Sickle cell disease is caused by the intracellular polymerization of human hemoglobin containing a mutation of a glutamic acid to a valine residue at the sixth position of the β chain. This substitution of a hydrophobic residue for a hydrophilic residue greatly decreases the solubility of the hemoglobin tetramer, promoting the formation of ordered fibers in deoxygenated red blood cells. These fibers are composed of double strands of hemoglobin tetramers, which effectively bury the valine side chain in a hydrophobic pocket, eliminating its unfavorable interaction with solvent. Inhibition of fiber formation would greatly alleviate the symptoms of sickle cell disease; therefore, the elucidation of the structure of the fiber is critical to developing treatments for the disease. In this thesis, an analysis of the crystal structures of the double strand component of the fibers formed by HbS and other site-directed mutants displaying altered sickling properties is undertaken. Structure of HbS at high resolution: The structure of HbS was solved at 2.05 Å resolution. This high-resolution analysis produced significant improvements in the previous 3.0 Å model. In particular, the accurate positioning of side chains, and the placement of more than 500 solvent molecules was achieved. Some side chains in the physiologically relevant contacts were moved by as much as 3.5 Å away from their locations in the lower resolution model. The structure also demonstrates that well ordered water molecules are located in both the axial and lateral contacts, some of which may be exploited in the design of sickling inhibitors. Structures of Hbβ6L and Hbβ6W: The crystal structures of two human hemoglobins with mutations at the β6 position that display altered sickling behavior were solved and refined at high resolution. Both mutants were crystallized under conditions similar to those used with HbS. Hbβ6L showed a greater tendency to polymerize, and displayed reduced delay times in aggregation assays. The refined structure was very similar to that of HbS, with changes confined mostly to the lateral contacts. However, the packing of Leu β6 in the linear crystalline double strands is sub-optimal. This has important ramifications for the differences between the crystalline double strands and those within the physiological HbS fiber. Hbβ6W, on the other hand, showed a reduced tendency to polymerize and shorter delay times in polymerization assays. The protein crystallized in a different space group from the other two mutants (HbS and Hbβ6L) under the same crystallization conditions, and formed fundamentally different double strands in the crystals. This structure demonstrates conserved interactions at the axial contacts, but very different interactions at the lateral contacts. The alternate double strand formed by this protein in the crystal may be useful as a model for tetramer interactions within the physiological fiber, or as a structural model for heterogeneous nucleation. The structures of each of these mutants help explain their altered polymerization behavior.

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:13:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge_SusanElisabethDominguesCosta_D.pdf: 8714965 bytes, checksum: 3191d67be1e9be2f9782ce3483bcfd3a (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The complete abstract is available with the full electronic document / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

Xing Hongtao. / "February 2003." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (p. 149-176). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

The homodimeric hemoglobin (HbI) from the blood clam Scapharca inaequivalvis binds oxygen cooperatively and thus offers a simple model system for studying communication between two chemically identical sites. Although the individual subunits of HbI have the same myoglobin-fold as mammalian hemoglobins, the quaternary assemblage is radically different. Upon oxygen binding by HbI, only small tertiary changes are seen at the subunit interface in contrast to the relatively large quaternary changes observed with mammalian hemoglobins. Analysis of structures of this hemoglobin in the liganded (02or CO) and unliganded states has provided a framework for understanding the role of individual amino acid side-chains in mediating cooperativity. The work presented in this dissertation has directly tested the central tenets of the proposed structural mechanism for cooperativity in HbI, illuminating the key roles played by residue Phe 97 and interface water molecules in intersubunit communication. Heterologous expression of Scapharca dimeric hemoglobin: A synthetic gene has been utilized to express recombinant RbI in Escherichia coli. The HbI apoprotein