Nitrilases are enzymes which catalyze the hydrolysis of a nitrile into the corresponding carboxylic acid and ammonia. These enzymes are potentially applicable in biocatalysis and bioremediation because of their advantages over the conventional (chemical) methods of nitrile hydrolysis (lower demand for energy, safety, simplicity, high yields, selectivity). In this work, genome mining was used to search for the sequences of hypothetical nitrilases from filamentous fungi. The amino acid sequences of previously characterized fungal nitrilases were used as the templates. Then the new synthetic genes together with other genes from our nitrilase library were expressed in E. coli and the substrate specificities of the enzymes thus produced were compared. Significant attention was focused on the relationships between the sequence of the enzyme and its substrate specificity. The arylacetonitrilases from Arthroderma benhamiae (NitAb) and Nectria haematococca (NitNh) were purified and characterized. Their substrate specificities, kinetic parameters, pH and temperature profiles and subunit and holoenzyme size were assessed. NitAb and NitNh together with other recombinant fungal nitrilases were employed in the hydrolysis of high concentrations of (R,S)-mandelonitrile in a batch or fed-batch mode. Nitrilase from...

6 Abstract Ellipticine (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole), an alkaloid isolated from Apocynaceae plants, exhibits significant antitumor and HIV activity. This antitumor agent binds to DNA and forms covalent DNA adducts. Enzymes, which are involved in its enzymatic activation, are cytochromes P450 (CYP) and peroxidases. To elucidate the effect of ellipticine on the expression and enzymatic activity of the individual components of the microsomal mixed function oxidase system in different tissues, we used rat model. Simultaneously, the effect of ellipticine and its cytotoxicity on different tumor cell lines was also investigated. Another part of the presented work was targeted on preparation of anti-peptide antibody against orphan cytochrome P450 2S1, which is highly expressed in many human tumours of the epithelial origin, for its detection in these tissues. For better understanding how CYP2S1 can contribute to the metabolism of xenobiotics, the protein was prepared by heterologous expression in E. coli. Furher, its role in metabolism of an antitumor drug ellipticine, a carcinogenic environmental pollutant benzo[a]pyrene (BaP) and its derivate BaP-7,8-dihydrodiol was examined. Utilizing a mouse model, the impact of pulmonary inflammation on the metabolism of an environmental carcinogen was...

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

Modelos humanizados de porco são muito importantes para pesquisa biomédica e desenvolvimento de novas drogas e tratamentos. Além de ser um melhor modelo para doenças humanas do que animais de menor porte devido sua maior semelhança fisiológica, anatômica, de metabolismo e tempo de vida, o modelo suíno ainda permite suprimento ilimitado de órgãos para transplante. Apesar dessas vantagens, a expressão gênica inconsistente de animais transgênicos tornam a criação e avaliação desses animais muito dispendiosas, imprevisível e não permite a comparação de resultados de animais diferentes de maneira apropriada. Nesse estudo descrevemos uma nova técnica utilizando o promoter endógeno para a geração de um protocolo de substituição de genes com padrão clonal (transplante clonal de genes) sem clonagem de células, preservando a expressão genética e sua regulação intactas. Esse protocolo é reprodutível e pode ser aplicado para mais de um alvo genético, permitindo geração rápida de linhas transgênicas de animais (14-20 dias) com potencial de se tornar o novo padrão para geração de animais transgênicos de grande porte Suínos / Humanized pig models are very important for biomedical research, and drugs and treatment development. Not only it is a better model for diseases than smaller animals because of its closer physiology, anatomy, metabolism and life span, it also may provide unlimited organs for transplantation. In spite of all this advantages, inconsistent gene expression in transgenic animals make its generation and evaluation expensive, unpredictable and do not allow proper outcome comparison between different animals. In this report we describe a reproducible technique utilizing the endogenous promoter for generation of a clonal pattern gene replacement protocol (clonal gene transplant) without cell cloning, maintaining the normal gene expression and its regulation. This protocol is reproducible and applicable to more than one gene target, allowing fast generation of transgenic animals cell lines (as low as 14-20 days) and could become the new standard for transgenic large animal generation

A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.

