur des électrodes modifiées par des nanoparticules d'or. Ainsi, un biocapteur électrochimique a été créé, permettant de tester certains inhibiteurs potentiels de cyt bd provenant d’E. coli. Le cyt bd issue de G. thermodenitrificans thermophile a également été étudié. En faisant appel aux spectroscopies IR et Raman ainsi que l’électrochimie, il a été démontré que la protéine est distincte du cyt bd d’E. coli. Une influence mutuelle du pH et de la température sur la catalyse a été aussi démontrée. La deuxième partie de la thèse portait sur la protéine mitochondriale mitoNEET. L'influence du pH et de divers ligands (pioglitazone, resvératrol, ions phosphates) a été examinée. / Protein-ligand interaction studies help to better understand the structure and function of proteins. In the first part of the thesis cyt bd oxidase was studied. The protein from E. coli was successfully immobilised at gold nanoparticles modified electrodes. Thus, an electrochemical biosensor was created allowing testing some potential inhibitors of cyt bd from E. coli. The cyt bd from thermophilic G. thermodenitrificans was also studied. By means of IR, Raman spectroscopy and electrochemistry the protein was shown to be distinct from cyt bd from E. coli. A mutual influence of pH and temperature was demonstrated on the electrochemical and catalytical properties. The second part of the thesis focused on mitochondrial mitoNEET protein. The influence of the pH and various ligands was studied.

La thèse a parcouru les étapes de l’affirmation progressive d’une véritable politique infrastructurelle européenne cohérente, en examinant trois volets : juridique, institutionnel et financier. Tout d’abord, la thèse a souligné le processus d’autonomisation horizontale (rapport de complémentarité et spécialité vis-à-vis d’autres politiques de l’UE) et verticale («communautarisation ») de la politique de réseaux transeuropéens. En deuxième lieu, l’analyse a mis en évidence le rôle des différents processus d’institutionnalisation et « d’intégration organique » des régulateurs nationaux entrepris par le législateur européen dans la centralisation et la communautarisation de la politique des réseaux. Enfin, la thèse a relevé l’affirmation du caractère central de l’aide financière de l’UE à la création de réseaux, accompagnée par une dérogation partielle des limites imposées par le droit européen aux politiques budgétaires expansionnistes des États membres. / The thesis highlights the development of a coherent and instrumental european infrastructure policy. First, the thesis shows the process of vertical (communitarization) and horizontal (complementarity and specialty vis-à-vis other EU policies) autonomisation of Trans-European Networks (TENs) policy. Secondly, the thesis points out the role played by the processes of « networkation » and « agencification » of national regulators in promoting interconnection and access to networks. Finally, the thesis emphasises the growing relevance of EU financial support to the establishment of TENs, and a competing tendency towards the reconciliation of national expansionary fiscal policy with EU law constraints. The thesis concludes by noting that Member States will continue to play a decisive role in TENs policy, not only by improving the actual degree of its implementation, but also allowing, in a forthcoming Treaty revision, to overcome the TENs intergovernmental legacy. / Le reti transeuropee sono uno dei vettori della competitività, dell’integrazione e dello sviluppo sostenibile dell’Unione. La tesi mette in luce la progressiva affermazione di una coerente politica infrastrutturale europea a carattere strumentale, esaminando tale evoluzione sotto tre profili: normativo, istituzionale e finanziario. In primo luogo, sotto il profilo normativo, la tesi evidenzia, da un lato, la progressiva emancipazione delle istituzioni dell’Unione dall’influenza degli Stati membri nell’esercizio delle proprie competenze in materia di reti transeuropee e, dall’altro, lo sviluppo di relazioni di complementarietà e specialità tra la politica di reti e altre politiche dell’Unione (capitoli 1 e 2). L’elaborato sottolinea, in secondo luogo, sotto il profilo istituzionale, il ruolo del processo di «integrazione organica» dei regolatori nazionali e del processo di «agenzificazione» nel perseguimento degli obiettivi di interconnessione e accesso alle reti nazionali. La tesi osserva, infine, sotto il profilo finanziario, l’accresciuta importanza del sostegno finanziario dell’UE alla costituzione delle reti, che si è accompagnata al parziale superamento dei limiti derivanti dal diritto dell’UE alla politiche di spesa pubblica infrastrutturale degli Stati membri. Da un lato rispetto al diritto della concorrenza e, in particolare, al divieto di aiuti di stato, grazie al rapporto funzionale tra reti e prestazione di servizi di interesse economico generale, e dall’altro lato riguardo ai vincoli di bilancio, attraverso un’interpretazione evolutiva della cd. investment clause del Patto di stabilità e crescita. La tesi, in conclusione, rileva gli sviluppi decisivi della politica di reti europea, ma sottolinea il ruolo che gli Stati membri sono destinati a continuare ad esercitare nel suo sviluppo. Da questi ultimi, infatti, dipende la concreta attuazione di tale politica, ma anche il definitivo superamento, in occasione di una prossima revisione dei Trattati, dei retaggi intergovernativi che continuano a caratterizzare il diritto primario in materia.

