Orientador: Stephen Hyslo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:41:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bifaroni_RenataManoScatamburlo_M.pdf: 12304500 bytes, checksum: a5c3c67724b7ea654b79231b9f69925a (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A heme oxigenase (HO) é uma enzima envolvida na degradação de grupos heme, levando à formação de biliverdina IX, ferro e monóxido de carbono. Em baixas concentrações, esses produtos exercem diversos efeitos protetores, inclusive antiapoptóticos, antiinflamatórios, antiproliferativos e antitrombóticos, enquanto, em concentrações elevadas, podem resultar em hipóxia, comprometimento neurológico, disfunções mitocondriais e hiperbilirrubinemia. Neste estudo, investigamos o envolvimento da HO no aumento da permeabilidade vascular, na hemorragia e na mionecrose causadas pela peçonha de Bothrops jararacussu. A peçonha de B. jararacussu (0,3-3 µg/sítio) aumentou a permeabilidade vascular no dorso de pele de camundongos. Este aumento foi inibido pelo zinco deuteroporfirina 2,4-bis-glicol (ZnDPBG), um inibidor não seletivo da HO, quando administrado i.p. (45 e 90 µmol/kg), mas não quando i.d. (25-200 nmol/sítio). O co-tratamento com o inibidor do óxido nítrico sintase, N?-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 100 nmol/sítio), não potencializou a inibição por ZnDPBG. ZnDPBG (45 ou 90 µmol/kg, i.p.) não reduziu a hemorragia na pele (3 e 10 µg de peçonha/sítio), mas aumentou esta resposta na dose maior. A peçonha (25 µg e 75 µg) aumentou a atividade da HO em músculo gastrocnêmio de camundongos em dois momentos - um precoce (nas primeiras horas após o envenenamento - fase de lesão aguda) e um tardio (alguns dias após a injeção de peçonha, fase de regeneração muscular). Na dose de 75 µg da peçonha, ocorreu aumento da expressão gênica da HO-1, entre 3 e 12 horas após o envenenamento, com pouca alteração na expressão da HO-2. As alterações histológicas causadas pela peçonha (25 µg e 75 µg) consistiram de três fases: fase 1 (até 6 h ou 12 h pós-peçonha - p.p.), caracterizada por hemorragia e mionecrose, fase 2 (de 12 h a 72 h p.p.), caracterizada por um extenso infiltrado inflamatório e fase 3 (7-28 dias p.p.), caracterizada por células regenerativas e maior deposição de colágeno ao redor destas células. O tratamento com ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.), 15 minutos após a injeção da peçonha (75 µg), inibiu parcialmente a mionecrose, diminuindo também os níveis de CK nas primeiras horas (1-3 h) pós-peçonha. Estes resultados indicam um envolvimento da HO no edema e na mionecrose causadas pela peçonha de B. jararacussu, e mostram que a inibição desta atividade com ZnDPBG pode proporcionar alguma proteção contra esses efeitos locais / Abstract: Heme-oxygenase (HO) is an enzyme involved in the degradation of heme groups that results in the formation of biliverdin IX, iron and carbon monoxide. At low concentrations, these reaction products have anti-apoptotic, anti-inflammatory, anti-proliferative, and anti-thrombotic activities, whereas at high concentrations they can cause hypoxia, neurological damage, mitochondrial dysfunction and hiperbilirrubinemia. In this study, we investigated the involvement of HO in the increase in vascular permeability, hemorrhage and myonecrosis caused by Bothrops jararacussu snake venom. Bothrops jararacussu venom (0.3-3 µg/site) increased the vascular permeability in mouse dorsal skin. This increase was inhibited by zinc deuteroporphyrin 2,4-bis-glycol (ZnDPBG), a non-selective HO inhibitor, when administered i.p. (45 and 90 µmol/kg). In contrast, ZnDPBG given i.d. (25-200 µmol/site) did not affect the increase in vascular permeability. Co-treatment with the nitric oxide synthase inhibitor N?-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 nmol/site) did not potentiate the inhibition by ZnDPBG. ZnDPBG (45 or 90 µmol/kg, i.p.) did not reduce the dorsal skin hemorrhage (3 and 10 µg of venom/site), but rather, increased this response at the highest dose. Venom (25 and 75µg) increased the HO activity of mouse gastrocnemius muscle. The increase in activity was biphasic and included early (first few hours after envenoming, corresponding to acute damage) and late (7-18 days after envenoming - muscle regeneration) phases. Enhanced gene expression of HO-1 was seen 3-12 h after envenomation (75 µg), with little change in HO-2 expression. Histological analysis showed that the muscle damage consisted of three phases: phase 1 (up to 6-12 h post-venom), characterized mostly by hemorrhage and myonecrosis, phase 2 (12-72 h post-venom), characterized by an extensive inflammatory infiltrate, and phase 3 (7-28 days post-venom), characterized mainly by regenerative cells and an increase in collagen deposition around these cells. Treatment with ZnDPBG (90 µmol/kg, i.p.) 15 min after venom (75 µg) injection partially attenuated the myonecrosis and also decreased the creatine kinase (CK) levels after 1 and 3 h. Together, these results indicate that HO activity is involved in the edema and myonecrosis caused by B. jararacussu venom, and that the inhibition of this activity with ZnDPBG provides some protection against these local effects / Mestrado / Mestre em Farmacologia

A malária é uma doença causada pelo parasita do gênero Plasmodium e que foi responsável por cerca de 440.000 mortes em 2015. A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma das principais complicações clínicas da malária. O modelo murino DBA/2 reproduz os sinais clínicos da SDRA observados em humanos, quando infectado com o Plasmodium berghei ANKA. Além disso, altos níveis da enzima heme oxigenase 1 (HO-1) foram observados em casos de malária cerebral e em SDRA em humanos. Os nossos dados indicam que os níveis da HO-1 estão aumentados em camundongos que desenvolvem SDRA associada à malária (SDRA-AM). Adicionalmente, a droga indutora de HO-1 (hemina) aumentou a sobrevivência e preveniu a SDRA-AM. Verificou-se também uma redução na permeabilidade pulmonar e nos níveis de VEGF, além de uma melhoria nos parâmetros respiratórios em animais tratados com hemina. Assim sendo, a indução da HO-1 antes do desenvolvimento da SDRA-AM é protetora e assim, a HO-1 pode ser um alvo de novos fármacos, como forma de prevenir o desenvolvimento da SDRA-AM em humanos. / Malaria is a serious disease, caused by the parasite of the genus Plasmodium, which was responsible to 440,000 deaths in 2015. Acute lung injury/ acute respiratory distress syndrome (ALI/ARDS) is one of the main clinical complications in severe malaria. The murine model DBA/2 reproduces the clinical signs of ALI/ARDS observed in humans, when infected with Plasmodium berghei ANKA. Additionally, high levels heme oxygenase 1 (HO-1) were reported in cases of cerebral malaria and in ALI/ARDS in humans. Our data have indicated that the HO-1 levels are increased in mice that develop malaria associated ALI/ARDS (MA-ALI/ARDS). Additionally, a HO-1 inducing drug (hemin) increased the survival rate and prevented mice from developing MA-ALI/ARDS in treated mice. Also, there was a decrease in the lung permeability and in lung VEGF levels, and an amelioration of respiratory parameters. Therefore, the induction of HO-1 before the development of MA-ALI/ARDS is protective, making this enzyme a possible target of new drugs to prevent the development of MA-ALI/ARDS in humans.

