Les Oniscidea présentent une diversité remarquable de systèmes chromosomiques de déterminisme du sexe (hétérogamétie mâle XX/XY ou hétérogamétie femelle ZW/ZZ), dont l'origine reste encore largement inconnue à ce jour. Il a été proposé que ces différents systèmes puissent être le produit de la coévolution entre les isopodes terrestres et Wolbachia, une bactérie endosymbiotique féminisante transmise verticalement par voie ovocytaire. Dans le but de caractériser l'impact de l'endosymbiose à Wolbachia sur l'évolution des mécanismes de déterminisme du sexe, nous avons utilisé une combinaison d'approches génomique, transcriptomique et d'expression de gènes. Tout d'abord, le génome de l'espèce Armadillidium nasatum (caractérisée par un système XX/XY) a été généré et ensuite annoté structurellement et fonctionnellement. A partir de ce génome, des approches de génomique comparatives ont permis la caractérisation de séquences liées au chromosomes Y, afin de mieux comprendre les processus impliqués dans la dégénérescence des gonosomes. Afin d'identifier des effecteurs liés au déterminisme ou à la différenciation du sexe, une approche par gènes candidats a permis de caractériser des gènes à domaines DM, connus pour être impliqués dans le déterminisme du sexe de nombreuses espèces, et d'en mesurer l'expression au cours du temps. Enfin, une phylogénie des Oniscidea a été réalisée en parallèle d'expériences de réversion de sexe afin d'estimer le nombre et la direction des transitions de systèmes d'hétérogamétie au cours de l'évolution des isopodes terrestres. Ces travaux contribuent à illustrer l'impact de l'endosymbiose sur l'évolution des mécanismes de déterminisme du sexe de l'hôte. / Oniscidea show a remarkable diversity of chromosomal sex determination systems (male heterogamety XX/XY or female heterogamety ZW / ZZ). However, the origin of such diversity is still largely unknown to date. It has been proposed that these different systems may be the product of the coevolution between terrestrial isopods and Wolbachia, a feminizing endosymbiotic bacteria transmitted vertically through oocytes. In order to characterize the impact of Wolbachia endosymbiosis on the evolution of sex determination mechanisms, we used a combination of genomic, transcriptomic and gene expression approaches. First, the genome of the species Armadillidium nasatum (characterized by an XX/XY system) was generated and then structurally and functionally annotated. From this genome, a comparative genomic approach allowed us to characterize sequences Y-linked, in order to better understand the processes involved in the sex chromosome degeneration. In order to identify effectors potentially related to sex determination or differentiation, a candidate gene approach has been used to characterize DM-domain genes, known to be involved in the sex determination pathways of many species, and then to measure their expression over development. Finally, a Oniscidea phylogeny was generated in parallel with sex-reversal experiments in order to characterize the number and the direction of the transitions of heterogenetic systems during the terrestrial isopods evolution. This work emphasize the impact of endosymbiosis on the evolution of host sex determination mechanisms.

Les formats de modulation avancés, codant l’information sur la phase, la polarisation ou plusieurs niveaux d’amplitude de la lumière reçoivent aujourd’hui un intérêt croissant. En effet, ceux-ci permettent d’atteindre une meilleure efficacité spectrale et par conséquent des débits plus élevés. Ces caractéristiques sont actuellement très recherchées dans les télécommunications pour répondre à la demande constante d’augmentation de capacité des transmissions optiques fibrées. L’essentiel du travail effectué porte sur la génération de tels signaux dans des sources photoniques monolithiques sur InP faisant appel à un concept nouveau de commutation de phases optiques préfixées avec des modulateurs électro-absorbants. Une comparaison de notre technologie intégrée avec la technologie actuelle de génération de formats de modulation avancés démontre des possibilités nouvelles de réduction de taille, de diminution de consommation énergétique et d’évolution en vitesse de modulation jusqu’à 56 GBauds. Suite à la validation, par simulations, d’architectures de transmetteurs spécifiques pour la génération de formats de modulation avancés, nous réalisons en salle blanche les circuits photoniques intégrés d’étude. Les caractérisations statiques confirment le fonctionnement de toutes les fonctions intégrées des circuits et soulignent l’efficacité de la filière technologique. Pour une première démonstration de fonctionnalité nous choisissons un transmetteur BPSK capable de générer une modulation de phase à 12,4 GB. Ce résultat démontre la plus petite source intégrée BPSK à l’heure actuelle. Un autre circuit capable de générer des formats de modulation plus complexes est aussi caractérisé / Advanced modulation formats, encoding data on the phase, polarization or multi-level intensity of the light are currently a hot topic in the telecommunication domain. By using them, high spectral efficiency and therefore higher bit rate signals could be generated. Those characteristics are really attractive for the telecommunication systems manufacturers in order to answer to the constant need of increased bandwidth in fiber optic communications. The study of advanced modulation formats generation in Photonic Integrated Circuits (PICs) based on a new concept of preset phases switching by Electro-Absorption Modulators is the main task of the current work. Compared to the actual technology used for generate advanced modulations, our choice could allow a strong reduction of the dimensions and of the energy consumption of the transmitter as well as bit rate up to 56 GB. After validating specific transmitters’ architectures by simulations, we fabricated the studied photonic integrated circuits in clean room. Through static characterizations, we verify that all integrated functions of the transmitters are working and we show the efficiency of our technological choices. Using the available equipments at the lab, we prove the validity of our concept of EAM based phase switching by using a BPSK transmitter. A 12.4 GB BPSK modulation is obtained as well as a wide open eye diagram. This result demonstrates the smallest BPSK integrated photonic source at this time. Another photonic circuit able to generate more complex modulation formats is also measured