L’objectif de ces travaux de thèse était l’étude des interactions de petites molécules avec les multiples structures de l’ADN quadruplex via i) le développement et l’utilisation d’un test haut-débit pour l’analyse des interactions ligand-ADN quadruplex et le criblage de chimiothèques/ciblothèques et ii) la préparation de composés aux modes d’interactions multiples (empilement/sillon, covalent/non-covalent, etc.), sélectifs (quadruplex vs. duplex et intra-quadruplex) et éventuellement fonctionnalisés (biotine, fluorophore, etc.). La première partie des travaux a été centrée sur le développement du test G4-FID (G-quadruplex Fluorescent Intercalator Displacement) qui est une méthode semi-quantitative permettant l’évaluation de l’affinité et de la sélectivité de petites molécules pour l’ADN quadruplex par déplacement d’une sonde off/on, le Thiazole Orange (TO). Le test a notamment été transposé avec succès de la cuve vers la microplaque (HT-G4-FID). D’autre part, nous avons montré l’intérêt de fluorophores alternatifs, TO-PRO-3 et Hoechst 33258, aux caractéristiques spectrales complémentaires à TO. Cette méthode d’analyse a également été utilisée avec succès pour l’identification de nouveaux ligands sélectifs d’ADN quadruplex et la mise en évidence des relations structure-activité ainsi que des sélectivités structurales. La deuxième partie des travaux a été consacrée à la préparation et à l’étude de nouveaux ligands d’ADN quadruplex. Ces ligands possèdent des particularités, soit dans leur mode d’interaction (sillons, coordination) soit par leur bifonctionnalité (biotinylés, fluorescents). Nous avons ainsi préparé un ligand de quadruplex polyhétéroaryle acyclique (TOxaPy) possédant une sélectivité inattendue pour certaines structures de l’ADN quadruplex. D’autre part, nous avons montré que les complexes de dérivés de terpyridine peuvent être adaptés, en changeant le ligand organique et/ou la nature du métal, de façon à interagir avec l’ADN quadruplex par interaction covalentes et/ou non covalentes. / The aim of this thesis work was to study the interactions of small molecules with multiple structures of quadruplex DNA via i) the development and use of a high-throughput test for the analysis of ligand-quadruplex DNA interactions and screening of chemical libraries and ii) the preparation of compounds with multiple binding modes (stacking/groove, covalent/non-covalent, etc..) selective (quadruplex vs. duplex and intra-quadruplex) and possibly functionalized (biotin, fluorophore, etc.). The first part of the work was focused on the development of the G4-FID (G-quadruplex Intercalator Fluorescent Displacement) assay, which is a semi-quantitative method for evaluating the affinity and selectivity of small molecules for quadruplex DNA by displacing an off/on probe, the Thiazole Orange (TO). The test has been implemented successfully with microplate (HT-G4-FID). On the other hand, we have shown the importance of alternative fluorophores, TO-PRO-3 and Hoechst 33258, with complementary spectral characteristics. This method of analysis has also been successfully used for the identification of new selective ligands of quadruplex DNA and the identification of structure-activity relationships and structural selectivities. The second part of the work was devoted to the preparation and study of new DNA quadruplex ligands. These ligands possess particular characteristics either in their mode of interaction (grooves, coordination) or by their bifunctionality (biotinylated, fluorescent). We have prepared an acyclic polyheteroaryle quadruplex ligand (TOxaPy) with an unexpected selectivity for certain structures of quadruplex DNA. Furthermore, we showed that complexes of terpyridine derivatives can be tailored by changing the organic ligand and / or the metal in order to interact with quadruplex DNA by covalent and / or non-covalent interaction.