A exposição de animais a situações ameaçadoras de natureza inata ou aprendida resulta em exibição de um repertório de comportamentos defensivos espécie-específicos, alterações autonômicas e em inibição da dor, sendo esse conjunto de reações de alta relevância para a sobrevivência de uma espécie. Considerando este contexto, um importante componente da resposta do organismo a situações de emergência é a redução da capacidade de perceber a dor. O processamento de estímulos nociceptivos pode ser modulado no prosencéfalo, na medula espinal, no tronco encefálico e no diencéfalo, por mecanismos envolvendo diferentes neurotransmissores e neuromoduladores. Nos últimos anos, evidências têm demonstrado que o monóxido de carbono (CO), produzido a partir da enzima heme-oxigenase estimula a formação de guanosina 3, 5- monofosfato cíclico (GMPc), participando como neuromodulador de vários processos fisiológicos. Dentro deste contexto, mostrou-se que a via HO-CO-GMPc está envolvida na modulação periférica e espinal da dor inflamatória, bem como na modulação do estresse, porém não há conhecimento da participação desta via na modulação de estímulo doloroso agudo, bem como da antinocicepção induzida pelo estresse. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o envolvimento da via HO-CO-GMPc na nocicepção e na antinocicepção induzida pelo estresse agudo em ratos, avaliada pelo índice de analgesia no teste de retirada da cauda (IARC). Nossos resultados demonstraram que a ativação da via HO-CO-GMPc por meio da administração ICV de heme-lisinato (substrato) tem efeito antinociceptivo, sendo este efeito dependente da atividade GMPc, desde que o pré-tratamento com inibidor da guanilase ciclase solúvel (GCs), ODQ, bloqueou o aumento do IARC. Ainda, esta modulação ocorre de maneira fásica e não tônica, pois o tratamento isolado ICV com o inibidor da HO, ZnDBPG ou com o inibidor da GCs, ODQ, não alterou o IARC. A antinocicepção induzida pelo estresse agudo (restrição física por 120 min) não é dependente da via HO-CO-GMPc, desde que o tratamento com o ZnDBPG, nem com o heme-lisinato alteraram o IARC. No entanto, esta antinocicepção é dependente da atividade do GMPc, pois o pré-tratamento com ODQ bloqueou o aumento do IARC. / The exposure of animals to threatening situations of innate or learned nature results in exhibition of a repertoire of species-specific defensive behaviors, autonomic alterations and pain inhibition. This group of reactions has high relevance for the survival of species. In this context, an important component of the response of the organism in the emergency situations is the reduction of the capacity to perceive pain. The processing of nociceptive stimulus can be modulated in forebrain, in spinal, and in midbrain, for mechanisms involving different neurotransmitters and neuromodulators. Recently, evidence has demonstrated that carbon monoxide gas (CO), produced from the enzyme heme oxygenase (HO), stimulate the formation of 3\', 5\' - cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and this molecule has participated as neuromodulator in some physiological processes. In this way, it has shown that the HO-CO-cGMP pathway is involved in the peripheral and spinal modulation of inflammatory pain, as well as in the modulation of the stress. However, the involvement of this pathway in the modulation of acute painful stimulus, as well as in the antinociception induced by stress isn´t clarified. Thus, this study evaluated the involvement of the HO-CO-cGMP pathway in nociception and in antinociception induced by acute stress in rats, by means the of analgesia index in the tail flick test (AITF). Our results demonstrated that the activation of the HO-CO-cGMP pathway by means of heme-lysinate ICV administration has antinociceptive effect. Again, the increase of the AITF was dependent of the cGMP activity, since that the pretreatment with inhibitor of soluble guanylase cyclase (sGC), ODQ, blocked the antinociceptive effect. This modulation occurs in fasic and not tonic manner, because per se ICV treatment with inhibitor of the HO, ZnDBPG or with inhibitor of the sGC, ODQ did not modify the AITF. The antinociception induced by acute stress (physical restriction during 120 min) is not dependent of the HO-CO-cGMP pathway, since that neither the treatment with the ZnDBPG, nor with the heme-lysinate had modified the AITF. However, this antinociception is dependent of the activity of the cGMP, because the pretreatment with ODQ blocked the increase of the AITF induced by acute stress.