Os primeiros vasos sanguíneos do embrião de vertebrados, formados de novo a partir de células originadas da mesoderme, originam os vasos linfáticos em um processo denominado vasculogênese. Já no adulto, novos vasos são formados principalmente através da angiogênese (ou linfoangiogênese) a partir da vasculatura pré-existente. Em indivíduos saudáveis, a arquitetura vascular é relativamente estática, sendo que o excesso ou a insuficiência de vasos são comumente relacionados à angiogênese patológica, vinculada a diversas doenças, como câncer, degeneração macular relacionada à idade, isquemia de membros e muitas outras. Dessa forma, o controle local da densidade de vasos sanguíneos torna-se interessante para o tratamento de condições patológicas visando melhoria de prognóstico e cura. Dentre os diversos fatores de crescimento conhecidos, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, destaca-se como o principal regulador do processo de angiogênese através de isoformas pró-angiogênicas (VEGFxxx) e antiangiogênicas (VEGFxxxb) do gene VEGF-A. Consequentemente, as proteínas codificadas por esse gene constituem um alvo com alto potencial terapêutico. No presente estudo, propusemos a produção das isoformas proteicas recombinantes rhVEGF165, rhVEGF165b e rhVEGF121, oriundas do gene VEGF-A humano, visando à geração de biofármacos que podem ser utilizados para terapia molecular e engenharia tecidual. As sequências codificadoras das isoformas rhVEGF165 e rhVEGF121 foram amplificadas a partir do cDNA total sintetizado de amostras de RNA total de pulmão humano, enquanto que a da isoforma rhVEGF165b foi gerada através da mutação sítio-dirigida da sequência de rhVEGF165. As sequências foram clonadas no vetor de clonagem pGEM®-T Easy, sendo em seguida subclonadas no vetor pLV-eGFP, um vetor plasmidial de transferência lentiviral, que permite a expressão de transgenes em células de mamíferos e, também, da proteína repórter eGFP. Células humanas HEK293 em cultura aderente foram independentemente cotransfectadas com cada uma das construções geradas (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b e pLV-rhVEGFl21) juntamente com o vetor pTK-Hyg na proporção de 40:1 (m/m), viabilizando a seleção dos transfectantes com o antibiótico higromicina B, além da detecção de eGFP. Os clones celulares superprodutores das proteínas de interesse foram avaliados quanto à cinética de expressão em meio carente de soro e adaptados para a cultura em suspensão estática na presença de meio na ausência de componentes derivados de animais, demostrando a capacidade de expressão das isoformas rhVEGFs nestas condições de cultivo. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a descrever a expressão de isoformas de VEGF-A em células HEK293 mantidas em suspensão. As isoformas rhVEGF165 e rhVEGF165b foram purificadas por cromatografia de afinidade a heparina, a partir do meio condicionado pelos clones superprodutores gerados. Ensaios in vitro, utilizando o AngioPhaseTM Kit, e in vivo, através do ensaio da membrana corioalantoide em embriões de galinha (CAM Assay), ambos próprios para avaliação da atividade pró- e antiangiogênica de diferentes compostos, demonstraram que a isoforma rhVEGF165 possui atividade biológica, enquanto a isoforma rhVEGF165b não apresentou a atividade esperada (inibição da angiogênese). Estas isoformas foram testadas em modelo murino de engenharia tecidual do intestino curto, com indícios de que poderiam contribuir para o uso terapêutico neste contexto. A purificação da isoforma rhVEGF121, bem como as análises estruturais das proteínas produzidas, estão em processo de otimização. / The first blood vessels of the vertebrate embryo are formed de novo from mesoderm-derived cells and give rise to lymph vessels in a process termed vasculogenesis. In the adult, new blood vessels are formed mainly through angiogenesis (or lymphangiogenesis) from the pre-existing vasculature. In healthy individuals, the vascular architecture is fairly static, and both the excess and the insufficiency of vessels comprise a pathological angiogenic state, to which is credited the onset and/or progression of several diseases such as cancer, age-related macular degeneration, limb ischemia, and many others. Therefore, locally controlling the blood vessel density becomes interesting for the treatment of pathological conditions aiming at prognosis improvement and cure. Among the various known growth factors, the vascular endothelial growth factor, VEGF, stands out as the major regulator of the