Ubiquitaires et très anciens, les communautés des tapis microbiens font preuve de capacités métaboliques et adaptatives très importantes. Situés en zone côtières, ces écosystèmes peuvent être soumis à des contaminations pétrolières. Dans ce contexte, cette étude vise d’une part à décrire la structure et le fonctionnement de tapis microbiens et d’autre part à comprendre l’impact d’une contamination pétrolière sur ces écosystèmes. Cette étude porte sur deux tapis microbiens de l’étang de Berre aux paramètres physico-Chimiques proches mais présentant des contaminations pétrolières contrastées. Le fonctionnement du système étant tributaire d’autres facteurs tels que la lumière et les saisons, les variations saisonnières et nycthémérales ont été prises en compte dans cette étude. Un accent particulier a également été porté sur le cycle du soufre de par son importance en milieu marin. Les résultats de cette étude mettent en évidence des structures de communautés différentes entre les deux tapis au niveau global, la séparation spatiale prévalant sur la séparation saisonnière. La fraction active de la communauté du site contaminé présente une évolution linéaire tandis que celle du site témoins suit pour sa part les variations saisonnières. Au niveau du site contaminé une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans la dégradation des hydrocarbures couplée à une biodégradation des hydrocarbures suggère que le tapis contaminé est adapté à la contamination pétrolière. Malgré les différences de structures et d’activités de dégradation, des profils métaboliques très semblables sont cependant observables entre les deux tapis, avec des fonctions similaires laissant supposer une redondance fonctionnelle. Des variations saisonnières et nycthémérales ont également été observées avec notamment des Desulfobulbaceae plus abondantes au printemps et plus actives en journée. Des études culturales ont été réalisées en parallèle. Elles permettront d’appréhender de manière complémentaire la dynamique des communautés des sulfato-Réducteurs au sein du tapis et de mieux comprendre les variations mises en évidence dans cette étude. / Ubiquist and very ancient, the microbial mats communities demonstrate very important metabolic and adaptive capacities. Located in the coastal area, these ecosystems may be subject to oil contamination. In this context, the aim of this study is on one hand to describe the structure and functioning of microbial mats and on the other to understand the impact of oil contamination on these ecosystems. This study focused on two microbial mats from the Berre lagoon with close physical chemical parameters but with contrasted hydrocarbon contamination levels. The functioning of the system is dependent on other factors such as light and seasons, diurnal and seasonal variations were taken into account in this study. Special emphasis was placed on the sulfur cycle due to its importance in the marine environments. The results of this study highlighted different communities’ structures at the global level between both mats, the spatial variation prevailed on seasonal variation. The active part of the community from the contaminated site shows a linear trend while that one of the uncontaminated site follows the seasonal variations. The contaminated site shows genes involved in hydrocarbon degradation more expressed coupled to a hydrocarbon biodegradation suggesting that the contaminated mat is adapted to the petroleum contamination. Despite these differences in the structure and the degradation capacities, very similar metabolic profiles are observed between the two mats with similar functions, suggesting functional redundancy. Seasonal and diurnal variation was also observed, the Desulfobulbaceae were particularly more abundant in spring and more active during the day. A complementary cultural approach will allow to better understanding the dynamics of sulfate-Reducers communities in the mat and comprehending these variations.