Les cancers triple négatif (TN) représente la forme la plus agressive des cancers du sein, avec un pourcentage de décès importants. Il existe une grande hétérogénéité au sein de cette maladie en termes de présentation clinique initiale, de caractéristiques biologiques, de sensibilité au traitement et d’évolution. Aucun progrès en survie n’a été réalisé depuis l’avènement des protocoles de chimiothérapie standards. En effet, malgré une bonne réponse initiale au traitement, 65% des patientes résistent aux thérapies actuelles et récidivent ce qui leur confère un pronostic particulièrement sombre. Il y a donc urgence à identifier de nouveaux protocoles de traitement et de nouvelles molécules efficaces pour ces patientes.Une stratégie de plus en plus intéressante actuellement est celle du repositionnement de composés médicaux qui n’étaient initialement pas destinés au traitement d’une maladie donnée. Cette approche a pour avantage de profiter de l’effort de recherche et développement initial extrêmement couteux et de profiter des études pharmacologiques déjà disponibles. J’ai ainsi effectué au cours de ma thèse un criblage de composés chimiques à haut débit sur 12 lignées de cancers du sein TN afin de prendre en compte leur hétérogénéité. A l’issue de ce crible, plusieurs composés se sont avérés intéressants de par leur potentiel anti-cancéreux. Plus particulièrement, des molécules psychoactives impliquées dans le métabolisme de la sérotonine (ie antidépresseurs, et notamment les inhibiteurs de recapture de la sérotonine-SSRI) sont apparues comme des « hits » forts.Suite à ces résultats, mon travail de thèse s’est orienté plus particulièrement vers la compréhension de l’activité de ces molécules et du métabolisme de la sérotonine dans nos modèles TN afin de comprendre pourquoi ces composés pouvaient présenter un intérêt dans le traitement de ces cancers. Différents aspects biologiques ont ainsi été investigués pour ces antidépresseurs. J’ai ainsi étudié le rôle exercé par la sérotonine sur mes modèles cellulaires. D’autre part, j’ai entrepris une cartographie des acteurs du métabolisme de la sérotonine afin de caractériser mes modèles. J’ai ainsi découvert deux récepteurs à la sérotonine majoritairement présents, HTR1D et HTR1B, qui ont fait l’objet de recherches approfondies. J’ai ainsi pu démontrer l’intérêt de ces deux récepteurs comme cibles thérapeutiques potentielles dans les cancers triple négatifs. Grace à une étude rétrospective j’ai pu mettre en évidence une corrélation statistiquement significative entre le niveau d’expression de chacun de ces deux récepteurs et la survie des patientes TN. Nous observons ainsi une nette discrimination entre les deux groupes de cancers exprimant peu ou fortement ces gènes. J’ai ainsi pu mettre en évidence que ces deux récepteurs représentent des biomarqueurs pronostics forts des patientes TN. L’étude immunohistochimique, a permis de confirmer la présence de ces récepteurs dans les tumeurs TN. Par ailleurs, j’ai pu identifier un micro ARN régulant l’expression de l’un des récepteurs dans les lignées TN. De façon cohérente, j’ai pu observer un effet pronostic significatif du niveau d’expression de ce micro ARN sur la survie des patientes TN. L’efficacité des composés de type SSRI et d’un antagoniste de nos deux récepteurs a pu être vérifiée sur des cultures ex vivo issues de PDX notamment résistantes aux chimiothérapies. L’évaluation préclinique de ces composés a pu être testée sur un premier modèle murin TN de type PDX mais n’a cependant pas permis de démontrer d’efficacité antitumorale in vivo. En effet, la complexité du métabolisme de la sérotonine, tout comme l’hétérogénéité biologique des TN requièrent des études plus approfondies afin de pouvoir faire la preuve de concept du ciblage thérapeutique de ces récepteurs et de la modulation du métabolisme de la sérotonine dans ces cancers. Ce travail fait l’objet d’un manuscrit en préparation pour publication dans le cadre de cette thèse. / Triple negative breast cancer (TNBC) is the most aggressive form of breast cancers. It accounts for 15-20% of breast cancers. No progress in survival has been achieved since the advent of standard chemotherapy protocols. TNBC is an important clinical challenge. They have the worst outcome among breast cancer subgroups. Given their poor prognosis, their assumed hetetogeneity, and absence of any alternative specific targeted therapy, chemotherapy remains the only TNBC treatment. Despite an often good initial response to treatment, more than a half of patients do not achieve a pathological complete response, with a frequent and fast tumor relapse. Several therapeutic approaches have been identified preclinically, but none of these molecules have been shown to be effective on all of these patients. There is a urge for the identification of new treatments.An interesting strategy is the repurposing of medical compounds that were initially not intended for the treatment of a given disease. This strategy takes advantage of the extremely expensive initial research and development effort. This process is potentially efficient and cost-effective as previous clinical trials have been performed and pharmacokinetics/pharmacodynamics and toxicity have been already explored. In order to develop new treatment schemes we addressed the following question: Is there available drugs with strong activity in TNBC? To do so, we performed a high-throughput drug screening on 12 TNBC cell lines to reflect the dramatic heterogeneity of the disease. From this drug discovery program, several interesting compounds were identified with significant anti-tumor potential against TNBC. More particularly, psychoactive compounds regulating serotonin metabolism (ie antidepressant drugs and notably serotonin selective reuptake inhibitors-SSRIs) were found to be highly effective “hits”.My thesis work turned to the comprehension of serotonin implication in TNBC physiopathology to understand if modulating its metabolism