Na lesão renal aguda, os mecanismos de defesa atuam como genes protetores, como a proteína heat shock 32 (HSP 32), também conhecida como heme oxigenase-1 (HO-1). A polimixina B (PmxB) é um antimicrobiano nefrotóxico. O objetivo deste estudo foi caracterizar a participação da enzima HO-1 na toxicidade da PmxB em células LLC-PK1. As células foram submetidas aos seguintes tratamentos: Controle (CTL- 0µM); Hemin (indutor de HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Protoporfirina de zinco (ZnPP - inibidor de HO-1, 10M,); Nitro-L-arginina-metilester (L-NAME - inibidor de iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM de Hemin uma hora antes da PmxB); PmxB + ZnPP (10M de ZnPP uma hora antes da PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M de Hemin e 0,1mM de L-NAME uma hora antes da PmxB). Os grupos foram avaliados em 24 e 72 horas. Foram analisados os seguintes parâmetros: desidrogenase láctica (DHL), peroxidação lipídica (MDA), expressão gênica da HO-1 por RT-PCR, síntese protéica da HO-1 por imunofluorescência, óxido nítrico (NO) pelo método de Griess e expressão protéica da HO-1 e da iNOS por western blotting. Os resultados mostraram que a PmxB elevou o DHL com aumento dos níveis de MDA. O Hemin e a ZnPP elevaram as variáveis DHL, MDA e óxido nítrico (NO). O indutor de HO-1 incrementou a expressão protéica da HO-1 e da iNOS. A PmxB se confirmou como citotóxica e a HO-1 intensificou a lesão por mecanismos oxidativos. O efeito da HO-1 na lesão celular parece ser mediado pelo NO / In the acute kidney injury, the mechanisms of defense act as protector genes, as the protein heat shock 32 (HSP 32), also known as heme oxygenase-1 (HO-1). The polymyxin B (PmxB) is a nephrotoxic antimicrobial. The aim of this study was to distinguish the role of the HO-1 enzyme in the PmxB toxicity in LLC-PK1 cells. The cells were submitted to the following treatments: Control (CTL- 0µM); Hemin (inhibitor of HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Zinc protoporphyrin (ZnPP - inhibitor of HO-1, 10M,); NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME - inhibitor of iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM of Hemin one hour before the PmxB); PmxB + ZnPP (10M of ZnPP one hour before the PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M of Hemin and 0,1mM of L-NAME one hour before the PmxB). All groups were evaluated in 24 and 72 hours. The following parameters were analysed: lactate dehydrogenase (LDH), lipid peroxidation (MDA), genic expression of HO-1 by RT-PCR, protein syntesis of HO-1 by immunofluorescence, nitric oxide (NO) by Griess method and protein expression of HO-1 and of iNOS by western blotting. The results showed that PmxB increased the LDH and the levels of MDA. Hemin and ZnPP also increased the LDH variables, MDA and nitric oxide (NO). The inducer of HO-1 improved the protein expression of HO-1 and of iNOS. The PmxB was confirmed as a cytotoxic and the HO-1 intensified the failure by oxidative mechanisms. The effect of HO-1 in the cell injury seemed to be mediated by NO

A heme oxigenase (HEOX) é uma enzima que converte o anel heme em quantidades equimolares de biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Fe3+. Esta enzima tem um importante papel fisiológico, regulando os níveis de hemeproteínas e protegendo as células da agressão oxidativa do heme livre. A biliverdina é, subseqüentemente, transformada em bilirrubina que apresenta propriedades antioxidativas e o Fe3+ é seqüestrado pela ferritina. O CO ativa a guanilil ciclase, com resultante produção de 3?,5?-monofosfato de guanosina cíclico provocando relaxamento da musculatura lisa vascular. Em trabalho anterior, nós verificamos o efeito da inibição aguda da heme oxigenase com zinco protoporfirina (ZnPP IX) sobre a pressão arterial de ratos Wistar machos recebendo dietas hipossódica (0,15% de NaCl), normossódica (1,3% de NaCl) ou hipersódica (8% de NaCl) desde o desmame. Nos animais sob dieta hipersódica houve diminuição nos níveis pressóricos, enquanto que nos animais que recebiam dieta hipo e normossódica, ocorreu um aumento dos níveis pressóricos. A análise destes resultados mostrou a existência de uma correlação negativa entre a pressão arterial basal medida antes da injeção de ZnPP IX e o efeito deste tratamento sobre os níveis pressóricos. Esta correlação independeu do conteúdo de sal na dieta consumida pelos animais. Concluímos assim, que a resposta à inibição da HEOX é modulada pela pressão arterial basal. Recentemente, foi mostrado que a heme oxigenase é induzida por incrementos da pressão obtidos de maneiras diversas e que ao retornar os níveis pressóricos a valores basais esta indução da enzima é revertida. A estimulação da HEOX promove consumo de anel heme. O heme integra a estrutura molecular de enzimas importantes na regulação da pressão arterial, como por exemplo, guanilato ciclase, óxido nítrico sintase, hidroxilase e epóxigenase (enzimas pertencentes à família do citocromo P-450). Permitimo-nos conjecturar que a falta de heme repercute sobre a atuação destas enzimas, uma vez que o turnover destas enzimas é dependente de heme. O objetivo deste estudo foi confirmar em outros modelos de hipertensão arterial os achados anteriores e verificar se a enzima epoxigenase que metaboliza o ácido araquidônico formando compostos vasodilatadores, tais como EET e DiHTE, está envolvida na queda da pressão arterial dos animais sob dieta hipersódica. Neste estudo foi induzida hipertensão arterial crônica com angiotensina II (AII - 0,7 mg.kg-1.d-1, via minibomba osmótica durante 7 dias) ou com L?-nitro L-arginina metil ester (L-NAME ? 