Nos últimos anos a incidência do câncer tem crescido significativamente mundialmente, porém, as técnicas atualmente empregadas para a detecção da doença não são individualmente conclusivas, além de serem extremamente invasivas e não permitirem seu diagnóstico precoce, o que justifica o desenvolvimento de novas tecnologias alternativas para a detecção do câncer. Células cancerígenas possuem receptores específicos de alta afinidade com folato e por serem altamente replicativas, são extremamente dependentes do suprimento de folato reduzido. Os alfa-receptores de folato (FR α) são proteínas com propriedades bioquímicas específicas as quais podem ser exploradas pela estratégia de marcação para detecção e tratamento do câncer (biomarcadores). Com raras exceções, são induzidos seletivamente em tecidos cancerígenos e raramente expressos em células normais, mostrando-se, assim, altamente seletivos e específicos. Sendo assim, neste projeto objetivou-se a expressão e a purificação dos FR α, além da sua imobilização em microssistema para estudos subsequentes em biossensores. Foram promovidos testes de expressão da proteína heteróloga (rFR α) em E. coli em diferentes linhagens, temperaturas e tempos de indução da expressão sendo observada a expressão da proteína recombinante de forma insolúvel. Paralelamente foram promovidos testes de expressão da proteína rFR α em P. pastoris, os quais não se mostraram eficientes, uma vez que não foi possível a detecção da proteína em estudo. Como alternativa, uma nova construção, em fusão com a proteína Trigger fator (TF) de E. coli, uma chaperona molecular de alta solubilidade, foi testada. Através de análises por SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL e espectrometria de massas, foi possível comprovar a produção da proteína recombinante TFFRα. Ainda, a proteína foi imobilizada em lipossomos, o que proporcionou o desenvolvimento de um padrão analítico que poderá ser utilizado em estudos subsequentes com biossensores de FR α. Este estudo será útil para o desenvolvimento de drogas visando a inativação desta proteína, como os anti-folatos, que são hoje os agentes anti-neoplásicos mais investigados, e possibilitará a caracterização bioanalítica da proteína FR α recombinante (rFR α) bem como o desenvolvimento de novos biossensores. / In recent years the incidence of cancer has grown significantly globally. Even though, the techniques currently employed for the detection of cancer are not individually conclusive due to the subjectivity of the analysis, inherently invasive, and are unable to provide early diagnosis. Therefore, the development of new technologies for cancer detection and prognostic are justified. Cancer cells have specific receptors with high affinity towards folate and are highly replicative. Alpha folate receptor (FR α) are extracellular proteins with specific biochemical properties since, with rare exceptions, are induced selectively in cancerous tissues and rarely expressed in normal cells, being highly sensitive and specific. In this work we produced FR α heterologously and we immobilized it on a microsystem mimicking a cancer cell that will become an analytical standard for studies with biosensors. Firstly, we produced rFR α in different E. coli strains, exploring variation of temperature and induction times, in which we observed the expression of insoluble protein. We also tried the expression in P. pastoris system, which was not efficient as well. Alternatively, we cloned FOLR1 gene in a special vector that enables the expression of FR α fusioned with the Trigger fator from E. coli, a highly soluble molecular chaperone. Using SDS-PAGE, Western Blot, OFFGEL and mass espectrometry we observed the production of soluble TFFR α. The recombinant protein was immobilized in liposomes, producing an analytical standard for studies with FR α-based biosensors. Our findings open research possibility in drug development, like anti-folates, besides the development of new biosensors.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