could be of therapeutic interest for TNBC management. Different biological aspects were investigated concerning serotonin effects on TNBC cellular models (serotonin adjunction in vitro or endogenous synthesis inhibition). In addition, I established a comprehensive map of the serotonergic landscape in TNBC (biosynthetic capacity, transporters, receptors) that led to the identification of therapeutic targets that would be of interest in the treatment of cancer: HTR1D and HTR1B. Indeed, by blocking these promising targets (with chemical inhibitors or siRNA knockdown) we observed a strong reduction in cell viability in our large panel of TNBC cell lines. Remarkably, we found that their expression levels were associated to poor prognosis in breast cancer, and notably in TNBC subtype with huge dichotomy observed in the outcome, allowing future stratification of TNBC patient management and selection for further targeted therapies. These results pinpoint HTR1D and HTR1B as strong prognosis biomarkers in TNBC. Immunohistochemistry staining was also conducted to confirm the presence of these targets at the protein level in tumor samples. Moreover, I could identify a microRNA regulating one of these receptors: has-miR-599. Consistently, expression levels of this microRNA demonstrated a prognostic impact on TNBC survival. While ex vivo data of one SSRI and the dual antagonist of HTR1D/HTR1D receptors shown encouraging efficacy, their preclinical evaluation assessed in a TN PDX model could not allow to demonstrate any significant effect on tumor growth in vivo. As a matter of fact, serotonin metabolism is a complex system and TNBC heterogeneity does not permit to conclude on the therapeutic proof of concept of the serotonergic modulation in TNBC with this first attempt. A scientific manuscript of this work is being prepared for publication.

La découverte de médicaments en oncologie repose encore majoritairement sur les criblages pharmacologiques à haut débit. Cependant, les modèles traditionnels de culture cellulaire en deux dimensions (2D) ne reflètent pas les conditions physiopathologiques des tumeurs solides in situ. Au laboratoire, notre hypothèse est que le manque de représentativité des cellules en culture 2D par rapport aux tumeurs in situ lors des essais de criblage pharmacologique in vitro est responsable du faible taux de succès des petites molécules lors d’essais cliniques. Pour pallier ce problème, nous avons développé une méthode de culture à long-terme en trois dimensions (3D) avec des cellules d’adénocarcinome du poumon qui permet le maintien des cellules en sphéroïdes jusqu’à 38 jours. Les cellules s’adaptent rapidement à la culture 3D en diminuant leur taille et en ralentissant significativement leur métabolisme. Au niveau épigénétique, l’expression du complexe KAT3A/KAT3B et de BRG1 est significativement diminuée, et ce de manière temps-dépendante. À l’inverse, l’expression de HDAC6 est augmentée lors du passage en 3D. Finalement, nous avons vérifié si les changements épigénétiques induits par la culture 3D influençaient significativement la réponse aux médicaments. Ainsi, nous avons traité les cellules en 2D et après 10 ou 24 jours en 3D avec une pharmacothèque de 154 médicaments épigénétiques. 60% des médicaments ont démontré une activité anticancéreuse significative sur les cellules en 2D, contrairement à 9% sur les sphéroïdes de 10 jours. Avec les sphéroïdes de 24 jours, uniquement 1 médicament, le MS023, un inhibiteur des arginines méthyltransférases (PRMT) de type I, a été efficace. L’augmentation de la sensibilité au MS023 concorde avec une augmentation de la méthylation des arginines dans les sphéroïdes. En conclusion, mon projet démontre que la culture 3D modifie l’épigénome des cellules cancéreuses du poumon de manière temps-dépendant et que ces changements sensibilisent les cellules à une inhibition des PRMT de type I. L’étude des sphéroïdes nous permet d’améliorer notre compréhension de la biologie tumorale et des processus de découverte de médicaments ce qui pourrait pallier le faible taux de succès associé aux modèles 2D classique. / Small molecule development in oncology mainly involves high-throughput drug screenings and preclinical validation studies using cancer cells grown in two-dimension (2D). However, classical cell culture methods poorly reflect tumor biology and cell epigenome. Here, our objective is to develop a 3D model that displays key epigenetic features of solid tumors in order to identify new actionable targets. First, we determined culture conditions for long-term expansion of adenocarcinoma spheroids to allow cell adaptation and the occurrence of specific epigenetic features triggered by 3D condition. Our results demonstrate that cells cultivated in 3D spheroids exhibit significant phenotypic and epigenetic changes as compared to 2D monolayers. Notably, we observed numerous expression changes of key epigenetic regulators, all taken place at a different time-point of the 3D cell culture. We observed a decrease in the expression of the KAT3A/KAT3B complex as well as BRG1. HDAC6 expression also increased in 3D. Then, we asked whether epigenetic changes triggered by 3D culture would modify drug sensitivity. We performed a screening of 154 epigenetic drugs on cancer cells cultivated in 2D and in 3D at two different time points. 60% of epigenetic drugs showed significant anticancer activity against 2D monolayers. Interestingly, A549 cells in 3D spheroids became gradually resistant over time. Against 3D spheroids cultivated for 10 days, only 9% of epigenetic drugs in the drug library showed anticancer activity. Against 3D spheroids cultivated for 24 days, only a single epigenetic compound called MS023, a selective agent against type I PRMTs, reduced cell viability significantly. This sensitivity is correlated with an increase of arginine methylation observed within spheroids. Taken together, we show that 3D spheroids trigger a time-dependent epigenetic context that increases lung cancer cells sensitivity to type I PRMT inhibition. 3D spheroids of well-characterized cancer cell lines will improve our understanding of tumor biology and drug discovery and can overcome the high false discovery rate associated with 2D classical models.

