MOURA, C. T. M. Envolvimento de vias capacitativas de cálcio nos efeitos inibitórios do extrato padronizado de Justicia pectoralis na hiperreatividade traqueal induzida por desafio antigênico. 2016. 169 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2016. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-12-21T13:36:06Z No. of bitstreams: 1 2016_tese_ctmmoura.pdf: 1895074 bytes, checksum: 7a2302baa02221806c7bb5270e15ac5e (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-12-21T13:36:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_tese_ctmmoura.pdf: 1895074 bytes, checksum: 7a2302baa02221806c7bb5270e15ac5e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-21T13:36:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_tese_ctmmoura.pdf: 1895074 bytes, checksum: 7a2302baa02221806c7bb5270e15ac5e (MD5) Previous issue date: 2016-10-04 / Justicia pectoralis Jacq. (Acanthaceae) is a plant that has significant amount of coumarin in its composition and is widely used in folk medicine for treatment of respiratory diseases. This study was conducted to test potential pharmacological effects of a standardized extract of J. pectoralis (EPJP) in an animal model of tracheal hyperreactivity. To this end, rats were actively sensitized to ovalbumin (OVA) and submitted or not to OVA challenge to assess the development of smooth muscle hyperreactivity. Stimulated with increasing concentrations of acetylcholine and KCl, rats tracheal rings challenged with OVA was contracted with significantly higher magnitude compared to the non-challenged group. Added directly into the bath chamber containing Ca2+ in free form, EPJP and its main constituent, coumarin, preferably inhibited concentration-effect curves induced by increasing concentrations of KCl or acetylcholine in rat tissues challenged with OVA, compared to those curves made for Ca2+, in the presence of the same agonists in assays performed in medium without Ca2+. After administration by gavage of EPJP or saline, the animals were sacrificed and isolated tracheal preparations were mounted in isolated organ bath chamber, to evaluate contractile response. The hyperresponsive phenotype of the challenged tissue decreased significantly after oral treatment with EPJP. The treatment by gavage abolished changes caused by OVA challenge on levels of inflammatory cytokines IL-1 and TNF-α in bronchoalveolar lavage fluid. In tracheal preparations subjected to depletion of intracellular stores of Ca2+ after repeated stimulation induced by carbachol in the presence of thapsigargin in medium without Ca2+, the EPJP reportedly inhibited the contraction induced by capacitive Ca2+ entry. TRPC proteins subfamily have been charged in these stock mediated Ca2+ currents. Through experiments to determine the expression of some genes associated with the TRPC type proteins, we found that EPJP was able to inhibit the changes in TRPC genes expression caused by antigen challenge. Thus, we can conclude that the pharmacological activity of EPJP in our hyperreactivity model seems to be due to its anti-inflammatory actions. Moreover, EPJP seems to have muscle relaxant activity, with likely involvement of its main constituent, coumarin. Some of these actions may result from the interference of EPJP in contractile mechanisms that recruit Ca2+ influx from the extracellular environment. / Justicia pectoralis Jacq. (Acanthaceae) é uma planta que possui significativa quantidade de cumarina em sua composição e é amplamente utilizada na medicina popular para o tratamento de doenças respiratórias. Este estudo foi conduzido para testamos os potenciais efeitos farmacológicos de um extrato padronizado de J. pectoralis (EPJP) em um modelo animal de hiperreatividade traqueal. Para este fim, ratos foram sensibilizados ativamente para a ovalbumina (OVA) e foram submetidos ou não ao desafio com OVA para avaliar o desenvolvimento de hiperreatividade do músculo liso. Estimuladas com concentrações crescentes de acetilcolina ou KCl, anéis de traqueia de ratos desafiados com OVA contrairam com magnitude significativamente superior em comparação com o grupo não desafiado. Adicionado diretamente na câmara de banho contendo Ca2+ na forma livre, o EPJP e seu principal constituinte, a cumarina, inibiram preferencialmente as curvas concentração-efeito induzidas por concentrações crescentes de KCl ou de acetilcolina em tecidos de ratos desafiados com OVA, comparado aquelas realizadas para o Ca2+, na presença dos mesmos agonistas, em preparações realizadas em meio sem Ca2+. Após o administração por gavagem do EPJP ou solução salina, os animais foram sacrificados e preparações isoladas de tecido traqueal foram montadas em câmara de banho de órgãos isolados, para avaliar a resposta contrátil. O fenótipo hiperresponsivo dos tecidos desafiados diminuiu significativamente após o tratamento oral com o EPJP. O tratamento por gavagem aboliu as alterações causadas pelo desafio com OVA sobre os níveis de citocinas inflamatórias IL-1 e TNF-α no lavado broncoalveolar. Em preparações traqueais submetidos a depleção de estoques intracelulares de Ca2+ após estímulos repetitivos induzidos por carbacol na presença de tapsigargina em meio sem Ca2+, o EPJP inibiu a contracção supostamente induzida por entrada capacitiva de Ca2+. Proteínas da subfamília TRPC têm sido imputadas nessas correntes de Ca2+ mediadas por estoque. Através de experimentos para determinação da expressão de alguns genes associados a proteínas do tipo TRPC, verificamos que o EPJP foi capaz de inibir as alterações na expressão de genes TRPC causadas pelo desafio antigênico. Assim, podemos concluir que a atividade farmacológica de EPJP no nosso modelo de hiperreatividade parece ser decorrente de suas ações antiinflamatórias. Além disso, EPJP parece possuir atividade miorrelaxante, com provável envolvimento de seu principal constituinte, a cumarina. Parte dessas ações podem ser decorrentes da interferencia de EPJP em mecanismos contráteis que recrutam influxo de Ca2+ do meio extracelular.