A leptospirose é causada por bactérias do gênero Leptospira e constitui um problema de saúde pública mundial, por acometer humanos e animais. Sua patogênese ainda é pouco esclarecida, especialmente quanto aos processos de invasão, adesão e colonização dos hospedeiros. Recentemente, proteínas secretadas por leptospiras foram identificadas por proteômica e análises in silico, algumas das quais apresentam possível envolvimento no desenvolvimento de quadros hemorrágicos, bem como podem ser possíveis antígenos para diagnóstico. Sendo assim, o presente trabalho propôs a clonagem em vetor de expressão heteróloga bacteriano das sequências codificantes das proteínas Sph2, LipA, ColA e LipL32 de L. interrogans sorovar Copenhageni, caracterização funcional das proteínas recombinantes purificadas e estudo do seu potencial uso no diagnóstico para a leptospirose. Essas proteínas foram escolhidas por possivelmente estarem envolvidas na patogênese de leptospiras. Para tanto, as sequências correspondentes aos genes das proteínas foram clonadas nos vetores de expressão em Brevibacillus choshinensis e Escherichia coli. A produção de soro policlonal e técnicas de ELISA, western-blotting e imuno-histoquímica foram realizadas para avaliar a funcionalidade das proteínas recombinantes purificadas. Também foram realizados testes de comprovação e caracterização da atividade enzimática para proteína LipA, que se apresenta como uma provável lipase na análise in silico. Os resultados obtidos mostraram que o sistema de expressão em Brevibacillus foi eficiente na expressão das proteínas, porém com baixo rendimento na purificação das proteínas Sph2, ColA e LipA. A proteína recombinante LipL32 purificada não apresentou diferença na sua atividade antigênica, em relação aos dois sistemas de expressão utilizados. Experimentos de Western - blotting demonstraram a presença de proteína LipA em diferentes sorovares patogênicos de Leptospira spp. A proteína LipA apresentou atividade lipásica sobre ésteres graxos de p-nitrofenil, sendo uma provável lipase euritérmica. Os dados obtidos com a análise de imuno-histoquímica sugerem que esta proteína possa participar dos eventos que levam a lesões na membrana celular no tecido hepático. Resultados de ELISA com soro de pacientes mostraram que as proteínas ColA e Sph2 são potenciais antígenos para diagnóstico da leptospirose. Apenas a proteína ColA apresentou ação hemorrágica na pele de camundongos. Estes resultados indicam que as proteínas LipA, ColA e Sph2 podem estar envolvidas em mecanismos patogênicos na leptospirose. / Leptospirosis is caused by bacteria of the genus Leptospira and it is a public health problem worldwide, for affecting humans and animals. Its pathogenesis is still unclear, especially regarding the processes of invasion, adhesion and colonization of hosts. Recently, proteins secreted by leptospires were identified by proteomics and in silico analyzes, some of which present possible involvement in the development of hemorrhagic conditions, as well they could be possible antigens for the diagnosis. Thus, the present work proposed the cloning into bacterial heterologous expression vectors of the coding sequences of the Sph2, LipA, ColA and LipL32 proteins of L. interrogans serovar Copenhageni, the functional characterization of the purified recombinant proteins and the study of their potential use in the diagnosis for the Leptospirosis. These proteins were chosen because they may be involved in the pathogenesis of leptospires. To that end, the coding sequences were cloned into the expression vectors in Brevibacillus choshinensis and Escherichia coli. The production of polyclonal serum and ELISA, Western-blotting and immunohistochemistry techniques were performed to evaluate the functionality of the purified recombinant proteins. Also, tests were carried out to prove and characterize the enzymatic activity of LipA protein, which presents as a probable lipase in the in silico analysis. The obtained results showed that the expression in the Brevibacillus system was efficient, but with low yield in the purification of Sph2, ColA and LipA proteins. The purified recombinant LipL32 protein showed no difference in its antigenic activity, in relation to the two expression systems used. Western-blotting experiments demonstrated the presence of LipA protein in different pathogenic serovars of Leptospira spp. The LipA protein showed lipase activity on p-nitrophenyl fatty esters, being a probable eurythermic lipase. The data obtained with the immunohistochemical analysis suggest that this protein can participate in the events that lead to cell membrane lesions in the hepatic tissue. ELISA results using serum from patients showed that ColA and Sph2 proteins are potential antigens for the diagnosis of leptospirosis. Only the ColA protein presented hemorrhagic action on the mice skin. These results indicate that LipA, ColA and Sph2 proteins may be involved in pathogenic mechanisms in leptospirosis.