Les écosystèmes côtiers sont des milieux complexes au sein desquels les communautés microbiennes, jouant un rôle majeur dans leur fonctionnement et leur maintien, s’adaptent et sont tolérantes à des conditions environnementales fluctuantes. En effet, au rythme des marées et de l'activité de la macrofaune, des oscillations oxie/anoxie influencent la composition et la dynamique des communautés microbiennes et par conséquent leur implication métabolique. Afin d’appréhender le devenir du pétrole dans ces écosystèmes, il est donc indispensable d’apporter des connaissances sur l’écologie des microorganismes intervenant dans son élimination, notamment dans des conditions oscillantes anoxie/oxie. Ainsi, ce travail de thèse a eu pour objectif de décrypter l’assemblage de communautés microbiennes hydrocarbonoclastesde sédiments intertidaux soumises à des oscillations anoxie/oxie en présence de pétrole lors d’une expérience en bioréacteurs. Les réponses écologiques des communautés bactériennes globales et de micro-organismes sulfato-réducteurs en conditions oscillantes ont pu être décrites en comparaison avec celles obtenues en conditions d’oxie ou d’anoxie permanentes, par l’analyse des données obtenues par séquençage haut-débit des gènes de l’ARN 16S et dsrB au niveau transcriptionnel. Ces études comparatives ont mis en évidence des profils écologiques en réponseaux conditions oscillantes, pouvant être répandus dans différents environnements marins côtiers. En réponse à ces conditions particulières, de nombreux microorganismes semblent avoir le potentiel à tolérer et/ou s’adapter aux différentes conditions d'oxygénation. Cette capacité d’acclimatation rapide des communautés bactériennes aux conditions oscillantes se sont accompagnées de capacités de dégradation équivalentes ou supérieures dans ces conditions par rapport à la condition d’oxie permanente montrant l’influence des oscillations anoxie/oxie sur le devenir du polluant dans les environnements pollués soumis à ces conditions. / Coastal ecosystems are complex environments in which microbial communities, playing a major role in their functioning and maintain, are tolerant and adapt to changing environmental conditions. Indeed, the tides and the macrofauna’s activity generate oxic/anoxic oscillations which influence the composition and dynamics of microbial communities and consequently their metabolic in volvement. To understand the fate of oil in these ecosystems, it is essential to provide knowledge on the ecology of microorganisms involved in these systems, taking into account anoxic/oxicoscillating conditions. Thus, this thesis aimed to decipher the organization of hydrocarbonoclastic microbial communities inhabiting intertidal sediments, when they are subjected to anoxic/oxic oscillations in an experiment in bioreactors with oil addition. Ecological responses of bacterial communities and sulfate-reducing microorganisms in oscillating conditions have been described comparing with those obtained with permanent oxic or anoxic conditions, using high-throughputsequencing analyses of the 16S rRNA and dsrB genes at the transcriptional level. These comparatives studies have highlighted ecological profiles in response to the oscillating conditions, which can be prevalent in different coastal marine environments. In response to these particular conditions, many organisms seem to have the potential to tolerate and / or adapt to the different conditions of oxygenation. This rapid acclimation capacity of bacterial communities tothese changing conditions have been accompanied by equivalent or greater degradation capacity under these conditions compared to the permanent oxic condition, showing the influence of the anoxic/oxic oscillations on the fate of pollutant in environments subjected tothese conditions.

Les communautés microbiennes procèdent au recyclage des nutriments et à la degradation de la matière organique, et sont ainsi essentielles aux cycles biogéochimiques dans le sédiment et plus largement dans les océans. La contamination chronique aux hydrocarbures représente près de 80% des déversements totaux dans les océans. Toutefois, en comparaison des marées noires, son impact sur les communautés microbiennes est encore mal compris. Dans cette étude, nous avons d’abord utilisé une approche de type méta-analyse pour élucider l’effet global de la contamination aux hydrocarbures dans différents habitats. La réponse des communautés bactériennes à la contamination s’est révélée être dépendante du type d’habitat, les sols étant plus impactés que d’autres habitats, comme par exemple les sédiments marins. Nous nous sommes ensuite intéressés aux communautés microbiennes des trois domaines du vivant de sédiments côtiers provenant des côtes méditerranéennes et atlantiques. La contamination chronique n’influençait que marginallement les communautés benthiques, et la diversité alpha n’était pas réduite dans les sédiments contaminés. Cedendant, la comparaison des réseaux de co-occurrence des échantillons contaminés et non-contaminés a montré que le réseau des communautés contaminées présentait une topologie différente, indiquant une vulnérabilité plus importante à d’éventuelles perturbations environnementales. Des indicateurs potentiels de la contamination identifiés avec la méta-analyse ont été ciblés pour étudier l’impact de la contamination chronique aux hydrocarbures sur les services écologiques qu’ils assurent (i.e. la dégradation de la matière organique et des hydrocarbures) en utillisant la technique de Micro-FISH. / Within the sediment, microbial communities play a pivotal role by driving essential processes such as nutrient cycling and organic matter degradation. Chronic hydrocarbons contamination represents almost 80% of the total input in the oceans. However, as compared to oil spills, its impact on microbial communities remains poorly understood. In this study, we first used a meta-analysis approach to decipher the global effect of hydrocarbons contamination in different habitats. Bacterial community response to the contamination was found to be dependant of the habitat studied, with soils being more impacted than other habitats, like marine sediments. Because bacteria are in interactions with other important members of microbial communities such as Archaea and Eukaryotes, we focused on microbial communities from the three domains of life in coastal marine sediments from the Mediterrranean and the French Atlantic coasts. Independently of the domains of life, chronic hydrocarbons contamination appeared to be a poor driver of communities structuration, and alpha diversity was not reduced in contaminated sediments. However, the comparison of co-occurences networks of contaminated and non-contaminated samples showed that the network from the contaminated samples exhibited a different topology, which suggests a higher vulnerability to eventual environmental perturbations. Potential indicators species identified using the meta-analysis approach were targeted to study the impact of chronic contamination on the ecological services they provide (i.e. organic matter and hydrocarbons degradation) using the Micro-FISH method.