SOUSA, C. T. Sildenafil diminui a hiperreatividade de aneis isolados de traqueia de ratos e altera a expressão genica de proteínas Canonical transient receptor potential após desafio antigênico. 2014. 121 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-10-28T13:32:52Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_ctsousa.pdf: 1438670 bytes, checksum: f1868e956123594817f3f143a9c687bb (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2015-10-28T13:33:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_ctsousa.pdf: 1438670 bytes, checksum: f1868e956123594817f3f143a9c687bb (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-28T13:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_ctsousa.pdf: 1438670 bytes, checksum: f1868e956123594817f3f143a9c687bb (MD5) Previous issue date: 2014-02-21 / Sildenafil (Viagra ®) is a selective inhibitor of cyclic guanosinamonofosfato (cGMP) a specific phosphodiesterase-5 (PDE5) useful in the treatment of erectile dysfunction and pulmonary arterial hypertension. The increase in intracellular cGMP levels caused by inhibition of PDE5 causes several cellular events such as airway smooth muscle relaxation and inhibition of cellular inflammation. The aim of this study was to evaluate the mechanism of action of sildenafil in tracheas of naive animals and challenged to ovalbumin, evaluate the effect of sildenafil on the expression and function of calcium channels operated by stock in tracheas of naive animals, sensitized and challenged with ovalbumin. In this work male rats of Wistar species were used, animals were actively sensitized by intraperitoneal injections of ovalbumin (three application on alternate days - 1, 3 and 5), the antigenic challenge (bronchoprovocation) occurred during the period between the 21 and 50 days post-sensitization, exactly 24 hours before the experiments in vitro. After removing the tracheal rings form chambers mounted on isolated bath and performed the concentration effect curves. When comparing the relaxing effect of sildenafil IC50 in animals with intact epithelium 27.2 [17.5 to 42.1] microM (n = 12), whereas the IC50 for the preparations without epithelium (n = 7) was of 232.25 [129.58 to 416.23] microM, (p <0.05 Kruskal-Wallis). In preparations not treated with L-NAME IC50 was 27.2 [17.5 to 42.1] microM (n = 12), while in preparations treated with L-NAME (n = 7) was 348.1 [248 to 488.5] microM (p <0.05 Kruskal-Wallis). We observed in naive animals an increase in the EC50 for carbachol contraction produced by 0.22 [0.17 to 0.30] microM (n = 8) in the absence of sildenafil for 2.01 [1.21 to 3.33 ] microM (n = 7) in the presence of 30 microM of sildenafil for 2.85 [2.09 to 3.87] microM in the presence of 100 mM of sildenafil, and 2.45 [1.67 to 3.6 ] microM (n = 10) in the presence of 300 mM of sildenafil. In animals sensitized and challenged with ovalbumin, sildenafil 30μM inhibited bronchial hyperactivity. Concerning the entrance of capacitative calcium, the sildenafi decreased the contraction produced by the replacement of calcium by 42.9 ± 7.3% in naive animals to 10.8 ± 3.7% in presence of 30 mM of sildenafil (p <0, 05). In the animals challenged sildenafi decreased the contraction produced by the replacement of calcium (98.0 ± 11.8%, n = 6) without the presence of sildenafil in 22.7 ± 5.4% in the presence of sildenafil 30 microM (p <0.05). Correlating gene expression with animals sensitized and challenged with ovalbumin treated with sildenafil a significant increase in gene expression TRPC1 TRPC6 (p <0.05, test HolmSidak) occurred. In contrast TRPC5 expression, expressed no changes after antigenic challenge, but decreased significantly after the treatment with sildenafil (p <0.05, test HolmSidak). In this study, we found that the myorelaxant effect of sildenafil involves NO, cGMP, potassium channels and calcium channels operated by stock. The presence of sildenafil was also able to significantly reduce the response to antigen in tissues from mice sensitized and challenged, and to alter the expression of genes belonging to the subfamily of TRPC, linking the involvement of phosphodiesterase 5 via the cellular expression of genes in TRPC tracheal smooth muscle. / O sildenafil (Viagra ®) é um inibidor seletivo da guanosina monofosfato cíclico (cGMP), um tipo específico de fosfodiesterase-5 (PDE5) útil no tratamento da disfunção erétil e hipertensão arterial pulmonar. O aumento do nível de GMPc intracelular causado pela inibição da PDE5 provoca vários eventos celulares, como relaxamento da musculatura lisa das vias aéreas e inibição da inflamação celular. O objetivo deste estudo foi avaliar o mecanismo de ação do sildenafil em traqueias de animais naive e desafiados a ovoalbumina; avaliar a interferência do sildenafil na expressão e no funcionamentode dos canais de cálcio operados por estoque em traqueias de animais naive, sensibilizados e desafiados a ovoalbumina. No presente trabalho foram utilizados ratos machos, da espécie Wistar, os animais foram sensibilizados ativamente por meio de injeções intraperitoneais de ovalbumina (3 aplicações em dias alternados - nos dias 1, 3 e 5), o desafio antigênico (broncoprovocação) ocorreu no período entre os dias 21 e 50 pós-sensibilização, exatamente 24 horas antes da realização dos experimentos in vitro. Apos a remoção os anéis de traqueia foram montados nas camaras de banho isolado e realizadas as curvas concentração efeito. Quando comparamos o efeito relaxante do sildenafil a IC50 nos animais com epitélio integro 27,2 [17,5 – 42,1] µM (n = 12), enquanto que a IC50 para o para as preparações sem epitélio (n = 7) foi de 232,25 [129,58 – 416,23] µM, (p<0,05 Teste de Kruskal-Wallis). Nas preparações não tratadas com L-NAME a IC50 foi de 27,2 [17,5 – 42,1] µM (n = 12), enquanto que nas preparações tratadas com L-NAME (n = 7) foi de 348,1 [248 – 488,5] µM (p<0,05 Teste de Kruskal-Wallis). Verificamos nos animais naive um aumento na EC50 para a contração produzida pelo carbacol de 0,22 [0,17 - 0,30] µM (n = 8) na ausência de sildenafil, para 2,01 [1,21 – 3,33] µM (n = 7) na presença de 30 µM de sildenafil, para 2,85 [2,09 – 3,87] µM na presença de 100 µM de sildenafil, e para 2,45 [1,67 – 3,6] µM (n = 10) na presença de 300 µM de sildenafil. Nos animais sensibilizados e desafiados a ovoalbumina o sildenafil 30µM inibiu a hiperreatividade brônquica. Com relação a entrada de cálcio capacitativo, o sildenafi diminuiu a contração produzida pela reposição de cálcio de 42,9 ± 7,3% nos animais naïve para 10,8 ± 3,7% na presence de 30 µM de sildenafil (p<0,05). Nos animais desafiados o sildenafi diminuiu a contração produzida pela reposição de cálcio de (98,0 ± 11,8%, n = 6) sem a presença de sildenafil para 22,7 ± 5,4% na presença de sildenafil 30 µM (p <0,05). Relacionando com a expressão genica os animais sensibilizados e desafiados a ovoalbumina, tratados com sildenafil ocorreu um aumento significativo na expressão dos genes TRPC1 TRPC6 (p<0,05, Teste de HolmSidak), Em contraste a expressão de TRPC5, não expressou mudanças após o desafio antigênico, entretanto diminuiu de forma significativa após o tratamento com sildenafil (p<0,05, Teste de HolmSidak). Nesse estudo, verificamos que o efeito miorrelaxante do sildenafil envolve o NO, GMPc, canais de potássio e canais de cálcio operados por estoque. A presença do sildenafil também foi capaz de reduzir significativamente a resposta ao antígeno nos tecidos provenientes de ratos sensibilizados e desafiados, e de alterar a expressão de genes pertencentes à subfamília dos TRPC, relacionando o envolvimento da via fosfodiesterase 5 na expressão celular de genes TRPC no musculo liso traqueal.