angiogenic process. This process is mediated through the action of pro- (VEGFxxx) and antiangiogenic (VEGFxxxb) isoforms, which are derived from the VEGF-A gene. Consequently, the proteins encoded by this gene are potential therapeutic targets. In this work, we set out to produce the recombinant protein isoforms rhVEGF165, rhVEGF165b, and rhVEGF121, which originate from the human VEGF-A gene, with the aim of generating biopharmaceuticals to be used for molecular therapy and tissue engineering. The rhVEGF165 and rhVEGF121 coding sequences were amplified from total cDNA sythesized from human lung total RNA. Conversely, the rhVEGF165b coding sequence was generated by site-directed mutagenesis of the rhVEGF165 sequence. The sequences were cloned into the pGEM®-T Easy cloning vector. These cDNAs were then subcloned into pLV-eGFP, a plasmid lentiviral transfer vector that allows for expression of transgenes and the eGFP reporter protein in mammalian cells. Human HEK293 cells cultivated under adherent conditions were independently co-transfected with each of the obtained constructs (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b, and pLV-rhVEGF121) and the pTK-Hyg vector at a proportion of 40:1 (m/m), enabling for the selection of transfectants with hygromycin B, apart from the detection of eGFP. The cell clones overexpressing the proteins of interest were evaluated for expression kinetics in serum-deprived conditioned media and adapted to static suspension culture in medium free of animal-derived components, demonstrating that expression of the protein isoforms was possible in these culture conditions. To the best of our knowledge, this is the first work that describes the expression of VEGF-A isoforms in HEK293 cells in suspension culture. The rhVEGF165 and rhVEGF165b isoforms were purified by affinity chromatography from media previously conditioned by the overexpressing cell clones. The biological activity of rhVEGF165 was demonstrated in vitro, by the AngioPhaseTM Kit assay, and in vivo with the CAM (chorioallantoic membrane) assay, both of which are suitable for evaluating the pro- and antiangiogenic activity of different compounds. The rhVEGF165b did not show the expected antiangiogenic activity. These isoforms were tested in a model of murine tissue-engineered small intestine, indicating a possible contribution to therapeutic use in this context. The purification of rhVEGF121, as well as the structural analysis of all three proteins, are in the process of being optimized.

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A biomassa vegetal pode ser uma importante fonte de obtenção de diversos produtos a partir da desestruturação de suas frações por um vasto grupo de enzimas. No entanto, a geração de compostos de alto valor agregado a partir da biomassa lignocelulósica requer o desenvolvimento de novos sistemas enzimáticos. Pensando nisso, a prospecção e a caracterização de novas enzimas que estão presentes no secretoma de fungos degradadores da biomassa lignocelulósica tem sido fonte de pesquisa por pesquisadores do mundo todo. O objetivo deste trabalho foi prospectar, clonar e expressar de maneira heteróloga o gene codificante de uma enzima putativa do fungo termofílico T. terrestris em cepas do fungo filamentoso A. nidulans A773 e promover sua caracterização bioquímica e biofísica. O gene da enzima foi amplificado, clonado e inserido no vetor pEXPYR antes de ser inserido no sistema de expressão do A. nidulans. Os transformantes obtidos foram induzidos em meio mínimo de cultivo contendo 3% (m/v) de maltose e 1% (m/v) de glicose em meio estacionário para a produção, seguido da purificação da enzima. Estudos bioquímicos foram realizados para determinar o pH e a temperatura ótima de reação, bem como, a especificidade aos substratos e a determinação dos parâmetros cinéticos. A termoestabilidade da enzima também foi avaliada por estudo de dicroísmo circular (DC). Além disso, foi avaliado o efeito colaborativo entre uma xilanase GH10 e a enzima em estudo na hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado. A enzima obtida por expressão heteróloga foi caracterizada como uma xilo-oligossacarídeo oxidase (XylO). Por meio da análise filogenética das sequências de aminoácidos entre a enzima expressa e outras enzimas oxidativas, a XylO foi classificada como pertencente a família das flavoproteínas e subfamília das BBE. A enzima TtXylO demonstrou ter especificidade em oligossacarídeos de C5 apresentando boa atividade enzimática em substratos