Polihidroxialcanoatos (PHAs) são polímeros produzidos por diversas bactérias como material de reserva de carbono e energia, apresentando propriedades termoplásticas comparáveis às dos plásticos de origem petroquímica, além da vantagem de ser totalmente biodegradáveis. A bactéria Cupriavidus necator DSMZ 545 é considerada o organismo modelo para a produção de PHA, possuindo a capacidade de utilizar CO2 como fonte de carbono, porém existem sérias limitações para o seu cultivo autotrófico. Visando otimizar a capacidade autotrófica desta bactéria, foi realizada neste trabalho a clonagem e expressão do gene da bacteriorodopsina (bop) de Halobacterium salinarum em C. necator. Esta proteína de membrana é capaz de converter a energia luminosa em um gradiente de prótons, que pode ser utilizado pela célula para produzir ATP. Obtiveram-se clones recombinantes de C. necator, que, sob iluminação, apresentaram maior produção de ATP, assim como produção aumentada de PHA, sem alterações no crescimento celular. / Polihydroxyalcanoates (PHAs) are polymers produced by several bacteria as carbon and energy storage materials, which show comparable thermoplastic properties with plastics from petrochemical origin and present the advantage of being completely biodegradable. The bacterium Cupriavidus necator DSM 545 is considered as a model organism for PHA production, being able to produce PHA utilizing CO2 as the carbon source, although there are severe limitations for its autotrophic cultivation. In the present work, with the purpose of optimizing the autotrophic capability of this bacterium, the cloning and expression of the Halobacterium salinarum bacteriorhodopsin gene (bop) was undertaken in C. necator. This membrane protein is able to convert light energy in a proton gradient that can be utilized by the cell for ATP production. Upon illumination, the C. necator recombinant clones showed an increase in ATP production, as well as an increase in PHA production, and no alterations in cell growth.

As hialuronidases de peçonhas animais são capazes de clivar o hialuronan presente na matriz extracelular, facilitando a difusão das toxinas no tecido da vítima. Essas enzimas têm sido negligenciadas, devido à instabilidade enzimática e à baixa concentração na peçonha. Assim, a expressão heteróloga das hialuronidases permite a sua obtenção em quantidades que viabilizam seu estudo estrutural e funcional. Associado a isso, o transcriptoma propicia a identificação de novas toxinas e componentes de baixa proporção na peçonha. Portanto, o presente trabalho realizou o transcriptoma da glândula de peçonha do escorpião Tityus serrulatus e a clonagem e expressão heteróloga da hialuronidase. No transcriptoma foram obtidos 558 ESTs, dos quais 61,8% correspondem às toxinas, dentre elas neurotoxinas com ação em canais iônicos, metaloproteinas, hipotensinas, peptídeos antimicrobianos, dentre outros. Foram também identificadas novas toxinas como o neuropeptídeo e Ts16.1, descritos pela primeira vez para o gênero Tityus. Dentre os transcritos obtidos, foi identificado apenas um clone correspondente ao C-terminal incompleto de uma hialuronidase de T. serrulatus. Consequentemente, foi produzido o gene sintético contendo a sequência da TsHyal-1, obtida em bancos de dados, no vetor de expressão pPICZ?A para expressão heteróloga em P. pastoris. A rTsHyal-1 foi expressa em escala laboratorial em meio não suplementado (BMM) em pH 7,0 durante 96 h da indução com alimentação diária de metanol a 0,75%. A rTsHyal-1 foi produzida na sua forma solúvel e ativa (838,31 UTR/mg) e resultou em um rendimento proteico de 250 mg/L de material expresso. O secretoma do meio de expressão mostrou que além da rTsHyal-1, a P. pastoris também secreta proteínas nativas associadas à ligação do ATP, metabolismo de carboidrato e resposta ao estresse oxidativo. A rTsHyal-1 foi parcialmente purificada em troca catiônica fraca e apresentou atividade específica de 1.097,45 UTR/mg. A rTsHyal-1 apresenta massa molecular de 49,5 kDa e o tratamento com PNGase F seguido da análise por espectrometria de massas (MALDI-TOF) indicou que uma possível N-glicosilação de 4,5 kDa. Adicionalmente, o sequenciamento dos digestos trípticos da enzima realizado no MALDI-TOF e pelo Q-Exactive resultaram em 46,8% de cobertura da sequencia da proteína. A rTsHyal-1 apresenta especificidade pelo substrato hialuronan, seguido da condroitina C, A e B e