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a exposição à fumaça de cigarro - ativa ou passiva - está altamente correlacionada ao agravamento e severidade do quadro asmático, que inclui inflamação, hiperresponsividade e remodelamento pulmonar. Os modelos experimentais que conjugam asma e tabagismo, em geral, abordam apenas alguns aspectos isolados desta complexa relação, e carecem de elucidação sobre as possíveis interrelações existentes. Neste modelo experimental, a proposta foi analisar os efeitos da coexposição de curta duração à fumaça de cigarro - do tipo \"mainstream\" - e alérgeno em camundongos previamente sensibilizados, focando as características fisiopatológicas e funcionais da asma ao final de três semanas. Os resultados demonstraram que o grupo coexposto à OVA e fumaça de cigarro (OF) apresentou diminuição do número total e diferencial de todas as células no lavado broncoalveolar, bem como da expressão celular de INF-gama e IL-4 quando comparados ao grupo OVA. Por outro lado, os parâmetros relativos ao remodelamento pulmonar parecem ser afetados de maneira oposta, demonstrado pelo aumento substancial do conteúdo de colágeno e pela expressão celular de MMP9 e TGF-? no grupo OF. A responsividade pulmonar, por sua vez, apresentou elastância aumentada nos animais com inflamação pulmonar alérgica crônica em comparação aos demais grupos, sugerindo uma correlação entre o número de eosinófilos e a resposta mecânica observada. A atividade de certos componentes específicos da fumaça de cigarro parece influenciar o comportamento das alças regulatórias no processo de inflamação, como sugerido pela expressão celular aumentada de IL-10 nos grupos expostos ao fumo. Conclui-se, portanto, que neste modelo experimental, a variedade de elementos químicos presentes na fumaça do cigarro pode afetar de maneira diferenciada os aspectos da inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos. / Several epidemiologic studies have shown that active as well passive smoking is positively associated with asthma severity, including inflammation, hiperresponsiveness and lung remodeling. Experimental models that conjugate asthma and smoking usually approach isolated aspects of this complex relation and more elucidation is needed about possible mechanisms involved. In this experimental model, the proposal was analyze the effects of short-term cigarette smoke - mainstream - on animals previously sensitized, pointing on physiological and functional characteristics of asthma during three weeks. Results demonstrated coexposed group to allergen and cigarette smoke (OVA+CS group) showed a decrease of total and differential number of all cells of bronchoalveolar lavage, as well cellular expression of INF-gamma and IL-4 when compared to OVA group. On the other hand, parameters related to lung remodeling seemed to be affected in opposite way, demonstrated by an increase of collagen content and cellular expression of MMP9 and TGF-beta of OVA+CS group. Pulmonary responsiveness was increased in tissue elastance in animals with chronic allergic pulmonary inflammation when compared to all groups, suggesting a correlation between eosinophils number and mechanical response observed. The activity of specific cigarette smoke components may influence the behavior of regulatory loops in inflammatory process, as showed by increased cellular expression of IL-10 in cigarette smoke exposed groups. In conclusion, in this experimental model the variety of chemical elements of cigarette smoke may affect in distinct ways aspects related to chronic allergic pulmonary inflammation in mice.

Dados mostram que o aparecimento do diabetes mellitus (DM), em pacientes previamente asmáticos, diminui os sintomas da asma, enquanto a insulina agrava a asma. Devido a dados na literatura e por dados prévios do nosso grupo, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito modulatório da insulina na inflamação alérgica pulmonar em camundongos diabéticos e saudáveis. Camundongos machos dibéticos BALB/c (aloxana, 50mg/kg, iv, 10 dias) foram sensibilizados com ovalbumina (OVA, 20 &#181;g e Al (OH)3, 2 mg) 10 dias após a injeção de aloxana e uma dose reforço foi dada, após 12 dias da primeira de sensibilização, após 6 dias da dose reforço, os animais foram expostos a nebulização durante 7 dias com solução de OVA (1mg/mL) ou solução salina (SAL). Animais diabéticos foram tratados com doses múltiplas de Protamine Hagedorn Neutro (NPH) 2UI e 1UI, respectivamente, por via subcutânea 12 horas antes do desafio com OVA (às 19h) e 1UI (às 7h) 2h antes de cada desafio com OVA. Os animais não diabéticos receberam 1UI de insulina, pela mesma via 2h antes de cada desafio (às 7h), 24h após o último desafio, realizaram-se as seguintes análises: a) expressão de proteína quinase p38, proteína quinase regulada por sinais extracelulares 1 e 2 (ERK 1/2), proteína quinase ativada por estresse ou c-jun NH2- terminal (JNK) , transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT 3) e transdutor de sinal e ativador de transcrição 6 (pSTAT 6) no homogenato de pulmão; b) perfil de imunoglobulinas presentes no soro; c) concentrações de interleucina (IL) IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, fator de necrose tumoral alfa (TNF-&#945;), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento transformador beta (TGF-&#946;) e interferon-gamma IFN-&#947; em homogenato de pulmão; d) migração celular em fluído do lavado broncoalveolar (LBA); e) perfil de células imunes na medula óssea, pulmão, timo e baço; f) mecânica pulmonar por BUXCO e FlexiVent. Em comparação com camundongos não diabéticos desafiados com OVA, os animais diabéticos desafiados com OVA mostraram diminuição em: ERK 1, ERK 2, JNK (fosfo54), JNK / SAPK, STAT3, pSTAT6 estava ausente; concentração da imunoglobulinas IgE, IgG1; perfil de citocinas Th2 como IL-4, IL-5, IL-13, TNF-&#945;, VEGF, TGF-&#946;; infiltrado inflamatório e) ausência de eosinofilia no LBA; células T, células B e eosinófilos na medula óssea, pulmão, timo e baço, e hiper-reatividade das vias aéreas. O tratamento com insulina restaubeleceu todos os parâmetros estudados. Portanto, sugerem que a insulina modula a inflamação alérgica pulmonar tardia em camundongos diabéticos. / Data show that the onset of diabetes mellitus (DM) in previously asthmatic patients decreases asthma symptoms while insulin worsens asthma. Due to data in the literature and previous data from our group, the present study aimed to evaluate the modulatory effect of insulin on pulmonary allergic inflammation in diabetic and healthy mice. Ovalbumin (OVA, 20 &#181;g and Al (OH)3, 2 mg) were sensitized at 10 days after alloxan injection and a booster dose was given , after 12 days of the first sensitization, after 6 days of booster dose, the animals were exposed to nebulization for 7 days with OVA solution (1mg / mL) or saline solution (SAL). Diabetic animals were treated with multiple doses of Protamine Hagedorn Neutral (NPH) 2UI and 1UI, respectively, subcutaneously 12 hours prior to challenge with OVA (at 7pm) and 1UI (at 7h) 2h before each challenge with OVA. Non-diabetic animals received 1UI of insulin, via the same route 2h before each challenge (at 7h), 24h after the last challenge, the following analyzes were performed: a) expression of protein kinase p38, protein kinase regulated by extracellular signals 1 and 2 (ERK 1/2), stress-activated or c-jun NH2-terminal protein kinase (JNK), signal transducer and transcriptional activator 3 (STAT 3) and signal transducer and transcriptional activator 6 (pSTAT 6) in the lung homogenate; b) profile of immunoglobulins present in serum; c) concentrations of interleukin (IL) IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming TGF-&#946;) and interferon-gamma IFN-&#947; in lung homogenate; d) cell migration in bronchoalveolar lavage fluid (BAL); e) profile of immune cells in the bone marrow, lung, thymus and spleen; f) Pulmonary mechanics by BUXCO and FlexiVent. In contrast to non-diabetic mice challenged with OVA, diabetic animals challenged with OVA showed decrease in: ERK 1, ERK 2, JNK (phospho54), JNK / SAPK, STAT3, pSTAT6 was absent; IgE immunoglobulin levels, IgG1; profile of Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13, TNF-&#945;, VEGF, TGF-&#946;; inflammatory infiltrate e) absence of eosinophilia in BAL; T cells, B cells and eosinophils in the bone marrow, lung, thymus and spleen, and airway hyperreactivity. The insulin treatment restored all parameters studied. Therefore, they suggest that insulin modulates late pulmonary allergic inflammation in diabetic mice.