La 5-azacytidine (AZA) est un médicament approuvé pour le traitement des leucémies myéloïdes aiguës des patients qui ne sont pas éligibles à une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Bien que l’AZA est augmenté significativement le pronostic des patients, le mécanisme d’action précis de l’AZA demeure nébuleux. En plus de son activité d’hypométhylation, il a été montré que l’AZA a aussi des effets immunologiques. Des études précédentes suggèrent que ces réponses immunitaires sont causées par des modifications du répertoire de peptides présentés par le CMH-I (MAPs), dont l’expression de MAPs dérivés de rétroéléments endogènes (EREs) et des cancer-testis antigens (CTAs). Ces gènes sont généralement réprimés par la méthylation de l’ADN. Dans cette thèse, nous avons testé cette hypothèse à l’aide de séquençage à haut débit et de spectrométrie de masse appliqués à quatre lignées cellulaires d’AML différentes. Notre approche protéogénomique d’avant-garde a révélé que l’AZA induit la présentation de MAPs dérivés de CTAs, mais pas d’EREs, malgré le fait que ces deux groupes de séquences soient surexprimés au niveau transcriptomique. Ces résultats indiquent que les réponses des lymphocytes T observées chez les patients suite au traitement à l’AZA dépendent probablement des MAPs dérivés des CTAs, et non pas des EREs. Les EREs stimulés par l’AZA ont tout de même un impact sur la réponse immunitaire en formant des ARN double-brins menant à une activation de l’immunité innée. L’incorporation de l’AZA et l’inhibition subséquente de la DNMT2 mène cependant à des agrégats protéiques et à l’autophagie, qui dégrade les transcrits EREs et limite leur surexpression. Nous avons démontré que les effets immunologiques de l’AZA peuvent être amplifiés par un traitement combiné de l’AZA et d’inhibiteurs de l’autophagie. De plus, le travail contenu dans cette thèse a montré que bien qu’elles soient un modèle expérimental pratique, les lignées cellulaires ont des limitations et doivent être utilisés avec prudence. Des différences majeures ont été observées entre des lignées cellulaires supposément identiques provenant de fournisseurs établis. Nos analyses ont permis de démontrer quelle lignée cellulaire était la plus similaire à la lignée parentale. Ainsi, ce travail fourni des recommandations pour améliorer les lignes directrices d’utilisation des lignées cellulaires en recherche. / 5-azacytidine (AZA) is approved for the treatment of acute myeloid leukemia (AML) patients ineligible for hematopoietic cell transplantation. Although AZA treatment has substantially improved patient outcomes, there remains a lack of clear understanding of the mechanisms driving these responses. In addition to its hypomethylating activity, AZA has been shown to have immunological effects. Previous reports suggest that these immune responses occur due to alterations in the repertoire of MHC-I-associated peptides (MAPs), including the expression of MAPs deriving from endogenous retroelements (EREs) and cancer-testis antigens (CTAs). These genes are typically silenced by methylation. With this thesis, we aimed to test this hypothesis using high-coverage RNA sequencing and mass spectrometry in four different AML cell lines. Our state-of-the-art proteogenomic approach uncovered that AZA treatment induced MAPs deriving from CTAs, but not EREs, despite both being upregulated at the RNA level. This indicates that T-cell responses post-AZA treatment are more likely to be dependent on CTA- than ERE-derived MAP presentation. AZA-induced EREs produced at the RNA level still contributed to immune responses by forming double-stranded RNA leading to a state of viral mimicry. However, AZA incorporation into RNA and subsequent DNMT2-inhibition led to protein aggregation and autophagy responses. These responses were responsible for degrading EREs, which limited their upregulation. We further demonstrate that the immune effects of AZA can be enhanced by the combination of AZA with autophagy inhibitors. Additionally, the work in this thesis has shown that although a practical model, cell lines have their caveats and must be used with caution. This work has highlighted the grave discrepancies between supposedly identical cell lines supplied by established repositories. Moreover, our analyses determine which of the two is closer to the parental cell line. Finally, this work provides recommendations for improving the current guidelines for cell line-based research.

