O diabetes, relacionado ao estresse celular, altera consideravelmente a cicatrização de úlceras cutâneas. O látex da seringueira Hevea brasiliensis tem se apresentado como importante indutor da cicatrização especialmente nas ulcerações comprometidas pelo diabetes no qual foi observado clinicamente estímulo do látex à total reepitelização. Foram avaliadas as modificações teciduais e os mecanismos de ação da fração proteica (F1) do látex na cicatrização de úlceras cutâneas em ratos diabéticos e não diabéticos. Inicialmente, foi testada a citotoxicidade da F1 em culturas de fibroblastos NIH-3T3 e queratinócitos humanos pelo método MTT. Em seguida, foram utilizados 80 ratos Wistar, dos quais 40 foram induzidos ao diabetes (DM) (por streptozotocina 45 mg/Kg) e 40 não-diabéticos (N), submetidos a úlceras dorsais por punch (1,5 cm de diâmetro), as quais foram tratadas com gel de carboximetil-celulose (CMC) 4% (DM/N-sham) e CMC+F1 0,01% (DM/N-F1), seguidos por 2, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após eutanasiados 10 animais/tempo/grupo, biópsias da pele/úlcera/cicatriz foram coletadas para estudo da reepitelização pelo cálculo do índice de cicatrização; histomorfometria (HE e Gomori) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos, fibroblastos e % da área de colágeno; imunoistoquímica para OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF, e sinalizadores da insulina: IRS, AKT, SHC e ERK; dosagem do estresse oxidativo (NO-óxido nítrico, LPM-lipoperóxidos de membranas, MPO-mieloperoxidase, MDA-malondialdeído, FOX-H2O2 e defesas antioxidantes: GSH-glutationa e TRAP-Capacidade Antioxidante Total e citometria de fluxo para CD11b+, CD4+ e CD8+. A fração F1 apresentou-se atóxica em relação às culturas de fibroblastos NHI-3T3 e queratinócitos humanos. Além disso, a pele diabética (sem tratamento) apresentou maior quantidade de infiltrado inflamatório (p=0,0001) e estresse oxidativo [NO (p=0,0473) e LPM (p=0,0001)] que a não diabética. No entanto, o DM diminuiu na pele os níveis de angiogênese (p=0,0001), VEGF (p=0,0002) e eNOS (p=0,0206) bem como a sinalização da insulina (IRS-p=0,0001, AKT-p=0,0041, SHC-p=0,0006, ERK-p=0,0002) em relação dos não diabéticos. Quando a proteína F1 foi utilizada no tratamento das úlceras dos ratos diabéticos, houve importante quimiotaxia de células inflamatórias para a úlcera até o 7° dia (p=0,0452), especialmente PMN, com maior estresse oxidativo [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX e LPM (p=0,0001)], além de assemelhar-se à cicatrização normal (grupo N sham). Este estímulo à fase inflamatória e ao estresse oxidativo pareceu favorecer as próximas fases da cicatrização, aumentando a angiogênese, VEGF e eNOS no 14° e 21° dia, o que certamente favoreceu a reepitelização (p=0,0026). Os efeitos da associação F1 x DM também pareceu estimular a fibroplasia no 14° e 21° dia (p=0,0121) e colagênese (p=0,0001). Além disso, F1 associada ao DM permitiu maior expressão de IRS, SHC e ERK diferente do DM sham e também semelhante ao N sham. Sendo assim, o maior recrutamento de células inflamatórias, estímulo à produção de citocinas e fatores de crescimento, o estresse oxidativo desencadeado até o 14° dia, o importante estímulo à fibroplasia e colagênese bem como a importante ativação da sinalização da insulina, outrora diminuída nos diabéticos, foram fatores essenciais que permitiram a total reepitelização das úlceras cutâneas tratadas com F1 nos ratos diabéticos. / Diabetes, stress-related cellular changes considerably the healing of skin ulcers. The latex of the rubber tree Hevea brasiliensis has emerged as an important inducer of healing ulcerations especially in compromised by diabetes in which it was clinically observed stimulation of latex to complete reepithelialization. We evaluated the tissue changes and the mechanisms of action of the protein fraction (F1) of the latex on the healing of cutaneous ulcers in diabetic and nondiabetic rats. Initially, we tested the cytotoxicity of F1 in cultured fibroblasts NIH-3T3 and human keratinocytes by MTT method. Then, we used 80 Wistar rats, of which 40 were induced diabetes (DM) (by streptozotocin 45 mg / kg) and 40 non-diabetic (N), dorsal ulcers underwent punch (1.5 cm diameter) , which were treated with gel of carboxymethyl cellulose (CMC) 4% (MD / N-sham) or CMC 0.01% + F1 (DM/N-F1), followed by 2, 7, 14 and 21 days after injury. After euthanized 10 animals / time / group, biopsies of skin / ulcer / scar were collected for the study of reepithelialization by calculating the rate of healing; histomorphometry (HE and Gomori) for quantification of inflammatory infiltrate, vessels, fibroblasts and collagen% of the area ; immunohistochemistry for OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF and insulin signaling: the IRS, AKT, ERK and SHC; dose of oxidative stress (NO, nitric oxide, LPM-membrane lipoperoxides, MPO, myeloperoxidase, MDA-malondialdehyde, FOX-H2O2 and antioxidant defenses: GSH-glutathione and TRAP-total antioxidant capacity and flow cytometry for CD11b +, CD4 + and CD8 +. fraction F1 presented nontoxic of cultures fibroblast NIH- 3T3 cells and human keratinocytes. In addition, diabetic skin (no treatment) had higher amounts of inflammatory infiltrate (p = 0.0001) and oxidative stress [NO (p = 0.0473) and LPM (p = 0.0001)] that non-diabetic. However, DM skin decreased levels of angiogenesis (p = 0.0001), VEGF (p = 0.0002) and eNOS (p = 0.0206) as well as insulin signaling (IRS P = 0.0001, p = 0.0041 AKT-,-SCH p = 0.0006, ERK-p = .0002) than