50 mg/L fornecido na água de beber ao longo de duas semanas) e hipertensão arterial aguda com fenilefrina (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazina (15 mg.kg-1.dia-1 fornecido na água de beber durante 9 dias) e nitroprussiato de sódio (SNP - 7,7?g.kg-1.min-1 iv) foram utilizados para induzir diminuição crônica e aguda, respectivamente, da pressão arterial. A participação da via do citocromo P-450 no mecanismo de queda pressórica em resposta ao ZnPP IX nos animais sob dieta hipersódica (descrita no trabalho anterior), foi avaliada através da inibição desta via com clotrimazole (80 mg/kg/24 horas) em animais na vigência de sobrecarga de sal ou consumindo dieta normossódica. Grupos de ratos submetidos ao tratamento com AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazina e clotrimazole foram submetidos ao teste de inibição da HEOX. A pressão arterial direta (artéria carótida) foi avaliada antes e após a administração de zinco protoporfirina IX (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) ou veículo (carbonato de sódio ? 0,15mmol/kg ip). Nós verificamos nos modelos de hipertensão arterial crônicos ou no modelo agudo um resultado similar ao encontrado no estudo anterior, ou seja, em resposta à inibição da heme oxigenase houve uma queda importante da pressão arterial. Nos animais submetidos a hipotensão arterial não houve modificação da pressão arterial em resposta à administração de ZnPP IX. Nos grupos de animais submetidos ao tratamento com clotrimazole não houve modificação da pressão arterial após administração de ZnPP IX. Em conclusão, pressão basal elevada modifica o efeito da inibição da heme oxigenase sobre os níveis pressóricos em comparação com pressão arterial basal normal ou reduzida. A via do citocromo P-450 parece estar envolvida na queda pressórica após inibição da heme oxigenase nos animais submetidos a tratamento crônico com dieta hipersódica, uma vez que nos animais tratados com clotrimazole não houve modificação pressórica após a inibição da heme oxigenase. / Heme oxygenase (HEOX) is the rate-limiting enzyme that opens the heme ring, resulting in equimolar quantities of biliverdin, carbon monoxide (CO) and Fe3+. HEOX plays an important physiological role in the degradation of heme, regulating hemoprotein levels and therefore protecting cells from the deleterious effects of free heme. Biliverdin is subsequently reduced by biliverdin reductase to bilirubin that has antioxidant properties. Iron is sequestered by ferritin. CO activates soluble guanylate cyclase with resultant production of 3?,5?-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) which produces relaxation of the vascular smooth muscle cells. Previously we demonstrated the effect of acute HEOX inhibition by zinc protoporphyrin IX (ZnPP IX) on blood pressure in male Wistar rats that were fed with low (LSD ? 0.15% NaCl), normal (NSD ? 1.3%) or high salt diet (HSD - 8% NaCl) from weaning (21 days-old animals). The blood pressure decreased in rats on HSD, and increased in the animals on NSD and LSD after ZnPP IX administration. A negative correlation was obtained between blood pressure measured before ZnPP IX and the area under the curve of the percentage of blood pressure changes induced by ZnPP IX. This correlation seems to be independent of the salt content in the diet. Our conclusion is that the response to heme oxygenase inhibition is modulated by basal arterial blood pressure. Recently it was showed that heme oxygenase is induced by high blood pressure and the levels of the enzyme returns to normal with blood pressure control. It is known that heme oxygenase stimulation provokes breakdown of heme ring. The heme integrates the molecular structure of several important enzymes that are involved in the regulation of blood pressure, such as, soluble guanylate cyclase, nitric oxide synthase, hydroxylase and epoxygenase (cytochrome P-450 family). We postulate that the deficiency in heme rings due to heme oxigenase induction might lead to disturbances in the activities of some of these enzymes and hence hypertension. The objective of this study was 1) to confirm the results observed previously in others models f hypertension and 2) to the role of epoxygenase in the regulation of blood pressure in response to HEOX inhibition in hypertensive animals. The chronic hypertension was induced by angiotensin II (AII - 0.7 mg.kg-1.d-1, by osmotic mini pumps during 7 days) or with L?-nitro L-arginine metyl ester (L-NAME ? 50 mg/L in the tap water was given during two weeks ) and acute hypertension with phenylephrine (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazine (15 mg.kg-1.d-1 in the tap water was given during 9 days) and sodium nitropruside (SNP - 7.7?g.kg-1.min-1 iv) were used, respectively, to induce chronic and acute decreases of the blood pressure. The participation of the cytochrome P-450 pathway in the mechanism of blood pressure reduction in response to ZnPP IX was evaluated through the inhibition of this pathway by clorimazole (80 mg/kg/24 hours) in animals on high salt diet or nornal salt diet. Groups of rats treated with AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazine and clotrimazole were submitted to HEOX inhibition. Direct blood pressure (carotid artery) measurements were undertaken before and after zinc protoprphyrin IX administration (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) or vehicle (sodium carbonate ? 0,15mmol/kg ip). In the chronic or acute hypertension models heme oxygenase inhibition induced a decrease of blood pressure. In the hypotension group there was no modification on blood pressure of these animals in response to ZnPP IX. Animals on high salt diet submitted to the clotrimazole treatment did not modify the blood pressure after ZnPP IX administration. Thus; the cytochrome P-450 pathway seems to be involved in the blood pressure decreases after HEOX inhibition in the animals under long term of high salt diet since there was no change in blood pressure in the clotrimazole-treated groups after heme oxygenase inhibition.