Estudos epidemiológicos têm demonstrado que a exposição à fumaça de cigarro - ativa ou passiva - está altamente correlacionada ao agravamento e severidade do quadro asmático, que inclui inflamação, hiperresponsividade e remodelamento pulmonar. Os modelos experimentais que conjugam asma e tabagismo, em geral, abordam apenas alguns aspectos isolados desta complexa relação, e carecem de elucidação sobre as possíveis interrelações existentes. Neste modelo experimental, a proposta foi analisar os efeitos da coexposição de curta duração à fumaça de cigarro - do tipo \"mainstream\" - e alérgeno em camundongos previamente sensibilizados, focando as características fisiopatológicas e funcionais da asma ao final de três semanas. Os resultados demonstraram que o grupo coexposto à OVA e fumaça de cigarro (OF) apresentou diminuição do número total e diferencial de todas as células no lavado broncoalveolar, bem como da expressão celular de INF-gama e IL-4 quando comparados ao grupo OVA. Por outro lado, os parâmetros relativos ao remodelamento pulmonar parecem ser afetados de maneira oposta, demonstrado pelo aumento substancial do conteúdo de colágeno e pela expressão celular de MMP9 e TGF-? no grupo OF. A responsividade pulmonar, por sua vez, apresentou elastância aumentada nos animais com inflamação pulmonar alérgica crônica em comparação aos demais grupos, sugerindo uma correlação entre o número de eosinófilos e a resposta mecânica observada. A atividade de certos componentes específicos da fumaça de cigarro parece influenciar o comportamento das alças regulatórias no processo de inflamação, como sugerido pela expressão celular aumentada de IL-10 nos grupos expostos ao fumo. Conclui-se, portanto, que neste modelo experimental, a variedade de elementos químicos presentes na fumaça do cigarro pode afetar de maneira diferenciada os aspectos da inflamação pulmonar alérgica crônica em camundongos. / Several epidemiologic studies have shown that active as well passive smoking is positively associated with asthma severity, including inflammation, hiperresponsiveness and lung remodeling. Experimental models that conjugate asthma and smoking usually approach isolated aspects of this complex relation and more elucidation is needed about possible mechanisms involved. In this experimental model, the proposal was analyze the effects of short-term cigarette smoke - mainstream - on animals previously sensitized, pointing on physiological and functional characteristics of asthma during three weeks. Results demonstrated coexposed group to allergen and cigarette smoke (OVA+CS group) showed a decrease of total and differential number of all cells of bronchoalveolar lavage, as well cellular expression of INF-gamma and IL-4 when compared to OVA group. On the other hand, parameters related to lung remodeling seemed to be affected in opposite way, demonstrated by an increase of collagen content and cellular expression of MMP9 and TGF-beta of OVA+CS group. Pulmonary responsiveness was increased in tissue elastance in animals with chronic allergic pulmonary inflammation when compared to all groups, suggesting a correlation between eosinophils number and mechanical response observed. The activity of specific cigarette smoke components may influence the behavior of regulatory loops in inflammatory process, as showed by increased cellular expression of IL-10 in cigarette smoke exposed groups. In conclusion, in this experimental model the variety of chemical elements of cigarette smoke may affect in distinct ways aspects related to chronic allergic pulmonary inflammation in mice.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Com o objetivo de verificar a influÃncia dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade traqueal, ratos machos (200 - 250 g) eutireÃideos, hipotireÃideos (propiltiouracil [PTU] - v.o. 0,05% p/v, durante 4 semanas) ou hipertireÃideos (L- tiroxina [T4] - 0,5 mg/kg s.c., por 7 ou 9 dias) foram sensibilizados à ovalbumina (OVA) e, 14 dias depois, desafiados atravÃs da inalaÃÃo de OVA (1 mg/ml, seguida de 5 mg/ml, 15 min cada). O sacrifÃcio dos animais para a realizaÃÃo dos experimentos ocorreu 24 h apÃs o desafio antigÃnico por anestesia com hidrato de cloral (400 mg/Kg). A traquÃia isolada foi montada em cubas contendo 10 ml de Krebs-Henseleit modificado (37 oC, 5% de CO2 em O2). Foram obtidas curvas concentraÃÃo-efeito (CCE) para cloreto de potÃssio (KCl), carbacol (CCh) ou serotonina (5-HT). TambÃm foram realizadas CCE ao Ca2+ em preparaÃÃes estimuladas por KCl, CCh ou 5-HT e mantidas em soluÃÃo sem Ca2+. A reapresentaÃÃo do antÃgeno promoveu significativo aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da resposta mÃxima (RM) das CCE ao KCl de 0,96  0,10 gF para 1,53  0,11 gF (n = 7), ao CCh de 1,98  0,06 gF para 2,92  0,07 gF (n = 7) e à 5-HT de 