complexos de xilana. A enzima possui pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 25 ºC. As análises de DC indicaram temperatura de desnaturação de 62,7 ºC, caracterizando esta enzima como termofílica. Contudo, novos estudos ainda são necessários para avaliar os produtos gerados a partir da oxidação dos diferentes xilo-oligossacarídeos pela XylO e seu potencial uso na indústria. / Plant biomass is an important source for generation of several products obtained from enzymatic cleavage of its fractions by a large group of enzymes. However, the generation of high value compounds from lignocellulosic biomass requires the development of new enzymatic systems. Considering that, prospection and characterization of enzymes present in the biomass-degrading fungi secretome has been a source of study by researchers around the world. The aim of this work was to prospect, clone and heterologously express a putative enzyme encoding gene from the thermophilic fungus T. terrestris in A. nidulans A773 strains and to promote its biochemical and biophysical characterization. The gene was amplified, cloned and inserted into the pEXPYR vector before being inserted into A. nidulans expression system. The transformants were induced by culture in minimal médium containing 3% (w/v) maltose and 1% (w/v) glucose by stationary culture for the production, followed by enzyme purification. Biochemical analyses were performed to determine optimum pH and temperature as well as the substrate specificities and kinetic parameters. The enzyme thermostability was also evaluated by circular dichroism (CD). In addition, the collaborative effect between the enzyme and a GH10 on hydrolys of pre-treated sugarcane bagasse was evaluated. The enzyme obtained by heterologous expression was characterized as a xylooligosaccharide oxidase (XylO). Phylogenetic analysis between amino acid sequences of expressed enzyme and other oxidative enzymes classified XylO as belonging to flavoproteins family and subfamily of BBE. TtXylO has been shown to have specificity on C5 oligosaccharides exhibiting good enzymatic activity on complex xylan substrates. The enzyme has an optimum pH of 5.5 and optimum temperature of 25 ºC. DC analyses showed melting temperature of 62.7 ºC, characterizing this enzyme as thermophilic. In general, further studies are still needed to evaluate the products generated from oxidation of xylooligosaccharides by XylO and their potential use in the industry.

Flagelina, a subunidade estrutural dos flagelos bacterianos, pode ser empregada em estratégias vacinais como carregadora de epitopos antigênicos fusionados ou como adjuvante. Neste trabalho avaliamos a imunogenicidade e o potencial vacinal das flagelinas Salmonella enterica sorovar Typhimurium em camundongos BALB/c após administração pelas vias oral ou intraperitoneal. Os resultados indicam que animais imunizados pela via oral com linhagens flageladas de S. Typhimurium não desenvolvem respostas de anticorpos, sistêmicos ou secretados, anti-flagelina, por outro lado, ativam respostas celulares específicas para as flagelinas em função da via de administração utilizada. Observamos ainda que as diferentes flagelinas testadas apresentam efeito adjuvante quando co-administradas pela via nasal com a fímbria CFA/I de ETEC. Em suma, os resultados apresentados contribuem para um melhor conhecimento sobre as propriedades imunológicas e adjuvantes das flagelinas de S. Typhimurium e agregam informações para o uso racional dessas proteínas em formulações vacinais. / Flagellin, the structural subunit of bacterial flagella, can be used in vaccine development as a fused antigenic epitope carrier or as an adjuvant. In this work we evaluated the immunogenicity and vaccine approach of S. Typhimurium flagellin in BALB/c mice after administration by oral or intraperitoneal route. Our results indicate that mice immunized by oral route with flagellated S. Typhimurium strains do not develop any anti-flagellin antibody response, be it serum or secreted. On the other hand, specific anti-flagellin cellular response was observed depending on the chosen route of immunization with S. Typhimurium attenuated strain. Furthermore, all flagellins tested proved to be efficient adjuvants when co-administrated with CFA/I fimbriae by nasal route. Together, these results contribute to a better understanding of the immunological and adjuvant properties of S. Typhimurium flagellins and also provide information on the rational use of these proteins in vaccine development.