Le virus de l’hépatite C (VHC) est un agent causateur de maladies du foie important responsable d’une pandémie affectant près de 180 millions d’individus mondialement. L’absence de symptômes dans les premières années d’infection entraîne des diagnostics tardifs qui empêchent la prise en charge rapide des patients avant l’apparition d’une fibrose et, dans près de 16 % des cas d’infection, d’une cirrhose. En exploitant les interactions protéine-protéine membranaires, des essais utilisant la technologie BRET, dans les cellules vivantes, ont été précédemment optimisés afin d’établir le réseau complet des interactions du VHC. En utilisant les fondements de cette étude, un essai à haut débit dans les cellules vivantes a été réalisé pour identifier de nouveaux composés anti-VHC ciblant une nouvelle interaction NS3/4A-NS3/4A. Approximativement 110,000 petites molécules ont été criblées pour leurs effets sur l’homodimérization de NS3/4A et ont été classées par rapport à leur spécificité et à leur puissance contre le VHC. Au terme de cette étude, UM42811 a été identifié comme un activateur potentiel de l’interaction NS3/4A-NS3/4A offrant une activité antivirale prometteuse dotant une excellente fenêtre thérapeutique. Par la suite, un séquençage exhaustif des virus, soumis à un traitement de UM42811, a permis d’établir le profil de résistance du VHC contre ce composé. Grâce à cette fine cartographie, il a été possible d’identifier un nouveau mécanisme d’inhibition de NS3/4A qui est indépendant de son activité protéase. En utilisant les données de notre groupe sur les interactions VHC-hôte, il a été possible de continuer la caractérisation fonctionnelle du composé UM42811 en étudiant son effet sur les interactions potentiellement bénéfiques à la persistance virale. Pour ce faire, les protéines associées au transport nucléaire et mitochondriale qui sont des interactants de choix de NS3/4A ont été priorisées. Parmi ces facteurs de l’hôte, l’étude de karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) et de heat shock protein 60 (HSP60) a été priorisée. De façon intéressante, les expériences de co-immunoprécipitation ont démontré que UM42811 était capable de prévenir l’interaction KPNB1-NS3/4A ainsi que l’interaction HSP60-NS3/4A. De plus, les études ii fonctionnelles et les analyses d’immunobuvardage de type western ont démontré que l’interaction KPNB1-NS3/4A avait des effets délétères sur l’induction des gènes stimulés par l’interféron (ISG). Finalement, il a été démontré que KPNB1 est possiblement clivé par NS3/4A suggérant la présence potentielle d’un mécanisme de subversion ou d’échappement. En bref, cette étude démontre la puissance des stratégies impliquant les interactions protéine-protéine dans les cellules vivantes pour l’identification de nouveaux composés inhibiteurs, caractérise un nouveau mécanisme d’inhibition anti-VHC et révèle la possibilité d’un nouveau mécanisme d’évasion du système immunitaire. / Hepatitis C virus (HCV) is an important causative agent for liver diseases and is responsible for a worldwide pandemic affecting roughly 180 million individuals worldwide. Late diagnosis following the progression to fibrosis and to cirrhosis, in nearly 16% of chronic infections, is attributed to the absence of symptoms in the first years of infection. By exploiting membrane protein-protein interactions (PPI), live cell assays using bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technology have previously been optimized to complete a comprehensive hepatitis C virus (HCV) protein interaction network. Using the groundwork laid by this network study, a high-throughput assay (HTS) cell-based assay was implemented to identify novel inhibitory compounds targeting an unreported NS3/4A-NS3/4A interaction. Approximately 110,000 compounds from a small-molecule collection were screened to monitor modulation of NS3/4A homodimerization and were discriminated based on specificity and potency. UM42811 was identified as a potential NS3/4A-NS3/4A interaction activator and found to have a promising antiviral activity boasting an excellent therapeutic window. Combined deep sequencing and mutation mapping have yielded a resistance profile based on statistical and functional probability pointing towards a novel inhibitory mechanism targeting the HCV NS3/4A independent from protease activity inhibition. Data from an HCV to host protein interaction network generated by our group was used to analyze alternative effects of UM42811 on interactions which potentially benefit viral persistence. NS3/4A-specific host interactors were heavily associated with nuclear and mitochondrial transport based on Gene Ontology (GO). Among these specific interactors, karyopherin subunit beta 1 (KPNB1) and heat shock protein 60 (HSP60) were selected for further study. Interestingly, co-immunoprecipitation experiments revealed that UM42811 was able to prevent both KPNB1-NS3/4A and HSP60-NS3/4A interactions. Moreover, functional and western analysis revealed the KPNB1-NS3/4A interaction to have deleterious effects on iv interferon stimulated gene (ISG) induction. Unexpectedly, analysis revealed a putative NS3/4A mediated cleavage of KPNB1. Overall, this study demonstrates the strength of cell-based PPI strategies in the identification of novel HCV antiviral compounds, characterizes a novel inhibitory mechanism for HCV and reveals a potentially novel viral immune evasion mechanism.