apresentou atividade ótima em pH 6,0 e a 40°C. Adicionalmente, o ensaio do MTT indicou que a enzima recombinante não apresenta citotoxicidade in vitro. Os resultados obtidos determinaram as melhores condições para a expressão heteróloga da rTsHyal-1, que corresponde à primeira hialuronidase recombinante de escorpião expressa em P. pastoris com atividade enzimática preservada / The venom hyaluronidases of animals are able to cleave hyaluronan present in the extracellular matrix, acting as a spreading factor for the toxins into the tissues of the victim. These enzymes have been neglected due to their instability and low concentration in the venom. Thus, heterologous expression of hyaluronidases permits the obtainment of sufficient amount for structural and functional studies. Moreover, the transcriptome allows the identification of new toxins or components with low proportion in the venom. In this way, this study aimed the construction of the transcriptome of Tityus serrulatus venom gland and cloning/heterologous expression of hyaluronidase. In the transcriptome, 558 ESTs were identified and 61.8% corresponded to toxins, such as neurotoxins with action on ion channels, metalloproteins, hypotensins, antimicrobial peptides, among others. In addition, new toxins were identified, comprising one neuropeptide and Ts16.1, described for the first time to the genus Tityus. Among the obtained transcripts, one identified clone corresponded to an incomplete C-terminal of a hyaluronidase. Consequently, a synthetic gene was synthesized containing the sequence of TsHyal-1 (obtained from databases) in the pPICZ?A vector for heterologous expression in P. pastoris. The rTsHyal-1 was expressed at laboratorial scale in unsupplemented medium (BMM) at pH 7.0 for 96 h, after induction time, with daily feeding of 0.75% methanol. The rTsHyal-1 was produced in soluble and active form (838.31 UTR/mg) and resulted in a protein yield of 0,266 mg/mL in final expressed material. Besides, the secretome of the medium showed that P. pastoris also secretes native proteins bound with ATP, proteins related to carbohydrate metabolism and oxidative stress response. The rTsHyal-1 was partially purified in a weak cation exchange and presented specific activity of 1097.45 UTR/mg. The rTsHyal-1 has molecular mass of 49.5 kDa and the treatment with PNGase F and analysis by mass spectrometry (MALDI-TOF) indicated a potential N-glycosylation of 4.5 kDa. Additionally, the sequencing of tryptic digests performed in the MALDI-TOF and Q-Exactive resulted in 46.8% of protein sequence coverage. The rTsHyal-1 presents substrate specificity for hyaluronan followed by chondroitin C, A and B and showed an optimum activity at pH 6.0 and 40°C. Furthermore, the MTT assay indicated that the recombinant enzyme does not display in vitro cytotoxicity. These results validate the biotechnological process of the heterologous expression of rTsHyal-1. This is the first recombinant hyaluronidase from scorpions expressed in P. pastoris system with enzymatic activity preserved.

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Through the cleavage process with restriction enzymes NdeI and BamHI, it was possible to obtain the coding sequence of the fusion protein between enterokinase and thioredoxin (ETK-Trx) of approximately 1259 bp from pENTK plasmid. Then, this sequence was subcloned at NdeI and BamHI sites of the expression vector pDM02, originating the recombinant plasmid pDMK06. This vector contains the TH2 promoter, which is efficiently regulated by Lac operator/repressor. E. coli JM110 cells transformed with the recombinant plasmid showed smaller growth in a solid medium when the expression of the heterologous protein was induced by IPTG in comparison with the control; however, this effect was not detected in the liquid medium. Furthermore, the E. coli cells morphology was analyzed through optical microscopy containing the recombinant plasmid pDMK06, when it was observed, all through the growth time, modifications on cell morphology, characterized by the formation of filaments in those induced with IPTG, in comparison with the control. For expression analysis of the recombinant protein ETKTrx, polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE was performed with the samples that grew with IPTG induction for eight hours. The results showed that the protein ETK-Trx is about 47 kDa with a high level of expression