constitutes 5-10% of the total bacterial protein in this system. Addition of the heme precursor δ-aminolevulinic acid to the expression culture results in a ~3-fold increase in the production of soluble hemoglobin. Recombinant HbI has been successfully purified to homogeneity, resulting in a final yield of 80-100 mg of pure holoprotein from a 12 L expression culture. Analysis of recombinant HbI reveals its oxygen binding properties to be indistinguishable from native HbI. It was necessary to correct a protein sequence error by mutating residue Asn 56 to aspartate in order to obtain diffraction quality crystals, that are isomorphous to native HbI crystals. These recombinant HbI crystals diffract to high resolution, permitting the functional effects of mutant HbI proteins to be correlated with detailed structural analysis.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

Introducción: El objetivo de este trabajo fue determinar la prevalencia de anemia ferropénica según el componente dinámico y estático, identificando de esta manera los deportes con mayor prevalencia de anemia y determinar la asociación entre el sexo, la edad y anemia.Material y métodos: Estudio observacional de tipo corte transversal analítico. Se utilizó la base de datos de la Dirección Nacional de Servicios Biomédicos del Instituto Peruano del Deporte, en el periodo de enero a diciembre de 2013. De un universo de 1833 deportistas, se seleccionaron aquellos entre 18 y 35 años de edad. Las variables numéricas se evaluaron usando la prueba de t de Student o la prueba de Mann-Whitney dependiendo del estado de normalidad de las variables. Las variables categóricas fueron evaluadas usando χ2. Razones de prevalencias crudas y ajustadas fueron calculadas usando regresión de Poisson con varianza robusta, para evaluar la asociación entre sexo y anemia.Resultados: Se analizaron 633 deportistas, siendo en su mayoría varones (68,4%). Las variables que se incluyeron en el modelo bivariado fueron sexo, edad deportiva y suplementación con hierro, las cuales fueron también incluidas en el modelo multivariado, encontrándose asociación entre anemia y edad deportiva (p=0,01). No se encontró asociación entre sexo y anemia (RPa= 0,96; IC95%: 0,60-1,40; p=0,85), sin embargo, la prevalencia de anemia fue por encima del 15% (17,9% hombres y 16,8% mujeres).Conclusiones: Se halló mayor prevalencia de anemia ferropénica en los deportes de alto componente estático y dinámico. No se encontró asociación entre anemia ferropénica y sexo en deportistas seleccionados del Instituto Peruano del Deporte en el año 2013.

The viability of multicellular aerobic organisms requires the binding and transport of molecular oxygen from the atmosphere to sites of metabolism. In the earthworm, Lumbricus terrestris, erythrocruorins are freely dissolved multi-subunit protein complexes that serve the same functions as red blood cells The aims of this study were to 1) determine the overall arrangement of hemoglobin chains and non-hemoglobin chains in Lumbricus erythrocruorin, 2) determine the stereochemical determinants specifying erythrocruorin's hierarchical symmetry, and 3) investigate the molecular and chemical basis for the remarkable cooperative binding of ligands to earthworm hemoglobin. Erythrocruorin is a highly cooperative oxygen-carrying protein with Hill coefficients measured at some pH's as high as n = 7.9. Crystallographic analysis of the whole erythrocruorin molecule structure to 5.5 Å resolution reveals a hierarchical organization of 144 oxygen-binding polypeptides and 36 non-hemoglobin linker polypeptide chains. The hemoglobin chains are arranged in a novel dodecameric substructure at the periphery of the complex, whereas 36 linker chains comprise the inner core and projected triple-stranded, helical coiled-coil spokes towards the center of the complex. Interdigitation of these spokes appears crucial for stabilizing the complex. Crystallographic analysis of crystals from isolated hemoglobin chains provides greater detail (resolution = 2.6 Å) and complete atomic models for the hemoglobin polypeptides. Comparison of these models with other hemoglobins reveal unique features in the distal heme pocket, including large aromatic residues at the B10 position in three of the four hemoglobin chains. Aromatic residues at this position have been implicated in other hemoglobins to confer resistance to oxidation. Molecular interactions across each subunit include pH-dependent interactions that are consistent with the observed Bohr effect on oxygen binding. Specifically a π-cation interaction between an arginine of one subunit to a histidine of the opposing subunit is likely an important molecular switch in the allosteric transition from a low to high affInity ligand-binding state.