QUEIROZ, Ismael Nilo Lino de. Caracterização estrutural preliminar e efeitos na inflamação da lectina da alga marinha verde Caulerpa cupressoides. 115 f. : Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará Fortaleza-CE, 2013. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-05-23T13:42:40Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_inlqueiroz.pdf: 2778929 bytes, checksum: 1ecf927693bc8e91aabb5a746c3dfbce (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-05T19:19:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_inlqueiroz.pdf: 2778929 bytes, checksum: 1ecf927693bc8e91aabb5a746c3dfbce (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-05T19:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_inlqueiroz.pdf: 2778929 bytes, checksum: 1ecf927693bc8e91aabb5a746c3dfbce (MD5) Previous issue date: 2013 / Lectins seaweed have various pharmacological applications. This work was partially characterize the structure and evaluate the effects on classical models of inflammation lectin of the green seaweed Caulerpa cupressoides. The Caulerpa cupressoides lectin (CcL) was extracted with Tris-HCl 25 mM, pH 7.5 and isolated by ion exchange chromatography on DEAE-cellulose. Structural characterization showed a partial aminoterminal sequence with 31 amino acid residues, obtained according to the method of Edman degradation, while in nuclear magnetic resonance spectroscopy to the CcL 1H-NMR purified by Sephadex G-100 and DEAE-cellulose obtained by was demonstrated similarity between signals obtained in both spectra. The anti-inflammatory activity was evaluated in male Wistar rats (n = 6), using the model of paw edema induced by carrageenan (700 μg/paw), dextran (500 μg/paw), histamine (100 μg/paw), serotonin (20 μg/paw) or bradykinin (30 μg/paw). Groups of animals were treated with CcL (0.1, 1.0 or 10.0 mg/kg, i.v.) 30 min before the inflammatory stimulus. Was evaluated the involvement of CcL (1.0 mg/kg) towards heme oxygenase-1. Groups were used that were treated with inhibitor CcL linked mucin (8.0 mg/kg, i.v.) or only mucin (8.0 mg/kg, i.v.) and dexamethasone (1.0 mg/kg, s.c.) were used as controls. The effect edematogenic CcL was evaluated by applying the doses of 0.1, 1.0 or 10 mg/kg (i.pl.). In the trial of paw edema induced by carrageenan, CcL reduced edema formation was confirmed by determining tissue levels of myeloperoxidase. CcL (1.0 mg/kg) showed no mucin linked to anti-inflammatory effect on the paw edema induced by carrageenan, except in the first hour after stimulation. In dextran-induced edema, CcL also inhibited the osmotic swelling. Only the dose of 1.0 mg/kg was used in reducing histamine-induced edema by 40% the edema within 30 min CcL (1.0 mg/kg), however, did not reduce the edema induced by serotonin or bradykinin. Besides, in the histological analysis of tissue subplantar, CcL (1.0 and 10.0 mg/kg) was able to reduce cell migration. In the presence of ZnPP IX (3.0 mg/kg, s.c.), CcL has lost its ability to inhibit the carrageenan-induced edema, exerting its mechanism of action anti-inflammatory pathway through the involvement of HO-1. While in immunohistochemistry, CcL (10 mg/kg) reduced the expression of IL-1β, but intense staining occurred cytokines TNF-α and IL-6, and expression of HO-1 in the groups treated with the same dose of CcL. In relation the effect edematogenic, CcL was able to induce intense inflammatory process with dose-dependent effect. However, the induced edema at a dose of 10 mg/kg was CcL was inhibited by indomethacin, meclizine, pentoxifylline and dexamethasone. Therefore, when the CcL partially characterized presented in its aminoterminal sequence of 43% identity with the protein from unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii and showed anti-and pro-inflammatory therapeutic agent is considered a potential for future studies in inflammatory processes. / As lectinas de algas marinhas possuem várias aplicações farmacológicas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar parcialmente a estrutura e avaliar os efeitos em modelos clássicos de inflamação da lectina da alga marinha verde Caulerpa cupressoides. A lectina de Caulerpa cupressoides (LCc) foi extraída com tampão Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 e isolada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE-celulose. A caracterização estrutural parcial apresentou uma sequência aminoterminal com 31 resíduos de aminoácidos, obtida de acordo com o método de degradação de Edman, enquanto que na espectroscopia de ressonância magnética nuclear unidimensional 1H para a LCc purificada por Sephadex G-100 e obtida por DEAE-celulose, foi demostrado uma similaridade entre os sinais obtidos em ambos os espectros. A atividade anti-inflamatória foi avaliada em ratos Wistar machos (n=6), utilizando o modelo de edema de pata induzidos por carragenana (700 μg/pata), dextrana (500 μg/pata), histamina (100 μg/pata), serotonina (20 μg/pata) ou bradicinina (30 μg/pata). Grupos de animais foram submetidos ao tratamento com LCc (0,1; 1,0 ou 10,0 mg/kg; i.v.), 30 min antes do estímulo inflamatório. Foi avaliado o envolvimento da LCc (1,0 mg/kg) na via da Heme oxigenase-1. Foram utilizados grupos que receberam tratamento com LCc ligada ao inibidor mucina (8,0 mg/kg; i.v.) ou somente mucina (8,0 mg/kg; i.v.) e dexametasona (1,0 mg/kg; s.c.) foram utilizados como controles. O efeito edematogênico de LCc foi avaliado aplicando as doses de 0,1; 1,0 ou 10 mg/kg (i.pl.). No ensaio de edema de pata induzido por carragenana, LCc reduziu a formação de edema sendo confirmado pela determinação dos níveis teciduais de mieloperoxidase. A LCc (1,0 mg/kg) ligada a mucina não apresentou efeito anti-inflamatório no edema de pata induzido por carragenana, exceto na primeira hora após o estímulo. No edema induzido por dextrana, LCc também inibiu o edema osmótico. Apenas a dose de 1,0 mg/kg foi utilizada no edema induzido por histamina reduzindo em 40% o edema no intervalo de 30 min LCc (1,0 mg/kg), entretanto, não reduziu a formação de edema induzido por serotonina ou bradicinina. Além disso, na análise histológica do tecido subplantar, LCc (1,0 e 10,0 mg/kg) foi capaz de reduzir a migração celular. Na presença de ZnPP IX (3,0 mg/kg; s.c.), LCc perdeu sua capacidade inibir o edema induzido por carragenana, exercendo seu mecanismo de ação anti-inflamatório através do envolvimento da via da HO-1. Enquanto que na imunohistoquímica, LCc (10 mg/kg) reduziu a expressão de IL-1β, porém ocorreu intensa marcação das citocinas TNF-α e IL-6, além da expressão de HO-1, nos grupos tratados com a mesma dose de LCc. Com relação ao efeito edematogênico, LCc foi capaz de induzir intenso processo inflamatório com efeito dose-dependente. No entanto, o edema induzido com a dose de 10 mg/kg de LCc foi foi inibido por indometacina, meclizina, pentoxifilina e dexametasona. Portanto, a LCc quando parcialmente caracterizada apresentou na sua sequência aminoterminal uma identidade de 43% com a proteína da alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii e apresentou propriedades anti- e pró-inflamatórias, sendo considerada um agente terapêutico em potencial para estudos futuros nos processos inflamatórios.