Les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA) forment un groupe de champignons qui appartient à l'embranchement des Gloméromycètes (Glomeromycota). Les CMA forment des associations symbiotiques, connus sous le nom des mycorhizes à arbuscules avec plus de 80 % des plantes vasculaires terrestres. Une fois que les CMA colonisent les racines de plantes, ils améliorent leurs apports nutritionnels, notamment le phosphore et l'azote, et protègent les plantes contre les différents pathogènes du sol. En contrepartie, les plantes offrent un habitat et les ressources de carbone nécessaires pour le développement et la reproduction des CMA. Des études plus récentes ont démontré que les CMA peuvent aussi jouer des rôles clés dans la phytoremédiation des sols contaminés par les hydrocarbures pétroliers (HP) et les éléments traces métaliques. Toutefois, dans les écosystèmes naturels, les CMA établissent des associations tripartites avec les plantes hôtes et les microorganismes (bactéries et champignons) qui vivent dans la rhizosphère, l'endosphère (à l'intérieur des racines) et la mycosphère (sur la surface des mycéliums des CMA), dont certains d'entre eux jouent un rôle dans la translocation, l’immobilisation et/ou la dégradation des polluants organiques et inorganiques présents dans le sol. Par conséquent, la diversité des CMA et celle des microorganismes qui leur sont associés sont influencées par la concentration et la composition des polluants présents dans le sol, et aussi par les différents exsudats sécrétés par les trois partenaires (CMA, bactéries et les racines de plantes). Cependant, la diversité des CMA et celle des microorganismes qui leur sont associés demeure très peu connue dans les sols contaminés. Les interactions entre les CMA et ces microorganismes sont aussi méconnus aussi bien dans les aires naturelles que contaminées. Dans ce contexte, les objectifs de ma thèse sont: i) étudier la diversité des CMA et les microorganismes qui leur sont associés dans des sols contaminés par les HP, ii) étudier la variation de la diversité des CMA ainsi que celle des microorganismes qui leur sont associés par rapport au niveau de concentration en HP et aux espèces de plantes hôtes, iii) étudier les correlations (covariations) entre les CMA et les microorganismes qui leur sont associés et iv) comparer les communautés microbiennes trouvées dans les racines et sols contaminés par les HP avec celles trouvées en association avec les CMA. Pour ce faire, des spores et/ou des propagules de CMA ont été extraites à partir des racines et des sols de l'environnement racinaire de trois espèces de plantes qui poussaient spontanément dans trois bassins de décantation d'une ancienne raffinerie de pétrole située dans la Rive-Sud du fleuve St-Laurent, près de Montréal. Les spores et les propagules collectées, ainsi que des échantillons du sol et des racines ont été soumis à des techniques de PCR (nous avons ciblés les genes 16S de l'ARNr pour bactéries, les genes 18S de l'ARNr pour CMA et les régions ITS pour les autres champignons), de clonage, de séquençage de Sanger ou de séquençage à haut débit. Ensuite, des analyses bio-informatiques et statistiques ont été réalisées afin d'évaluer les effets des paramètres biotiques et abiotiques sur les communautés des CMA et les microorganismes qui leur sont associés. Mes résultats ont montré une diversité importante de bactéries et de champignons en association avec les spores et les propagules des CMA. De plus, la communauté microbienne associée aux spores des CMA a été significativement affectée par l'affiliation taxonomique des plantes hôtes et les niveaux de concentration en HP. D'autre part, les corrélations positives ou négatives qui ont été observées entre certaines espèces de CMA et microorganismes suggérèrent qu’en plus des effets de la concentration en HP et l'identité des plantes hôtes, les CMA peuvent aussi affecter la structure des communautés microbiennes qui vivent sur leurs spores et mycéliums. La comparaison entre les communautés microbiennes identifiées en association avec les spores et celles identifiées dans les racines montre que les communautés microbiennes recrutées par les CMA sont différentes de celles retrouvées dans les sols et les racines. En conclusion, mon projet de doctorat apporte de nouvelles connaissances importantes sur la diversité des CMA dans un environnement extrêmement pollué par les HP, et démontre que les interactions entre les CMA et les microorganismes qui leur sont associés sont plus compliquées que ce qu’on croyait précédemment. Par conséquent, d'autres travaux de recherche sont recommandés, dans le futur, afin de comprendre les processus de recrutement des microorganismes par les CMA dans les différents environnements. / Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are an important soil fungal group that belongs to the phylum Glomeromycota. AMF form symbiosic associations known as arbuscular mycorrhiza with more than 80% of vascular plants on earth. Once AMF colonize plant roots, they promote nutrient uptake, in particular phosphorus and nitrogen, and protect plants against soil-borne pathogens. In turn, plants provide AMF with carbon resources and habitat. Furthermore, more recent studies demonstrated that AMF may also play key roles in phytoremediation of soils contaminated with petroleum hydrocarbon pollutants (PHP) and trace elements. Though, in natural ecosystems, AMF undergo tripartite associations with host plants and micoorganisms (Bacteria and Fungi) living in rhizosphere (the narrow region of soil surounding the plant roots), endosphere (inside roots) and mycosphere (on the surface AMF mycelia), which some of them play a key role on translocation, immobilization and/or degradation of organic and inorganic pollutants. Consequently, the diversity and community structures of AMF and their associated microorganisms are influenced by the composition and concentration of pollutants and exudates released by the three partners (AMF, bacteria and plant roots). However, little is known about the diversity of AMF and their associated microorganisms in polluted soils and the interaction between AMF and these microorganisms remains