at the insoluble fraction, probably as an inclusion corpuscle. The high levels of expression of ETK-Trx protein occurred in a perfectly regulated way, showing the functionality of the pDM02 plasmid expression/regulation system. / A enteroquinase (EC 3.4.21.9) é uma serino protease heterodimérica, ativadora natural do tripsinogênio, capaz de clivar especificamente a sequência Asp-Asp-Asp- Asp-Lys. Devido à alta especificidade do sítio de reconhecimento tornou-se uma ferramenta de grande interesse biotecnológico. É comumente utilizada para a remoção in vitro de marcas de afinidade, como etiquetas de fusão (tags) de proteínas recombinantes. No presente trabalho, a estratégia de clonagem molecular resultou na construção do plasmídeo pDMK06, que é capaz de programar a expressão heteróloga regulada do gene ETK-Trx em E.coli. Por meio do processo de clivagem com as enzimas de restrição NdeI e BamHI foi possível obter a sequência codificadora da proteína de fusão entre enteroquinase e tiorredoxina (ETK-Trx) de aproximadamente 1259 pb partir do plasmídeo pENTK, a seguir essa sequência foi subclonada nos sítios de NdeI e BamHI do vetor de expressão pDM02, originando o plasmídeo recombinante pDMK06. Esse vetor contém o promotor TH2 que é regulado eficientemente pelo sistema operador/repressor Lac. Células de E.coliJM110 transformadas com o plasmídeo recombinante mostram menor crescimento em meio sólido quando a expressão da proteína heteróloga era induzida por IPTG em relação ao controle, porém esse efeito não foi detectado em meio líquido. Além disto foi analisado por microscopia ótica a morfologia das células de E.colicom o plasmídeo recombinante pDMK06, onde observou-se no decorrer do tempo de crescimento e indução, alterações na morfologia celular caracterizada de filamentação das células induzidas com IPTG quando comparadas com o controle. Para análise da expressão da proteína recombinante ETK-Trx utilizou-se a eletroforese em gel de poliacrilamida SDS-PAGE das amostras referentes a 8 horas de crescimento e indução com IPTG. Os resultados obtidos apresentaram a proteína ETK-Trx com tamanho aproximado de 47kDa com alto nível de expressão na fração insolúvel, provavelmente em forma de corpúsculo de inclusão. A expressão em altos níveis das proteínas ETK-Trx ocorreu de forma perfeitamente regulada mostrando a funcionalidade do sistema de expressão/regulação do plasmídeo pDM02.

Celulases têm atraído muito interesse nos últimos anos devido a sua habilidade na bioconversão de material lignocelulolítico em glucose, a qual pode, então, ser convertida a etanol por fermentação. O complexo celulolítico capaz de degradar a celulose consiste de várias enzimas (principalmente celulases e β-glucosidases) e proteínas auxiliadoras, que atuam em sinergismo para eficientemente hidrolizar a biomassa. Nesse estudo, investigou-se a hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado utilizando enzimas produzidas por T. harzianum e enzima comerial. O rendimento de hidrólise foi avaliado quanto a diferentes níveis de deslignificação de biomassa, graus de cristalinidade da celulose, composição dos coquetéis enzimáticos e adição de BSA. Estudos de difração de raios-X mostraram que a cristalinidade da lignocelulose não é um fator determinante na recalcitrância ao ataque enzimático. Além disso, a adição de BSA não teve qualquer efeito no rendimento da hidrólise. O mais eficiente coquetel enzimático foi obtido misturando o preparado comercial com o produzido pelo T. harzianum (rendimento acima de 97%). Esse desempenho está, provavelmente, relacionado com níveis adequados de β-glucosidases e xilanases no coquetel. Devido a essa eficiente atividade celulolítica, o fungo T. harzianum tem um grande potencial em aplicação para hidrólise de biomassa. A celobiohidrolase I, uma exoglucanase, é a principal enzima secretada por esse fungo (cerca de 60% do total) e nesse estudo ela foi expressa em bioreator, purificada por cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração e caracterizada bioquímica, biofísica e estruturalmente. Conforme confirmado por SAXS, tanto a CBHI inteira quanto seu domínio catalítico, obtido por digestão parcial com papaína, são monoméricos em solução e apresentam distância máxima (DMax) de 110 e 60 Å, e raio de giro (Rg) de 20 e 27 Å, respectivamente. Os resultados indicam que o linker é flexível em solução e confirmam o formato de girino da enzima. A CBHI