Na primeira parte deste trabalho foi estudada a interação da porfirina catiônica meso-tetrakis N-metil-4-piridil (TMPyP) e a porfirina aniônica meso-tetrakis 4-fenilsulfonato (TPPS4) nas formas de base livre com sistemas modelos de membrana biológica (micelas iônicas, micelas mistas e vesículas de fosfolipídios) em soluções aquosas, através das técnicas de absorção ótica, espalhamento de luz ressonante (RLS do inglês \"resonante light scattering), fluorescência e SAXS, do inglês \"Small Angle X-Ray Scattering\". As curvas de SAXS das micelas catiônicas de CTAC (cloreto de cetiltrimetilamônio) foram ajustadas como um elipsóide prolato na ausência e na presença de 2-10 mM de TPPS4. Os dados de SAXS mostraram que a presença da porfirina TPPS4 modifica o centro hidrofóbico micelar, levando a formação de micelas menores. Através das análises dos dados de SAXS das micelas de SDS (dodecilsulfato de sódio) observamos que a forma da micela na ausência e na presença de 2-10 mM TMPyP apresenta a forma de um elipsóide prolato sem mudanças. Entretanto, o coeficiente de ionização, diminuiu com o aumento da concentração de porfirina, sugerindo a \"blindagem\" da carga aniônica do SDS pela porfirina catiônica. A supressão de fluorescência da TPPS4 e TMPyP foi estudada na ausência e na presença de diferentes micelas de surfactantes, tais como as de SDS, CTAC, HPS (N-hexadecil-N,N,dimetil-3-amônio-1-propano sulfato) e TX-100 (t-octil-fenoxi-polietoxi-etanol). O iodeto de potássio (KI) foi utilizado como supressor. Os gráficos de Stern-Volmer dos dados de fluorescência no estado estacionário foram ajustados pela equação quadrática, incluindo a supressão dinâmica (KD) e estática (KS). Os valores de KS são muito menores do que os valores de KD. Os resultados da TMPyP são consistentes com as constantes de ligação reportadas na literatura: uma redução significativa de supressão acontece para a TMPyP na presença de SDS, e uma redução moderada é observada para o sistema TMPyP-HPS e quase nenhuma mudança é vista para a TMPyP na presença de TX-100. Para o sistema CTAC-TPPS4 um aumento na supressão foi observado quando comparada com a TPPS4 em tampão puro. Isto provavelmente é associado ao acúmulo de iodeto na interface da micela catiônica. A atração entre a cabeça polar do CTAC e I-, e a repulsão entre SDS e I-, aumenta e reduz a supressão de fluorescência, respectivamente, das porfirinas que se localizam na interface micelar. A pequena supressão da TPPS4 em TX-100 é coerente com a forte ligação entre a TPPS4-TX-100 reportada na literatura. A TPPS4 e a TMPyP na presença de concentrações baixas dos surfactantes CTAC e SDS, respectivamente, apresentaram formação de agregados pré-micelares. A adição de surfactante neutro, TX-100, reduziu o efeito de agregação, acompanhada pelas várias técnicas espectroscópicas utilizadas neste trabalho. Portanto, sob condições onde temos a máxima formação de agregados (porfirina-surfactante), a titulação da TPPS4 com micelas de 40%CTAC-60%TX-100 e a TMPyP com micelas de 80%SDS-20%TX-100 não foi suficiente para eliminar a agregação, apesar da diminuição significativa do efeito de supressão de fluorescência e da intensidade de luz espalhada. A interação da TMPyP com 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-fosfocolina (POPC), 1-Palmitoil-2-Oleoil-sn-Glicero-3-[Fosfo-rac-(1-glicero)] (POPG) e a mistura POPC + POPG é predominantemente devido à contribuição de eletrostática. O aumento da carga negativa, devido à adição de POPG, favorece a interação das vesículas com a porfirina catiônica. Na segunda parte deste trabalho foram estudados os efeitos de três surfactantes na estrutura oligomérica da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) na sua forma oxi. O estudo com o SDS, CTAC e HPS permitiu diferenciar os efeitos de cargas opostas da cabeça polar dos surfactantes na dissociação da estrutura oligomérica e na autoxidação da hemoglobina. A interação do HPS com HbGp foi claramente menos intensa que a interação desta hemoglobina com os surfactantes catiônico (CTAC) e aniônico (SDS). Provavelmente, esta menor interação da HbGp com HPS, quando comparada com o SDS e o CTAC, é devido a menor atração eletrostática entre o HPS e os sítios iônicos da proteina. Dados espectroscópicos foram discutidos e comparados com os da literatura, afim de compreender a interação hemoglobina-surfactante, e como o ponto isoelétrico ácido (pI) pode influenciar na relação da estrutura-atividade das hemoglobinas gigantes extracelulares. As amostras de HbGp foram estudadas por espalhamento de luz dinâmico (DLS do inglês \"Dynamic light scattering\"). Na faixa de pH 6.0 a 8.0, HbGp é bastante estável e a distribuição de tamanho das partículas é monodispersa com um diâmetro hidrodinâmico médio (Dh) de 27 nm. O aumento dos valores de pH (pH>9.0) induziu um processo de dissociação irreversível, resultando num valor do Dh menor (10 nm). A diminuição do Dh sugere uma dissociação completa da hemoglobina. Em pH>9,0 a cinética de dissociação é lenta, com um mínimo 24 h para ser completada. As constantes cinéticas de dissociação aumentam progressivamente, com o aumento do valor do pH. As curvas de melting point para HbGp apresentaram dissociação oligomérica e desnaturação da proteina em função do pH. Os processos de autoxidação e dissociação estão intimamente relacionados, de modo que a dissociação da proteina oligomérica promove um aumento na velocidade de autoxidação e vice-versa. / In the first part