Na lesão renal aguda, os mecanismos de defesa atuam como genes protetores, como a proteína heat shock 32 (HSP 32), também conhecida como heme oxigenase-1 (HO-1). A polimixina B (PmxB) é um antimicrobiano nefrotóxico. O objetivo deste estudo foi caracterizar a participação da enzima HO-1 na toxicidade da PmxB em células LLC-PK1. As células foram submetidas aos seguintes tratamentos: Controle (CTL- 0µM); Hemin (indutor de HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Protoporfirina de zinco (ZnPP - inibidor de HO-1, 10M,); Nitro-L-arginina-metilester (L-NAME - inibidor de iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM de Hemin uma hora antes da PmxB); PmxB + ZnPP (10M de ZnPP uma hora antes da PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M de Hemin e 0,1mM de L-NAME uma hora antes da PmxB). Os grupos foram avaliados em 24 e 72 horas. Foram analisados os seguintes parâmetros: desidrogenase láctica (DHL), peroxidação lipídica (MDA), expressão gênica da HO-1 por RT-PCR, síntese protéica da HO-1 por imunofluorescência, óxido nítrico (NO) pelo método de Griess e expressão protéica da HO-1 e da iNOS por western blotting. Os resultados mostraram que a PmxB elevou o DHL com aumento dos níveis de MDA. O Hemin e a ZnPP elevaram as variáveis DHL, MDA e óxido nítrico (NO). O indutor de HO-1 incrementou a expressão protéica da HO-1 e da iNOS. A PmxB se confirmou como citotóxica e a HO-1 intensificou a lesão por mecanismos oxidativos. O efeito da HO-1 na lesão celular parece ser mediado pelo NO / In the acute kidney injury, the mechanisms of defense act as protector genes, as the protein heat shock 32 (HSP 32), also known as heme oxygenase-1 (HO-1). The polymyxin B (PmxB) is a nephrotoxic antimicrobial. The aim of this study was to distinguish the role of the HO-1 enzyme in the PmxB toxicity in LLC-PK1 cells. The cells were submitted to the following treatments: Control (CTL- 0µM); Hemin (inhibitor of HO-1, 25µM); Hemin II (250M), Zinc protoporphyrin (ZnPP - inhibitor of HO-1, 10M,); NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME - inhibitor of iNOS, 0,1mM); PmxB (375µM); PmxB + Hemin (25µM of Hemin one hour before the PmxB); PmxB + ZnPP (10M of ZnPP one hour before the PmxB); PmxB + Hemin + L-NAME (25M of Hemin and 0,1mM of L-NAME one hour before the PmxB). All groups were evaluated in 24 and 72 hours. The following parameters were analysed: lactate dehydrogenase (LDH), lipid peroxidation (MDA), genic expression of HO-1 by RT-PCR, protein syntesis of HO-1 by immunofluorescence, nitric oxide (NO) by Griess method and protein expression of HO-1 and of iNOS by western blotting. The results showed that PmxB increased the LDH and the levels of MDA. Hemin and ZnPP also increased the LDH variables, MDA and nitric oxide (NO). The inducer of HO-1 improved the protein expression of HO-1 and of iNOS. The PmxB was confirmed as a cytotoxic and the HO-1 intensified the failure by oxidative mechanisms. The effect of HO-1 in the cell injury seemed to be mediated by NO

A heme oxigenase (HEOX) é uma enzima que converte o anel heme em quantidades equimolares de biliverdina, monóxido de carbono (CO) e Fe3+. Esta enzima tem um importante papel fisiológico, regulando os níveis de hemeproteínas e protegendo as células da agressão oxidativa do heme livre. A biliverdina é, subseqüentemente, transformada em bilirrubina que apresenta propriedades antioxidativas e o Fe3+ é seqüestrado pela ferritina. O CO ativa a guanilil ciclase, com resultante produção de 3?,5?-monofosfato de guanosina cíclico provocando relaxamento da musculatura lisa vascular. Em trabalho anterior, nós verificamos o efeito da inibição aguda da heme oxigenase com zinco protoporfirina (ZnPP IX) sobre a pressão arterial de ratos Wistar machos recebendo dietas hipossódica (0,15% de NaCl), normossódica (1,3% de NaCl) ou hipersódica (8% de NaCl) desde o desmame. Nos animais sob dieta hipersódica houve diminuição nos níveis pressóricos, enquanto que nos animais que recebiam dieta hipo e normossódica, ocorreu um aumento dos níveis pressóricos. A análise destes resultados mostrou a existência de uma correlação negativa entre a pressão arterial basal medida antes da injeção de ZnPP IX e o efeito deste tratamento sobre os níveis pressóricos. Esta correlação independeu do conteúdo de sal na dieta consumida pelos animais. Concluímos assim, que a resposta à inibição da HEOX é modulada pela pressão arterial basal. Recentemente, foi mostrado que a heme oxigenase é induzida por incrementos da pressão obtidos de maneiras diversas e que ao retornar os níveis pressóricos a valores basais esta indução da enzima é revertida. A estimulação da HEOX promove consumo de anel heme. O heme integra a estrutura molecular de enzimas importantes na regulação da pressão arterial, como por exemplo, guanilato ciclase, óxido nítrico sintase, hidroxilase e epóxigenase (enzimas pertencentes à família do citocromo P-450). Permitimo-nos conjecturar que a falta de heme repercute sobre a atuação destas enzimas, uma vez que o turnover destas enzimas é dependente de heme. O objetivo deste estudo foi confirmar em outros modelos de hipertensão arterial os achados anteriores e verificar se a enzima epoxigenase que metaboliza o ácido araquidônico formando compostos vasodilatadores, tais como EET e DiHTE, está envolvida na queda da pressão arterial dos animais sob dieta hipersódica. Neste estudo foi induzida hipertensão arterial crônica com angiotensina II (AII - 0,7 mg.kg-1.d-1, via minibomba osmótica durante 7 dias) ou com L?-nitro L-arginina metil ester (L-NAME ? 