possui atividade máxima em pH 5.0 e temperatura de 50 °C, com atividade específica contra Avicel &reg e pNPC de 0,28 and 1,53 U/mg, respectivamente. Outras celulases de interesse foram também expressas para caracterização, no entanto, para essas, foi utilizado o sistema de expressão heteróloga em Aspergillus Níger ou Pichia pastoris. O domínio catalítico da endoglucanase I de T. harzianum foi expresso em A. Níger. A proteína tem atividade específica contra CMC de 15,8 U/mg e pH e temperatura ótima de 3 e 50 °C, respectivamente. A proteína é estável nessas condições em até 3 dias de incubação (dados de ensaios de atividade residual). Estudos biofísicos de deslocamento térmico e dicroísmo circular apresentaram alguns parâmetros de estabilidade de estrutura terciária e secundária, respectivamente. A proteína perde estrutura terciária regular, em pH 5, em torno de 30 °C mas sua estrutura secundária é desordenada somente em pH 9 (quando a 25 °C). Experimentos de dicroísmo circular também indicaram a composição de estrutura secundária do domínio catalítico da EGLI de 6% de α-hélice e 42% de folhas- β. / Cellulases have attracted an outstanding interest in the recent years because of its ability in the bioconversion of cellulose-containing raw materials into glucose, which can then be converted into ethanol by fermentation. The cellulase complex able to degrade cellulose consists of several enzymes (mainly cellulases and β-glucosidases) and auxiliary proteins, which act in synergism to efficiently solubilize the biomass. In this study, we investigated the enzymatic hydrolysis of pretreated sugarcane bagasse using crude enzyme extracts produced by Trichoderma harzianum as well as from the extract in combination with a commercial cocktail. The influence of different levels of biomass delignification, degree of crystallinity of lignicellulose, composition of enzymatic activities and BSA on enzymatic hydrolysis yields was evaluated. Our X-ray diffraction studies showed that crystallinity of lignocellulose is not a key determinant of its recalcitrance toward enzymatic hydrolysis. In fact, under the experimental conditions, an increase in crystallinity of lignocellulosic samples resulted in increased glucose release by enzymatic hydrolysis. Furthermore, under the same conditions, the addition of BSA had no significant effect on enzymatic hydrolysis. The most efficient enzyme blends were obtained by mixing a commercial enzymatic cocktail with T. harzianum cellulase preparations (above 97%). Increased hydrolytic efficiencies appeared to correlate with having an adequate level of both β-glucosidase and xylanase activities in the blends. Due to its elevated cellulolytic activity, the filamentous fungus T. harzianum has a considerable potential in biomass hydrolysis applications. The cellobiohydrolase I, an exoglucanase, is the main enzyme secreted by this fungus (about 60% of total) and in this study we have expressed, purified and performed an initial biochemical, biophysical and structural characterization. As confirmed by small angle X-ray scattering (SAXS) both full-length CBHI and its catalytic core domain (CCD), obtained by partial digestion with papain, are monomeric in solution and they have Dmax of 110 and 60 Å, and Rg of 20 and 27 Å, respectively. The results indicate that the linker is flexible in solution and confirmed the tadpole shape of the enzyme. CBHI displays maximum activity at pH 5.0 and temperature of 50 °C, with specific activities against Avicel &reg and pNPC of 0,28 and 1.53 U/mg, respectively. Other celulases were also expressed, however, for them we have used the heterologous expression system in Aspergillus niger and Pichia pastoris. The catalytic domain of endoglucanase I from T. harzianum was expressed in A. niger and partially characterized. The protein has specific activity against CMC of 15.8 U/mg and optimum pH and temperature of 3 and 50 °C, respectively. The protein is stable in these conditions until 3 days of incubation. Biophysical studies of termal shift and circular dichroism (CD) assays have showed some parameters of stability of tertiary and secondary structure of the protein. It loses regulary terciary structure in pH 5 around 30 °C but the secondary structure is desordened only in pH 9 at 25 °C. CD experiments also indicated the secondary structure compsition of the catalytic domain of EGLI: 6% de α-helices and 42% de β-sheet.