of this work interactions of the cationic meso tetrakis (4-N-methilpyridil) porphyrin (TMPyP) and meso-tetrakis (4-sulfonatophenyl) porphyrin (TPPS4) in the free base forms with membrane model systems (ionic micelles, mixed micelles and phospholipids vesicles) in aqueous solutions, have been investigated by optical absorption, resonance light scattering (RLS), fluorescence and SAXS (Small Angle X-Ray Scattering). The best-fit SAXS curves were obtained assuming for cetyltrimethylammonium chloride (CTAC) micelle a prolate ellipsoidal shape in the absence and upon incorporation of 2-10 mM TPPS4. SAXS results show that the presence of TPPS4 impacts on micellar hydrophobic core, leading to a micellar reassembling into smaller micelles. SAXS data analysis demonstrated a prolate ellipsoidal shape for sodium dodecyl sulfate (SDS) micelles; no significant changes in shape and size were observed for SDS-TMPyP co-micelles. Moreover, the ionization coefficient, α, decreases with the increase of the porphyrin concentration, suggesting the \"screening\" of the anionic charge of SDS by the cationic porphyrin. These results are consistent with optical absorption, fluorescence and RLS spectroscopies data, allowing to conclude that neutral surfactants present a smaller interaction with the cationic porphyrin as compared with ionic surfactants. Fluorescence quenching of TPPS4 and TMPyP is studied in aqueous solution and upon addition of micelles of SDS, CTAC, N-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1- propanesulfonate (HPS) and t-octylphenoxypolyethoxyethanol (Triton X-100). Potassium iodide (KI) was used as quencher. Steady-state Stern-Volmer plots were best fitted by a quadratic equation, including dynamic (KD) and static (KS) quenching. KS was significantly smaller than KD. For TMPyP quenching results are consistent with reported binding constants: a significant reduction of quenching takes place for SDS, a moderate reduction is observed for HPS and almost no change is seen for Triton X-100. For CTAC-TPPS4 system an enhancement of quenching was observed as compared to pure buffer. This is probably associated to accumulation of iodide at the cationic micellar interface. The attraction between CTAC headgroups and I-, and repulsion between SDS and I-, enhances and reduces the fluorescence quenching, respectively, of porphyrins located at the micellar interface. The small quenching of TPPS4 in Triton X-100 is consistent with strong binding as reported in the literature. Anionic TPPS4 and cationic TMPyP in the presence of low concentrations of the surfactants CTAC and SDS, respectively, showed formation of aggregates, monitored by optical absorption, fluorescence and resonance light scattering intensity (RLS). The addition of nonionic surfactant, Triton X-100, reduced the effect of aggregation monitored by the various techniques used in the present work. Therefore, under conditions for the maximum of aggregate formation (porphyrin-surfactant), apparently, the CTAC: TX-100 ratio equal to 40:60 and SDS:TX-100 ratio equal to 80:20 are not sufficient to eliminate aggregation, despite the significant decrease of the quenching effect of fluorescence and of the light scattering intensity. The interaction of TMPyP with 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn- Glycero-3-Phosphocholine (POPC), 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-Glycero-3-[Phospho-rac-(1- glycerol)] (POPG) and the mixture POPC+POPG is predominantly due to the electrostatic contribution. The increase of the negative charge, due to addition of POPG, favors the interaction of vesicles with the cationic porphyrin. On the second part of this work the effects of three surfactants upon the oligomeric structure of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in the oxy - form was studied. The use of SDS, CTAC and HPS has allowed to differentiate the effects of opposite headgroup charges on the oligomeric structure dissociation and hemoglobin autoxidation. Furthermore, the interaction of HPS with HbGp was clearly less intense than the interaction of this hemoglobin with cationic (CTAC) and anionic (SDS) surfactants. Probably, this lower interaction with HPS is due to the lower electrostatic attraction between the HPS surfactant and the protein surface ionic sites when compared to the electrostatic interaction between HbGp and cationic and anionic surfactants. Spectroscopic data are discussed and compared with the literature in order to improve the understanding of hemoglobin-surfactant interaction as well as the acid isoelectric point (pI) influence of the giant extracellular hemoglobins on its structure-activity relationship. HbGp samples were studied by dynamic light scattering (DLS). In the pH from range 6.0 to 8.0, HbGp is stable and a monodisperse size distribution with a z-average hydrodynamic diameter (Dh) of 27±1 nm is observed. More alkaline pH (pH>9.0) induced an irreversible dissociation process, resulting in smaller Dh of 10±1 nm. Dh decrease suggests a complete hemoglobin dissociation. At pH 9.0 the dissociation kinetics is slow, taking a minimum of 24 h to be completed. Dissociation rate constants progressively increase at higher pH. Melting curves for HbGp showed oligomeric dissociation and protein denaturation as a function of pH. Autoxidation and dissociation processes are intimately related, so that oligomeric protein dissociation promotes the increase of autoxidation rate and vice-versa.