La symbiose mycorhizienne à arbuscule (MA) est une association mutualiste s’établissant entre les racines des plantes et des champignons du sol appartenant à l’embranchement des Gloméromycètes. Dans cette association, le champignon agit comme un fertilisant naturel, fournissant à la plante divers minéraux (phosphore, mais aussi azote et soufre …) en échange de sources de carbone indispensables à son développement. Une caractéristique originale de ces champignons est leur très large spectre d’hôte : de l’ordre de 80% des espèces végétales ont l’aptitude à former cette symbiose, et certains espèces de champignons MA ne semblent pas avoir de limitation de spectre d’hôte. Les champignons MA possèderaient-ils des « clés universelles » de compatibilité cellulaire avec leur hôte, ou de contournement de l’immunité végétale ? Pour aborder cette problématique, nous avons entrepris l’étude du sécrétome du champignon MA Rhizophagus irregularis dont plusieurs données génomiques étaient disponibles. Les microorganismes eucaryotes sécrètent en effet dans leur environnement des protéines agissant sur leurs structures exogènes (paroi cellulaire), leur environnement, et pouvant agir sur l’immunité des cellules hôtes. Ces protéines sécrétées (SPs) sont dans ce dernier cas appelées « effecteurs ». Sur la base de deux assemblages différents, un catalogue de 872 SPs de R. irregularis (RiSPs) a été défini pour lesquelles les profils d’expression dans trois plantes hôtes ont été comparés. Nous avons également comparé ces SPs à celles que nous avons définies sur une autre espèce de champignon MA, Gigaspora rosea. Après enrichissement du catalogue de RiSPs avec des séquences de petite taille identifiées sur un assemblage transcriptomique propre, puis sélection des candidats dont les cadres de lecture sont robustes et présentant un niveau d’expression élevé (FC>10) dans les 3 hôtes testés, un jeu de 33 RiSPs d’intérêt a été défini, dont 18 ont été sélectionnées pour effectuer des analyses fonctionnelles. En absence de protocole de transformation de ces champignons, l’analyse fonctionnelle a porté sur la cytolocalisation de protéines de fusion RiSP:citrine dans les cellules végétales par surexpression dans des feuilles de tabac et des racines de luzerne tronquée. Différents compartiments cellulaires sont ciblés par ces RiSPs, très souvent le compartiment vacuolaire. Des approches par surexpression in planta de plusieurs candidats RiSP ont permis d’identifier une activité stimulatrice de 3 RiSPs sur l’établissement de la symbiose. Parallèlement, des essais de stimulation de la symbiose MA par apport exogène de différents SPs sur plantules en cours de mycorhization en chambre ont été initiés. Ils devront être poursuivis sur les 3 candidats issus du crible de surexpression. En perspective, l’évaluation de la spécificité d’action de ces SPs sur la symbiose MA comparativement à d’autres interactions plante-champignon ouvrira la voie à des essais d’application au champ. / Arbuscular mycorrhizal (AM) symbiosis is a mutualistic association established between plant roots and soil fungi belonging to the phylum Glomeromycota. In this association, the fungus acts as a natural fertilizer, supplying the plant with various minerals (phosphorus, but also nitrogen and sulfur) in exchange to carbon sources essential for its development. An original feature of these fungi is their very broad host spectrum: c.a. 80% of plant species have the ability to form this symbiosis, and some species of AM fungi do not seem to have a restrictive host spectrum. Would MA fungi possess "universal keys" for cell compatibility with their host, or to by-pass plant immunity? To address this problem, we studied the secretome of the AM fungus Rhizophagus irregularis from which several genomic data were available. Eukaryotic microorganisms indeed secrete in their environment proteins acting on their exogenous structures (cell wall), on their environment (nutrient recruitment), and even on host plant cell immunity. These last secreted proteins (SPs) are defined as effectors. Based on two different assemblies, a repertoire of 872 SPs of R. irregularis was defined for which transcriptional expression profiles obtained in three hosts were compared, as well with SPs from another species of AM fungus, Gigaspora rosea. After adding sequences of small size identified from an in-house transcriptomic assembly, screening unambiguous open reading frame, and selecting strongly expressed candidates (FC> 10) in the 3 plant hosts analyzed, a set of 33 RiSPs of interest was defined, of which 18 were selected for functional analysis. As genetic transformation protocol is unavailable for AM fungi, RiSP:citrine fusion proteins were overexpressed in tobacco leaves and barrel medic roots for plant cell localization. Different cell compartments were targeted by these RiSPs, and often localised in the vacuolar compartment. In planta overexpression of several candidates allowed identifying 3 RiSPs that stimulate the establishment of the symbiosis. In the same time, attempts to enhance MA symbiosis by addition of exogenous RiSPs on seedlings during mycorrhizal establishment were initiated. Such assays should be pursued on the 3 active candidates revealed by overexpression assays. Evaluating the specificity of action of these RiSPs on AM symbiosis compared to other plant-fungus interactions will open the way to field trials.