Malaria is a major threat to the public health worldwide as it is affecting populations in tropical and subtropical areas globally. Among those populations are around 40% of pregnant women and children who are susceptible to this disease. Plasmodium falciparum is the most lethal agent that causes malaria in human. Currently, there is drug resistance against antimalarial drugs in parasite against treatment of malaria infections, it is essential to search for new drug targets in order to find cure and alleviate suffering of human population. There are approximately 100 protein kinases in P. falciparum that are involved in phosphorylation of asexual blood stage. Hence, the phosphorylation plays an important part in the development of different stages of malarial parasites. Due to their significance in the parasite life cycle, one of the protein kinase of P. falciparum belongs to the ABC-1 family of proteins. PfABCK2 can be a therapeutic target due to its higher expression during the late schizont stage of blood stage form. The bioinformatic analysis and preliminary results of PfABCK2 showed the heterologous expression of this protein. Hence, the gene of PfABCk2 was ligated into pET21a+ vector with His-tag at C-terminus and transformed into BL-21 (DE3) competent cells that were verified through Miniprep and DNA sequencing. Furthermore, this gene construct is utilized to heterologous express this protein with IPTG and afterwards purified the recombinant protein kinase using nickel affinity chromatography as shown on 10% SDS-PAGE with the expected 36 kDa protein band. Therefore, the aim of this study is to partially characterize PfABCK2 protein kinase utilizing molecular cloning, heterologous express and protein kinase activity assay.

Natural products have long furnished medical science playing a significant role in drug discovery and development. Their importance notwithstanding, it is estimated that less than 1% of microorganisms can be cultivated from environmental sources using standard laboratory techniques. It is therefore necessary to develop biochemical and genetic techniques to access these uncultivable genomes. Here as a point of departure toward this goal, two cDNA libraries of two microorganisms were constructed along with five fosmid libraries with DNA isolated from marine environmental samples. We describe the construction of cDNA libraries from marine microbial species and detail experiments to exploit these libraries for their natural product biosynthetic pathways and other metabolic enzymes they harbor. However, no useful biosynthetic pathways were detected within the cDNA libraries. Genetic selection by complementation was additionally explored as a method to identify and localize biosynthetic gene clusters within marine microbial DNA libraries. Genetic selection is a fast and economic method which utilizes selection of a part of a pathway to represent the presence of an entire pathway for the complementation of known mutant strains. We describe genetic selection to localize biotin biosynthetic pathways of Hon6 (Chromohalobacter sp.) as a proof of principle experiment for the identification and localization of biosynthetic pathways in general. Instead of developing purification methods or manipulating cultivation conditions, large fragments of non-culturable bacterial genomes can be cloned and expressed using recombinant DNA technology. A strong transcriptional promoter to control high-level gene expression is required in recombinant expression plasmids. We aimed to develop new tools to control gene expression through the use of riboswitches. Riboswitches are metabolite-sensing ribonucleic acid (RNA) elements that possess the remarkable ability to control gene expression. The thiamine pyrophosphate (TPP) riboswitch system was chosen as it will enable use of E. coli as a suitable host strain. This system is particularly attractive because it has one of the simplest structures among the riboswitches elucidated to date. The use of the TPP riboswitch will also enable modulation of pathway gene expression by varying the TPP coccentration as many gene products are toxic. The violacein gene cluster from Chromobacterium violaceum was selected and placed under the control of this riboswitch. We describe modulation of heterologous gene expression by the ThiC/Riboswitch and detail experiments to investigate the expression and manipulation of the gene cluster under various promoters.