A anemia é a causa primária de indicação de transfusão de glóbulos vermelhos e é especialmente prevalente e esperada em centros de terapia intensiva. Os benefícios das transfusões incluem aumento da oxigenação tissular, diminuição de hemorragias, tratamento da anemia e da hipovolemia. Os poucos estudos publicados têm demonstrado variações significativas nas práticas de transfusões de glóbulos vermelhos e o melhor momento para a indicação destas transfusões ainda não foi identificado. Objetivos Descrever a população de crianças que recebeu transfusão de glóbulos vermelhos com relação à faixa etária, concentração de hemoglobina (Hb) e taxa de hematócrito (HT), uso de saturação venosa central de oxigênio (SvO2), lactato sérico arterial, procedimentos terapêuticos e presença de disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (DMOS). Métodos Estudo retrospectivo observacional, realizado no Centro de Terapia Intensiva Pediátrico (CTIP) do Instituto da Criança da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em 2004, com crianças que receberam transfusão de glóbulos vermelhos. Descrevemos o número de pacientes, faixa etária, motivo de internação no CTIP, presença de doença de base e de DMOS, uso de SvO2, lactato sérico arterial, Hb, HT e procedimentos terapêuticos (ventilação mecânica, drogas vasoativas e métodos de substituição renal). Resultados A transfusão de glóbulos vermelhos foi realizada em 50% dos pacientes internados. A idade mediana foi de 18 meses e o principal motivo de internação foi insuficiência respiratória (35% dos casos). Doença de base estava presente em 84% dos casos e DMOS em 47% dos casos. Foram realizadas coletas de Hb e HT em todos os casos e de SvO2 e lactato sérico arterial em 24% dos casos. A mediana de Hb pré-transfusional foi de 7,8 g/dl. Os pacientes transfundidos estavam sendo submetidos a algum procedimento terapêutico em 82% dos casos. Conclusões São realizadas transfusões de glóbulos vermelhos em todas as idades. A concentração de hemoglobina e a taxa de hematócrito são os principais dados utilizados para a indicação destas transfusões. O lactato sérico arterial e a SvO2 são pouco utilizados para se indicar a transfusão de glóbulos vermelhos. A maioria dos pacientes transfundidos recebe algum procedimento terapêutico e, em muitos casos, são realizadas transfusões em pacientes que apresentam DMOS. / Anemia is the primary cause of red blood cell transfusions and it is especially prevalent and even expected in critical care settings. The benefits of red blood cell transfusions include increase in tissue oxygenation, treatment of anemia and hypovolemia. There are substantial variations in transfusion practices and the optimal transfusion practice for various types of critically ill patients with anemia has not been established. Objectives To describe the clinical, hematological and therapeutic characteristics of children who received red blood cell transfusion in a Pediatric Intensive Care Unit (PICU). Methods Retrospective observational study, performed in the PICU of ?Instituto da Criança?, Medicine School of University of São Paulo, in 2004, with one hundred children who received red blood cell transfusion. We described the number of patients included in the study, age, reason for admission to the PICU, presence of baseline illness and multiple organ system failure (MODS), use of oxygen central venous saturation, arterial lactate, hemoglobin concentration (Hb), hematocrit (HT) and therapeutics procedures (mechanical ventilation, use of vasoactive drugs and renal replacement methods). Results The red blood cell transfusion occurred in 50% of the patients. Median age of patients was 18 months. The most common reason for admission was respiratory failure, in 35% of the cases. Baseline illness was present in 84% of the cases and MODS in 47% of the cases. Hb and HT were collected in all the cases and oxygen central venous saturation and arterial lactate were collected in 24% of the cases. The median pre-transfusion hemoglobin concentration was 7.8 g/dl. The patients were receiveing therapeutics procedures in 82% of the cases. Conclusions Red blood cell transfusions are performed in children of all ages. The hemoglobin concentration and hematocrit are the main reason to indicate the red blood cell transfusion. Arterial lactate and oxygen central venous saturation are rarely utilized. The majority of patients receive therapeutic procedures and, in many cases, patients with MODS are given red blood cell transfusions.