non-diabetic subjects. When the F1 protein was used in the treatment of ulcers of diabetic rats , there was a significant chemotaxis of inflammatory cells for the ulcer to the 7th day (p = 0.0452), especially PMN with higher oxidative stress [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX and LPM (p = 0 , 0001)], and resemble the normal healing (sham group N). This stimulation of the inflammatory and oxidative stress seemed to favor the next phases of wound healing by increasing angiogenesis, VEGF and eNOS in 14 and 21 days , which certainly favored the re-epithelialization (p = 0.0026). The effects of the combination F1 x DM also appeared to stimulate fibroplasia in 14 and 21 days (p = 0.0121) and collagenesis (p = 0.0001). In addition, F1 associated with DM allowed a greater expression of IRS, SHC and ERK different from sham DM and also similar to N sham. Thus, the increased recruitment of inflammatory cells, stimulate the production of cytokines and growth factors, stress oxidative triggered until the 14th day, the important stimulus to fibroplasia and collagenesis well as the important activation of insulin signaling, once diminished in diabetics, were key factors that allowed total reepithelialization of cutaneous wounds treated with F1 in diabetic rats.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:54:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MAXLEY MARTINS ALVES.pdf: 10774103 bytes, checksum: d2c2ae244a11db0a98fe9c83ada4e1c8 (MD5) Previous issue date: 2014-09-03 / The acute inflammatory answer is a manifestation of the organism triggered by an infectious or non-infectious taunting. Predisposal factors are, for instance: bacteria, viruses, amongst other microorganisms or traumas. It is an internal survival mechanism. The development of a cascade of immunological events in an attempt of destroying an aggressive agent, with cardiologic, hemodynamic, respiratory, renal, endocrine, metabolic, gastrointestinal and hematological alterations occurs determining a syndrome clinic case. Vascular and immunological alterations trigger a counter balance inflammatory response. Recent researches using a specific derived fraction of the natural gum of Hevea brasiliensis rubber tree, called Hev b 13, has shown induction capability to synthesize interleukin 10 (IL-10) in vitro, stimulating the anti-inflammatory response that may result in homeostasis. These evidences are assessed with high mortality sepis induction, after surgical procedure with gastric, intestinal and pancreatic damaging and strain infusion of Acinetobacter baumanni of resistance profile to multiple antibiotics tested. In dose 0,5 mg/kg of Hev b 13 solution, subcutaneous, similarities were observed in the survival of animals treated with this solution and the control group, treated with 1 ml of SF0, 9% (p= 0,8106). The laboratorial analysis, on the other hand, showed total leukocytes reckoning (p = 0,0207) and total lymphocyte (p= 0,0032) with statistically significant differences. In further counting there was no significant difference (p>0,05). The Hev b 13 solution may lead to the induction of reducing the amplification of immunological cellular cascade, reducing the production of total leukocytes and lymphocytes, with effect over the immunological response, anti-inflammatory effect. The experiment induced synthesis of interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor (TNF). Rats receiving Hev b 13, lung tissue showed lesser involvement of inflammatory cells. / A resposta inflamatória aguda é uma manifestação do organismo desencadeada por um insulto. Fatores que predispõem são, por exemplo: bactérias, vírus, dentre outros micro-organismos ou traumas. É um mecanismo interno de sobrevivência. A resposta inflamatória leva ao desenvolvimento de uma cascata de eventos imunológicos na tentativa de destruir o agente agressor, com alterações cardiológicas, hemodinâmicas, respiratórias, renais, endocrinometabólicas, gastrointestinais e hematológicas determinando um quadro clínico sindrômico. As alterações vasculares e imunológicas desencadeiam uma resposta de contra-balanço inflamatória. Pesquisas recentes utilizando uma fração específica derivada do látex natural da seringueira Hevea brasiliensis, denominada Hev b 13, tem mostrado capacidade de induzir síntese de interleucina 10 (IL-10) in vitro, estimulando a resposta anti-inflamatória, podendo resultar em homeostase. Estas evidências são avaliadas no modelo experimental adotado com indução de sepse grave, após procedimento cirúrgico com lesões gástrica, intestinal e pancreática, além de infusão de cepas de Acinetobacter baumanni com perfil de resistência a múltiplos antibióticos testados. Foi infundido solução Hev b 13 via subcutânea na dosagem 0,5 mg/Kg. Observou-se semelhança na sobrevida dos animais que foram tratados com esta solução e os animais do grupo controle, tratados com 1 ml de SF0,9% (p =0 ,8106). A contagem de leucócitos totais (p= 0,0207) e linfócitos totais (p= 0,0032) apresentou diferenças estatisticamente significativas. Nas demais células as contagens não apresentaram diferença estatística significativa (p>0,05). A solução de Hev b 13 pode induzir a redução da amplificação da cascata celular imunológica, reduzindo a produção de leucócitos e linfócitos totais, modulando a resposta imunológica. O experimento realizado induziu síntese de interleucina 10 (IL-10) e Fator de necrose tumoral (TNF). Os ratos que receberam Hev b 13, apresentaram no tecido pulmonar menor envolvimento de células inflamatórias.