Der Mensch besitzt ~25 funktionelle Bitterrezeptoren (TAS2R), die für die Wahrnehmung potenziell toxischer Substanzen in der Nahrung verantwortlich sind. Aufgrund der großen genetischen Variabilität der TAS2R-Gene könnte es eine Vielzahl funktionell unterschiedlicher TAS2R-Haplotypen geben, die zu Unterschieden der Bitterwahrnehmung führen. Dies konnte bereits in funktionellen Analysen und sensorischen Studien für einzelne Bitterrezeptoren gezeigt werden. In dieser Arbeit wurden die häufigsten Haplotypen aller 25 Bitterrezeptoren verschiedener Ethnien funktionell charakterisiert. Das Ziel war eine umfassende Aussage über die funktionelle Diversität der TAS2Rs, die die molekulare Grundlage für individuelle Bitterwahrnehmung bildet, treffen zu können. Fehlende Varianten wurden aus genomischer DNA kloniert oder durch gezielte Mutagenese bereits vorhandener TAS2R-Konstrukte generiert. Die funktionelle Analyse erfolgte mittels Expression der TAS2R-Haplotypen in HEK293TG16gust44 Zellen und anschließenden Calcium-Imaging-Experimenten mit zwei bekannten Agonisten. Die Haplotypen der fünf orphanen TAS2Rs wurden mit über hundert Bitterstoffen stimuliert. Durch die gelungene Deorphanisierung des TAS2R41 in dieser Arbeit, wurden für die 21 aktivierbaren TAS2Rs 36 funktionell-unterschiedliche Haplotypen identifiziert. Die tatsächliche funktionelle Vielfalt blieb jedoch deutlich hinter der genetischen Variabilität der TAS2Rs zurück. Neun Bitterrezeptoren wiesen funktionell homogene Haplotypen auf oder besaßen nur eine weltweit vorherrschende Variante. Funktionell heterogene Haplotypen wurden für zwölf TAS2Rs identifiziert. Inaktive Varianten der Rezeptoren TAS2R9, TAS2R38 und TAS2R46 sollten die Wahrnehmung von Bitterstoffen wie Ofloxacin, Cnicin, Hydrocortison, Limonin, Parthenolid oder Strychnin beeinflussen. Unterschiedlich sensitive Varianten, besonders der Rezeptoren TAS2R47 und TAS2R49, sollten für Agonisten wie Absinthin, Amarogentin oder Cromolyn ebenfalls zu phänotypischen Unterschieden führen. Wie für den TAS2R16 bereits gezeigt, traten Haplotypen des funktionell heterogenen TAS2R7 und TAS2R41 ethnien-spezifisch auf, was auf lokale Anpassung und verschiedene Phänotypen hinweisen könnte. Weiterführend muss nun eine Analyse der funktionell-variablen TAS2Rs in sensorischen Tests erfolgen, um ihre phänotypische Relevanz zu prüfen. Die Analyse der funktionsmodulierenden Aminosäurepositionen, z.Bsp. des TAS2R44, TAS2R47 oder TAS2R49, könnte weiterführend zum besseren Verständnis der Rezeptor-Ligand- und Rezeptor-G-Protein-Interaktion beitragen. / Bitter taste perception varies markedly from person to person, due to a high number of polymorphisms present in the 25 known functional bitter receptors (TAS2Rs). These polymorphisms lead to a number of haplotypes for each receptor, which are common in different populations, but vary in frequency. The individual combination of receptor variants seems to determine the person’s sensitivity of bitter perception, as could already be shown for single TAS2Rs. Bitter is an aversive taste quality, indicating the ingestion of harmful substances. Different sensitivity could have an impact on food choice. In order to characterize functional consequences of the genetic diversity, we performed calcium imaging experiments with all main haplotypes for the 25 bitter receptors. The obtained information about receptor properties enables us on the one hand to analyze structure-function relationships and on the other hand gives us the functional diverse candidates to focus on in psychophysical studies. The overall aim is to show genotype-phenotype correlation for bitter taste perception and their impact on food choice and therefore diet and health. Our first aim was to identify agonists for the 5 receptors, which could not be deorphaned in previous screens. We challenged all main haplotypes of these TAS2Rs with 106 bitter compounds and could identify the antibiotic chloramphenicol as agonist for bitter receptor TAS2R41. In total we identified 36 functionally different receptor variants of the 21 deorphaned TAS2Rs. Main haplotypes of nine TAS2Rs were functionally homogeneous while twelve TAS2Rs possessed between two and three functionally heterogeneous receptor variants. In summary the observed functional diversity is not as big as expected. Based on our in vitro findings the shown functional diversity of these twelve bitter receptors might be the molecular basis for individual differences in bitter taste perception and will be further analyzed in psychophysical studies.