Le Grapevine fanleaf virus (genre Nepovirus) est l'agent principal du court-noué de la vigne. Il induit des symptômes très variables. Ce travail présente une étude mécanistique de la symptomatologie du GFLV sur un hôte herbacé et sur l'hôte d’intérêt agronomique. Par détection de marqueurs biochimiques et moléculaires j'ai montré que le GFLV-F13 induit une réponse hypersensible (HR) sur N. occidentalis et une restriction partielle du virus. J'ai identifié puis cartographié le déterminant viral de cette HR en utilisant des réassortants, des recombinants et des variants naturels du virus. Sur vigne, sur un dispositif expérimental unique en son genre, j'ai mené une approche sans a priori d’étude transcriptomique par RNA-Seq. J'ai comparé des vignes du cépage gewurztraminer mono-infectées par une souche sévère induisant des symptômes de rabougrissement et par une souche plus modérée. 1 023 gènes sont spécifiquement dérégulés par la souche sévère parmi lesquels des gènes impliqués dans la régulation de la HR. Ce résultat permet de proposer pour la première fois qu'une HR pourrait être mise en place dans la vigne en réponse à une infection virale. / Grapevine fanleaf virus (genus Nepovirus) the causative agent of fanleaf degeneration, induces variable symptoms. This manuscript presents a mechanistic study of GFLV symptomatology on both an herbaceous model plant and an agronomically important crop plant.On N. occidentalis, I demonstrated that GFLV-F13 induces a reaction exhibiting hallmarks of a hypersensitive response (HR), partially restricting virus spread. Using reassortants, recombinants and natural variants of the virus, I could identify and map the viral determinant of this HR. On grapevine, I took advantage of a unique experimental set-up and used RNA-Seq to compare the transcriptoms of Gewurztraminer plants infected with two different GFLV strains, one of which induced stunting symptoms and the other mild symptoms. 1,023 genes among which genes involved in the regulation of HR, were specifically regulated by the more severe strain This is the first hint of a HR taking place in grapevine in response to a virus infection.