poorly understood both in natural and contaminated areas. In this context, the objectives of my thesis were to: i) study the diversity of AMF and their associated microorganisms in PHP contaminated soils, ii) study the variation in diversity and community structures of AMF and their associated microorganisms across plant species identity and PHP concentrations, iii) study the correlations (covariations) between AMF species and their associated microorganisms and iv) compare microbial community structures of PHP contaminated soils and roots with those associated with AMF spores in order to determine if the microbial communities shaped on the surface of AMF spores and mycelia are different from those identified in soil and roots. To do so, AMF spores and/or their intraradical propagules were harvested from rhizospheric soil and roots of three plant species growing spontaneously in three distinct waste decantation basins of a former petrochemical plant located on the south shore of the St-Lawrence River, near Montreal. The harvested spores and propagules, as well as samples of soils and roots were subjected to PCR (we target 16S rRNA genes for bacteria, 18S rRNA genes for AMF and ITS regions for the other fungi), cloning, Sanger sequencing or 454 high throughput sequencing. Then, bioinformatics and statistics were performed to evaluate the effects of biotic and abiotic driving forces on AMF and their associated microbial communities. My results showed high fungal and bacterial diversity associated with AMF spores and propagules in PHP contaminated soils. I also observed that the microbial community structures associated with AMF spores were significantly affected by plant species identity and PHP concentrations. Furthermore, I observed positive and negative correlations between some AMF species and some AMF-associated microorganisms, suggesting that in addition to PHP concentrations and plant species identity, AMF species may also play a key role in shaping the microbial community surrounding their spores. Comparisons between the AMF spore-associated microbiome and the whole microbiome found in rhizospheric soil and roots showed that AMF spores recruit a microbiome differing from those found in the surrounding soil and roots. Overall, my PhD project brings a new level of knowledge on AMF diversity on extremely polluted environment and demonstrates that interaction of AMF and their associated microbes is much complex that we though previously. Further investigations are needed to better understand how AMF select and reward their associated microbes in different environments.

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand. / Human dihydrofolate reductase (hDHFR) is an essential enzyme for cellular proliferation and it has long been the target of antifolate drugs for the treatment of various types of cancer. Despite the clinical effectiveness of current antifolate treatments, new drugs are required to reduce the side-effects associated with their use. An essential requirement for design of new antifolates is a better understanding of how these drugs interact with their targets. We applied directed evolution to identify mutant hDHFR variants with modified binding to some clinically relevant antifolates. A saturation mutagenesis approach was used to create genetic diversity at active-site residues of hDHFR and a new, efficient screening strategy was developed to identify the amino acids that preserved native activity and/or conferred antifolate resistance. The screening method consists in a high-throughput first-tier bacterial selection coupled with a second-tier in vitro assay that allows for rapid detection of the best variants among the leads, according to user-defined parameters. Many active, antifolate-resistant mutants of hDHFR were identified. Moreover, the approach has proven efficient in rapidly assessing kinetic (kcat) and inhibition parameters of the hDHFR variants (IC50). Structure-function relationship analysis based on kinetic investigation, available structural and functional data as well as modeling were performed. By monitoring which mutations have the greatest effect on binding, we have begun to build a molecular picture of the contacts involved in drug binding. By varying the drugs we test against, we gain a better understanding of the specific binding properties that determine ligand discrimination.

La régulation de l’expression des gènes est fondamentale pour coordonner la synthèse, l’assemblage et la localisation des complexes macromoléculaires dans les cellules. Cette expression est régulée à divers niveaux. Elle commence dans le noyau où les facteurs de transcription se lient à des séquences spécifiques d’ADN et recrutent les ARN polymérases pour la synthèse des ARN. La régulation à ce niveau est dite transcriptionnelle. Les protéines de liaison à l’ARN s’associent avec l’ARN en cours de synthèse et opèrent divers modifications comme l’addition d’une coiffe en 5’, l’épissage, l’édition et la poly-adénylation en 3’. Les transcrits sont alors exportés vers le cytoplasme où ils vont être adressés et stockés dans des régions subcellulaires. Les ARNm s’assemblent avec des facteurs de traduction et les ribosomes pour initier la synthèse protéique de manière contrôlée. Enfin, les ARNm sont dégradés. Les régulations qui touchent chacune de ces étapes sont dites post-transcriptionnelles. Le développement récent d’outils d’analyse à l’échelle génomique ont permis une meilleure compréhension globale des programmes de régulation des gènes au niveau transcriptionnel. Cependant, l’architecture globale des systèmes qui régulent les étapes post-transcriptionnelles d’expression des gènes est encore peu connue. Un tel système de régulation post-transcriptionnelle doit être contrôlé par des centaines de protéines de liaison à l’ARN et de microARN (miARN) encodés dans les génomes eucaryotes. C’est pourquoi il est important de disposer d’outils et de plateformes adaptés à l’étude de cette régulation à l’échelle génomique. Dans cette thèse, nous nous sommes intéressés à deux programmes de la régulation post-transcriptionnelle chez Caenorhabditis elegans : l’épissage alternatif et la régulation par les