L'hévéa (Hevea brasiliensis) est la seule source de caoutchouc naturel commercialisé à travers le monde. En Afrique et en Asie, la maladie 'Corynespora Leaf Fall' (CLF), causée par le champignon nécrotrophe Corynespora cassiicola, affecte les plantations hévéicoles en provoquant des défoliations massives sur les clones les plus sensibles. L’évaluation précoce de la sensibilité des clones dans les programmes de sélection est un enjeu majeur pour écarter les individus les plus sensibles des programmes de développement et ainsi réduire la pression de la maladie. Une des méthodes d’évaluation envisagée consiste à tester indirectement la sensibilité des clones aux effecteurs fongiques responsables de la virulence (test toxinique). Parmi tous les effecteurs potentiels du champignon identifiés in silico, seule la cassiicoline Cas1 a été purifiée et caractérisée à ce jour. Il s’agit d’une petite glycoprotéine sécrétée qui jouerait un rôle dans les phases précoces de l’infection en induisant la nécrose des tissus. Les souches porteuses du gène Cas1 sont parmi les plus agressives sur les clones d'hévéa testés. Néanmoins, certaines souches de C. cassiicola ne produisant pas de cassiicoline présentent tout de même une agressivité modérée, suggérant l'implication d'autres effecteurs dans l'établissement de la maladie CLF. Les objectifs de cette thèse sont (i) de déterminer si la sensibilité à la cassiicoline Cas1 est un critère de sélection pertinent pour identifier les clones d’hévéa les plus sensibles à la maladie CLF, et (ii) d’identifier chez l’hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1. Nous avons d'abord analysé l’inoculum naturel et montré que les souches porteuses du gène Cas1 représentent un quart de la population de C. cassiicola dans les plantations d’hévéa d’Afrique de l’Ouest, le reste étant majoritairement constitué de souches dépourvues du gène codant la cassiicoline (Type A/Cas0). Nous avons ensuite créé un mutant de délétion du gène Cas1 pour la souche de référence CCP et comparé sa virulence à celle de la souche sauvage. Nous avons ainsi pu montrer que la cassiicoline Cas1 est bien un effecteur de nécrotrophie déterminant pour la virulence de C. cassiicola chez l’hévéa puisque la souche délétée perd toute virulence sur les clones testés. Enfin, nous avons recherché chez l'hévéa des facteurs de sensibilité à la cassiicoline Cas1 à travers deux approches. La technique de "double hybride en levures" nous a permis d'identifier une trentaine de protéines candidates qui pourraient interagir physiquement avec la toxine. Une approche transcriptomique, nous a permis d’identifier les gènes d’hévéa dont l’expression est modifiée suite à l’application de la cassiicoline purifiée, en comparant un clone sensible (PB260) et un clone tolérant (RRIM600). En conclusion, ces travaux ont permis de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'interaction compatible entre C. cassiicola et l'hévéa et ouvrent la voie de la sélection assistée par effecteur. / The rubber tree (Hevea brasiliensis) is the primary commercial source of natural rubber worldwide. In Asia and Africa, H. brasiliensis is affected by the Corynespora leaf fall (CLF) disease, caused by the broad-spectrum necrotrophic fungus Corynespora cassiicola. During severe attacks, massive fall of young leaves can occur in susceptible cultivars. Early evaluation of the susceptibility of rubber clones in breeding programs is required to avoid developing highly susceptible clones that would amplify the disease. An indirect phenotyping procedure envisaged consists in testing the sensitivity to the fungal toxins (or effectors) rather than the susceptibility to the fungus itself (toxin test). Among all putative effectors identified in silico, only cassiicolin Cas1 has been purified and characterized to date. This small secreted glycoprotein was for long suspected to play a role in the early phase of infection by inducing tissue necrosis. Strains carrying the Cas1 gene are the most aggressive on tested rubber clones. However, strains without cassiicolin gene (called Cas0) still show moderate aggressiveness, suggesting the existence of effectors other than cassiicolin. The objectives of this study are (i) to determine if susceptibility to cassiicolin Cas1 is a relevant selection criterion to eliminate the rubber clones most susceptible to CLF disease, and (ii) identify molecular factors involved in the sensitivity to Cas1, in rubber tree. We have thus analyzed the typology of a large set of C. cassiicola isolates collected from various rubber plantations in West Africa. Our results show that isolates carrying the cassiicolin isoform Cas1 are widely represented, but that the most represented type (A/Cas0) are isolates without cassiicolin gene. Here we show that deletion of the cassiicolin gene in the isolate CCP resulted in a total loss of virulence. This clearly demonstrated that cassiicolin is indeed a necrotrophic effector required for the virulence of isolate CCP in rubber tree. Finally, we have investigated susceptibility factors to cassiicolin Cas1 on rubber tree with two different approaches. We identified about thirty candidate proteins that could physically interact with the toxin, through the two-hybrid assay. A transcriptomic approach allowed us to identify the rubber genes differentially expressed in response to the purified cassiicolin, comparing a susceptible clone (PB260) and a tolerant clone (RRIM600). In conclusion, we think that the necrotrophic effector Cas1 can be an interesting tool for effector-based selection of tolerant clones for African plantations; however, efforts should also be placed on A/Cas0 isolates, in order to identify potential necrotrophic effector(s) responsible for their virulence. This would enlarge the potential of effector-based selection.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2563568 bytes, checksum: e5cef4ec163c1c100192c5a2bbc10855 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / The foliar anthracnose of rubber tree causes necrotic lesions and wrinkling of the leaflets, which can lead to premature defoliation, reducing leaf area. Since the first reports of occurrence of anthracnose, several species of Colletotrichum have been listed as its purported causal agent. However, in Brazil, no study has been conducted for this purpose. For this reason, the objectives of the present study were: to generate information about the identity of the causal agent of foliar anthracnose of rubber tree by morphological and molecular phylogenetic analyses; and to develop procedures for the molecular diagnosis of Colletotrichum spp. associated with the disease. Isolates belonging to three complexes of Colletotrichum species were found: C. acutatum complex; C. gloeosporioides complex; and C. boninense complex. Primers were designed based on the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) region which allowed the amplification of specific bands for Colletotrichum associated with each of the three species complexes. / Os sintomas da antracnose foliar da seringueira são tipicamente lesões necróticas que podem causar o enrugamento dos folíolos e, em etapas avançadas, a desfolha prematura, reduzindo a área foliar. Desde o relato inicial da doença, várias espécies de Colletotrichum são mencionadas como sendo o agente etiológico. No Brasil, até o momento, nenhum estudo foi realizado com o propósito de identificar as espécies associadas à antracnose foliar da seringueira. Por essa razão, estabeleceu-se como objetivo gerar informações acerca da natureza do agente etiológico da antracnose da seringueira, mediante caracterização morfológica e análises filogenéticas moleculares. Outro objetivo foi desenvolver procedimento para o diagnóstico molecular de Colletotrichum spp. associadas à seringueira. Isolados de Colletotrichum spp. foram obtidos de folhas de seringueira, diferentes regiões genômicas foram sequenciadas e as principais características morfológicas de relevância taxonômica foram estudadas. Isolados pertencentes a três complexos de espécies de Colletotrichum foram identificados: complexo C. acutatum; complexo C. gloeosporioides; e complexo C. boninense. Primers desenhados com base na região que codifica para a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) permitiram a amplificação de bandas específicas para os isolados de Colletotrichum associados a cada um dos três complexos de espécies mencionados.