1,64  0,14 gF para 2,41  0,15 (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. As traquÃias tambÃm apresentaram aumento (p < 0,05, two-way ANOVA) da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl de 0,54  0,06 gF para 0,86  0,07 gF (n = 6), com CCh de 1,20  0,14 gF para 1,77  0,14 gF (n = 6) ou com 5-HT de 0,59  0,10 gF para 1,15  0,05 gF (n = 6) nos tecidos obtidos de animais sensibilizados ou desafiados, respectivamente. O hipotireoidismo nÃo alterou significativamente a RM induzida por KCl e CCh, enquanto que aquela induzida pela 5-HT foi reduzida de 1,64  0,14 gF nos animais eutireÃideos para 0,34  0,07 gF nos animais hipotireÃideos (p < 0,001, two-way ANOVA). ApÃs desafio, a 5-HT produziu 0,56  0,11 gF (n = 7) no tecido hipotireÃideo (p < 0,001, two-way ANOVA). O hipotireoidismo aboliu o desenvolvimento de hiperreatividade para KCl e CCh. Ocorreu um aumento na CE50 nas CCE obtidas ao CCh de 0,49 x 10-6M para 4,65 x 10-6M (P < 0,05, two-way ANOVA ). O desafio reduziu a CE50 novamente para 1,53 x 10-6M (n = 6, p<0,05, two-way ANOVA). As traquÃias de animais hipotireÃideos desafiados apresentaram diminuiÃÃo da RM ao Ca2+ quando estimuladas com KCl, CCh e 5-HT. Ocorreu aumento na CE50 nas CCE ao Ca2+ em traquÃias desafiadas e estimuladas com CCh de 5,77 x 10-4 M para 22,50 x 10-4 M (n = 6, p<0,01 two-way ANOVA). O hipertireoidismo promoveu um significativo aumento na RM das CCE apenas ao KCl (0,96  0,10 gF no controle versus 1,58  0,15 no tecido hipertireÃideo). NÃo houve desenvolvimento de hiperreatividade apÃs o desafio antigÃnico (RM = 1,87  0,14 gF). Ocorreu diminuiÃÃo da CE50 ao CCh de 0,67 x 10-4 M no controle para 0,14 x 10-4 M apÃs tratamento com T4. Os resultados mostram que hà envolvimento dos hormÃnios tireoideanos no desenvolvimento de hiperreatividade em traquÃia de rato, induzida apÃs reapresentaÃÃo do antÃgeno a animais previamente sensibilizados. / In other to verify the influence of thyroid hormones on the tracheal hyperreactivity development, euthyroid, hypothyroid (propiltiouracil [PTU] - p.o. 0.05% w/v, 4 weeks) or hyperthyroid (L-tiroxine [T4] â 0.5 mg/kg s.c.,7 or 9 days) male rats (200 - 250 g) were sensitized to ovalbumine (OVA) and, 14 days later, challenged with OVA inhalation, (1 mg/ml, followed by 5 mg/ml, 15 min each). Animals sacrifice was carried out 24 later by means of anaesthesia with chloral hydrate (400 mg/Kg). Isolated trachea was mounted in 10 ml bath chamber filled with modified Krebs-Henseleit (37 oC, 5% de CO2 em O2). Concentration-effect curves (CEC) were carried out for potassium chloride (KCl), carbachol (CCh) or serotonin (5-HT). CEC to Ca2+ added in tissues maintained in Ca2+-free medium stimulated with KCl, CCh or 5-HT also were carried out. Antigenic challenge produced significant increase (p < 0.05, two-way ANOVA) of the maximal response (Emax) of the CCE for KCl from 0.96  0.10 gF to 1.53  0.11 gF (n = 7), for CCh from 1.98  0.06 gF to 2.92  0.07 gF (n = 7) and for 5-HT from 1.64  0.14 gF to 2.41  0.15 (n = 6) in tissues obtained from sensitized or challenged animals, respectively. Tracheae also showed increase on the Emax to Ca2+ (p < 0.05, two-way ANOVA) when stimulated with KCl from 0.54  0.06 gF to 0.86  0.07 gF (n = 6), with CCh from 1.20  0.14 gF to 1.77  0.14 gF (n = 6) or with 5-HT from 0.59  0.10 gF to 1.15  0.05 gF (n = 6) on sensitized or challenged tissues, respectively. The hypothyroidism did not modify significantly the KCl- or CCh-induced Emax, while the 5-HT-induced contractile effect was reduced from 1.64  0.14 gF in euthyroid tissues to 0.34  0.07 gF in hypothyroid tissues (p < 0.001, two-way ANOVA). After challenge, 5-HT produced in hypothyroid tissues a contraction corresponding to 0.56  0.11 gF (n = 7, p < 0.001, two-way ANOVA). Hypothyroidism prevented hyperreactivity development for KCl and CCh. It was observed an increased EC50 value in CCE for CCh from 0.49 x 10-6M to 4.65 x 10-6 M (p < 0,05, two-way ANOVA). After challenge, CE50 value was reduced to 1.53 x 10-6 M (n = 6, p < 0,05, two-way ANOVA). Tracheae from challenged hypothyroid animals showed decreased Emax to Ca2+ when they were stimulated with KCl, CCh and 5-HT. It was observed an increased EC50 value in CCE to Ca2+ in challenged tissues stimulated with CCh from 5.77 x 10-4 M to 22.50 x 10-4 M (n = 6, p < 0.01, two-way ANOVA). Hyperthyroidism significantly increased Emax of the KCl-induced CCE (0.96  0,10 gF in control versus 1.58  0.15 on hyperthyroid tissue). Hyperreactivity was not showed after antigenic challenge (Emax = 1.87  0.14 gF). It was observed a reduction of the EC50 value to CCh from 0.67 x 10-4 M in control to 0.14 x 10-4 M after T4 treatment. Our results show that there is a putative thyroid hormones involvement in hyperreactivity development on rat trachea, after an antigenic challenge.