50 mg/L fornecido na água de beber ao longo de duas semanas) e hipertensão arterial aguda com fenilefrina (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazina (15 mg.kg-1.dia-1 fornecido na água de beber durante 9 dias) e nitroprussiato de sódio (SNP - 7,7?g.kg-1.min-1 iv) foram utilizados para induzir diminuição crônica e aguda, respectivamente, da pressão arterial. A participação da via do citocromo P-450 no mecanismo de queda pressórica em resposta ao ZnPP IX nos animais sob dieta hipersódica (descrita no trabalho anterior), foi avaliada através da inibição desta via com clotrimazole (80 mg/kg/24 horas) em animais na vigência de sobrecarga de sal ou consumindo dieta normossódica. Grupos de ratos submetidos ao tratamento com AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazina e clotrimazole foram submetidos ao teste de inibição da HEOX. A pressão arterial direta (artéria carótida) foi avaliada antes e após a administração de zinco protoporfirina IX (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) ou veículo (carbonato de sódio ? 0,15mmol/kg ip). Nós verificamos nos modelos de hipertensão arterial crônicos ou no modelo agudo um resultado similar ao encontrado no estudo anterior, ou seja, em resposta à inibição da heme oxigenase houve uma queda importante da pressão arterial. Nos animais submetidos a hipotensão arterial não houve modificação da pressão arterial em resposta à administração de ZnPP IX. Nos grupos de animais submetidos ao tratamento com clotrimazole não houve modificação da pressão arterial após administração de ZnPP IX. Em conclusão, pressão basal elevada modifica o efeito da inibição da heme oxigenase sobre os níveis pressóricos em comparação com pressão arterial basal normal ou reduzida. A via do citocromo P-450 parece estar envolvida na queda pressórica após inibição da heme oxigenase nos animais submetidos a tratamento crônico com dieta hipersódica, uma vez que nos animais tratados com clotrimazole não houve modificação pressórica após a inibição da heme oxigenase. / Heme oxygenase (HEOX) is the rate-limiting enzyme that opens the heme ring, resulting in equimolar quantities of biliverdin, carbon monoxide (CO) and Fe3+. HEOX plays an important physiological role in the degradation of heme, regulating hemoprotein levels and therefore protecting cells from the deleterious effects of free heme. Biliverdin is subsequently reduced by biliverdin reductase to bilirubin that has antioxidant properties. Iron is sequestered by ferritin. CO activates soluble guanylate cyclase with resultant production of 3?,5?-cyclic guanosine monophosphate (cGMP) which produces relaxation of the vascular smooth muscle cells. Previously we demonstrated the effect of acute HEOX inhibition by zinc protoporphyrin IX (ZnPP IX) on blood pressure in male Wistar rats that were fed with low (LSD ? 0.15% NaCl), normal (NSD ? 1.3%) or high salt diet (HSD - 8% NaCl) from weaning (21 days-old animals). The blood pressure decreased in rats on HSD, and increased in the animals on NSD and LSD after ZnPP IX administration. A negative correlation was obtained between blood pressure measured before ZnPP IX and the area under the curve of the percentage of blood pressure changes induced by ZnPP IX. This correlation seems to be independent of the salt content in the diet. Our conclusion is that the response to heme oxygenase inhibition is modulated by basal arterial blood pressure. Recently it was showed that heme oxygenase is induced by high blood pressure and the levels of the enzyme returns to normal with blood pressure control. It is known that heme oxygenase stimulation provokes breakdown of heme ring. The heme integrates the molecular structure of several important enzymes that are involved in the regulation of blood pressure, such as, soluble guanylate cyclase, nitric oxide synthase, hydroxylase and epoxygenase (cytochrome P-450 family). We postulate that the deficiency in heme rings due to heme oxigenase induction might lead to disturbances in the activities of some of these enzymes and hence hypertension. The objective of this study was 1) to confirm the results observed previously in others models f hypertension and 2) to the role of epoxygenase in the regulation of blood pressure in response to HEOX inhibition in hypertensive animals. The chronic hypertension was induced by angiotensin II (AII - 0.7 mg.kg-1.d-1, by osmotic mini pumps during 7 days) or with L?-nitro L-arginine metyl ester (L-NAME ? 50 mg/L in the tap water was given during two weeks ) and acute hypertension with phenylephrine (FE - 1 mg.kg-1.h-1 iv ). Hidralazine (15 mg.kg-1.d-1 in the tap water was given during 9 days) and sodium nitropruside (SNP - 7.7?g.kg-1.min-1 iv) were used, respectively, to induce chronic and acute decreases of the blood pressure. The participation of the cytochrome P-450 pathway in the mechanism of blood pressure reduction in response to ZnPP IX was evaluated through the inhibition of this pathway by clorimazole (80 mg/kg/24 hours) in animals on high salt diet or nornal salt diet. Groups of rats treated with AII, L-NAME, FE, SNP, hidralazine and clotrimazole were submitted to HEOX inhibition. Direct blood pressure (carotid artery) measurements were undertaken before and after zinc protoprphyrin IX administration (ZnPP IX ? 90 ?mol/kg ip) or vehicle (sodium carbonate ? 0,15mmol/kg ip). In the chronic or acute hypertension models heme oxygenase inhibition induced a decrease of blood pressure. In the hypotension group there was no modification on blood pressure of these animals in response to ZnPP IX. Animals on high salt diet submitted to the clotrimazole treatment did not modify the blood pressure after ZnPP IX administration. Thus; the cytochrome P-450 pathway seems to be involved in the blood pressure decreases after HEOX inhibition in the animals under long term of high salt diet since there was no change in blood pressure in the clotrimazole-treated groups after heme oxygenase inhibition.