O diabetes, relacionado ao estresse celular, altera consideravelmente a cicatrização de úlceras cutâneas. O látex da seringueira Hevea brasiliensis tem se apresentado como importante indutor da cicatrização especialmente nas ulcerações comprometidas pelo diabetes no qual foi observado clinicamente estímulo do látex à total reepitelização. Foram avaliadas as modificações teciduais e os mecanismos de ação da fração proteica (F1) do látex na cicatrização de úlceras cutâneas em ratos diabéticos e não diabéticos. Inicialmente, foi testada a citotoxicidade da F1 em culturas de fibroblastos NIH-3T3 e queratinócitos humanos pelo método MTT. Em seguida, foram utilizados 80 ratos Wistar, dos quais 40 foram induzidos ao diabetes (DM) (por streptozotocina 45 mg/Kg) e 40 não-diabéticos (N), submetidos a úlceras dorsais por punch (1,5 cm de diâmetro), as quais foram tratadas com gel de carboximetil-celulose (CMC) 4% (DM/N-sham) e CMC+F1 0,01% (DM/N-F1), seguidos por 2, 7, 14 e 21 dias após a lesão. Após eutanasiados 10 animais/tempo/grupo, biópsias da pele/úlcera/cicatriz foram coletadas para estudo da reepitelização pelo cálculo do índice de cicatrização; histomorfometria (HE e Gomori) para quantificação de infiltrado inflamatório, vasos, fibroblastos e % da área de colágeno; imunoistoquímica para OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF, e sinalizadores da insulina: IRS, AKT, SHC e ERK; dosagem do estresse oxidativo (NO-óxido nítrico, LPM-lipoperóxidos de membranas, MPO-mieloperoxidase, MDA-malondialdeído, FOX-H2O2 e defesas antioxidantes: GSH-glutationa e TRAP-Capacidade Antioxidante Total e citometria de fluxo para CD11b+, CD4+ e CD8+. A fração F1 apresentou-se atóxica em relação às culturas de fibroblastos NHI-3T3 e queratinócitos humanos. Além disso, a pele diabética (sem tratamento) apresentou maior quantidade de infiltrado inflamatório (p=0,0001) e estresse oxidativo [NO (p=0,0473) e LPM (p=0,0001)] que a não diabética. No entanto, o DM diminuiu na pele os níveis de angiogênese (p=0,0001), VEGF (p=0,0002) e eNOS (p=0,0206) bem como a sinalização da insulina (IRS-p=0,0001, AKT-p=0,0041, SHC-p=0,0006, ERK-p=0,0002) em relação dos não diabéticos. Quando a proteína F1 foi utilizada no tratamento das úlceras dos ratos diabéticos, houve importante quimiotaxia de células inflamatórias para a úlcera até o 7° dia (p=0,0452), especialmente PMN, com maior estresse oxidativo [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX e LPM (p=0,0001)], além de assemelhar-se à cicatrização normal (grupo N sham). Este estímulo à fase inflamatória e ao estresse oxidativo pareceu favorecer as próximas fases da cicatrização, aumentando a angiogênese, VEGF e eNOS no 14° e 21° dia, o que certamente favoreceu a reepitelização (p=0,0026). Os efeitos da associação F1 x DM também pareceu estimular a fibroplasia no 14° e 21° dia (p=0,0121) e colagênese (p=0,0001). Além disso, F1 associada ao DM permitiu maior expressão de IRS, SHC e ERK diferente do DM sham e também semelhante ao N sham. Sendo assim, o maior recrutamento de células inflamatórias, estímulo à produção de citocinas e fatores de crescimento, o estresse oxidativo desencadeado até o 14° dia, o importante estímulo à fibroplasia e colagênese bem como a importante ativação da sinalização da insulina, outrora diminuída nos diabéticos, foram fatores essenciais que permitiram a total reepitelização das úlceras cutâneas tratadas com F1 nos ratos diabéticos. / Diabetes, stress-related cellular changes considerably the healing of skin ulcers. The latex of the rubber tree Hevea brasiliensis has emerged as an important inducer of healing ulcerations especially in compromised by diabetes in which it was clinically observed stimulation of latex to complete reepithelialization. We evaluated the tissue changes and the mechanisms of action of the protein fraction (F1) of the latex on the healing of cutaneous ulcers in diabetic and nondiabetic rats. Initially, we tested the cytotoxicity of F1 in cultured fibroblasts NIH-3T3 and human keratinocytes by MTT method. Then, we used 80 Wistar rats, of which 40 were induced diabetes (DM) (by streptozotocin 45 mg / kg) and 40 non-diabetic (N), dorsal ulcers underwent punch (1.5 cm diameter) , which were treated with gel of carboxymethyl cellulose (CMC) 4% (MD / N-sham) or CMC 0.01% + F1 (DM/N-F1), followed by 2, 7, 14 and 21 days after injury. After euthanized 10 animals / time / group, biopsies of skin / ulcer / scar were collected for the study of reepithelialization by calculating the rate of healing; histomorphometry (HE and Gomori) for quantification of inflammatory infiltrate, vessels, fibroblasts and collagen% of the area ; immunohistochemistry for OSM, OSMR-, iNOS, VEGF, eNOS, TGF-1, IGF and insulin signaling: the IRS, AKT, ERK and SHC; dose of oxidative stress (NO, nitric oxide, LPM-membrane lipoperoxides, MPO, myeloperoxidase, MDA-malondialdehyde, FOX-H2O2 and antioxidant defenses: GSH-glutathione and TRAP-total antioxidant capacity and flow cytometry for CD11b +, CD4 + and CD8 +. fraction F1 presented nontoxic of cultures fibroblast NIH- 3T3 cells and human keratinocytes. In addition, diabetic skin (no treatment) had higher amounts of inflammatory infiltrate (p = 0.0001) and oxidative stress [NO (p = 0.0473) and LPM (p = 0.0001)] that non-diabetic. However, DM skin decreased levels of angiogenesis (p = 0.0001), VEGF (p = 0.0002) and eNOS (p = 0.0206) as well as insulin signaling (IRS P = 0.0001, p = 0.0041 AKT-,-SCH p = 0.0006, ERK-p = .0002) than non-diabetic subjects. When the F1 protein was used in the treatment of ulcers of diabetic rats , there was a significant chemotaxis of inflammatory cells for the ulcer to the 7th day (p = 0.0452), especially PMN with higher oxidative stress [OSM, OSMR-, iNOS, NO, MPO, FOX and LPM (p = 0 , 0001)], and resemble the normal healing (sham group N). This stimulation