miARN. Nous avons utilisés des vers rapporteurs de l’épissage alternatif exprimant la double fluorescence GFP et RFP afin d’étudier l’architecture de cette régulation et l’identification ou la validation des facteurs en trans et des éléments en cis par génétique classique en utilisant la mutagenèse aléatoire, l’automatisation du crible grâce au COPAS biosorter et le séquençage des génomes entiers. Nous avons également modifiés en profondeur le module ReFlx du cytomètre en flux adapté aux organismes de grande taille (COPAS Biosorter) afin d’éliminer les problèmes de contamination et diviser par sept le temps nécessaire au traitement dans le but de mener une étude de génétique inverse à haut débit par ARN interférence. Nous avons enfin générer des lignées fluorescentes bi-colores pour étudier la régulation dépendante de la région 3’ UTR grâce aux microARN. / The regulation of gene expression is fundamental to coordinate the synthesis, assembly and localization of macromolecular complexes in cells. This expression is regulated at various levels. It begins in the nucleus where transcription factors bind to specific DNA sequences and recruit RNA polymerases to synthesize RNA. Regulation at this level is called transcriptional. RNA binding proteins associate with RNA during synthesis and operate various modifications such as the addition of a 5' cap, splicing, editing and polyadenylation at the 3'. The transcripts are then exported to the cytoplasm where they will be sent to subcellular regions and stored. mRNA are then associated with translation factors and ribosomes to initiate protein synthesis in a controlled manner. Finally, mRNAs are degraded. Regulations that affect each of these steps are called post-transcriptional regulations. The recent tools developments for genomic scale analysis have allowed a better overall understanding of gene regulation programs at the transcriptional level. However, the overall architecture of systems that regulate post-transcriptional steps of gene expression is still misunderstood. Such a system of post-transcriptional regulation must be controlled by hundreds of RNA binding proteins and microRNA (miRNA) encoded in eukaryotic genomes. This is why it is important to have tools and platforms suited to the study of the post-transcriptional regulation on a genomic scale. During this thesis, we have focused our work on two post-transcriptional regulation programs in Caenorhabditis elegans : alternative splicing and miRNAs regulation. We used GFP and RFP double fluorescent alternative splicing reporter lines to study the architecture of this regulation and to identify trans factors and cis-elements by using forward genetics, random mutagenesis, automated screen through COPAS biosorter and whole genome sequencing. We also extensively modified the ReFlx module of the COPAS to fix carry over problems and divide by seven the time required for processing in order to conduct a High throughput reverse genetic study using RNA interference. We finally generate bi-color fluorescent lines to study 3 'UTR regulation mediated by microRNAs.

L’émergence de l’informatique dans les nuages met en avant de nombreux défis qui pourraient limiter l’adoption du paradigme Cloud. Tandis que la taille des données traitées par les applications Cloud augmente exponentiellement, un défi majeur porte sur la conception de solutions efficaces pour la gestion de données. Cette thèse a pour but de concevoir des mécanismes d’auto-adaptation pour des systèmes de gestion de données, afin qu’ils puissent répondre aux exigences des services de stockage Cloud en termes de passage à l’échelle, disponibilité et sécurité des données. De plus, nous nous proposons de concevoir un service de données qui soit à la fois compatible avec les interfaces Cloud standard dans et capable d’offrir un stockage de données à haut débit. Pour relever ces défis, nous avons proposé des mécanismes génériques pour l’auto-connaissance, l’auto-protection et l’auto-configuration des systèmes de gestion de données. Ensuite, nous les avons validés en les intégrant dans le logiciel BlobSeer, un système de stockage qui optimise les accès hautement concurrents aux données. Finalement, nous avons conçu et implémenté un système de fichiers s’appuyant sur BlobSeer, afin d’optimiser ce dernier pour servir efficacement comme support de stockage pour les services Cloud. Puis, nous l’avons intégré dans un environnement Cloud réel, la plate-forme Nimbus. Les avantages et les désavantages de l’utilisation du stockage dans le Cloud pour des applications réelles sont soulignés lors des évaluations effectuées sur Grid’5000. Elles incluent des applications à accès intensif aux données, comme MapReduce, et des applications fortement couplées, comme les simulations atmosphériques. / The emergence of Cloud computing brings forward many challenges that may limit the adoption rate of the Cloud paradigm. As data volumes processed by Cloud applications increase exponentially, designing efficient and secure solutions for data management emerges as a crucial requirement. The goal of this thesis is to enhance a distributed data-management system with self-management capabilities, so that it can meet the requirements of the Cloud storage services in terms of scalability, data availability, reliability and security. Furthermore, we aim at building a Cloud data service both compatible with state-of-the-art Cloud interfaces and able to deliver high-throughput data storage. To meet these goals, we proposed generic self-awareness, self-protection and self-configuration components targeted at distributed data-management systems. We validated them on top of BlobSeer, a large-scale data-management system designed to optimize highly-concurrent data accesses. Next, we devised and implemented a BlobSeer-based file system optimized to efficiently serve as a storage backend for Cloud services. We then integrated it within a real-world Cloud environment, the Nimbus platform. The benefits and drawbacks of using Cloud storage for real-life applications have been emphasized in evaluations that involved data-intensive MapReduce applications and tightly-coupled, high-performance computing applications.