INTRODUÇÃO: A indução de tolerância oral atenua a resposta inflamatória e a produção de anticorpos anafiláticos secundários presentes em quadros alérgicos pulmonares tanto em humanos quanto em modelos experimentais. Nestas situações, a modulação do remodelamento brônquico e o papel do óxido nítrico não foram previamente estudados. OBJETIVOS: 1. Desenvolver dois modelos de tolerância oral em cobaias com inflamação crônica pulmonar caracterizando: mecânica pulmonar, hiper-responsividade a metacolina, óxido nítrico exalado (NOex), anticorpos IgG1, inflamação brônquica e eosinofilopoiese. 2. Avaliar o remodelamento brônquico e a expressão da enzima óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) no epitélio brônquico nestes animais. MÉTODOS: As cobaias receberam inalações de ovoalbumina ou soro fisiológico durante 15 minutos ou até que apresentassem desconforto respiratório (este tempo foi denominado tempo de inalação). O protocolo foi repetido duas vezes por semana durante quatro semanas. Para a indução da tolerância foi administrada ovoalbumina a 2% por via oral e oferecida ad libitum, sendo formados os grupos: 1. TO1 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da primeira inalação com ovoalbumina); 2. TO2 (recebeu ovoalbumina oral a 2% a partir da quarta inalação com ovoalbumina); 3. SAL (recebeu água ad libitum e inalações com soro fisiológico); 4. OVA (recebeu água ad libitum e inalações com solução de ovoalbumina). Após os animais serem anestesiados e ventilados, foram avaliados: 1. mecânica pulmonar basal e após inalação com ovoalbumina (30mg/ml) ou soro fisiológico, 2. hiper-responsividade brônquica à metacolina, 3. coletado o NOex. Ao final do experimento, os fragmentos pulmonares foram retirados e corados com hematoxilina e eosina, com a técnica histoquímica cianeto resistente para peroxidase eosinofílica (células EPO+), com a técnica imunoistoquímica para a detecção da óxido nítrico sintase neuronal (nNOS) e com resorcina-fucsina, resorcina-fucsina oxidada e picro-sírius. A medula óssea foi retirada e corada com hematoxilina e eosina. O índice de edema peribrônquico, as células EPO+, os mononucleares e os polimorfonucleares brônquicos e os eosinófilos da medula óssea foram avaliados por morfometria. As células epiteliais brônquicas nNOS+ e as fibras elásticas e colágenas foram avaliadas por densitometria óptica. Os anticorpos IgG1 foram detectados por anafilaxia cutânea passiva. A análise estatística foi feita com o programa SigmaStat e considerado significante um P<0,05. RESULTADOS: Nos grupos TO1 e TO2 houve aumento no tempo de inalação, diminuição na resposta máxima de elastância do sistema respiratório após desafio antigênico e com metacolina, diminuição do edema peribrônquico, dos eosinófilos, dos polimorfonucleares, das fibras elásticas e colágenas, da eosinofilopoiese e dos títulos de IgG1 (P < 0,05). Os mononucleares, a resposta máxima de resistência do sistema respiratório depois do desafio antigênico, e a metacolina diminuíram em TO2 (P < 0,05). O NOex e a percentagem de células epiteliais nNOS+ não foram alterados nos grupos tolerizados. CONCLUSÕES: A indução de tolerância oral concomitante ao início da sensibilização ou depois de estabelecida a resposta alérgica foi capaz de atenuar a inflamação eosinofílica, os títulos de IgG1 e o remodelamento brônquico presentes neste modelo de inflamação crônica pulmonar. A redução dos linfomononucleares e da hiper-responsividade brônquica foi mais efetiva quando a indução de tolerância foi feita em animais previamente sensibilizados. A dissociação entre o controle da inflamação eosinofílica e a avaliação do NOex e da expressão da nNOS no epitélio brônquico sugere um mecanismo novo ativado pela indução de tolerância oral / INTRODUCTION: The oral tolerance induction attenuates the inflammatory response and the production of secondary anaphylactic antibodies present in pulmonary allergy pictures in humans as well as in experimental models. In these situations, the bronchial remodeling modulation and the role of nitric oxide have not been previously studied. OBJECTIVES: 1. To develop two models of oral tolerance in guinea pigs with chronic pulmonary inflammation, characterizing: pulmonary mechanics, hyperreponsiveness to methacholine, exhaled nitric oxide (NOex), IgG1 antibodies, bronchial inflammation and eosinophylopoiesis. 2. To evaluate the bronchial remodeling and the expression of the neuronal nitric oxide synthase enzyme (nNOS) in bronchial epithelium of these animals. METHODS: The guinea pigs were submitted to ovalbumin or saline solution inhalation for 15 minutes or until they presented respiratory stress (this time period was called inhalation time). The protocol was repeated twice a week for 4 weeks. Oral tolerance induction was carried out by the administration of 2% oral ovalbumin, offered ad libitum, and the following groups were formed: 1. OT1 (received 2% oral ovalbumin from the first ovalbumin inhalation; 2. OT2 (received 2% oral ovalbumin from the fourth ovalbumin inhalation; 3. SAL (received water ad libitum and saline solution inhalations; and 4. OVA (received water ad libitum and ovalbumin solution inhalations). After being anesthetized, the animals were ventilated and evaluated regarding: 1. basal pulmonary mechanics and after ovalbumin (30mg/ml) or saline solution inhalation; 2. bronchial hyperresponsiveness to methacholine; and 3. NOex was collected. At the end of the experiment, the pulmonary fragments were removed and stained with hematoxylin-eosin, with the cyanide-resistant eosinophilic peroxidase histochemical technique (EPO+ cells), with the immunohistochemical technique for the detection of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) and with Resorcin-fuchsin, Resorcin-fuchsin with oxidation and Picrosirius. The bone marrow was removed and stained with hematoxylin-eosin. The index of peribronchial edema, the EPO+ cells, the bronchial mononuclear and polymorphonuclear cells and the eosinophils from the bone marrow were evaluated by morphometry. The epithelial bronchial nNOS+ cells and the elastic and collagen fibers were evaluated by optical densitometry. IgG1 antibodies were detected by Passive Skin Anaphylaxis. Statistical analysis was performed with the SigmaStat software program and a P value < 0.05 was considered significant. RESULTS: The OT1 and OT2 groups showed increased inhalation time, decrease in the maximum elastance response of the respiratory system after the antigenic challenge and with methacholine, decrease of peribronchial edema, eosinophils, polymorphonuclear, elastic and collagen fibers, eosinophylopoiesis, and IgG1 titers (P < 0.05). The mononuclear cells, the maximum resistance response of the respiratory system after the antigenic challenge and methacholine decreased in OT2 (P < 0.05). NOex and the percentage of nNOS+ epithelial cells were not altered in the tolerized groups. CONCLUSIONS: The oral tolerance induction concomitant to the start of sensitization or after the allergic response has been established, was capable of attenuating the eosinophilic inflammation, IgG1 titers and the bronchial remodeling present in this model of chronic pulmonary inflammation. The decrease in lymphomononuclear cells and bronchial hyperresponsiveness was more effective when the tolerance induction was carried out in animals that had been previously sensitized. The dissociation between the eosinophilic inflammation and NOex evaluation and the expression of nNOS in the bronchial epithelium suggests a new mechanism activated by the oral tolerance induction