of the inflammatory and oxidative stress seemed to favor the next phases of wound healing by increasing angiogenesis, VEGF and eNOS in 14 and 21 days , which certainly favored the re-epithelialization (p = 0.0026). The effects of the combination F1 x DM also appeared to stimulate fibroplasia in 14 and 21 days (p = 0.0121) and collagenesis (p = 0.0001). In addition, F1 associated with DM allowed a greater expression of IRS, SHC and ERK different from sham DM and also similar to N sham. Thus, the increased recruitment of inflammatory cells, stimulate the production of cytokines and growth factors, stress oxidative triggered until the 14th day, the important stimulus to fibroplasia and collagenesis well as the important activation of insulin signaling, once diminished in diabetics, were key factors that allowed total reepithelialization of cutaneous wounds treated with F1 in diabetic rats.

Le caoutchouc naturel (CN), a cis-1,4-polyisoprene, est produit principalement par Hevea brasiliensis. Le CN est un matériau très important pour l’industrie du transport et médicale. La demande en CN augmente d’année en année. Le CN est obtenu à partir du latex. Le latex s’écoule des laticifères après saignée de l’écorce des hévéas. L’éthéphon, un libérateur d’éthylène, peut être appliqué sur certains clones d’hévéa pour stimuler la production de latex. La saignée et la stimulation à l’éthéphon sont des stress de récolte conduisant à la production de métabolites secondaires et par conséquence au caoutchouc. La biosynthèse et la signalisation de l’éthylène (ET) et de l’acide jasmonique (JA) jouent un rôle crucial dans la réponse aux stress de récolte. Deux gènes codant des facteurs de réponse à l’éthylène (ethylene response factor, ERF), HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5, ont été prédits être orthologue à ERF1 d’Arabidopsis. ERF1 est considéré comme un facteur clé de la réponse de défense à travers l’intégration des voies de signalisation de l’éthylène et du jasmonate. Les transcrits de HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 s’accumulent dramatiquement en réponse à des traitements combinant la blessure, le méthyl jasmonate, et l’éthylène. Ces facteurs sont ainsi supposés être des régulateurs clés au croisement des voies de signalisation de l’éthylène et du jasmonate dans les laticifères. HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 ont plusieurs caractéristiques des facteurs de transcription révélés respectivement lors des expériences de trans-activation et de localisation subcellulaire : ils peuvent activer des éléments GCC agissant en cis des promoteurs des gènes cibles et ils sont présents au niveau du noyau.Dans cette étude, l’analyse fonctionnelle des gènes HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 a été effectuées par sur-expression de ces gènes sous le contrôle de deux promoteurs, 35S CaMV et HEV2.1 dans des lignées transgéniques d’Hevea obtenues par transformation génétique via Agrobacterium tumefaciens. Cette sur-expression a conduit à augmenter les effets des gènes natifs HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5. Vingt-neuf lignées à activité GFP ont été sélectionnées sur un milieu contenant de la paromomycine. Douze lignées ont permis régénérées des plantes mais seulement dix ont produit un nombre suffisant de plantes pour réaliser les observations de phénotypage avec au total 1622 plantes transgéniques acclimatées en serre. Ces dix lignées transgéniques ont été confirmées par hybridation moléculaire de type Southern. L’observation morphologique des plants jusqu’à un an montre que les deux gènes (HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5) favorisent une meilleure croissance, en termes de hauteur des plants, du diamètre des tiges, et du poids frais et sec des parties aériennes et racinaires, avec une plus forte vigueur et tolérance aux stress abiotiques. Les plants sur-exprimant HbERF-IXc5 ont aussi une meilleure performance que ceux sur-exprimant HbERF-IXc4. Ces résultats montrent aussi un système racinaire plus vigoureux et bien équilibré par rapport à la plante entière. Les analyses de RT-PCR en temps réel révèlent que l’expression des gènes HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 est plus forte dans les lignées transgéniques que la lignée sauvage. L’analyse fine des lignées HbERF-IXc5 montre aussi des modifications anatomiques (activité cambiale, nombre de cellules laticifères, amidon, et largeur du xylème).Ce travail est la première analyse fonctionnelle de facteurs de transcription chez Hevea. Des différences ont été observées entre les lignées HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5. Comme ERF1, HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5 doivent diriger la réponse à certains stress. HbERF-IXc5 serait un régulateur de la différentiation des laticifers. Cette étude pourrait être complétée par des analyses dans des lignées éteintes pour ces gènes, une comparaison des transcriptomes et métabolome de lignées sauvages et transgéniques, et l’identification des gènes cibles contrôlés par HbERF-IXc4 et HbERF-IXc5. / Natural rubber (NR) (cis-1,4-polyisoprene) is the main production from Hevea brasiliensis. NR is a very important industrial material for transportation, consumer, and medical. The demand for NR is increasing from year to year. NR is obtained from latex. The latex flows out from laticifers after tapping the bark. Ethephon, an ethylene releaser, can be applied on certain clones to stimulate the latex production. Tapping and ethephon stimulation are sources of harvesting stresses conducing to the production of secondary metabolites and consequent rubber. Ethylene (ET) and jasmonic acid (JA) biosynthesis and signalling pathways play a crucial role in the response to latex harvesting stress. Two Hevea ethylene response factor