A exposição de animais a situações ameaçadoras de natureza inata ou aprendida resulta em exibição de um repertório de comportamentos defensivos espécie-específicos, alterações autonômicas e em inibição da dor, sendo esse conjunto de reações de alta relevância para a sobrevivência de uma espécie. Considerando este contexto, um importante componente da resposta do organismo a situações de emergência é a redução da capacidade de perceber a dor. O processamento de estímulos nociceptivos pode ser modulado no prosencéfalo, na medula espinal, no tronco encefálico e no diencéfalo, por mecanismos envolvendo diferentes neurotransmissores e neuromoduladores. Nos últimos anos, evidências têm demonstrado que o monóxido de carbono (CO), produzido a partir da enzima heme-oxigenase estimula a formação de guanosina 3, 5- monofosfato cíclico (GMPc), participando como neuromodulador de vários processos fisiológicos. Dentro deste contexto, mostrou-se que a via HO-CO-GMPc está envolvida na modulação periférica e espinal da dor inflamatória, bem como na modulação do estresse, porém não há conhecimento da participação desta via na modulação de estímulo doloroso agudo, bem como da antinocicepção induzida pelo estresse. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar o envolvimento da via HO-CO-GMPc na nocicepção e na antinocicepção induzida pelo estresse agudo em ratos, avaliada pelo índice de analgesia no teste de retirada da cauda (IARC). Nossos resultados demonstraram que a ativação da via HO-CO-GMPc por meio da administração ICV de heme-lisinato (substrato) tem efeito antinociceptivo, sendo este efeito dependente da atividade GMPc, desde que o pré-tratamento com inibidor da guanilase ciclase solúvel (GCs), ODQ, bloqueou o aumento do IARC. Ainda, esta modulação ocorre de maneira fásica e não tônica, pois o tratamento isolado ICV com o inibidor da HO, ZnDBPG ou com o inibidor da GCs, ODQ, não alterou o IARC. A antinocicepção induzida pelo estresse agudo (restrição física por 120 min) não é dependente da via HO-CO-GMPc, desde que o tratamento com o ZnDBPG, nem com o heme-lisinato alteraram o IARC. No entanto, esta antinocicepção é dependente da atividade do GMPc, pois o pré-tratamento com ODQ bloqueou o aumento do IARC. / The exposure of animals to threatening situations of innate or learned nature results in exhibition of a repertoire of species-specific defensive behaviors, autonomic alterations and pain inhibition. This group of reactions has high relevance for the survival of species. In this context, an important component of the response of the organism in the emergency situations is the reduction of the capacity to perceive pain. The processing of nociceptive stimulus can be modulated in forebrain, in spinal, and in midbrain, for mechanisms involving different neurotransmitters and neuromodulators. Recently, evidence has demonstrated that carbon monoxide gas (CO), produced from the enzyme heme oxygenase (HO), stimulate the formation of 3\', 5\' - cyclic guanosine monophosphate (cGMP), and this molecule has participated as neuromodulator in some physiological processes. In this way, it has shown that the HO-CO-cGMP pathway is involved in the peripheral and spinal modulation of inflammatory pain, as well as in the modulation of the stress. However, the involvement of this pathway in the modulation of acute painful stimulus, as well as in the antinociception induced by stress isn´t clarified. Thus, this study evaluated the involvement of the HO-CO-cGMP pathway in nociception and in antinociception induced by acute stress in rats, by means the of analgesia index in the tail flick test (AITF). Our results demonstrated that the activation of the HO-CO-cGMP pathway by means of heme-lysinate ICV administration has antinociceptive effect. Again, the increase of the AITF was dependent of the cGMP activity, since that the pretreatment with inhibitor of soluble guanylase cyclase (sGC), ODQ, blocked the antinociceptive effect. This modulation occurs in fasic and not tonic manner, because per se ICV treatment with inhibitor of the HO, ZnDBPG or with inhibitor of the sGC, ODQ did not modify the AITF. The antinociception induced by acute stress (physical restriction during 120 min) is not dependent of the HO-CO-cGMP pathway, since that neither the treatment with the ZnDBPG, nor with the heme-lysinate had modified the AITF. However, this antinociception is dependent of the activity of the cGMP, because the pretreatment with ODQ blocked the increase of the AITF induced by acute stress.