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico. / Silicosis is a lung disease caused by inhalation of silica particles, which is dependent on several inflammatory mediators. In this study we investigated the role of nitric oxide (NO) in the alteration of lung function and airways hyperreactivity caused by intranasal silica stimulation in mice. The parameters analyzed included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to aerosolized methacholine (3 - 27 mg/mL) by invasive plethysmography, and ii) morphological changes, by classical histological techniques and immunohistochemistry. We found that the instillation of silica particles (10 mg) caused an increase in the baseline levels lung of resistance and elastance and airways hyperreactivity to methacholine, from 2 to 28 days. We noted that there was a temporal correlation with morphological changes in lung tissue, which reflected the presence of an intense inflammatory cell infiltrate, followed by progressive fibrosis and granuloma formation. The time-points of 7 and 28 days post-silica stimulation were chosen for subsequent experiments, because they corrrespond to acute and chronic phases of experimental silicosis, respectively. Higher levels of nitric oxide (NO) and peroxynitrite as well as iNOS expression were detected in the bronchoalveolar lavage and lung tissue of silica-stimulated mice stimulated, respectively. In another group of experiments, we observed that mice depleted for the gene encoding for inducible NOS (iNOS) had the responses of increased basal levels of resistance and elastance lung and airways hyperreactivity abolished as compared to wildtype animals (C57BL/6). Inhibition of the inflammatory and fibrotic granulomatous responses were also inhibited in the case iNOS knockout mice. Treatment with the iNOS inhibitor 1400W markedly suppressed changes in lung function and tissue fibrosis observed in silicotic mice. In conclusion, our results show that suppression of lung function failure, including increased in resistance/elastance as well as airways hyperreactivity were correlated with NO and peroxynitrite generation as well as the iNOS expression. The depletion of the gene encoding to or inhibition of iNOS enzymatic activity abolished the response of lung function and tissue fibrosis in experimental silicosis. Together, these findings indicate that NO is an important mediator in the context of silicosis and suggest that it can be considered a potential therapeutic target for the treatment of fibrotic diseases.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Silicose é uma doença pulmonar causada pela inalação de partículas de sílica, na qual vários são os mediadores inflamatórios implicados. Neste estudo investigamos o envolvimento do óxido nítrico (NO) nas alterações de função pulmonar e hiper-reatividade das vias aéreas, em camundongos estimulados com sílica por via intranasal. Foram analisados parâmetros como i) função pulmonar (resistência e elastância) e hiper-reatividade das vias aéreas ao aerossol com metacolina (3 27 mg/mL) através de sistema de pletismografia invasiva, e ii) alterações morfológicas, mediante técnicas clássicas de histologia e imuno-histoquímica. Verificamos que a instilação de partículas de sílica (10 mg) causou aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonar, bem como de hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina, em tempos que variaram de 2 a 28 dias. Observamos uma correlação temporal com as alterações morfológicas no tecido pulmonar, que refletiram presença de resposta inflamatória e infiltrado celular intenso, seguidos de progressiva fibrose e formação de granulomas. Os tempos de 7 e 28 dias pós-estimulação com sílica foram selecionados para os ensaios subsequentes, por corresponderem às fases aguda e crônica da silicose experimental, respectivamente. Foram detectados níveis elevados de óxido nítrico (NO), bem como de peroxinitrito/expressão da enzima iNOS no lavado broncoalveolar e no tecido pulmonar de camundongos estimulados com sílica, respectivamente. Em outro grupo de experimentos, observamos que camundongos depletados para o gene codificante para a enzima NOS induzida (iNOS) apresentaram abolidas as respostas de aumento nos níveis basais de resistência e elastância pulmonares, bem como da hiper-reatividade das vias aéreas à metacolina em comparação aos animais selvagens (C57BL/6). A inibição da resposta inflamatória e fibrótica granulomatosa foi também notada no caso dos animais nocautes para iNOS. O tratamento com 1400W, um inibidor da enzima iNOS, diminui de forma marcada as alterações de função pulmonar e fibrose tecidual verificadas nos camundongos silicóticos. Em conclusão, nossos resultados mostram que o comprometimento da função pulmonar, representado pelo aumento na resistência/elastância e hiper-reatividade das vias aéreas, mostraram-se correlacionados à maior geração de NO e de peroxinitrito, assim como da expressão da enzima iNOS. A depleção do gene codificante ou, ainda, o bloqueio da enzima iNOS aboliram a resposta de comprometimento da função pulmonar e fibrose tecidual na silicose experimental. Em conjunto estes achados indicam que o NO parece ser um mediador importante no contexto da silicose, colocando-se como um alvo terapêutico em potencial no tratamento de doenças de caráter fibrótico. / Silicosis is a lung disease caused by inhalation of silica particles, which is dependent on several inflammatory mediators. In this study we investigated the role of nitric oxide (NO) in the alteration of lung function and airways hyperreactivity caused by intranasal silica stimulation in mice. The parameters analyzed included: i) lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to aerosolized methacholine (3 - 27 mg/mL) by invasive plethysmography, and ii) morphological changes, by classical histological techniques and immunohistochemistry. We found that the instillation of silica particles (10 mg) caused an increase in the baseline levels lung of resistance and elastance and airways hyperreactivity to methacholine, from 2 to 28 days. We noted that there was a temporal correlation with morphological changes in lung tissue, which reflected the presence of an intense inflammatory cell infiltrate, followed by progressive fibrosis and granuloma formation. The time-points of 7 and 28 days post-silica stimulation were chosen for subsequent experiments, because they corrrespond to acute and chronic phases of experimental silicosis, respectively. Higher levels of nitric oxide (NO) and peroxynitrite as well as iNOS expression were detected in the bronchoalveolar lavage and lung tissue of silica-stimulated mice stimulated, respectively. In another group of experiments, we observed that mice depleted for the gene encoding for inducible NOS (iNOS) had the responses of increased basal levels of resistance and elastance lung and airways hyperreactivity abolished as compared to wildtype animals (C57BL/6). Inhibition of the inflammatory and fibrotic granulomatous responses were also inhibited in the case iNOS knockout mice. Treatment with the iNOS inhibitor 1400W markedly suppressed changes in lung function and tissue fibrosis observed in silicotic mice. In conclusion, our results show that suppression of lung function failure, including increased in resistance/elastance as well as airways hyperreactivity were correlated with NO and peroxynitrite generation as well as the iNOS expression. The depletion of the gene encoding to or inhibition of iNOS enzymatic activity abolished the response of lung function and tissue fibrosis in experimental silicosis. Together, these findings indicate that NO is an important mediator in the context of silicosis and suggest that it can be considered a potential therapeutic target for the treatment of fibrotic diseases.