genes, HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5, were predicted to be orthologue to ERF1 from Arabidopsis. ERF1 was suggested to be a key component of defence responses through the integration of ethylene and jasmonic acid signalling pathways. Transcripts of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 were dramatically accumulated by combining wounding, methyl jasmonate, and ethylene treatment. These factors were assumed to be a key regulator at the crosstalk of ethylene and jasmonate signalling pathways in latex cells. HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 have several features of transcription factor revealed by transactivation experiment and subcellular localization, respectively: they can activate the GCC cis-acting element of promoters of target genes and are localized in nucleus, In this study, functional analysis of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes have been carried out by overexpression under control of two promoters, 35S CaMV and HEV2.1 in transgenic Hevea lines obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation. This overexpression led to emphasize the effect of native HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes. Twenty-nine GFP-positive lines were established on paromomycin selection medium. Twelve lines regenerated plants but only ten led to produce a sufficient number of plants for further phenotyping with totally 1,622 transgenic plants in greenhouse. These ten ines were confirmed as transgenic by Southern blot hybridization. Observation of morphology until one year showed both genes (HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5) promoted a better growth in terms of plant height, stem diameter, and weight of aerial and root system with higher vigour and better tolerance to some abiotic stresses. Plants overexpressing HbERF-IXc5 have also a better performance than HbERF-IXc4. Data also showed a vigorous root system well balanced with regard to the whole plant. Real-time RT-PCR analyses revealed that expression of HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 genes was higher in transgenic lines compared to wild-type . Analysis in details of HbERF-IXc5 lines also showed some changes in anatomy (cambium activity, number of latex cells, starch, and width of xylem).This work is the first successful functional analysis of transcription factors in Hevea. Some differences have been observed between HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5. As ERF1, HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5 should drive the response to some stresses. HbERF-IXc5 might be a regulator of laticifer differentiation. This study could be completed with analysis of silenced transgenic lines, comparison of transcriptome, metabolome of wild-type and transgenic lines, and identification of target genes controlled by HbERF-IXc4 and HbERF-IXc5.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-20Bitstream added on 2014-06-13T21:01:35Z : No. of bitstreams: 1 daud_rd_dr_sjrp.pdf: 374546 bytes, checksum: 6286f38c9fc3dc578888faa92f95d070 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Através de experimentos de campo, laboratório e de casa de vegetação foi analisada a susceptibilidade de diferentes clones de seringueira ao ataque de Calacarus heveae Feres (Acari, Eriophyidae). Em campo foram estudadas a dinâmica populacional de ácaros fitófagos e sua influência na estrutura da comunidade de ácaros em seis clones da seringueira, em área pertencente a empresa Plantações Edouard Michelin, Itiquira, MT. Para isso, foram amostrados 10 folíolos de 10 diferentes plantas em seis parcelas clonais, num intervalo médio de 14 dias, no período de março de 2004 a março de 2005. Em experimentos realizados no Laboratório de Acarologia do Depto. de Zoologia e Botânica, UNESP, São José do Rio Preto, foram acompanhados o ciclo biológico, a reprodução e sobrevivência populacional de 20 indivíduos de C. heveae em folíolos destacados dos clones GT 1, PB 235 e RRIM 600. Os ensaios foram repetidos quatro vezes, sendo cada repetição realizada em período em que se registrou a ocorrência do ácaro no campo. Em ensaio realizado em casa de vegetação, no campus da UNESP, São José do Rio Preto, SP, foi verificada a influência do ataque de C. heveae nos processos fisiológicos foliares e na produção de látex em 9 e 11 mudas dos clones RRIM 600 e GT 1, respectivamente, com cinco meses de idade. Foi verificado que a abundância de cada espécie fitófaga diferiu entre os seis clones estudados e, consequentemente, exerceu influência na ocorrência e distribuição das espécies diretamente ou indiretamente relacionadas. Os clones mais susceptíveis ao ataque de C. heveae foram PB 260 e RRIM 600, enquanto os mais resistentes PB 235, PB 217 e GT 1. Em arenas confeccionadas com folíolos destacados, C. heveae apresentou rápido ciclo biológico e maior taxa reprodutiva... / The susceptibility of different rubber tree clones to the attack of Calacarus heveae Feres (Acari, Eriophyidae) was analyzed through field, laboratory and greenhouse essays. In the field essay, we studied the population dynamics of phytophagous mites and its influence on the mite community structure in six rubber trees clones, in a farm belonging to the Plantações Edouard Michelin, Itiquitira, MT. For that, 10 leaflets of 10 different plants were sampled from each of the six clonal plots, from March 2004 to March 2005. We observed in essays performed in the Laboratory of Acarology of Depto. Zoology and Botany, UNESP, São José do Rio Preto, the biological cycle, reproduction and population survivorship of 20 C. heveae individuals reared on detached leaflets of clones GT 1, PB 235 and RRIM 600. The essays were repeated four times, in the periods when C. heveae was more abundant in the field. For the greenhouse essay, performed in UNESP, São José do Rio Preto, SP, we verified