La caractérisation de l'activité enzymatique des (phospho)lipases requiert des tests enzymatiques spécifiques, continus, utilisant des substrats lipidiques et adaptés au criblage à haut débit des activités et/ou des inhibiteurs de (phospho)lipases. Afin de développer de tels tests, la synthèse de glycérophosphatidylcholine (PC) estérifiée en position sn-1 et/ou sn-2 par l'acide alpha-éléostéarique (acide 9Z, 11E, 13E, octadécatriénoïque) a été effectuée. La triple insaturation conjuguée présente au sein de cet acide gras constitue un chromophore intrinsèque qui confère une forte absorption dans le domaine de l'ultra-violet à cet acide gras et aux lipides le contenant. Les PC contenant l'acide alpha-éléostéarique ont été adsorbées par « coating » au fond des puits d'une microplaque de titration. L'hydrolyse du substrat lipidique par une phospholipase A1 (PLA1) ou phospholipase A2 (PLA2), injectée dans le milieu réactionnel, est suivie en continu par l'augmentation de l'absorbance à 272 nm, due à la transition de l'acide alpha-éléostéarique de la phase adsorbée à la phase aqueuse. Des PC hétérogènes ont été synthétisées à partir de rac-glycidol pour effectuer un marquage sélectif de la PC par l'acide alpha-éléostéarique sur la position sn-1 (EOPC) ou sn-2 (OEPC). Pour empêcher la migration de la chaîne acyle, un lien éther non hydrolysable par les PLA1 ou PLA2 a été introduit sur l'autre position sn de la PC avec une chaîne alkyl (C18). Ces PC chimiquement définies ont permis d'élaborer une méthode de dosage en continu de l'activité enzymatique et discriminant les activités PLA1 ou PLA2, ce qui représente un caractère innovant par rapport à toutes les méthodes existantes / The characterization of the catalytic activity of (phospho)lipases requires specific assays, that are continuous, sensitive, use lipidic substrates and could be applied to high throughput screening. In order to perform these tests, several tailor-made alpha-eleostearic (9Z, 11E, 13E-octadecatrienoic acid) containing glycerophosphatidylcholines (PC) have been synthetized with the alpha-eleostearic acid at the position sn-1 and/or sn-2. The conjugated triene present in this fatty acid constitutes an intrinsic chromophore and, consequently, confers strong UV absorption properties of the fatty acid and the lipids harboring it. PC substrates were coated onto a microplate well and the phospholipase A1 (PLA1) or phospholipase A2 (PLA2) activity was measured continuously by the increase in absorbance, at 272 nm, due to the transition of alpha-eleostearic acid from the adsorbed to the soluble state. Moreover, two structured analogues of PC labeled at the sn-1 (EOPC) or sn-2 (OEPC) position with the alpha-eleostearic acid have been synthetized from rac-glycidol. A non-absorbing and non-hydrolysable by PLA1 and PLA2 O-ether alkyl(C18) was introduced at the other sn position to prevent intramolecular acyl chain migration during the synthesis and the lipolysis. These structured PC were coated onto a microplate and used in a continuous assay, to discriminate, with excellent accuracy, between PLA1 or PLA2 activities. The development of a sensitive enzymatic method using coated substrates analogues to natural lipid is a relevant improvement from current assays for measuring continuously (phosphor)lipases activities and/or their inhibitors due to the alpha-eleostearic acid UV spectroscopic properties

Les travaux présentés dans cette thèse font suite à celle de Melle LE GOFF. Ils se concentrent sur la technologie HIFI brevetée et développée pendant ses travaux. Une première partie du travail présenté dans ce manuscrit concerne le test HIFI Blood 96™ et plus particulièrement les améliorations et les évolutions apportées au test afin d'en faire un véritable outil de génotypage, multiparamétrique et haut-débit pouvant être installé dans les banques de sang dans le but de constituer des inventaires de sang génotypé de façon étendue, participant ainsi à améliorer la sécurité transfusionnelle. Il permet de caractériser 96 échantillons sur 15 polymorphismes (divisés en deux panels) associés aux groupes sanguins en approximativement 4h30. Cette plateforme a fait l'objet d'une étude de validation à moyenne échelle sur 583 donneurs pour le panel 1 et 190 donneurs pour le panel 2. La deuxième partie des travaux décrit l'adaptation de la technologie HIFI appliquée au diagnostic des pathologies respiratoires, avec le développement d'une autre plateforme, ReSynPlex, en partenariat avec 3 équipes de recherche de Grenoble / The work reported in this thesis follows the one undertaken by Ms LE GOFF. It is focused on HIFI technology, which is patented and developed during her thesis. The first part of this work concerns the HIFI Blood 96™ test, and particularly the improvements and developments adduced to the test to make it a real diagnostic tool, multiparametric and high-throughput which can be implemented in blood banks in order to constitute negative antigen inventories, thus contributing to improve blood safety. It allows to characterize 96 samples on 15 polymorphisms (divided in two panels) associated to blood group systems in approximately 4.5 hours. A mesoscale validation study has been conducted on 583 samples for panel 1 and 190 samples for panel 2. The second part of this work describes the adaptation of HIFI technology applied to diagnosis of respiratory tract infections, with the development of another platform, ReSynPlex, in partnership with 3 research teams in Grenoble