Orientador: Sonia Jancar / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-06T23:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Landgraf_RichardtGama_D.pdf: 1629843 bytes, checksum: d732dae7c868194b49b83ed52b21a953 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A asma é uma doença inflamatória crônica que envolve, simultaneamente, a participação de diversos tipos celulares, citocinas e mediadores inflamatórios. Apesar do grande número de estudos sobre o papel da bradicinina e do óxido nítrico (NO) na asma, vários aspectos não foram abordados e outros são controversos. Os objetivos deste trabalho foram, em modelo murino de asma: 1) caracterizar alguns parâmetros da inflamação pulmonar como infiltrado de eosinófilos e linfócitos (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1) no espaço aéreo, reatividade das vias aéreas à metacolina e produção de muco e avaliar o efeito de antagonistas de receptor induzível (B1) e constitutivo (B2) da bradicinina nestes parâmetros; 2) comparar o efeito da supressão aguda da síntese de NO (por tratamento com inibidores da síntese) com a ausência constitucional da iNOS (utilizando animais deficientes para este gene) nestes parâmetros; 3) avaliar a cinética da expressão da iNOS no pulmão e o tipo celular responsável pela produção de NO na fase inicial da inflamação alérgica pulmonar. Camundongos foram sensibilizados por injeção intraperitoneal de ovalbumina utilizando hidróxido de alumínio como adjuvante. Uma dose de reforço foi administrada após 7 dias e o desafio antigênico realizado no 14º e 21º dia por aerosol. Os antagonistas de receptores da bradicinina e os inibidores de NO foram administrados por via intraperitoneal 30 minutos antes de cada desafio antigênico. Os resultados obtidos mostram que o tratamento com o antagonista do receptor induzível B1 da bradicinina (R-954) reduziu significativamente o número de eosinófilos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco, entretanto não alterou o número de linfócitos no BAL. Por outro lado, o tratamento com o antagonista do receptor constitutivo B2 da bradicinina (HOE-140) aumentou o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, porém, não alterou a hiperreatividade das vias aéreas nem a secreção de muco. Estes efeitos dos antagonistas foram semelhantes nas linhagens C57Bl/6 e BALB/c. Estes resultados sugerem que, neste modelo de inflamação alérgica pulmonar, a ativação dos receptores constitutivos da bradicinina regula negativamente a inflamação enquanto que a ativação dos receptores induzíveis regula positivamente. O tratamento com os inibidores de NO, L-NAME ou aminoguanidina, diminuiu o número de eosinófilos e linfócitos no BAL, a hiperreatividade das vias aéreas e a secreção de muco. Surpreendentemente, camundongos deficientes para o gene da iNOS apresentaram inflamação das vias aéreas semelhantes aos camundongos não deficientes, e o tratamento destes camundongos com os inibidores de NO não afetou nenhum dos parâmetros avaliados. Estes dados mostram que a inibição aguda da iNOS tem efeito anti-inflamatório neste modelo de asma, enquanto que a ausência constitutiva desta enzima não tem efeito. Observamos ainda que no BAL obtido 12 horas após o desafio antigênico, as células que expressam marcador fluorescente de NO são células com núcleo polimórfico. Isto coincidiu com o pico de infiltração de neutrófilos para o BAL e com o pico de expressão da iNOS no pulmão. Estes resultados sugerem que neutrófilos do BAL produzem NO na fase inicial da asma murina. Assim, nossos estudos contribuíram para uma melhor compreensão do papel dos receptores constitutivos e induzidos da bradicinina, na asma e sugeriram que a utilização de antagonistas do receptor B1 poderia ter um efeito protetor. Além disso, a demonstração da produção de NO por neutrófilos que migraram para o BAL na fase inicial da inflamação alérgica sugere que inibidores da síntese de NO possam ter efeito protetor quando utilizados em fase precoce da estimulação antigênica / Absract: Asthma is a chronic inflammatory disease that involves simultaneously several cell types, cytokines and inflammatory mediators. Despite the large number of publications dealing with the role of nitric oxide (NO) and bradykinin in asthma, several aspects of the disease were not addressed and some are controvertial. In the present study, using a murine model of asthma, we: 1) characterized some parameters of pulmonary inflammation such as airways infiltration of eosinophil and lymphocytes (CD4 +, CD8 +, B, T?d e NK1.1), airways reactivity to methacholine and mucus secretion and evaluated the effect of antagonists of the inducible (B1) and constitutive (B2) bradikinin receptors in these parameters; 2) compared the effect of acute suppression of NO synthesis (by treatment with NO inhibitors) with the absence of iNOS (using mice deficient for this gene) on these parameters; 3) evaluated the temporal profile of iNOS expression in the lungs and the cell type responsible for lung NO production in the initial phase of lung inflammation. Mice were sensitized by ip injection of ovalbumin using alum as adjuvant. One booster was administered after 7 days and antigen challenge performed on day 14 and 21 by aerosol. The bradykinin receptor antagonists and the NO inhibitors were given ip, 30 min before each challenge. The results obtained show that treatment with the B1 receptor antagonist, R-954 significantly reduced the number of eosinophils in the BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion but did not alter the number of BAL lymphocytes. Treatment with the constitutive (B2) bradykinin receptor,HOE-140), however, increased eosinophils and BAL lymphocytes number, but had no effect on airways hyperreactivity nor in mucus secretion. These effects of the antagonists were observed in both, C57Bl/6 e BALB/c mice. These results suggest that, in this model of lung inflammation, activation of constitutive bradykinin receptors would down-regulate the inflammation whereas activation of the inducible receptor would have a pro-inflammatory effect. Treatment with NO inhibitors, L-NAME or aminoguanidine, reduced eosinophils and lymphocytes in BAL, airways hyperreactivity and mucus secretion. Surprisingly, in mice deficient of iNOS gene the airways inflammation was similar to that observed in iNOS sufficient mice and treatment of the deficient mice with the NO inhibitors did not affect the parameters analyzed. These results show that acute inhibition of iNOS has anti-inflammatory effect in this model of asthma whereas the absence of this enzyme has no effect. It was also observed that in the BAL collected 12h after antigen challenge, the cells that expressed a fluorescent NO marker were cells with polymorphic nucleous. This was coincident with the peak of neutrophils infiltration to the BAL and with the peak expression of lung iNOS. These results suggest that BAL neutrophils produce NO in the initial phase of murine asthma. Thus, our studies contributed for a better understanding of the role of the constitutive and inducible bradykinin in asthma and suggest that antagonists of B1 receptor could have a beneficial effect on asthma. Moreover, the demonstration of NO production by neutrófilos that had migrated to the BAL suggests that NO synthesis inhibitors would have a beneficial effect when administered early after antigenic stimulation / Doutorado / Doutor em Farmacologia