the influence of C. heveae attack on physiological processes and on the latex yield in 9 and 11 five-months aged seedlings of the clones RRIM 600 and GT 1, respectively. The phytophagous species had different abundances on the six rubber tree clones and, consequently, influenced the occurrence and distribution of other mite species. The most susceptible clones to the attack of C. heveae were PB 260 and RRIM 600, while the most resistant were PB 235, PB 217 and GT 1. In the arenas made of detached leaflets, C. heveae had faster development, high reproductive rate and survivorship increase on PB 235 and RRIM 600. Probably, the different ages of the plants used in field and laboratory essays influenced the conflicting results in relation to PB 235 susceptibility to C. heveae. The C. heveae attack decreased the photosynthetic rate... (Complete abstract click electronic access below)

Submitted by LEANDRA ERNST KERCHE SILVA null (leakerche@gmail.com) on 2017-03-02T20:29:44Z No. of bitstreams: 1 Tese Leandra Versão Final.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-08T14:55:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_lek_dr_prud.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T14:55:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_lek_dr_prud.pdf: 8949571 bytes, checksum: 3379799c19a1298e8da231c910b37d91 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Biomateriais podem ser definidos como dispositivos que entram em contato com sistemas biológicos tanto na forma de sólidos quanto de líquidos e géis. Para um novo biomaterial, são necessários testes toxicológicos e de interação in vitro e in vivo. O látex é uma substância branca e leitosa que exsuda da casca da Hevea brasiliensis quando a mesma é perfurada e que tem sido apontado como um biomaterial promissor. O látex quando centrifugado em alta velocidade é separado em três frações: a fração com partículas de borracha, uma fração aquosa chamada fração C e uma fração de fundo chamada fração B. A fração C é a fração metabolicamente ativa do látex. Assim, o presente estudo investigou os potenciais efeitos antioxidantes, citotóxicos, genotóxicos e antitumorais da fração C do látex da Hevea brasiliensis. Para isso, foram utilizados os testes de sequestro de radicais livres e capacidade antioxidante total em meio in vitro sem células; o teste do MTT, o ensaio do cometa, avaliação de morte celular com coloração com Hoechst 33342 e Iodeto de Propídio (PI) e avaliação de parâmetros bioquímicos de estresse oxidativo em meio in vitro com duas linhagens celulares, a CHO-k1, linhagem de células normais de epitélio de ovário de hamster, e a B16F10, linhagem de células de melanoma murino; e a ação da fração C na indução de carcinoma de células escamosas (SCC) em camundongos SKH-1 por exposição crônica à radiação UVB. Nossos resultados mostraram que a fração C é antioxidante, com capacidade para sequestrar os radicais HO• e NO• e o H2O2. A fração C não alterou a viabilidade celular das células CHO-k1, não induziu danos no DNA dessas células, não induziu apoptose e necrose e nem alterou a quantidade de tiol total e de malonaldeído (MDA) nessas células. No entanto, para a linhagem celular B16F10, a fração C mostrou atividade antitumoral, reduzindo a viabilidade celular, induzindo danos no material genético, induzindo morte celular e alterando os níveis de tiol e MDA nessas células. Nos animais que foram expostos cronicamente à radiação UVB, a fração C protegeu os eritrócitos e a pele dos animais do estresse oxidativo promovido pela irradiação e protegeu as células da pele de transformação maligna para SCC. Em resumo, nossos resultados mostraram que a fração C do látex da H. brasiliensis apresenta propriedades terapêuticas antioxidantes e antitumorais. / Biomaterials can be defined as devices that come in contact with biological systems in the form of solids, liquids and gels. In vitro and in vivo toxicological tests are needed for a new biomaterial to come out. Latex is a white and milky solution that exsudes from Hevea brasiliensis bark when perforated, and it has been appointed as a new promising biomaterial. When centrifuged in high speed, latex can be separated in three parts: rubber particle fraction, aqueous C-serum fraction and a bottom fraction called B-serum. Cserum is the part that is metabolically active. In this way, the aim of this work was to investigate potential antioxidant, cytotoxic, genotoxic and antitumor effects of latex Cserum from Hevea brasiliensis. For this purpose, we used in vitro free-radical scavenger and total antioxidant capacity tests; MTT test, comet assay, staining with Hoechst 33342 and Propidium Iodide (PI) to evaluate cell death, and evaluation of biochemical parameters of oxidative stress in Chinese hamster ovary epithelium normal cell line, CHO-k1, and murine melanoma cell line, B16F10; and C-serum effects in the induction of squamous cell carcinoma (SCC) in SKH-1 mice by chronic UVB exposure. Our results show that latex C-serum is an antioxidant compound that was able to scavenge HO• and NO• radicals and H2O2. C-serum did not alter the cell viability in CHO-k1 cells and it did not promote DNA damage in these cells, it did not alter the levels of apoptotic and necrotic cells for this cell lineage and did not alter total thiol and MDA levels in these cells. However, for B16F10 cells, latex C-serum presented antitumor effect, reducing cell viability, inducing DNA damage and cell death, and altering total thiol and MDA levels in these cells. In the animals chronically exposed to UVB radiation, latex C-serum protected the erythrocytes and skin cells from oxidative stress promoted by the irradiation, and prevented skin cells from malignant transformation to SCC. In summary, this work shows that latex C-serum from Hevea brasiliensis present antioxidant and antitumor therapeutic properties.

Orientador: Elias Taylor Durgante Severo / Coorientador: Fred Williams Calogeno / Banca: José Tarcísio da Silva Oliveira / Banca: Claudio Angeli Sansígolo / Resumo: O estudo das propriedades físicas e químicas da madeira possibilita um melhor aproveitamento das suas potencialidades. O aproveitamento da madeira de seringueira Hevea brasiliensis após o declínio da produção de látex tem relevância mundial. Uma parte da madeira da seringueira vem de uma área significativa do fuste submetida ao processo de extração de látex. Esse trabalho tem como objetivo analisar as características químicas e físicas da madeira proveniente da região submetida ao processo de extração de látex e compará-la a madeira originária da região que não sofreu processo de extração de látex. Foram utilizadas árvores de seringueira com 53 anos de idade, submetidas ao processo de extração de látex durante 45 anos ininterruptos. Foram realizadas as seguintes análises químicas: determinação do teor de holocelulose, do teor de lignina e teor de extrativos totais. Foram determinadas as seguintes propriedades físicas: densidade, contração volumétrica, contrações lineares e coeficiente de anisotropia. Não foram encontradas diferenças estatísticas entre as propriedades químicas das duas regiões do fuste analisadas nem entre os diferentes tipos de lenho juvenil e adulto. Em relação às propriedades físicas não foram encontradas diferenças entre as regiões estudadas, mas em relação ao tipo de lenho juvenil e adulto ocorrem diferenças estatísticas entre os coeficientes de contrações lineares e contração volumétrica / Abstract: The study of physical and chemical properties of wood allows a better use of its potential. The use of wood from rubber tree Hevea brasiliensis after the decline of the production of latex has global significance. A portion of the rubber wood is a significant area of the stem submitted to the extraction process latex paper aims to analyze the chemical and physical characteristics of the wood from the region subjected to the process of extracting latex and compares it to wood originally from the region that has not undergone the process of extraction of latex. Rubber trees were used with 53 years old, subject to the latex extraction process for 45 consecutive years. We made the following chemical analysis: determination of holocellulose, lignin content and the content of total extractives. We determined the following properties: density, volumetric shrinkage, linear shrinkage and coefficient of anisotropy. There were no statistical differences between the chemical properties of both the stem region analyzed or between different types of juvenile and adult wood. Regarding the physical properties no differences were found between the regions studied, but in relation to the type of juvenile wood and adult wood statistical difference between the coefficients of linear shrinkage and shrinkage were found / Mestre

O presente trabalho teve como objetivo avaliar as propriedades mecânicas da madeira de seringueira (Hevea brasiliensis), clones RRIM600 e GT1, para melhorar o aproveitamento comercial dessa madeira, que por falta de pesquisa não está no mercado brasileiro. A compreensão desse estudo contribuiu para a tecnologia de manufatura de produtos madeireiros de boa qualidade, determinados pelas propriedades mecânicas de importância na teoria das estruturas. Foram efetuados testes de compressão, cisalhamento e flexão estática em corpos de prova obtidos em duas épocas do desenvolvimento fenológico anual da cultura, analisando-se a influência do teor de amido da madeira da H.brasiliensis nas propriedades mencionadas acima. As árvores de Hevea foram cortadas com 26 anos de idade, depois de terem sido submetidas ao processo de extração de látex (\"sangria\") desde os sete anos do plantio. Foram cortadas para o estudo completo 72 árvores, sendo metade delas antes da senescência provocada por uma desfolha artificial e metade após o refolhamento. O experimento foi conduzido em área pertencente ao Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de agricultura \"Luiz de Queiroz\" da Universidade de São Paulo (ESALQ-USP) localizada em Piracicaba - SP (22º 42´30´´ S, 47º 38´00´´ W), à altitude de 550 m. Os resultados permitiram verificar que houve diferenças nas propriedades mecânicas entre as épocas fenológicas estudadas. Os clones GT1 e RRIM 600 puderam ser considerados de mesma resistência à compressão paralela e de mesma resistência à flexão estática, mas foram considerados diferentes na resistência ao cisalhamento e no módulo de elasticidade à flexão estática. Dentro das classes de perímetro do tronco estudadas os resultados foram similares para as resistências à compressão, ao cisalhamento e ao módulo de ruptura e diferentes para o módulo de elasticidade. O teor de amido na madeira caiu acentuadamente durante o refolhamento principalmente no clone GT1 e isso contribuiu para o aumento das propriedades mecânicas da época final da senescência para a época final da brotação. / This study aimed to evaluate the mechanical properties of the wood of rubber trees (Heveabrasiliensis) clones GT1 and RRIM600, to improve commercial uses of this wood, which is not in the Brazilian market due to a lack of research.The comprehension of this study has contributed to the technology of manufacturing of good quality wood products, determined by the mechanical properties of importance in the theory of structures.It were carried out tests of compression, shear and bending on specimens obtained at two stages of the crop annual phenological development, analyzing the influence of starch content of H.brasiliensis wood on the properties mentioned above. Hevea trees were cut at 26 years old, after being subjected to the extracting latex process (\"bleeding\") since seven years after planting.It were cut for the complete study 72 trees, half of them before senescence caused by an artificial defoliation and half after sprouting leaf. The experiment was conducted in an area which belongs to the Department of Plant Production of the School of Agriculture \"Luiz de Queiroz\" of the University of São Paulo (USP-ESALQ) located in Piracicaba - SP (22 º 42\'30\'\' S, 47 º 38\'00 \'\' W), at an elevation of 550 m. Results showed that there were differences in mechanical properties between the studied phenological stages. The GT1 and RRIM 600 clones could be considered of the same compression strength in parallel to the grain and same bending strength, but they were considered different in shear strength and modulus of elasticity in static bending. In the range of stem girth studied the results were similar for compression, shear and bending strength and different for modulus of elasticity. The starch content of wood decreased sharply during the sprout leaf mainly in GT1 clone and this contributed to the increase the mechanical properties from the final period of senescence to the final period of shooting.